CN105985446A

CN105985446A - 可优化病毒复制的培养基

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Publication number: CN105985446A
Application number: CN201510080767.4A
Authority: CN
Inventors: 王晓佳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN105985446B

Abstract

本发明涉及可优化病毒复制的培养基，所述培养基中含有浓度为100-1000nM的融合蛋白E，所述细胞系为过表达融合蛋白E基因的宿主细胞系。本发明提供的融合蛋白E，可提高多种病毒TCID₅₀效价1-3个lg单位，HA效价2-4个lg₂单位，包括冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒以及疱疹病毒等，且在使用剂量内无细胞毒性，突破了DNA病毒与RNA病毒之间的界限，以及病毒有无囊膜的界限。通过原核表达系统获得的融合蛋白E表达效率较高，且易于纯化，一步纯化效率可达85％以上，蛋白终浓度可达3mg/ml。通过将融合蛋白E直接加入病毒培养基中，可提升多种病毒疫苗滴度效价，简便快捷，本发明在病毒学科的产、学、研诸多方面均具有重大的影响和意义。

Description

可优化病毒复制的培养基

技术领域

本发明涉及全病毒疫苗制备领域，具体地说，涉及一种可优化病毒复制的培养基。

背景技术

全病毒疫苗(包括弱毒苗与灭活苗)在现代疫苗应用中占据相当大的比重。全病毒疫苗又被称为常规疫苗，包括灭活疫苗与减毒活疫苗。其中，人类疫苗包括腮腺炎减毒活苗、乙脑减毒苗、甲肝减毒活疫苗、狂犬弱毒苗、手足口病灭活苗、轮状病毒灭活苗、甲型肝炎灭活苗、乙脑灭活苗等。动物疫苗的使用更为普遍，同时考虑到成本与给药方便，一般常制备成多联苗，最典型的就是犬五联苗，即犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副流感五种病毒弱毒的细胞培养冻干苗(30元/支)。然而实际研发过程中，最常遇到苗毒效价低的问题，导致疫苗的成本居高不下。此外，非全病毒疫苗的疗效也并不令人满意，有时采用亚单位疫苗或基因工程疫苗免疫后，仍无法控制疾病的发生发展，加之许多新发病的病原致病机理不甚清楚，因此最直接有效的方法就是同时免疫弱毒疫苗或灭活苗，可获得稳定可靠的免疫效果。这些现状促使研究者持续重视开发减毒活疫苗或灭活苗，并认为如果不存在严重不良反应，全病毒疫苗仍为首选，当然，考虑到致病表型逆转的风险，对其安全性的要求更加严格。

此外，许多病毒学实验室经常遇到的技术瓶颈是，很多病毒(如肠道病毒以及某些新发现病毒)很难甚至根本无法在常用细胞系内增殖，以至于很多病毒学试验无法跟进，也因此直接影响后续研究。因此，如何不通过遗传改造法，提高病毒复制力，是病毒学科领域面临的重大挑战之一。

目前全病毒疫苗制备领域也面临相似的难题，很多疫苗用毒株效价不高，这直接影响着疫苗的效果与价格。国内外一些研究小组尝试在病毒培养过程中通过多次换液以降低细胞对病毒的防御影响(如干扰素浓度)；还有研究者尝试将不同细胞系的贴壁细胞改良成悬浮细胞，以通过增加单位体积的细胞密度，提升细胞增殖病毒的效价滴度。这些方案一定程度上提高了病毒的效价滴度，然而皆属于外部因素的改造，而且操作繁琐，并没有通过深入了解病毒复制的宿主因素，从根本上发现并开发有利于病毒复制的可利用细胞内资源。

细胞核仁蛋白P60，是胶质瘤抑癌候选基因2(Glioma tumorsuppressor candidate region gene 2,GLTSCR2)编码蛋白，可调节肿瘤抑制因子P53与PTEN的稳定性，在肿瘤学领域，P60拥有“肿瘤抑制因子”及“抑制癌症的路障”双重身份。P60独特的生化特性与复杂功能使之迅速成为科研热点，但是在病毒学领域，鲜见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可优化病毒复制的培养基。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种新型的融合蛋白E，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

