RU2688327C2 - Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов - Google Patents
Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688327C2 RU2688327C2 RU2017117772A RU2017117772A RU2688327C2 RU 2688327 C2 RU2688327 C2 RU 2688327C2 RU 2017117772 A RU2017117772 A RU 2017117772A RU 2017117772 A RU2017117772 A RU 2017117772A RU 2688327 C2 RU2688327 C2 RU 2688327C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- monolayer
- peninsulae
- apodemus
- cell line
- tick
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002356 single layer Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 241001513264 Apodemus peninsulae Species 0.000 title claims abstract description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract 4
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 title abstract description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title abstract description 10
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 19
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 241000700180 Apodemus sylvaticus Species 0.000 claims 2
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 7
- 238000013456 study Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 14
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 241000605310 Ehrlichia chaffeensis Species 0.000 description 7
- 241001495399 Ehrlichia muris Species 0.000 description 7
- 206010020429 Human ehrlichiosis Diseases 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000605281 Anaplasma phagocytophilum Species 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000466360 Myodes glareolus Species 0.000 description 1
- 241001504686 Myodes rufocanus bedfordiae Species 0.000 description 1
- 241001097839 Pipistrellus ceylonicus Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241001529801 Tick-borne flavivirus Species 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов, включающий гомогенизацию почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae, затем суспендирование в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и инкубирование суспензии при 37°С в течение 1 часа, после чего суспензию центрифугируют при 1200g, удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 м кг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, затем первичные культуры клеток инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СОдо формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для производства вакцин и диагностических препаратов, а также для выделения, накопления и изучения ВКЭ. 4 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и вирусологии, в частности к разработке клеточного субстрата для репродукции вируса клещевого энцефалита in vitro и производству вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству Flaviviridae и ежегодно вызывает до 10 тысяч случаев заболевания человека. Человеку ВКЭ передается при укусах иксодовых клещей. Естественными хозяевами вируса в природе являются прокормители клещей - мелкие млекопитающие, в том числе восточноазиатская лесная мышь Apodemus peninsulae, зараженность которой ВКЭ может достигать 20% [Клещевой энцефалит…, 1996; Балахонов С.В. и др., 2012]. В последние годы, в качестве наиболее перспективного пути совершенствования модельных и производственных систем культивирования вирусов in vitro, рассматривается создание новых модельных систем на основе естественных хозяев инфекций [Eckerle I et al., 2014; Stoltz M et al., 2011; Mourya DT et al., 2013; Sheng et al., 2011]. Однако разнообразие, доступность и степень изученности таких моделей еще очень невелики. Так, недавно была разработана клеточная линия MRK101 красно-серой полевки (Myodes rufocanus bedfordiae). Линия клеток MRK101 получена в Японии из почки полевки - представителя хомякообразных - другого семейства грызунов, являющихся важными хозяевами многих трансмиссивных инфекций, в том числе ВКЭ [Sanada Т et al., 2012]. Однако, данная линия клеток рекомендована как инструмент для изучения хантавирусов in vitro и не тестирована на восприимчивость к ВКЭ и другим флавивирусам.
В настоящее время для производства антигена ВКЭ, изучения биологии вируса и разработки новых средств диагностики, профилактики и лечения заболевания используются клетки позвоночных: VERO, ВНК-21, ФЭК, СПЭВ. Все эти клеточные линии получены от животных, не являющихся естественными хозяевами клещевых флавивирусов - курицы, обезьяны, свиньи, хомяка, человека. Именно с этим связаны основные недостатки существующих клеточных культур. Это и быстрая (до 4 пассажей) адаптация ВКЭ к линии клеток, приводящая к изменению естественных свойств вируса [Mandl et al, 2001], и избыток куриного белка в иммунопрепаратах при производстве вакцинных антигенов на культуре ФЭК [Воробьева М.С. и др., 2007], и то, что доступные клеточные модели не отражают характеристики специфичных взаимодействий вирусов и их позвоночных хозяев [Stoltz et al. 2011, Eckerle et al. 2013, Tigabu В et al., 2010]. У линии клеток VERO отсутствует секреция интерферонов типа I (IFN α/β) [Emeny J. and Morgan M., 1979], кроме того, эффективность репродукции ВКЭ в этих клеток снижена [Морозова О.В. и др., 2012]. Отмечается дерегуляция естественных клеточных механизмов, связанная с вырождением традиционных клеточных линий в процессе культивирования [Eckerle et al., 2014]. Многие традиционные культуры клеток (СПЭВ, ВНК-21) быстро, в течение 3-5 дней, гибнут от цитопатического действия ВКЭ, что повышает ресурсоемкость производства антигена с использованием этих линий в качестве субстрата. Эти недостатки традиционных линий оказывают негативное влияние на совершенствование производства вакцин и диагностических препаратов. Поэтому разработка новых эффективных клеточных субстратов для репродукции ВКЭ и производства вирусного антигена является актуальной задачей.
Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, явилось создание новой линии клеток из почки Apodemus peninsulae, пригодной для репродукции ВКЭ, а также для производства вирусного антигена.
Цель данного изобретения создание монослойной перевиваемой линии клеток естественного хозяина ВКЭ для репродукции вируса и производства вирусного антигена.
Поставленная цель достигается тем, что создана перевиваемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae), для которой показана возможность репродукции ВКЭ и накопления вирусного антигена в культуральной жидкости. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Клеточная линия хранится в коллекции клеточных культур лаборатории трансмиссивных инфекций Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (г. Иркутск) под обозначением ApnK.
Таким образом, создана новая перевиваемая линия клеток для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов и следовательно, данное техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».
Проведенный анализ патентной и научной литературы не выявил публикаций, описывающих перевиваемые линии клеток A. peninsulae и их применение для репродукции ВКЭ. А именно, предлагаемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae позволяет поддерживать репродукцию вируса клещевого энцефалита и накапливать вирус в культуральной жидкости в количестве 6-7,1 lg БОЕ/мл. При этом происходит выработка специфичного антигена ВКЭ в количествах, сопоставимых с коммерческими антигенами ВКЭ. По результатам иммуноферментного анализа, через 4 дня после заражения клеток ApnK, концентрация антигена ВКЭ в культуральной среде превышает как концентрацию коммерческих антигенов (2,5 ОЕ), так и аналитический предел тест-системы (3,5 ОЕ). Репродукция ВКЭ и накопление специфичного антигена проходит на протяжении 3 недель без смены культуральной среды.
В отличие от традиционных клеточных линий, линия клеток ApnK является более адаптированным к ВКЭ субстратом, поскольку получена от естественного хозяина вируса. Это обеспечивает стабильную репродукцию ВКЭ в культуре клеток и накопление вирусного антигена в культуральной жидкости в течение трех недель.
Предлагаемую линию клеток можно использовать в научно-исследовательских лабораториях как модельную систему для изучения ВКЭ, в биотехнологических компаниях, на фармацевтических заводах для производства антигена ВКЭ для вакцин и диагностических препаратов.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Пассажная история клеточной линии ApnK. Первичная культура клеток получена из почек взрослой самки Apodemus peninsulae, отловленной в Иркутской области. Животное эвтаназировали под анестезией и немедленно препарировали для извлечения органов. Суспензию клеток почки культивировали в течение 40 суток до получения монослоя первичной культуры прикрепленных клеток и затем пассировали с разведением от 1:2 до 1:5. Стабильно растущая перевиваемая морфологически однородная линия клеток ApnK сформировалась на 17 пассаже. Основные характеристики клеточной линии установлены на 30 пассаже.
Морфология клеточной линии ApnK. Адгезивная, монослойная, эпителиоподобная (см приложение к описанию фиг. 1 а, в). На фиг. 1 представлена морфология адгезивной монослойной линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши ApnK. Фиксация формальдегидом, окраска кристаллическим фиолетовым. А) увеличение ×10; В) увеличение ×40.
