CN107603942B - 用于流感疫苗生产的mdck细胞株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于流感疫苗生产的MDCK细胞株。所述的细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201773，本发明还涉及所述的MDCK‑G1细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒优选为H5N1病毒，所述的疫苗包括减毒活疫苗或灭活疫苗，优选为灭活疫苗。

Description

用于流感疫苗生产的MDCK细胞株

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种用于流感疫苗生产的MDCK细胞株。

背景技术

目前我国上市的流感疫苗均为以传统鸡胚为基质生产而来，由于鸡胚生产的流感疫苗， 存在着生产周期长、传代中毒株易变异、过程控制中存在较大安全隐患、禽流感大规模爆发 时不能及时满足疫苗供应等现状。基于这些不足，WHO早在1995年就建议研发以哺乳动物 细胞作为基质代替传统的鸡胚来生产流感疫苗[1]。目前MDCK细胞(犬肾细胞)[2]、PER.C6 细胞(人胚胎视网膜母细胞)[3]和Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)[4]等均在用于流感疫苗的 生产研究。由于流感在MDCK细胞中传代变异小、病毒滴度高、MDCK细胞可建库易于生 物反应器系统放大培养等优势，因此MDCK成为细胞基质流感疫苗的首选基质。VRBPAC(Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee)更进一步在2005年和2008 年专题讨论以MDCK细胞为细胞基质生产灭活流感疫苗和减毒流感疫苗[5]。

MDCK细胞(Madin-Darby canine kidney cells)是正常犬肾来源的传代细胞[6]。1958年 Madin和Darby从健康成年母犬(Cocker Spaniel)的肾脏组织中分离培养建立，后经转化而 形成传代细胞系。目前用于研究的MDCK细胞多数来源于ATCC,但是原始MDCK细胞株在 培养过程中发现其形态、增殖速率以及核型上出现很大差异。对此，很多实验室通过克隆筛 选亚细胞株来满足不同的目的，其中诺华和MeddImmune就通过克隆筛选得到了拥有自主知 识产权且适宜于生产流感疫苗的细胞株，目前二者的细胞基质流感疫苗已经在欧美上市[7,8]。 目前国内还没有MDCK细胞基质流感疫苗申报。

接种流感疫苗是预防和控制流感大流行的有效方法。目前上市的流感疫苗有全病毒灭活 疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗及减毒活疫苗四种类型，这四种疫苗中绝大多数疫苗是以鸡胚 为培养基质，尽管传统的鸡胚基质疫苗在流感控制方面起到重要作用，但其潜在的缺点也一 直成为限制流感疫苗产能扩大、品质提高和应急生产的瓶颈。鉴于此，1995年WHO建议各 流感疫苗生产企业使用哺乳动物细胞培养流感病毒来代替鸡胚培养以快速制备流感疫苗，使 其抗原性更接近自然流行株，减少宿主蛋白成分，降低接种对象的不良反应。目前在国外已 经有以MDCK细胞为基质的流感疫苗上市。

参考文献：

1.Cell culture as a substrate for the production of influenzavaccines:memorandum from a WHO meeting.Bull World Health Organ 1995,74(4):431-435.

2.Sun B,Yu X,Kong W,Sun S,Yang P,Zhu C,Zhang H,Wu Y,Chen Y,Shi Y etal: Production of influenza H1N1vaccine from MDCK cells using a noveldisposable packed-bed bioreactor.Applied microbiology and biotechnology 2013,97(3):1063-1070.

3.Koudstaal W,Hartgroves L,Havenga M,Legastelois I,Ophorst C,Sieuwerts M, Zuijdgeest D,Vogels R,Custers J,de Boer-Luijtze E et al:Suitability of PER.C6cells to generate epidemic and pandemic influenzavaccine strains by reverse genetics.Vaccine 2009, 27(19):2588-2593.

4.Montomoli E,Khadang B,Piccirella S,Trombetta C,Mennitto E,Manini I,Stanzani V, Lapini G:Cell culture-derived influenza vaccines from Vero cells:a new horizon for vaccine production.Expert review of vaccines 2012,11(5):587-594.