研究发现，P60蛋白(如Seq ID No.3所示的氨基酸序列)可提高6科类不同病毒TCID₅₀效价2-3个lg单位，包括冠状病毒(如传染性支气管炎病毒)、副粘病毒(如犬瘟热与新城疫病毒)、正粘病毒(如禽流感病毒)以及疱疹病毒(人单纯疱疹病毒-1和马立克病毒)。但P60的细胞毒性限制其直接应用。进一步研究发现，P60蛋白不同片段的功能差异显著。本发明是在P60蛋白的研究基础上，通过筛选其关键作用域，构建融合蛋白以制备出稳定的可提升多种不同科类病毒苗毒效价滴度的培养基，同时构建过表达所述蛋白的稳定细胞系。蛋白毒性实验结果表明，P60全蛋白可诱导显著的细胞凋亡，且细胞毒性较明显，而融合蛋白E在100μM浓度以下对细胞无毒性作用。

应当注意的是，本领域技术人员知晓，当将本发明所述的Seq IDNo.1所示的氨基酸序列中的6个His标签去掉后获得的蛋白具有与SeqID No.1所示的氨基酸序列同等的生物学功能，因此同样属于本发明的保护范围。

本发明还提供编码所述融合蛋白E的基因，所述基因具如Seq IDNo.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白E基因的载体。

本发明融合蛋白E的制备方法包括以下步骤：

1)基因克隆：以胶质瘤抑癌候选基因2(GenBank:KJ898763.1)为模板，设计引物进行目的基因的亚克隆；其中，上游引物：5'-CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'(Seq ID No.4所示的氨基酸序列)，下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'(Seq ID No.5所示的氨基酸序列)；

2)载体构建：将pET-28a载体用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切，将步骤1)获得的目的基因同样用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切后与载体连接，得到含有目的基因的重组载体pET-E；

3)细胞转化与表达：用重组载体pET-E转化BL21(DE3)，37℃摇床培养至OD₅₉₀为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4h获得诱导后的菌体；

4)蛋白纯化：诱导后的菌体经5000r/min离心15min，超声裂解菌体后离心取上清，将上清通过经PBS平衡的镍亲和层析柱，再用20mM咪唑洗涤层析柱10个柱体积，然后用3个柱体积的250mM咪唑洗脱液洗脱，得到含有6个His标签的融合蛋白溶液。然后用截流分子量为10KD的蛋白超滤管进行浓缩，得到纯化的融合蛋白E。其中，20mM咪唑的配方为：50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl，20mM咪唑；250mM咪唑洗脱液的配方为：50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,250mM咪唑。

本发明还提供所述融合蛋白E在制备灭活疫苗和/或减毒活疫苗以及病毒复制中的应用。

前述的应用，其是通过在宿主细胞中过表达编码所述融合蛋白E的基因，并用病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株接种宿主细胞，培养细胞，收获病毒液。

前述的应用，其是通过向用于制备病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗的宿主细胞培养液，或鸡胚培养液中添加融合蛋白E，使宿主细胞培养液或鸡胚培养液中融合蛋白E的浓度为100-1000nM，然后接种病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株，培养后收获病毒液。

本发明涉及的病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株包括但不限于冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、呼肠孤病毒科以及疱疹病毒科。例如，禽流感病毒AIV、传染性支气管炎病毒IBV、犬瘟热CDV、新城疫病毒NDV、人单纯疱疹病毒HSV-1、马立克病毒MDV、肠道病毒EV71等。

本发明还提供一种可优化病毒复制的培养基，所述培养基中含有浓度为100-1000nM的融合蛋白E。

可选的，所述培养基为含有融合蛋白E的DMEM培养基。例如，所述培养基可以是将所述融合蛋白E加入含有2-5％血清的DMEM培养基中制备获得的。

本发明所述的培养基中还可以含有本领域在生产病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗时常用的添加物。

本发明还提供一种可优化病毒复制的细胞系，所述细胞系为过表达编码融合蛋白E基因的宿主细胞系。

本发明提供的融合蛋白E，可提高多种病毒TCID₅₀效价1-3个lg单位，HA效价2-4个lg₂单位，包括冠状病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒以及疱疹病毒，且在使用剂量内无细胞毒性，突破了DNA与RNA病毒的界限。原核系统表达的蛋白表达效率较高，且易于纯化，纯化效率达85％以上，蛋白终浓度可达到3mg/ml。通过将融合蛋白E直接加入病毒培养基中，可提升多种病毒疫苗滴度效价，简便快捷。根据每提升疫苗毒1个lg单位，即可提高利润1-5千万/病毒来计算，多种病毒疫苗滴度效价的提升将带来可观的经济效益，且本发明在病毒学科的产、学、研等诸多方面均具有重大的影响和意义。

