CN102294013B - 一种促肝细胞生长素，其制剂及应用 - Google Patents
一种促肝细胞生长素，其制剂及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种促肝细胞生长素，采用高效液相色谱法分析，具有12个色谱组分峰，所述的促肝细胞生长素的数均分子量为10685道尔顿，重均分子量为11350道尔顿数，并含有18种氨基酸和10种微量元素。本发明的促肝细胞生长素的浓度为15.0～22.5mg/ml，其中活性蛋白质的含量为71％～75％。所述的促肝细胞生长素在体外促7721细胞的增殖试验中，用MTT法测定的增殖倍数为4.5～6.0。本发明还涉及该促肝细胞生长素的制剂及应用。本发明的促肝细胞生长素活性高，有效物质的含量高，使用安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种促肝细胞生长素，还涉及其制剂和应用。
背景技术
促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取的小分子量多肽类混合物，分子量在10,000左右。其药理作用主要为可刺激正常肝细胞DNA的合成，促进肝细胞再生，对损伤的肝细胞有保护作用，促进肝功能的恢复，还有调节机体的免疫功能和抗肝纤维化作用。临床上用于治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等。
目前，针对促肝细胞生长素这一生物制剂类药物，已经有很多专利和文献报道。
在专利ZL03116052.2中，公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法，其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质，该专利称该肝细胞生长素中的蛋白质有15种氨基酸组成，占总蛋白含量的60％以上，分子量为2.1万道尔顿。
专利ZL200610047371.0公开了一种促肝细胞生长素水针剂制剂的制备方法，其中公开了一种促肝细胞生长素溶液的制备方法，包括以下步骤：1)选材；2)组织处理；3)匀浆：低温匀浆2分钟；4)冻融：反复冻融3次；5)热变性去除大分子蛋白：升温至85℃，恒温5分钟；6)离心；7)分级超滤及病毒灭活：一级超滤收集分子量30,000Da以下的组分；二级超滤收集分子量为10,000Da以下的多肽组分，60℃保温10小时，灭活病毒。
但上述专利中并未对肝细胞生长素的成分进行进一步深入的研究和分析，发明人在专利ZL93120999.4中已经公开了一种促肝细胞生长素的组成成分，但经过发明人的深入研究，得到了一种新的、含量更高、活性更强的促肝细胞生长素。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供了一种促肝细胞生长素；
本发明的第二发明目的在于提供了这种促肝细胞生长素的制剂；
本发明的第三发明目的在于提供了这种促肝细胞生长素的用途。
为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：
一种促肝细胞生长素，所述的促肝细胞生长素溶液采用高效液相色谱法分析，在分析条件为：流动相甲醇∶水的体积比为10∶90，色谱柱hypersil ODS 4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，具有12个色谱组分峰，其保留时间和峰面积为：
本发明的第一优选技术方案为，优选的保留时间和峰面积为：
本发明的第二优选技术方案为，促肝细胞生长素的数均分子量为10685道尔顿，重均分子量为11350道尔顿。
本发明的第三优选技术方案为，促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％。其中，氨基酸的检测方法采用高效液相色谱检测。
本发明的第四优选技术方案为，促肝细胞生长素的微量元素包括Fe 7.3～7.6ug/ml，Se0.04～0.05ug/ml，Mg140.5～140.7ug/ml，Zn 14.2～14.4ug/ml，Na 33.5～33.7ug/ml，Ca 0.3～0.5ug/ml，Mn 0.6～0.7ug/ml，Co 200.1～200.3ug/ml。本发明中微量元素的检测方法通过原子吸收光谱检测。
本发明的第五优选技术方案为，促肝细胞生长素的浓度为15.0～22.5mg/ml，优选15.0～21.7mg/ml，测定方法为福林酚法。
本发明的第四优选技术方案为，促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的71％～75％。其中，活性蛋白的测量方法为促肝细胞生长素通过凝胶色谱等方法分离，经7721细胞掺入培养，通过MTT法测定活性组份，并计算活性组份重量的占总质量的比例。
本发明的第五优选技术方案为，所述的促肝细胞生长素在体外促7721细胞的增殖试验中，用MTT法测定的增殖倍数为4.5～6.0。
本发明还涉及一种所述的促肝细胞生长素的制剂，所述的制剂包括冻干粉针。
本发明还对提取得到的促肝细胞生长素进一步制备成了制剂，其中包括粉针剂；
冻干粉针剂的配方为：促肝细胞生长素10重量份，赋形剂甘露醇1～100重量份；其中优选促肝细胞生长素10重量份，赋形剂10～100重量份，更优选促肝细胞生长素10重量份，赋形剂40～100重量份。
其中，赋形剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、右旋糖酐、木糖醇等，所述的冻干粉针中还可以包括稳定剂、防腐剂、抗氧化剂等，辅料的选择可依据本领域技术人员的常规选择进行，也可以通过处方筛选实验获得。本发明的冻干粉针可采用已知的方法制备。
本发明制备的冻干针剂，通过动物体内实验、体外实验的检测，其活性与所提取的促肝细胞生长素的活性相同。
本发明还涉及所述的促肝细胞生长素在制备治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎或肝硬化药物中的应用。
下面对本发明的内容做进一步的解释和说明
本发明中促肝细胞生长素的制备方法的工艺步骤为：
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，匀浆液冷冻至-20℃～-35℃；
(4)将-20℃～-35℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃～85℃后立刻撤掉加热源，放入滤布或滤网自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液冷冻至-20℃～-30℃密封保存；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的1/3～1/2，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装，-18℃以下保存。