Культуральные свойства клеточной линии ApnK. Ростовая среда RPMI-1640 с добавлением 10% или 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и L-глутамина (2 mM). Клеточную линию ApnK в количестве 1×106 клеток ресуспендируют в 5 мл ростовой среды и засевают в культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см2. Условия инкубации: 37°C в атмосфере 5% CO2. Монослой клеток плотностью 90-100% формируется через 3-5 дней. Среднее время удвоения клеточной культуры ApnK составляет 28 часов. Без смены среды монослой стабилен не менее 19 суток. Клетки снимаются с использованием 0,25% раствора трипсина с добавлением 0,5 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Частота пересева 1-2 раза в неделю с кратностью 1:5. Для криоконсервации в жидком азоте используется среда для заморозки, состоящая из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Замораживание медленное со снижением температуры на 1°C в минуту до -80°C затем перенос в жидкий азот. Размораживание быстрое при 37°C. Размороженные клетки ресуспендируют в 5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и L-глутамина (2 mM), засевают в культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см2 и инкубируют в течение ночи при 37°C в атмосфере 5% CO2. На следующий день культуральную жидкость над монослоем заменяют на 5 мл свежей ростовой среды.
Подтверждение видовой принадлежности клеточной линии ApnK. Кариологичская характеристика: кариотип нормальный диплоидный, 2n=48 A-хромосом (см приложение к описанию, фиг. 2), присутствует 21±2 B-хромосом.
На фиг. 2 представлен кариотип A-хромосом ApnK. Метафазные пластинки приготовлены по методу A. Nagy et al. (Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. 2008. CSH Protocols; doi: 10.1101/pdb.prot4706) с окраской по Гимза. Увеличение ×1000, масляная иммерсия.
Генетическая характеристика: проанализирована первичная нуклеотидная структура двух локусов генома клеточной линии ApnK - гена цитохрома В (mtCytB) и D-петли митохондриального генома (d-loop). Последовательности депонированы в международную базу данных GenBank с номерами доступа KT983422 (mtCytB) и KT983423 (d-loop). Филогенетический анализ и анализ BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) показали что клеточная линия ApnK является линией клеток восточноазиатской лесной мыши А. peninsulae. Наиболее генетически близкие особи A. peninsulae были отловлены в Республике Бурятия (номер доступа AY588251), Приморском крае (DQ121415), Томской области (АВ073806) и Монголии (JQ664596).
Контроль контаминации. При культивировании в течение 3-х недель бактерии и грибы не обнаружены (ПНР). Микоплазмы не обнаружены (ПЦР). При исследовании в ПЦР и методом культивирования не выявлено ВКЭ, хантавирусов, морбилливирусов (в т.ч. вируса чумы плотоядных), вируса бешенства, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia sp.
Чувствительность к вирусам. Поддерживает репродукцию ВКЭ.
Пример 1. Получение линии клеток ApnK.
Цельные почки азиатской лесной мыши получали при заборе материала от грызунов для вирусологических исследований. Вид мыши определяли на основе морфологических признаков. Для приготовления суспензии клеток почек, органы гомогенизиовали с помощью фарфоровой ступки и пестика. Клетки суспендировали в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После этого суспензию центрифугировали при 1200g, удаляли супернатант и ресуспендировали в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Первичные культуры клеток инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO2 до формирования монослоя. Клеточную линию пассировали по мере формирования монослоя с разведениями 1:2-1:5.
Пример 2. Культивирование линии клеток ApnK.
Клеточную линию ApnK выращивали в культуральном флаконе с площадью рабочей поверхности 25 см2 до формирования 90% монослоя. Ростовую среду удаляли и клетки открепляли с помощью раствора трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,5 mM) в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4) при температуре 37°C. После этого суспензию клеток центрифугировали при 1200g, удаляли супернатант и ресуспендировали в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Суспензию клеток в количестве 1 мл переносили в чистый культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см2 и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO2. Клеточную линию пассировали по мере формирования монослоя с разведением 1:5.