附图说明

图1为P60蛋白预测分析的三级结构图；其中，A、B、C与E片段分别是P60蛋白上的一部分。

图2为本发明实施例4中采用western-blot法检测宿主细胞中过表达的蛋白；其中，从左至右，未感染Hep-2细胞、过表达对照pEGFP-N1质粒后感染病毒，过表达pEGFP-p60质粒后感染病毒，过表达对照pEGFP-A质粒后感染病毒，过表达GFP-B质粒后感染病毒，过表达对照pEGFP-C质粒后感染病毒，过表达pEGFP-E质粒后感染病毒；其中，所用质粒10μg，过表达时间为40小时，感染时间为48小时，10个TCID₅₀。ICP0/ICP8为HSV-1的病毒蛋白表达检测抗体，CDV-N为CDV的检测抗体；可见，C与E片段过表达显著有利于病毒复制，其中E效果最显著。

图3为本发明实施例4中采用western-blot法检测原核蛋白的表达结果；其中，图3A从左至右，Vero细胞感染CDV，10个TCID₅₀，同时加入不同量的融合蛋白E(100μg，50μg，25μg)，2小时后洗细胞，并换成5％DMEM培养基，48小时后进行免疫印迹分析(采用病毒N抗体)，可见融合蛋白E两个剂量对CDV病毒复制均有显著促进作用；图3B，mock，Vero细胞感染CDV，10个TCID₅₀；洗，表示感染细胞加入50μg的融合蛋白E，2小时后用PBS洗细胞3次，换成5％DMEM培养基；不洗，表示病毒感染细胞1.5小时后，加入含有50μg融合蛋白E的5％DMEM培养液，继续培养48小时，然后进行免疫印迹分析，可见不洗效果更显著；图3C，原核表达且纯化的pET-E，可见纯度超过85％，分子量约30kDa；图3D从左至右，Hep-2细胞感染HSV，10个TCID₅₀，病毒感染细胞1.5小时后，加入含有不同量的融合蛋白E(100μg，50μg，25μg)的5％DMEM培养基，48小时后进行免疫印迹分析(采用两种病毒抗体同时检测，即ICP0/ICP8)，可见融合蛋白E 50μg对HSV病毒复制促进作用显著，而25μg效果不明显；图3E，从左至右，Vero细胞感染NDV，10个TCID₅₀，病毒感染细胞1.5小时后，加入含有不同量的融合蛋白E(100μg，50μg，25μg)的5％DMEM培养基，48小时后进行免疫印迹分析(采用病毒NP抗体)，可见融合蛋白E 50μg对NDV病毒复制促进作用显著，而25μg效果不明显。本发明中均采用1PD细胞瓶，培养液为4-5mL。

图4为本发明实施例4中Hep-2细胞过表达pEGFP-N1、pEGFP-p60、pEGFP-C、pEGFP-E质粒后感染CDV、MDV、IBV病毒，然后采用RT-PCR法测病毒基因的转录水平；可见差异，*p<0.05；差异显著，**p<0.01，其中E相较于C有显著优势。

图5A为本发明实施例4中采用的细胞病变法，EV71攻毒量为1个TCID₅₀，试验时预先将42μL病毒加入到16mL DMEM中。先将六孔板中液体吸出，再用1mL/孔的DMEM洗涤细胞一次，每孔分别加入2mL预先配好的含病毒DMEM，放入37℃温箱进行培养。2h后换液，吸出液体后，再加入相应含量蛋白E，从a至f分别为0、6、12、24、48、98μL，每孔最后分别加入DMEM至总体积2mL，24h后进行镜下观察。结果可见病变率在加入24μL蛋白时病变率提升到71％，在加入48μL蛋白时病变率提升到83％。右侧3个图为仅加蛋白的结果，可见48μL蛋白本身并没有引起特征性的细胞病变。

图5B将Vero细胞感染CDV，10个TCID50，同时加入不同量的蛋白E(0,12,24,48μL)，感染8小时后PBS洗3遍，加4％的甲醛固定后，用CDV小鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotech，sc-66014)孵育60min，用PBS洗3遍，加入Rhodamine Red-x标记的山羊抗鼠的二抗(Beyotime，A0277)孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫荧光显微镜568nm波长下，通过观察记录病毒荧光，进行毒力测定。结果可见病毒感染的细胞数量在加入48μL蛋白时显著增多。右侧3个图为仅加蛋白的结果，可见48μL蛋白本身并没有引起特征性的细胞病变。