具体的要求及技术优势为：
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个的完整乳猪肝不得超过140克，实验证实，乳猪的肝脏的促肝细胞生长素的活性组份含量更高，大大高于成年猪的含量；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为：5分钟，比例优选为水∶猪肝质量比为1.1∶1；匀浆液冷冻至-20～-35℃；匀浆液以10～18℃/min的速度从室温冷冻至0～-5℃，再以4～8℃/min的速度冷冻至-20～-35℃，优选匀浆液以12～15℃/min的速度从室温冷冻至0～-5℃，再以3～6℃/min的速度冷冻至-20～-35℃/min。本发明此处采用了分步快速速冻的方式，发明人通过反复试验发现，通过分步冷冻的匀浆液，促肝细胞生长素的得率会有所提高。这可能是由于通过对冷冻速度的控制，使匀浆液冷冻产生颗粒大小适宜的冰晶，从而在细胞内更加彻底的破坏细胞膜，释放出细胞内物质，使得提取液中有效成分含量大大增加。现有技术中，采用速冻的方式冷冻的，都是采用同一速度降温的，但如果降温速度一直保持很快，就会产生比较大的冰晶，也对细胞膜的破坏不完全，从而使细胞内的物质的释放不完全，造成提取率低下。而且如果速冻速度过快，对设备和工艺的要求很高，一般设备难以达到。
(4)将-10～-25℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃～85℃后立刻撤掉加热源，放入滤布或滤网自然过滤，滤布或滤网的孔径0.1mm，滤布或滤网的面积为2～3平方米，速度200ml/min，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；本发明采用了达到83℃～85℃后立刻撤掉加热源，从而进一步保证了产品的活性。解冻和加热的速度为1～10℃/min，并优选阶段式升温的方式，优选以1～2℃/min的速度升温至0～5℃，再以4～8℃/min的速度加热至83℃～85℃。阶段式升温的好处为：先以较慢的速度升温至零度左右，对于冷冻体，升温速度过快，会造成冷冻体内部和外部的温差增大，缓慢升温可以使冷冻体均匀缓慢的解冻。因为在操作过程中一般采用蒸汽加热，避免了在蒸汽加热过程中，外层解冻融化温度增高，内层还未融化，外层的溶液在高温作用下活性降低的可能。当冷冻体溶解，本发明采用了较快速升温的过程，这是因为，如果解冻后还采用较慢的速度，冷冻后的匀浆液中由于细胞分解破裂，释放出大量的具有活性的蛋白分解酶，此类活性酶物质在一个较长时间内处于一种适于其酶解其他物质的环境中，从而会引起其促肝细胞生长素活性物质的降解。
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液冷冻至-20℃～-30℃密封保存；此处的冷冻也采用了分步冷冻，超滤液以10～15℃/min的速度从室温冷冻至0～-5℃，再以2～6℃/min的速度冷冻至-20～-30℃，优选超滤液以12～15℃的速度从室温冷冻至0～-5℃，再以3～5℃/min的速度冷冻至-20～-30℃/min；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg。
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为1～10℃/min，优选以1～4℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。在现有技术中，一般采用反复冻融的方式，对促肝细胞生长素进行提取，然而，反复冻融易产生降压物质，在对用药的安全产生隐患。而采用化学提取、酶提取法，由于在提取过程中，pH变化过大或者酶的作用，最终提取得到的促肝细胞生长素的活性偏低，基本无临床效果。本发明采用了两次冻融、低温长时间冷冻的方式，最终制备得到了一种活性多肽含量高、产品得率高的促肝细胞生长素，经动物实验和临床试验，得到了良好的治疗效果。
本发明采用的工艺流程为：匀浆液分步冷冻、冻存至少7天-溶解、加热至83～85℃、调pH值-分子量20,000中空纤维柱过滤、分子量10,000超滤膜过滤-分步冷冻、冻存至少7天-溶解、浓缩-分子量20,000中空纤维柱过滤-0.22μm除菌过率；
1.本发明的工艺流程中，先将匀浆液分步冷冻，并冻存至少7天后溶解加热后，滤布易于过滤。冻存7天可使细胞充分破裂，从而使蛋白、多肽等物质释放，从而可使一次冷冻达到反复冻融的目的，避免了降压物质的产生。
2.本发明热变性步骤中，仅加热至83～85℃并立即撤掉热源，本发明通过反复试验确定，采用这种方式即可以使大分子蛋白变性，而加热至更高的温度或者在85℃这一度下保温，都会对降低本发明活性物质的活性。
3.本发明对匀浆液采用的是自然过滤的方式，避免了离心等操作对本发明活性物质的活性的影响，节约能源。
4.本发明采用了在对溶液进行过滤前就调节PH的做法。
5.本发明采用了对溶液先采用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，再采用截留分子量10000的超滤膜过滤，并对中空纤维柱过滤的压力和超滤膜的压力进行了控制，可防止极少量的高分子物质通过滤膜，也可防止膜的损坏。
6.本发明对超滤液再进行一次冷冻、解冻、过滤，从而进一步去除最终产品中的高分子物质，再经除菌得到一种安全的产品。
附图说明
图1为实施例1制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图2为实施例2制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图3为实施例3制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图4为实施例4制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图5为实施例5制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图6为实施例6制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图；
图7为实施例7制备的促肝细胞生长素的高效液相色谱图。
本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。
具体实施方式
实施例1促肝细胞生长素的提取
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5min，比例为水∶猪肝质量比为1.1∶1；匀浆液以16℃/min内从室温冷冻至0℃，再以4℃/min的速度冷冻至-35℃；