Пример 3. Репродукция ВКЭ в клеточной линии ApnK. Линию клеток ApnK выращивали на 24-луночных планшетах в количестве 1,5×105 клеток на лунку. Культуральную жидкость удаляли, промывали монослой стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и заражали ВКЭ с множественностью инфекции 1 бляшкообразующая единица (БОЕ) на клетку. Адсорбцию проводили в течение 1 ч при 37°C. После этого, заражающую дозу убирали и тщательно отмывали несвязавшийся вирус посредством трех промывок монослоя и стенок планшеты средой RPMI 1640 без сыворотки. Затем вносили в каждую лунку 1 мл среды поддержки (RPMI1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина). Зараженные клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение двух недель. В течение первых суток культуральную жидкость собирали каждые 4 часа, после этого - один раз в 4 дня. Каждую временную точку собирали в трех независимых повторах. Содержание инфекционного ВКЭ в культуральной жидкости определяли с помощью титрования БОЕ и выражали в виде логарифма БОЕ по основанию 10 в 1 мл культуральной жидкости (lg БОЕ/мл). Нарастание количества инфекционного вируса начинается между 12 и 16 часами после заражения и достигает максимальных значений с титром 7,1 lg БОЕ/мл на 4 день инфекции. Без смены среды поддержки к 14 дню количество инфекционного вируса снижается до титра 6 lg БОЕ/мл, возможно, из-за деградации монослоя клеток вследствие истощения культуральной среды (см приложение к описанию, фиг. 3). На фиг. 3 представлена репродукция инфекционного ВКЭ в линии клеток ApnK. Приведены средние значения трех независимых повторов. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение. Обнаружено, что ВКЭ не оказывает цитопатического действия на линию клеток ApnK, через трое суток после заражения выживаемость клеток составляет 90-100% по сравнению с контролем, а через 8 суток - 80-81%. Таким образом, установлено, что клеточная линия ApnK стабильно и эффективно поддерживает репродукцию ВКЭ в течение длительного времени без гибели культуры клеток.
Пример 4. Накопление антигена ВКЭ в клеточной линии ApnK. Линию клеток ApnK выращивали на 24-луночных планшетах в количестве 1,5×105 клеток на лунку. Культуральную жидкость удаляли, промывали монослой стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и заражали ВКЭ с множественностью инфекции 1 бляшкообразующая единица (БОЕ) на клетку. Адсорбцию проводили в течение 1 ч при 37°C. После этого, заражающую дозу убирали и тщательно отмывали несвязавшийся вирус посредством трех промывок монослоя и стенок планшеты средой RPMI 1640 без сыворотки. Затем вносили в каждую лунку 1 мл среды поддержки (RPMI1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина). Зараженные клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 в течение трех недель. В течение первых суток культуральную жидкость собирали каждые 4 часа, после этого - один раз в 4 дня. Каждую временную точку собирали в трех независимых повторах. Антиген ВКЭ выявляли с помощью иммуноферментного анализа с тест-системой «Векто-ВКЭ антиген» (Вектор-бест, Новосибирск). Концентрацию антигена ВКЭ оценивали по оптической плотности реакционной смеси при длине волны 450 нм в сравнении с незараженными клетками и контрольными образцами антигена ВКЭ. Нарастание концентрации специфичного антигена начинается через 16-20 часов после заражения и достигает максимальных значений на четвертые сутки инфекции (см приложение к описанию, фиг. 4). К этому времени концентрация антигена ВКЭ превышала как концентрацию контрольных коммерческих антигенов (2,7±0,4 ОЕ), так и аналитический предел тест-системы (3,5 ОЕ). После этого концентрация оставалась стабильно высокой в течение 14 дней с тенденцией к некоторому снижению к концу третьей недели инкубации (см приложение к описанию, фиг. 4).
На фиг. 4 показано накопление антигена ВКЭ в культуральной жидкости с использованием клеточной линии ApnK. Приведены средние значения трех независимых повторов. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение.
К концу эксперимента показатели серопозитивности культуральной жидкости (3,4 ОЕ) превышали таковые контрольных образцов антигена ВКЭ (в среднем 2,45 ОЕ) в 1,5 раза. Установлено, что линия клеток ApnK позволяет накапливать антиген ВКЭ в культуральной жидкости без смены среды в течение, не менее 3-х недель.