图6为本发明实施例4中采用的细胞病变法，将蛋白p60-E(50μg/5mL)与对照(N1)加入不同MOI的HSV(0.1、1、10)，感染不同时间后分别收集培养液(图6A)与细胞沉淀(图6B)，可见蛋白E的加入在感染48h时相差3个Ig值，但是在72h时有缩小趋势，相差约2个Ig值。图6C为加入蛋白24h后收集细胞沉淀的免疫印迹结果。图6D为病毒用量0.01MOI，左侧为仅加病毒，右侧为病毒加蛋白E。可见病毒在高稀释度下，蛋白E的加入仍可提升1-2个Ig值。

图7为本发明实施例8中采用的蛋白E稳定表达细胞系的构建，将HSV与NDV病毒感染Hep-2细胞或稳定细胞系Hep-2E(含有Flag标签)，10TCID₅₀，培养12、24、48小时后，进行免疫印迹分析，所用病毒蛋白抗体分别为HSV-ICP8与NDV-NP。可见不同感染时间下，稳定细胞系培养病毒的复制力优于母体Hep-2细胞。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的AIV病毒毒株为H9N2；NDV毒株为F48E9；IBV毒株为H52；CDV为标准毒株Snyder Hill；HSV-1为标准毒株F；MDV毒株为RB1B。

以下实施例中涉及的常规试验：

1、细胞的制备

进行Hep-2和Vero细胞传代时使用含有5％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液，维持液用含有2％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液。

原代鸡胚成纤维(CEF)细胞：9-10日龄鸡胚购自北京梅里亚公司，产品目录号为“SPF鸡胚”。将9-10日龄鸡胚取出后仔细将头尾、骨头与脂肪组织剔除，余下部分用PBS洗涤3遍后尽量剪成小块，加0.25％胰酶消化30分钟，PBS洗涤3遍后加入70ml培养液(含有5％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液，维持液用含有2％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液)，大力冲洗出成纤维细胞，含有细胞的培养液过三层纱布，以5ml/瓶或200μl/24孔板分装，37℃细胞培养24小时后(覆盖率达80％以上)即可进行下一步实验。

人肠道病毒EV71使用人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞RD，其形态特性为梭型和大的多核细胞，贴壁生长，使用10％FBS的DMEM培养，1:2～1:4传代，3～4天换液1次。

HSV与NDV感染Hep-2细胞，AIV感染vero细胞，CDV、MDV和IBV感染CEF细胞，EV71感染RD细胞。此外，细胞培养液购自北京迈晨公司，产品目录号为CM15019。

2、病毒的增殖

HSV、NDV、AIV、EV71与CDV细胞毒的增殖：按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变(如NDV形成大合胞体)达75％(一般为48小时)采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-20℃冻存2小时后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-20℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，分别于-20℃和-70℃冻存。

细胞依赖性的MDV病毒的增殖：其增殖与保存不同之处在于，不采用反复冻融法收获病毒，即将液氮保存的病毒放置冰上缓慢融化，然后按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变达75％时(一般为48～72小时)，0.25％胰酶消化使贴壁细胞脱壁，再次放入液氮中冻存。

NDV鸡胚毒的增殖：9-10日龄鸡胚经尿囊腔接种NDV病毒原液，鸡胚死亡后收集尿囊液测定血凝效价，观察鸡胚病变及记录死亡时间。结果，鸡胚呈现全身出血性病变。病毒引致鸡胚病变表征为出血，肉眼即可观察并区分正常与感染状况。

IBV鸡胚毒的增殖：9-10日龄鸡胚经尿囊腔每胚接种10⁴个TCID₅₀的病毒原液，接种鸡胚140小时后收集尿囊液，-20℃或-70℃冻存保存，IBV感染鸡胚不死亡，但是鸡胚明显形体较小(侏儒胚)。

3、病毒效价滴度的测定方法

细胞病变(cytopathic effect，CPE)为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。病变融合率为病变细胞占所有细胞的比率。

毒力测定：将细胞毒倍比稀释得到细胞毒悬液，用96孔板培养CEF细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液50μL/孔(包括HSV、NDV、MDV、EV71与AIV)，做12个稀释度及8个重复，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，或记录病变融合率(病变融合率即病变细胞占所有细胞的比率)，重复3次。间接免疫荧光：将攻毒CDV培养5天的CFE细胞培养基吸弃，用PBS洗3遍后，加4％的甲醛固定后，用CDV小鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotech，sc-66014)孵育60min，用PBS洗3遍，加入Rhodamine Red-x标记的山羊抗鼠的二抗(Beyotime，A0277)孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫荧光显微镜568nm波长下，通过观察记录病毒荧光，进行毒力测定。