(4)将-10～-25℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃～85℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5，解冻和加热的速度为1～2℃/min；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以15℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以5℃/min的速度冷冻至-25℃。其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg。
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为1℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图1所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.6ug/ml，Se 0.04ug/ml，Mg 140.5ug/ml，Zn 14.2ug/ml，Na 33.5ug/ml，Ca 0.3ug/ml，Mn 0.6ug/ml，Co 200.1ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为20.3mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的71％。
实施例2
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5分钟，比例为水∶猪肝质量比为1.15∶1；匀浆液以15℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以5℃/min的速度冷冻至-35℃。
(4)将-35℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃～85℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；解冻和加热的速度以2℃/min的速度升温至0℃，再以8℃/min的速度加热至85℃；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以12℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以3℃/min的速度冷冻至-30℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为1℃/min升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图2所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.3ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.6ug/ml，Zn 14.4ug/ml，Na 33.7ug/ml，Ca 0.5ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.2ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为21.5；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的71％。
实施例3
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5分钟，水和猪肝质量比为1.1∶1；匀浆液以18℃/min的速度从室温冷冻至-2℃，再以8℃/min的速度冷冻至-28℃；
(4)将-30℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以10℃/min的速度从室温冷冻至-4℃，再以4℃/min的速度冷冻至-25℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为1～10℃/min，优选以1～4℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图3所示；
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.5ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.7ug/ml，Zn 14.3ug/ml，Na 33.6ug/ml，Ca 0.4ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.3ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为20.8mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的72％。
实施例4
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5分钟，水和猪肝质量比为1.1∶1；匀浆液以15℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以5℃/min的速度冷冻至-30℃；
(4)将-30℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以12℃/min的速度从室温冷冻至-4℃，再以4℃/min的速度冷冻至-25℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为1～10℃/min，优选以1～4℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图4所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.5ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.7ug/ml，Zn 14.3ug/ml，Na 33.6ug/ml，Ca 0.4ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.3ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为21.2mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的73％。
实施例5