5.United States.Department of Health and Human Services.:Vaccines andRelated Biological Products Advisory Committee.

6.Madin SH,Darby NB,Jr.:Established kidney cell lines of normal adultbovine and ovine origin.Proc Soc Exp Biol Med 1958,98(3):574-576.

7.Gregersen JP,Schmitt HJ,Trusheim H,Broker M:Safety of MDCK cellculture-based influenza vaccines.Future microbiology 2011,6(2):143-152.

8.Liu J,Mani S,Schwartz R,Richman L,Tabor DE:Cloning and assessmentof tumorigenicity and oncogenicity of a Madin-Darby canine kidney(MDCK)cellline for influenza vaccine production.Vaccine 2010,28(5):1285-1293.

9.Nichols GE,Lovejoy JC,Borgman CA,Sanders JM,Young WW,Jr.:Isolationand characterization of two types of MDCK epithelial cell clones based onglycosphingolipid pattern. Biochimica et biophysica acta 1986,887(1):1-12.

发明内容

本研究从来源于ATCC的MDCK细胞系中筛选出一株对H5N1流感高度敏感、低致瘤的亚细胞株，并对该MDCK细胞为基质的流感疫苗的生产进行了优化。

本发明首先涉及一株MDCK亚克隆细胞株MDCK-G1，所述的细胞株保藏于保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201773，保藏日期，2017年5月26日， 分类名称为：犬肾细胞MDCK-G1株。地址，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校 内，邮编430072，电话027-68752319。

本发明还涉及所述的MDCK-G1细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，所述的流感病毒 优选为H5N1病毒，所述的疫苗包括减毒活疫苗或灭活疫苗，优选为灭活疫苗。

本发明还涉及以所述的MDCK-G1细胞株的大规模培养方法，所述方法参数如下：

(1)培养基为MEM培养基添加5％～10％的小牛血清，pH 6.8～7.5；

(2)搅拌速度40～70rpm；

(3)微载体浓度3～8g/L，接种密度10cells/微载体；

(4)葡萄糖浓度6-12mmol/L。

优选的，培养基pH为7.2，搅拌速度55rpm，微载体浓度5g/L，细胞接种密度10cells/ 微载体。

优选的，培养反应器为7.5L反应器灌流反应器；微载体为微球载体。

本发明还涉及以所述的MDCK-G1细胞株为载体，生产流感病毒疫苗的方法，所述的方 法包括如下步骤：

(1)培养所述MDCK-G1细胞株；

(2)对步骤(1)培养获得的细胞接种流感病毒；

(3)放大培养接种后的细胞，收获病毒液并对病毒液进行纯化。

优选的，所述的流感病毒为H5N1流感病毒，所述的疫苗为灭活疫苗。

本发明还涉及以所述的MDCK-G1细胞株为载体，生产H5N1流感病毒疫苗的方法，步骤如下：

(1)在所述的MDCK-G1细胞密度为1.0×10⁶cells/ml～3.0×10⁶cells/ml时，以MOI0.00001～0.001接种H5N1流感病毒；优选的，细胞密度为1.5×10⁶cells/ml，MOI为0.0001；