TCID₅₀计算方法：制备96孔板单层细胞，将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复3孔，每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，计算比距，获得TCID₅₀结果。计算公式为：(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)＝比距；比距与接近50％病变率的病毒的稀释度的指数相加，即得指数。例如，比色计算或显微镜观察病毒的TCID₅₀在10^-7～10^-8之间，那么，指数-8与比距相加，即获得新的指数，就是TCID₅₀的指数。

IBV毒力测定：9-10日龄鸡胚经尿囊腔接种病毒溶液，10倍比稀释，测定IBV鸡胚半数感染量EID₅₀，计算得出IBV的EID₅₀＝10^6.5/ml。以下实施例中每只鸡胚接种10个EID₅₀单位病毒液，接种鸡胚72小时后收集尿囊液，观察鸡胚病变。结果表明，鸡胚呈现鸡胚形体变小的病变状态(身体主干部分长度约为正常对照鸡胚体积的2/3)，考虑到实际生产中病毒常高滴度感染的状况，此后实验皆采用此病毒稀释度。

血凝(HA)试验：NDV与AIV病毒或病毒的血凝素，能够选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验(HA)。在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水，于左侧第1孔加50μL病毒液(尿囊液或感染细胞冻融液)，混合均匀后，吸50μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。自右至左依次向各孔加入0.5％鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温下静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100％凝集(++++)，不凝集(-)红细胞沉于孔底呈点状。以100％凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。

实施例1 几种病毒的细胞半数感染量与鸡胚半数感染量

HSV与NDV感染Hep-2细胞，AIV感染vero细胞。CDV、MDV和IBV感染CEF细胞。EV71感染RD细胞。

取9-10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞(CEF)，将CDV、MDV和IBV接种到CEF上培养48h，收获细胞和培养上清反复冻融3次，再次接种到CEF细胞上继续培养，如此传代至3代。将病毒液10倍比稀释，接种细胞96孔板或鸡胚。病毒测细胞半数感染量(TCID₅₀)，其中MDV用细胞病变痘斑的形成测TCID₅₀，此外IBV用鸡胚半数感染量EID₅₀，确定病毒的毒力。

计算得出NDV的TCID₅₀＝2×10⁹/ml，HSV-1的TCID₅₀＝10^8.1/ml，CDV的TCID₅₀＝TCID₅₀＝10^5.38/ml，MDV的TCID₅₀＝10^4.70/ml，EV71的TCID₅₀＝10^2.5/ml，AIV的TCID₅₀＝10^5.4/ml。本实施例中采用的各种病毒均为10TCID₅₀，仅EV71为1个TCID₅₀。

实施例2 蛋白A、B、C、E的过表达

细胞转染：待CEF、Hep-2或Vero细胞的细胞密度达到80％，按照lipofectamine 2000说明书，将真核表达质粒pEGFP-E及载体pEGFP-N1分别转染上述细胞，每种质粒均10μg，过表达40h。

pEGFP-E质粒的构建方法为：以胶质瘤抑癌候选基因2为模板，设计上、下游引物，分别为5'-GAATTCTTTGAAGACCACCAG-3(SeqID No.6所示的核苷酸序列)'和5'-GGATCCTCACAACTGGATCTC-3'(Seq ID No.7所示的核苷酸序列)，进行PCR扩增，将PCR扩增产物分别加上酶切位点EcoRI与BamHI；同时选用可稳定表达GFP的载体pEGFP-N1，在EGFP上游选择酶切位点EcoRI与BamHI。将蛋白E编码基因与载体分别双酶切后连接，构建得到pEGFP-E质粒(如图2所示)。

病毒接种：转染后细胞分别感染病毒，每种病毒均10TCID₅₀，培养不同时间。

质粒pEGFP-A、pEGFP-B、pEGFP-C的构建方法同pEGFP-E。

其中，蛋白A、B、C、E分别对应于P60蛋白第1-60位氨基酸、第70-120位氨基酸、第130-230位氨基酸、第250-478位氨基酸(如图1所示)。P60蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.3所示。

实施例3 融合蛋白E基因的原核表达及纯化

1)基因克隆：以胶质瘤抑癌候选基因2为模板，设计引物进行目的基因的亚克隆。其中，

上游引物：5'-CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'，

下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'。

2)载体构建：将pET-28a载体用限制性内切酶NdeI/EcoRI酶切，将1)中获得的目的基因同样双酶切后与载体连接，得到含有目的基因的重组载体pET-E。进行酶切和测序验证，证明重组载体中目的基因的插入方向和插入序列均正确。常规方法构建的pET-E原核表达质粒中，目标蛋白末端加终止密码子tga序列，酶切位点NdeI与EcoRI。