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5分钟，水和猪肝质量比为1.1∶1；匀浆液以15℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以6℃/min的速度冷冻至-30℃；
(4)将-30℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以12℃/min的速度从室温冷冻至-4℃，再以5℃/min的速度冷冻至-25℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为4℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图5所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.5ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.7ug/ml，Zn 14.3ug/ml，Na 33.6ug/ml，Ca 0.4ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.3ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为20.5mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占重量的72％。
实施例6
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为1000转/分，时间为5分钟，水和猪肝质量比为1.2∶1；匀浆液以18℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以5℃/min的速度冷冻至-32℃；
(4)将-30℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至84℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以15℃/min的速度从室温冷冻至-4℃，再以6℃/min的速度冷冻至-25℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为3℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图6所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为：Fe 7.5ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.7ug/ml，Zn 14.3ug/ml，Na 33.6ug/ml，Ca 0.4ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.3ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为21.7mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的71％。
实施例7
(1)选材：原材料选用当天宰杀的新鲜乳猪肝；单个完整猪肝的重量不得超过140克；
(2)组织处理：乳猪肝除去筋膜、结蒂等组织后，用纯水洗净；并用不锈钢刀切成2～3块，以便于匀浆；
(3)室温下与注射用水混合，匀浆的速度为800～1000转/分，时间为5分钟，水和猪肝质量比为1.15∶1；匀浆液以17℃/min的速度从室温冷冻至-5℃，再以7℃/min的速度冷冻至-30℃；
(4)将-30℃冻存至少7天的匀浆液解冻后，加热至83℃后立刻撤掉加热源，放入滤布自然过滤，滤液用NaOH溶液调节PH值至6.5；
(5)将调节至PH为6.5的溶液用截留分子量20000的中空纤维柱过滤，然后经截留分子量10000的超滤膜过滤，超滤液以15℃/min的速度从室温冷冻至-4℃，再以6℃/min的速度冷冻至-25℃；其中，中空纤维柱过滤的压力不超过2.3kg，截留分子量10000的超滤膜的压力不超过2.5kg；
(6)将冻存至少7天的超滤液解冻，解冻的速度为4℃/min的速度升温至室温；过滤，上清液用反渗透膜浓缩至原体积的三分之一，浓缩液经截留分子量10000的中空纤维柱过滤，再经0.22um的滤膜除菌后分装于不锈钢桶中，-18℃以下保存。
将制备得到的促肝细胞生长素溶液用高效液相色谱法分析，条件为：流动相甲醇∶水＝10∶90(体积比)，色谱柱hypersilODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml/min，共有12个色谱组分峰，其高效液相色谱图如图7所示。
经检测，所制备的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp 1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu 3.6％，Pro 0.9％，Gly1.2％，Ala 1.2％，Cys0.2％，Val 0.9％，Met 0.5％，Ile 0.9％，Leu1.8％，Tyr 0.4％，Phr 0.9％，His 0.7％，Try 2.5％，Lys 1.5％，Arg 9.1％，总量占28.8％；
微量元素的含量为Fe 7.5ug/ml，Se 0.05ug/ml，Mg 140.7ug/ml，Zn 14.3ug/ml，Na 33.6ug/ml，Ca 0.4ug/ml，Mn 0.7ug/ml，Co 200.3ug/ml；
促肝细胞生长素的浓度为20.5mg/ml；
促肝细胞生长素中活性组份的重量占总重量的71％。
实施例8
配方为：实施例1提取得到的促肝细胞生长素10重量份，甘露醇90重量份，
采用常规方法配液、除菌、灌装，冻干。
比较例1：不同的制备工艺处理对生物活性的影响
工艺1：其他工艺处理均与实施例1相同，除在步骤(4)加热至85℃并保持15分钟；
工艺2：其他工艺处理均与实施例1相同，除在步骤(4)直接以2℃/min的速度加热至83℃～85℃；
工艺3：其他工艺处理均与实施例1相同，除在步骤(4)直接以6℃/min的速度加热至83℃～85℃；
检测方法同实验例3，实验结果如表1所示：
表1：
比较例2：不同的制备工艺处理对产率的影响
工艺1：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(3)中，匀浆液以30℃/min的速度从室温冷冻至-35℃；
工艺2：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(3)中，匀浆液以10℃/min的速度从室温冷冻至-35℃；