(2)接种后更换细胞培养液为病毒培养液，培养至HA滴度平台期，收获病毒液；病毒 培养液为不含血清的VP-SFM培养基，内含4ug/ml TPCK-胰酶。

(3)对病毒液进行微滤、除菌过滤；

(4)对病毒液进行灭活，浓缩和纯化。

所述的微滤为使用3μm滤网过滤，除菌过滤使用0.22μm过滤器；

所述的灭活为使用甲醛灭活，优选的，采用终浓度100μg/mL的甲醛2～8℃灭活144h；

所述的浓缩为超滤浓缩，优选的，采用300kD膜包超滤浓缩；

所述的纯化采用层析法，优选的，采用Sepharose 4FF凝胶进行层析。

本发明还涉及所述的MDCK-G1细胞株生产的流感疫苗在制备预防或治疗流感的产品中 的应用。

本发明还涉及所述的MDCK-G1细胞株在制备预防或治疗流感的产品中的应用。

本发明采用极限稀释法，成功得到了108株单细胞亚克隆，并且各亚克隆在细胞形态、 生长特性、胰酶耐受等方面都有着显著性差异，这与ATCC公布的结果相一致[9]。MDCK细 胞目前已经在欧洲获得批准可以用于流感疫苗生产，但在我国尚处于研发阶段，因此没有国 家检测标准，我们参考我国现行的药典要求，同时参考国际上的最新要求，对我们筛选的一 株MDCK细胞进行较为全面的敏感性及安全性评价。检测项目主要包括鉴别、对H5N1流感 敏感性、内外源因子检测、致瘤性及致癌性检测，初步评价了该细胞株作为H5N1流感疫苗 生产的可行性。

综合考虑病毒敏感性、安全性结果最终选定G1亚细胞株作为适用于H5N1流感生产的 MDCK亚细胞株，同时进一步进行安全性研究。本发明对G1细胞株进行体内细胞致瘤性、细胞裂解物和DNA的致癌性检测，在观察末期未见肿瘤生成，病理检测见肝细胞和脾细胞非特异性炎性反应可能是裸鼠免疫功能低下继发感染引起。综上，我们筛选出的MDCK-G1亚细胞株具有低致瘤性，对H5N1流感高度敏感，具有用于大流行流感疫苗生产的潜在可能性。

本文成功采用40L生物反应器培养H5N1流感病毒，病毒收获液的HA滴度可以达到1:1024，与鸡胚培养滴度相当，经过三次培养，结果显示批次间一致性较好，病毒培养工艺稳定，可重复，且生物反应器微载体培养易放大，可以用于流感疫苗的应急生产，因此MDCK-G1细胞是H5N1流感疫苗的合适生产基质。

附图说明

图1、各克隆胰酶耐受浓度

图2、MDCK单细胞克隆血凝滴度复筛

图3、软琼脂克隆形成检测

图4、MDCK-G1株细胞核型分析

图5、MDCK-G1致瘤性检测，A肝脏组织病理切片；B肾脏组织病理切片；C肺组织病理切片；D脾脏组织病理切片；E阳性对照瘤体组织病理切片

图6、7.5L反应器中接种病毒时不同细胞浓度下病毒血凝滴度

图7、7.5L反应器中不同MOI值下的病毒血凝滴度

图8、分子筛结果

图9、血清中和抗体监测

图10、小鼠攻毒实验后体重变化

图11、小鼠攻毒实验死亡监测

具体实施方式

细胞和病毒：待筛选MDCK细胞，从ATCC引进，MDCK CCL-34，P55代Lot：58569518。MRC-5细胞、Hela细胞均由武汉生物制品研究所疫苗研究二室保存，从ATCC引进。H5N1禽 流感病毒疫苗株：毒株名称为NIBRG-14，从NIBSC引进，WHO推荐的禽流感毒株。H5N1 病毒鼠肺适应株由本实验室保存；鸡胚H5N1全病毒灭活流感疫苗由本实验室生产制备。

主要试剂：MEM培养基购于Gibco公司，货号：41500；胎牛血清购于Gibco公司，货号：25200；地高辛糖苷键分型试剂盒购于Roch公司，货号：11210238001；秋水仙素购于Sigma公司，货号：D1925；Hoechst 33258染色液购于Invitrogen公司，货号：H3569；改良 马丁培养基、硫乙醇酸盐培养基、琼脂斜面培养基由武汉生物制品研究所培养基室制备。TPCK-trypsin购自Sigma公司；微载体Cytodex-1购自GE Healthcare公司；生物反应器(Celligen plus 7.5L、Celligen 510 40L)购自NBS公司。

MDCK细胞库建立：复苏一支ATCC引进的MDCK CCL-34细胞株，常规建立前主库、 主库及工作库。

H5N1流感工作毒种库建立：取一支NIBSC引进的毒株NIBRG-14，接种于11日龄SPF鸡胚，接种后的鸡胚置于33℃培养72h，然后鸡胚4℃冷库冷冻过夜并收获尿囊液。将收获尿囊液分装成1ml/支即为工作毒种库。使用工作库MDCK细胞测定工作毒种的TCID₅₀滴度。