3)细胞转化与表达：将阳性重组载体pET-E转化BL21(DE3)，37℃摇振培养至OD₅₉₀为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4h。

4)蛋白纯化：诱导后的菌体经5000r/min离心15min，超声裂解菌体后离心取上清，将上清通过经PBS平衡的镍亲和层析柱，再用20mM咪唑洗涤层析柱10个柱体积，然后用3个柱体积的250mM咪唑洗脱液洗脱，得到含有6个His标签的融合蛋白溶液。然后用截流分子量为10kDa的蛋白超滤管进行浓缩，得到纯化的融合蛋白E，终浓度为3mg/mL。其中，20mM咪唑的配方为：50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl，20mM咪唑；250mM咪唑洗脱液的配方为：50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,250mM咪唑。

实施例4 免疫印迹法、细胞病变法与RT-PCR法研究融合蛋白E对病毒毒力的影响

免疫印迹：利用实施例2与3中过表达或原核表达纯化蛋白处理，感染的细胞用预冷的pH7.5 PBS洗涤3遍后，刮下细胞，超声裂解提取细胞总蛋白3-5秒后，与6×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，电泳后将凝胶上的蛋白通过电转膜仪转移到PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液室温封闭lh，加一抗4℃摇动孵育2h。用PBST洗膜4次，每次5min，1：8000稀释HRP标记的相应二抗室温摇动孵育1h，洗膜4次，每次5min，最后用SuperSignalWest Pico Chemilumineseent HRP Substrate ECL显色，并用柯达医用胶片爆光，最后显影定影进行观察。其中病毒蛋白抗体均购自圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)。含Rhodamine Red-x荧光山羊抗小鼠lgG二抗与其他二抗均购自北京康为世纪生物科技有限公司。所用病毒蛋白抗体，包括ICP8、ICP0、NDV-NP、CDV-N抗体以及actin抗体，均为1:1000稀释。可见过表达则可优化病毒的复制。过表达试验结果如图2所示，原核蛋白表达的实验结果如图3所示。

用实施例3中原核表达纯化蛋白处理细胞，并分别收集感染病毒的细胞样品，其中MDV用0.25％的胰酶消化，其他病毒感染细胞采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-20℃冻存2小时后放置室温至部分融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-20℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来。所有样品如果暂时不用，需在-70℃或液氮中冻存。然后进行以下细胞病变分析实验。

实时定量RT-PCR：分别收集实施例2中过表达后感染的细胞样品，按照Trizol裂解液说明书提取总RNA。用特异性下游引物作为反转录引物进行cDNA的合成。用SYBR Green I染料法进行实时定量PCR扩增。20μL总反应体系：10μL 2×SYBR Green I PCR mix，上、下游引物各0.4μL(10μM)，补水至总体积20μL。Real-Time PCR System(ViiA 7)设定反应程序：95℃预变性5min；变性95℃ 10s，60℃退火和延伸45s，设定40个循环，最后进行熔解曲线分析。采取2^-△△CT，对目标基因进行相对定量，β-actin选为内参基因。细胞接种病毒并转染融合蛋白E基因，在接毒后不同时间收细胞，提取细胞中总RNA，反转录成cDNA，采用SYBR Green I染料在ViiAA 7荧光定量PCR仪上进行qPCR检测，用2^-△△CT法计算不同处理组间病毒mRNA表达水平的差异。用GraphPad prism5进行绘图。将每个时间点的N1处理都标准化为1，可见差异明显。结果如图4所示。

引物的设计：根据GenBank中已发表的病毒蛋白基因序列，如CDV-N蛋白、MDV-meq蛋白、IBV-N蛋白序列，采用分子生物学软件DNAStar进行核苷酸同源性分析，选择病毒复制相关的基因保守序列作为PCR扩增的靶序列。遵循荧光PCR引物设计原则，用Primer 5.0软件分别设计引物(表1引物序列信息)。