Таким образом, предлагаемая монослойная перевиваемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae позволяет поддерживать репродукцию вируса клещевого энцефалита и накапливать вирус в культуральной жидкости в количестве 6-7,1 lg БОЕ/мл. При этом происходит выработка специфичного антигена ВКЭ в количествах, сопоставимых с коммерческими антигенами ВКЭ. Кроме того, полученную линию клеток можно использовать для изучения in vitro биологии ВКЭ в условиях близких к естественным.
Литература:
1. Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири. / Злобин В.И., Горин О.З. - Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 1996. - 177 с;
2. Балахонов С.В., Никитин А.Я., Андаев Е.И., Алленов А.В., Борисенко Е.А., Зверева Т.В., Гордейко Н.С., Краснощеков В.Н., Аделыпин Р.В., Борисова Т.Н., Вержуцкая Ю.А., Вершинин Е.А., Сидорова Е.А. Эколого-паразитологическая характеристика совмещенных очагов инфекций, передаваемых клещами, на территории проведения саммита АТ-ЭС (2012 г.) // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012. Т. 111. №4. С. 67-71
3. Mandl CW, Kroschewski Н, Allison SL, Kofler R, Holzmann H, Meixner T, Heinz FX. Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo. J Virol. 2001; 75 (12): 5627-37.
4. Воробьева M.C., Расщепкина M.H. История создания и развитие производства вакцины клещевого энцефалита в России и за рубежом. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. №11, 2007, С. 21-26
5. Stoltz et al. 2011, Eckerle et al. 2013, Tigabu B1, Juelich T, Holbrook MR. Comparative analysis of immune responses to Russian spring-summer encephalitis and Omsk hemorrhagic fever viruses in mouse models. // Virology. 2010; 408 (1): 57-63
6. Emeny JM, Morgan MJ. Regulation of the interferon system: evidence that Vero cells have a genetic defect in interferon production. J Gen Virol. 1979; 43 (1): 247-52.
7. Морозова О.В., Гришечкин А.Е., Бахвалова В.Н., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я. Динамика репродукции вируса клещевого энцефалита в культурах клеток. // Вопросы вирусологии. 2012. Т. 57. №2. С. 40-43
8. Eckerle I, Lenk М, Ulrich RG. More novel hantaviruses and diversifying reservoir hosts--time for development of reservoir-derived cell culture models? // Viruses. 2014; 6 (3): 951-67;
9. Stoltz M, 
KB, Hidmark 
, Tolf C, Vene S, Ahlm C, Lindberg AM, Lundkvist , 
J. A model system for in vitro studies of bank vole borne viruses. // PLoS One. 201 1; 6 (12): e 28992.;
10. Mourya DT, Lakra RJ, Yadav PD, Tyagi P, Raut CG, Shete AM, Singh DK. Establishment of cell line from embryonic tissue of Pipistrellus ceylonicus bat species from India & its susceptibility to different viruses. // Indian J Med Res. 2013; 138: 224-31;
11. Sheng Li Xue Bao. [Primary culture and purification of cerebral astrocyte of tree shrew]. // Acta Phys. Sinica, 201 1; 63 (1): 89-92
12. Sanada T, Seto T, Ozaki Y, Saasa N, Yoshimatsu K, Arikawa J, Yoshii K, Kariwa H. Isolation of Hokkaido virus, genus Hantavirus, using a newly established cell line derived from the kidney of the grey red-backed vole (Myodes rufocanus bedfordiae). J Gen Virol. 2012; 93 (Pt 10): 2237-46
Claims (1)
- Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов, включающий гомогенизацию почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae, затем суспендирование в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и инкубирование суспензии при 37°С в течение 1 часа, после чего суспензию центрифугируют при 1200g, удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 м кг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, затем первичные культуры клеток инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2 до формирования монослоя.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017117772A RU2688327C2 (ru) | 2017-05-22 | 2017-05-22 | Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017117772A RU2688327C2 (ru) | 2017-05-22 | 2017-05-22 | Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017117772A3 RU2017117772A3 (ru) | 2018-11-23 |
| RU2017117772A RU2017117772A (ru) | 2018-11-23 |
| RU2688327C2 true RU2688327C2 (ru) | 2019-05-21 |
Family