实施例1、MDCK亚克隆细胞培养及H5N1流感病毒敏感性初筛

复苏1支MDCK工作库细胞，在细胞汇合度约80％时，按细胞传代步骤消化细胞，吹打 充分分散细胞使之成为单细胞悬液，取样计数并稀释细胞至最终浓度为10cells/ml，稀释液为 MEM/DMEM/F12混合液。将悬液充分混匀并接种细胞于96孔板中，每孔50ul。将96孔板 置于8％CO₂孵箱中37℃培养一周，各孔补加预温的细胞生长液50ul，10天后显微镜下观察 是否有由形状大小均一的细胞组成的细胞团块，待细胞铺满孔底面积50％时进行传代。

当亚克隆细胞在24孔板内细胞汇合度达70-90％时，弃培养液并用PBS清洗两遍，向24 孔板内以MOI 0.001接种H5N1流感病毒，向细胞维持液中添加TPCK-胰酶，使其终浓度达 到0.5ug/ml。置于置于8％CO₂孵箱中37℃培养。每天观察细胞病变状况，96h取样，做血凝 滴度检测，对每批血凝滴度较高的前五株亚细胞克隆冻存。

结果显示，对108株MDCK亚克隆细胞血凝滴度初筛，各克隆血凝滴度最高为1:512，大部分克隆得到的滴度在64-128水平，选择其中的16株血凝滴度在128以上的进行进一步的筛选。

实施例2、MDCK亚克隆细胞胰酶耐受筛选

选择H5N1滴度较高的亚克隆细胞株分别给予0μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2ug/ml，4ug/ml， 8ug/mlTPCK-胰酶刺激，观察细胞的耐受状况。

TPCK-胰酶浓度对流感病毒的感染影响较大。经筛选发现，各克隆间胰酶耐受浓度差别 较大，大部分克隆胰酶耐受浓度在1-2μg/mL之间，如图1所示。因此选择2μg/mL作为进一 步筛选MDCK亚克隆细胞的TPCK-胰酶浓度。

实施例3、MDCK亚克隆细胞血凝滴度复筛：

根据对各克隆胰酶浓度测定结果，再次以H5N1毒株，MOI 0.001对各克隆细胞的病毒敏 感性进行接种，观察接种后的血凝滴度。

以MOI 0.001、TPCK-胰酶浓度2ug/ml接种H5N1流感病毒，测定不同亚克隆细胞株的 血凝滴度如图2，显示病毒液最高血凝滴度为1:1024，选择B6、A5、G1三株亚克隆株进入下一阶段筛选。

实施例4、软琼脂克隆形成试验：

用蒸馏水分别制备1.2％和0.6％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌，将1.2％琼脂糖 液按照1:1比例添加MEM培养基后注入六孔板，冷却凝固，作为底层琼脂置CO₂孵箱中备 用。按照1:1比例将0.6％的琼脂糖和MEM培养液混匀，向其内加入MDCK细胞，使细胞的终浓度达到100个/ml，将混合液注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成琼脂双层。每个样品重复三次，阳性对照以Hela细胞、阴性对照以MRC-5细胞同法操作。待上层琼脂凝固后，置37℃5％CO2培养箱中培养10～14天。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆形成 情况，并统计。

根据2010版药典的规定，我们以软琼脂克隆试验对备选细胞株进行了致瘤性的初步测定。 结果如图3所示：阳性对照的Hela细胞(P10)组出现明显细胞团块生长，阴性对照组的MRC-5 细胞组(P31)未出现细胞团块生长，试验阴阳性对照成立。所测定的3个待选细胞株：A5、 B6、G1(P72)代细胞均未出现明显的细胞团块，上述结果表明：优选的MDCK细胞株系未 表现出明显的高致瘤性。