表1

细胞病变分析：将HSV与NDV感染的Hep-2细胞，AIV感染vero细胞，EV71感染RD细胞、MDV感染CEF细胞的样品，进行倍比稀释得到细胞毒悬液，用96孔板培养CEF细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液50μL/孔(包括HSV、NDV、EV71、MDV与AIV)，做12个稀释度及8个重复，于37℃二氧化碳培养箱中放置48小时后观察细胞病变，并计算TCID₅₀(形成细胞病变的病毒滴度)，重复3次。此外，免疫荧光分析：CDV感染的CFE细胞培养基吸弃，用PBS洗3遍后，加4％的甲醛固定后，用CDV小鼠单克隆抗体孵育60min，用PBS洗3遍，加入Rhodamine Red-x标记的山羊抗鼠的二抗孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫荧光显微镜568nm波长下，通过观察记录病毒荧光，以进行毒力测定并计算TCID₅₀。可见融合蛋白E与阴性对照(载体pEGFP-N1)差别在1-3个lg之间，差异明显。结果见表2(不同病毒处理与未处理E后的TCID₅₀比较)，其中--代表仅加病毒，E代表感染细胞加入融合蛋白E(终浓度为1μg/mL)。EV71与CDV的病变结果如图5所示，HSV-1不同感染时间的病毒滴度结果如图6所示。

表2

TCID₅₀	--(Ig)	E处理(Ig)	t test
				CDV	5.58	6.66	*p<0.05
NDV	7.6	10.01	**p<0.01
				HSV	6.29	7.55	*p<0.05
EV71	2.5	3.66	*p<0.05
				AIV	5.2	7.1	**p<0.01

实施例5 血凝试验研究蛋白E对病毒毒力的影响

将NDV病毒感染Vero细胞(10TCID₅₀)，96孔板；不洗涤，即病毒感染细胞1.5小时后，PBS洗细胞3次，换上含有融合蛋白E的5％DMEM培养液150μL，继续培养48小时；洗涤，即感染细胞同时加各蛋白，2小时后用PBS洗细胞3次，更换成5％DMEM培养基150μL，继续培养48小时；-20℃冰箱反复冻融3次，测培养液上清的HA。其中，蛋白加入10μg，5μg，2.5μg，1μg，0.5μg，作用48小时后，可见不洗涤组0.5-5μg之间的融合蛋白E对病毒复制促进效果最好，表明蛋白E可以直接加入培养基到收毒，这使应用更为简便(表3NDV的血凝(HA)试验结果)。表3中C、A分别表示C与A蛋白，可见这两种蛋白的促病毒复制活性有限。

表3

将AIV病毒感染Vero细胞(10TCID₅₀，或1MOI)，96孔板，感染细胞1.5小时后，PBS洗细胞3次，更换成含有E蛋白(10μg，5μg，2.5μg，1μg，0.5μg)的5％DMEM培养液150μL，继续培养72小时后直接收集上清进行HA试验，其中，DMEM培养液中分别加入融合蛋白E：。可见1-5μg之间的融合蛋白E对病毒HA效价影响约3个数量级。结果见表4，AIV的血凝(HA)试验结果。血凝试验皆为平行试验3次的平均结果。

表4

融合蛋白E	10TCID₅₀
		AIV	1:2⁷
+10	1:2⁹
		+5	1:2⁹
+2.5	1:2¹⁰
		+1	1:2¹⁰
+0.5	1:2⁸
		空白	-

实施例6 鸡胚实验研究融合蛋白E对病毒毒力的影响

鸡胚接种IBV病毒(10个EID₅₀)，NDV与AIV为10TCID₅₀，并添加融合蛋白E 200μg，100μg，50μg，浓度为1mg/mL，48-96小时后收集尿囊液，同时观察鸡胚病变。结果发现，融合蛋白E用量为100μg时，鸡胚可存活120小时以上，但浓度超过150μg时，对鸡胚毒性明显，鸡胚仅能存活24小时；鸡胚加入致死性病毒(NDV与AIV)，融合蛋白E加入100μg时，鸡胚仅能存活24小时，加入10μg时，鸡胚能存活76小时，且HA效价提升2³倍；鸡胚加入非致死性病毒(IBV)，融合蛋白E加入10μg时，鸡胚能存活76小时以上，加融合蛋白E的鸡胚侏儒病变更明显。

实施例7 融合蛋白E的细胞毒性实验

采用lactate dehydrogenase(LDH)实验研究多肽或蛋白对细胞是否有毒性，利用购自Roche公司的毒性检测试剂盒完成。向培养至单层的CEF细胞中分别加入以下终浓度的融合蛋白E：5μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1.0mM，并轻轻混合均匀，24小时后按照试剂盒说明书测定毒性指数。实验重复三次。结果显示，融合蛋白E在100μM浓度及以下对细胞均无毒性作用。