ID=64400944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017117772A RU2688327C2 (ru) | 2017-05-22 | 2017-05-22 | Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688327C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2402603C1 (ru) * | 2009-02-12 | 2010-10-27 | Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Me, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН |
| RU2509803C2 (ru) * | 2008-02-25 | 2014-03-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Способ получения непрерывных клеточных линий и их применение |
-
2017
- 2017-05-22 RU RU2017117772A patent/RU2688327C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2509803C2 (ru) * | 2008-02-25 | 2014-03-20 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Способ получения непрерывных клеточных линий и их применение |
| RU2402603C1 (ru) * | 2009-02-12 | 2010-10-27 | Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН | КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Me, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHRISTIAN W. MANDL et al., Adaptation of Tick-Borne Encephalitis Virus to BHK-21 Cells Results in the Formation of Multiple Heparan Sulfate Binding Sites in the Envelope Protein and Attenuation In Vivo, JOURNAL OF VIROLOGY, June 2001, Vol.75, No.12, pp.5627-5637. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017117772A3 (ru) | 2018-11-23 |
| RU2017117772A (ru) | 2018-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sunarto et al. | Isolation and characterization of koi herpesvirus (KHV) from Indonesia: identification of a new genetic lineage | |
| Fernandes et al. | Endosymbiotic relationship between animal viruses and host cells: a study of rabies virus in tissue culture | |
| KR101624089B1 (ko) | 고감염가의 파보바이러스의 생산 방법 | |
| Davies et al. | Characteristics of a Kenyan camelpox virus | |
| CN111500542B (zh) | 一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的应用 | |
| Mani et al. | Serological evidence of lyssavirus infection among bats in Nagaland, a north-eastern state in India | |
| Swaminathan et al. | Establishment of caudal fin cell lines from tropical ornamental fishes Puntius fasciatus and Pristolepis fasciata endemic to the Western Ghats of India | |
| Ma et al. | Characteristics and viral propagation properties of a new human diploid cell line, walvax-2, and its suitability as a candidate cell substrate for vaccine production | |
| Gao et al. | Key techniques for somatic embryogenesis and plant regeneration of Pinus koraiensis | |
| Li et al. | Comparison of gE/gI-and TK/gE/gI-gene-deleted pseudorabies virus vaccines mediated by CRISPR/Cas9 and Cre/Lox systems | |
| Pennington et al. | New paradigms for the study of ocular alphaherpesvirus infections: insights into the use of non-traditional host model systems | |
| CN109735499B (zh) | 新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用 | |
| Wang et al. | Establishment and characterization of a new cell line from koi brain (Cyprinus carpio L.) | |
| RU2688327C2 (ru) | Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов | |
| Justice et al. | Quantitative proteomic analysis of enriched nuclear fractions from BK polyomavirus-infected primary renal proximal tubule epithelial cells | |
| Dunnebacke et al. | Preparation and cultivation of primary human amnion cells | |
| CN114058566B (zh) | 一种鳜皮肤细胞系及其应用 | |
| ES2795040T3 (es) | Métodos para producir virus | |
| Lawal et al. | Propagation and molecular characterization of bioreactor adapted very virulent infectious bursal disease virus isolates of Malaysia | |
| Diosi et al. | Genetic control of resistance to mouse cytomegalovirus infection | |
| CN107603942B (zh) | 用于流感疫苗生产的mdck细胞株 | |
| TW200846471A (en) | Lymantria xylina cell strain | |
| CN105985446A (zh) | 可优化病毒复制的培养基 | |
| Mase et al. | Experimental assessment of the pathogenicity of H5N1 influenza A viruses isolated in Japan | |
| Razmaraii et al. | Study on propagation and adaptation of eds-76 avian adenovirus in duck and spf primary embryonic chicken cell culture comparison to duck and spf embryonated chicken eggs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20181113 |