实施例5、MDCK亚克隆细胞受体丰度检测及亚克隆细胞株鉴别：

复苏各亚克隆细胞，正常传代至T75细胞瓶，待细胞汇合至90％左右时消化，制备单细 胞悬液备用。按照地高辛糖苷键分型试剂盒说明书进行MDCK亚克隆细胞受体丰度检测。

YYY/6A采用秋水仙素抑制细胞有丝分裂，使部分细胞停滞于分裂中期，收获处于中期 分裂相的细胞并进行低渗、固定及Gimsa染色，对50个处于中期分裂相的细胞进行染色技术， 并给出平均染色体数和染色体范围。油镜观察，随机选取染色体清晰、分布相对集中、分散 较好的中期细胞进行计数，共计数50个细胞，染色体分布在74-83之间，众数为78条，如 图4所示。

亚克隆细胞株外源因子检测：细菌、真菌、支原体、外源病毒因子检测参照《中国药典》 三部进行。结果显示，MDCK亚克隆细胞库G1株细胞库细菌、真菌及支原体检测均合格。

细胞内外源因子检测结果：

(1)细胞培养直接观察及红细胞吸附试验：细胞形态正常、红血球吸附检测结果为阴性。

(2)动物体内接种法检测外源因子：按照药典方法接种动物和鸡胚，观察期末乳鼠、成 年鼠存活率均为100％，观察期内未发现动物出现异常。接种豚鼠均健在，解剖无病变。接种 5～6日龄鸡胚存活率为100％，9～11日龄鸡胚尿囊液红细胞凝集试验结果为阴性。

实施例6、MDCK细胞亚克隆致瘤性检测：

按照细胞致瘤性检测规程进行，将P85代MDCK亚克隆细胞制备成5*10⁷/ml，每只裸鼠 皮下注射0.2ml，相当于每只裸鼠接种细胞数目为1*10⁷/ml。阳性对照选用Hela细胞，阴性 对照选用MRC-5细胞，阳性对照细胞每只裸鼠接种数目为1*10⁶/ml，阴性对照细胞每只裸鼠 接种数目为1*10⁷/ml。试验观察期为3个月，并在21d及观察期末分别对半数动物进行病理 组织检查。结果如图5所示，观察期末，阳性对照组所有裸鼠接种部位有巨大肿瘤形成；阴 性对照及试验组裸鼠接种处结节在一周左右消失。病理检查显示：阴性对照组、试验组及阳 性对照组均可见部分动物肝细胞坏死但是无癌变(5A),肾脏组织切片(5B)及肺组织切片(5C) 显示正常，脾脏均可见脾窦多形核细胞聚集(5D)。阳性对照组裸鼠瘤体结节可见细胞癌变 伴坏死(图5E)，阴性对照组及试验组未见瘤体生成。

MDCK细胞破碎匀浆致癌性检测：细胞匀浆液致癌性检测：收集MDCK活细胞1*108个细胞，悬于2mlMEM培养液中，用超声破碎仪制备细胞匀浆，然后按照活细胞致瘤性检测方法进行裸鼠注射、观察及病理检查，阴性对照组注射生理盐水。细胞DNA致癌性检测： 收集MDCK活细胞1*108个细胞，悬于2mlMEM培养液中，平均分为10份，每份样品200ul， 按照QIAGEN的DNeasy Blood&Tissue Kit提取试剂说明书操作提取细胞DNA，并将所有 细胞DNA样品合并后按照活细胞致瘤性检测方法进行裸鼠注射、观察及病理检查。阴性对 照组注射生理盐水。结果显示，MDCK细胞匀浆液接种组、DNA接种组和生理盐水接种组 接种部位均未检测到病理性改变，内脏病理学解剖正常，致癌性病理检测结果为阴性。