实施例8 蛋白E稳定表达细胞系的构建与验证

1、载体准备与重组慢病毒的产生

1)基因片段(flag标签+E基因)亚克隆入商业化的慢病毒载体Lenti-Puro；2)将下述Tube1与Tube2的混合物加入培养的HEK-293T细胞中。轻轻地反复混匀之后在37℃下孵化。Tube1：慢病毒表达载体、gag/pol载体、VSVG载体，三者的混合物；Tube2：聚醚酰亚胺；3)转染6h后，用完全生长液取代转染时的培养液，37℃孵育48h；4)转染24h后，收集含有重组病毒的培养液，将其储存于制冷的条件下；5)转染48h后收集病毒培养液，并用0.45μm过滤器过滤；6)将过滤的上清液装入贝克曼清除管中，并用PBS平衡，19400r，4℃离心90min；7)将上清液倒入含有10％漂白剂的容器中，用500μlPBS重悬病毒，并且放于冰上过夜。

2、重组细胞的选择(用嘌呤霉素去除非重组细胞)

为了能产生充分转导的细胞群，滴定实验旨在检测挑选72h后能杀死100％未转导Hep-2细胞的嘌呤霉素的最小浓度。1)Hep-2细胞接种于24孔板上，1x10⁵/孔，5％CO₂，37℃过夜培养；2)准备培养液，其中嘌呤霉素的浓度依次是0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12μg/ml；3)用含嘌呤霉素的培养液取代旧的培养液，继续培养，而且每隔一天用新鲜的选择性培养液进行换液；4)用能在72h将所有细胞杀死的最低浓度的嘌呤霉素来挑选转导的细胞。

3、重组慢病毒在Hep-2细胞的转导

1)转导前12h，用完全生长培养基于24孔板上培养Hep-2细胞；2)加入5个MOI的重组慢病毒，在聚凝胺(4μg/ml)条件下，孵育24h；3)用新鲜的完全培养基培养24h；4)换液，用含0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基，挑选4天直到未转导的细胞被全部杀死；5)一次或两次筛选后，将死细胞移除，收集稳定存在的转导的细胞。

功能验证：将HSV与NDV病毒感染Hep-2细胞或稳定细胞系Hep-2E(含有Flag标签)，10TCID₅₀，培养12,24,48小时，用预冷的pH7.5PBS洗涤3遍后，刮下细胞，超声裂解提取细胞总蛋白3-5秒后，与6×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸10min，进行免疫印迹分析，所用病毒蛋白抗体分别为HSV-ICP8与NDV-NP。可见不同感染时间下，稳定细胞系培养病毒的复制力优于母体Hep-2细胞。结果如图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.融合蛋白E，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述融合蛋白E的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.权利要求1所述融合蛋白E的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)基因克隆：以胶质瘤抑癌候选基因2为模板，设计引物进行目的基因的亚克隆；其中，

上游引物：5'-CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'，

下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'；

2)载体构建：将pET-28载体用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切，将步骤1)获得的目的基因同样用限制性内切酶NdeI/EcoRI进行双酶切后与载体连接，得到含有目的基因的重组载体pET-E；

3)细胞转化与表达：用重组载体pET-E转化BL21，37℃摇床培养至OD₅₉₀为0.8-1.0，加诱导物IPTG至终浓度1mM，37℃继续培养4h获得诱导后的菌体；

4)蛋白纯化：诱导后的菌体经5000r/min离心15min，超声裂解菌体后离心取上清，将上清通过经PBS平衡的镍亲和层析柱，再用20mM咪唑洗涤层析柱10个柱体积，然后用3个柱体积的250mM咪唑洗脱液洗脱，得到含有6个His标签的融合蛋白溶液。然后用截流分子量为10KD的蛋白超滤管进行浓缩，得到纯化的融合蛋白E。

5.权利要求1所述融合蛋白E在制备灭活疫苗和/或减毒活疫苗以及病毒复制中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在宿主细胞中过表达编码权利要求1所述融合蛋白E的基因，并用病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗毒株接种宿主细胞，培养细胞，收获病毒液。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，向用于制备病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗的宿主细胞培养液或鸡胚培养液中添加融合蛋白E，使宿主细胞培养液或鸡胚培养液中融合蛋白E的浓度为100-1000nM，然后接种病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株，培养后收获病毒液。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述病毒、灭活疫苗和/或减毒活疫苗生产用毒株包括冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、呼肠孤病毒科以及疱疹病毒科。

9.一种可优化病毒复制的培养基，其特征在于，所述培养基中含有浓度为100-1000nM的权利要求1所述融合蛋白E。

10.一种可优化病毒复制的细胞系，其特征在于，所述细胞系为过表达权利要求2所述基因的宿主细胞系。