工艺4：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(5)中，匀浆液以15℃/min的速度从室温冷冻至-25℃；
工艺5：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(5)中，匀浆液以5℃/min的速度从室温冷冻至-25℃/min；
工艺6：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(4)和步骤(6)中，冻存48小时；
工艺7：其他工艺处理与实施例1相同，在步骤(4)和步骤(6)中，冻存72小时；
实验结果见表2：
表2：
实验例1体内实验
取实施例1～7制备的促肝细胞生长素作为实验药品，进行以下实验：
实验例1体内实验
取实施例1～7制备的促肝细胞生长素作为实验药品，进行以下实验：
雄性Wistar大鼠，135～190g，在戊巴比妥钠(4mg/100g体重)麻醉下进行32％的肝部分切除，术后4～6小时经腹腔注射生理盐水4ml、本发明实施例1～7制备的促肝细胞生长素20mg，于30小时固定于肝右叶中下1/3处取材，Bouin’s液固定，包埋切片，6u H.E.染色，有丝分裂计数，如表3所示：
表3：
实验例2体外实验
取实施例1～7制备的促肝细胞生长素作为实验药品，进行以下实验：
雄性豚鼠200～300G，经心脏采血致死，无菌取出心脏，冲洗后剪碎与100目尼龙网上轻研，过滤，用含10％胎牛血清1640培养液制备肝细胞悬液，细胞计数为5～7×105个/ml，0.2％台盘蓝染色活率为81％。当成活率高于70％时进行24孔板培养，每孔加1ml含血清1640培养液，37℃，5％CO2，培育4小时，吸取各孔上清液，正常对照组不加促肝细胞生长素，实验组每孔加含有40μg促肝细胞生长素的无血清1640培养液，24小时每孔加2uci的3H-dTR，7℃，5％CO2，培育2.5小时，分别收集各孔的细胞，用0.01MPBS冲洗3次，涂于玻璃纤维滤纸片上，37℃干燥过夜，将纸片放入闪烁杯中，加闪烁液5ml，闪烁计数器测各样品的CPM值。
表4本发明促肝细胞生长素对体外肝细胞DNA3H-dTR参入量的影响
实验例3体外实验MTT法
1.取实施例1～7制备的促肝细胞生长素，用RPMI-1640培养液制成每1ml中含多肽100μg的溶液。
2.用10％的小牛血培养液培养SMMC-7721细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含2.5×104～5×104个细胞，将上述细胞悬液在96孔细胞板上铺板，每孔100μl，其中3孔加10％小牛血清培养液100μl作为空白对照，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养3～4小时使其贴壁。
供试品组，每孔加供试品溶液100μl，每批供试品均做3个孔，细胞对照组和空白对照组每孔分别加RPMI-1640培养液100μl，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时，结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)洗一次，然后再每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(pH7.3)100μl和MTT溶液20μl，继续培养。
培养结束后，其吸出培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，摇匀，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸收度A值；并计算刺激指数；其中刺激指数为(供试品组3孔吸收度平均值-空白对照组3孔吸收度平均值)与(对照组3孔吸收度平均值-空白对照组3孔吸收度平均值)的比值。
表5：
Claims (10)
1.一种促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素溶液采用高效液相色谱法分析，在分析条件为：流动相甲醇：水的体积比为10：90，色谱柱hypersil ODS4.6×300mm(5um)，波长256nm，流速0.8ml／min，具有12个色谱组分峰，其保留时间和峰面积为：
2.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，其保留时间和峰面积为：
3.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素的数均分子量为10685道尔顿，重均分子量为11350道尔顿。
4.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素含有18种氨基酸，氨基酸的名称及重量百分比含量为：Asp1.5％，Thr0.3％，Ser0.7％，Glu3.6％，Pro0.9％，Gly1.2％，Ala1.2％，Cys0.2％，Val0.9％，Met0.5％，Ile0.9％，Leu1.8％，Tyr0.4％，Phr0.9％，His0.7％，Try2.5％，Lys1.5％，Arg9.1％，总量占28.8％。
5.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素的微量元素包括：Fe7.3～7.6μg/ml，Se0.04～0.05μg／ml，Mg140.5～140.7μg／ml，Zn14.2～14.4μg/ml，Na33.5～33.7μg/ml，Ca0.3～0.5μg／ml，Mn0.6～0.7μg/ml，Co200.1～200.3μg/ml。
6.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素的浓度为15.0～22.5mg／ml。
7.根据权利要求6所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素的浓度为15.0～21.7mg／ml。
8.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素中活性蛋白质的含量为71％～75％。
9.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素，其特征在于，所述的促肝细胞生长素在体外促7721细胞的增殖试验中，用MTT法测定的增殖倍数为4.5～6.0。
10.一种含有权利要求1所述的促肝细胞生长素的制剂，其特征在于，所述的制剂包括冻干粉针。
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| 徐明红等.肝细胞生长素研究进展.《广东药学院学报》.1995,第11卷(第1期), |
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