实施例7、MDCK-G1细胞的培养条件优化及病毒纯化

细胞的培养：MDCK细胞经胰酶消化，接种至准备好的生物反应器中进行微载体贴壁培 养。培养参数为MEM培养基添加5％小牛血清，pH 7.2，搅拌速度55rpm，5g/L的微载体浓 度，细胞接种密度10cells/微球。通过调整灌流速度维持葡萄糖浓度在6-12mmol/L范围内。 利用7.5L生物反应器确定最佳培养条件，考察接种病毒时的最佳细胞密度。以MOI为0.0001 分别接种于1.5×10⁶cells/ml和2.5×10⁶cells/ml，结果显示前者条件下流感病毒的血凝滴度 更高(图6)，因此选择1.5×10⁶cells/ml作为最适接种病毒的细胞密度。

利用7.5L生物反应器确定H5N1流感病毒接种最佳MOI。在细胞密度为1.5×10⁶cells/ml 时，以MOI为0.001、0.0001和0.00001接种H5N1流感病毒，观察最高能够达到的血凝滴度。 结果如图7所示，在MOI为0.0001时血凝滴度可以达到1024。因此最适H5N1流感接种MOI 为0.0001。

待7.5L反应器中微载体90％细胞汇合时，采用灌外细胞消化法，将细胞分散至单个，导 罐至40L反应器中，继续培养。按照上述7.5L反应器摸索的最适合病毒接种细胞密度及最适 合MOI于NBS公司的40L生物反应器放大培养，重复三次最高血凝滴度均可以达到1024， 说明MDCK-G1细胞的培养、H5N1流感种毒可以放大，重复性良好。收获三次培养获得的 病毒液，进入下游纯化。

病毒培养：待MDCK细胞密度达到1.5×10⁶时，将细胞培养液更换为病毒培养液，并按 MOI为0.0001值接种H5N1流感病毒，每12h取样测定HA滴度，HA滴度达到平台期时， 收获病毒液。

病毒纯化：将收获的H5N1流感病毒液进行微滤(3μm+0.8μm)、除菌过滤 (0.45μm+0.22μm)，采用终浓度100μg/mL的甲醛2～8℃灭活144h。采用300kD膜包超滤浓 缩，Sepharose 4FF凝胶层析纯化流感病毒。

病毒收获液经澄清、除菌两级过滤，去除收获液中的细胞碎片及杂质，然后按照2015版 《中国药典》的要求进行灭活。采用300KD的膜包进行超滤浓缩，浓缩倍数在50倍左右， 结果显示超滤前后HA含量变化不大，杂蛋白去除率在90％以上(表1)。

表1：病毒液超滤浓缩结果

凝胶纯化：使用Sepharose 4FF凝胶柱对浓缩样进行纯化(图8)。结果显示小分子杂蛋 白与H5N1流感病毒能有效的分离，经检测病毒回收率在90％左右，总蛋白是HA含量的4.1 倍(表2)，符合2015版《中国药典》流感病毒裂解疫苗规定的总蛋白含量不超过总HA含量的4.5倍。

表2分子筛纯化结果

实施例8、免疫原性评价及小鼠攻毒实验：

以细胞基质和鸡胚基质的H5N1流感病毒灭活疫苗腹腔注射BALB/c小鼠。免疫剂量分 别为10μg/只、1μg/只、0.1μg/只，免疫时间为0、21天。小鼠免疫的0、2、3、4、5、6、7 周进行小鼠后眼眶静脉丛采血，检测HI中和抗体滴度。

初免后小鼠的HI中和抗体GMT偏低，加强免疫后HI中和抗体水平明显升高，第28天中和抗体滴度达到高峰。其中10μg剂量组细胞基质疫苗达到最高1:414，高于鸡胚基质疫苗1:383，经检验，无显著性差异；0.1μg剂量组细胞基质疫苗为1:74，高于鸡胚基质疫苗1:43，经检验，有显著性差异(P<0.01)。第35天后抗体水平下降，第49天所有剂量组的抗体滴度降在1:40以下(图9)。HI中和抗体滴度≥40作为机体具有保护性的标志。在首剂免疫后14天细胞来源疫苗和鸡胚来源疫苗10ug剂量组的抗体保护率为50％，1ug和0.1ug剂量组抗体保护率均为零。首剂免疫后28天细胞来源疫苗和鸡胚来源疫苗各剂量组抗体保护率均达到100％，统计分析各组别间的抗体保护率无显著性差异(表3)。综上，细胞基质来源H5N1流感疫苗和鸡胚来源H5N1流感疫苗都可以产生很好的免疫效果，且细胞基质疫苗免疫原性非劣效于鸡胚基质疫苗。

表3：小鼠抗体保护率

攻毒实验：按照上述血清学抗体检测的免疫方式进行BALB/c小鼠免疫，首剂免疫后42 天进行小鼠攻毒实验，观察疫苗的保护率。

以本实验室制备保存的H5N1鼠肺适应株，对首剂免后42天的小鼠进行攻毒试验，对照 组免疫注射PBS，观察存活的小鼠的体重变化和死亡情况，评估疫苗对小鼠的免疫保护性。 结果显示攻毒后，PBS组小鼠体重迅速下降，在攻毒后8天小鼠全部死亡；其余各实验组小 鼠的体重有一个先下降后上升的过程，在攻毒后14天各组别存活的小鼠体重均恢复到攻毒前 水平(图10)。在攻毒后第三天开始出现小鼠死亡现象，至攻毒后第14天观察期末，细胞来 源疫苗与鸡胚来源疫苗10μg剂量组均无小鼠死亡，产生100％的保护；1μg剂量组细胞来源 疫苗的保护率为80％高于鸡胚来源疫苗的70％；0.1μg剂量组细胞来源苗保护率为40％高于 鸡胚来源疫苗的30％，各组别间进行统计学分析，均无显著性差异(图11)。综上所述，细 胞基质流感疫苗对H5N1攻击毒株的保护率非劣于鸡胚来源疫苗，MDCK细胞可以作为一个 生产H5N1流感疫苗的基质。

最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本 发明保护范围的限定。

Claims (10)

1.一株MDCK亚克隆细胞株MDCK-G1，所述的细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201773。

2.权利要求1所述的MDCK-G1细胞株在制备流感病毒疫苗中的应用，其特征在于，所述的流感病毒为H5N1病毒。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的疫苗为灭活疫苗。

4.权利要求1所述的MDCK-G1细胞株的大规模培养方法，其特征在于，所述方法的参数如下：

（1）培养基为MEM培养基添加5%~10%小牛血清，pH 6.8～7.5；

（2）搅拌速度40～70rpm；

（3）微载体浓度3～8g/L，接种密度10cells/微载体；

（4）葡萄糖浓度6-12mmol/L。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养参数还包括，培养反应器为7.5L灌流反应器。

6.以权利要求1所述的MDCK-G1细胞株为载体，生产流感病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）培养所述MDCK-G1细胞株；

（2）对步骤（1）培养获得的细胞接种流感病毒；

（3）放大培养接种后的细胞，收获病毒液并对病毒液进行纯化；

所述的流感病毒为H5N1流感病毒，所述的疫苗为灭活疫苗。

7.以权利要求1所述的MDCK-G1细胞株为载体，生产H5N1流感病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的方法步骤如下：

（1）在所述的MDCK-G1细胞密度为1.0×10⁶cells/ml～3.0×10⁶cells/ml时，以MOI0.00001～0.001接种H5N1流感病毒；

（2）接种后更换细胞培养液为病毒培养液，培养至HA滴度平台期，收获病毒液；

（3）对病毒液进行微滤、除菌过滤；

（4）对病毒液进行灭活，浓缩和纯化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的细胞密度为1.5×10⁶cells/ml，所述的接种MOI为 0.0001。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，

步骤（3）所述的微滤为使用3μm滤网过滤，除菌过滤使用0.22μm过滤器；

步骤（4）所述的灭活为使用甲醛灭活；

步骤（4）所述的浓缩为超滤浓缩；

步骤（4）所述的纯化为采用层析法纯化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，

步骤（4）所述的灭活为采用终浓度100μg/mL的甲醛，2～8℃灭活144h；

步骤（4）所述的浓缩为采用300kD膜包超滤浓缩；

步骤（4）所述的纯化为采用Sepharose 4 FF凝胶进行层析纯化。

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