KR20060057577A

KR20060057577A - 부착성 또는 비부착성 조류 세포주를 이용한폭스바이러스의 생산

Info

Publication number: KR20060057577A
Application number: KR1020067001289A
Authority: KR
Inventors: 파비엔느 구헨눅스; 베르트란드 파인
Original assignee: 비바리스
Priority date: 2003-07-22
Filing date: 2004-07-22
Publication date: 2006-05-26
Also published as: US7432101B2; US7771980B2; US20100111999A1; HK1091229A1; DE602004027141D1; EP1646715A1; CA2531565C; JP2006527995A; PT1646715E; WO2005007840A1; EP1646715B1; AU2004257939A1; JP2011224009A; EP2143788A1; JP4787156B2; US20090239286A1; CA2531565A1; PL1646715T3; ATE467678T1; AU2004257939B2

Abstract

본 발명은 조류 배아 줄기세포들에 바이러스 입자들을 접종하고 세포 용해가 야기되고 새롭게 생산된 바이러스 입자들이 배지 내로 분비될 때까지 기본 배지에서 상기 세포들을 배양하는 단계들을 포함하는, 우두바이러스와 같은 폭스바이러스를 복제하는 방법에 관한 것이다.

Description

부착성 또는 비부착성 조류 세포주를 이용한 폭스바이러스의 생산{PRODUCTION OF POXVIRUSES WITH ADHERENT OR NON ADHERENT AVIAN CELL LINES}

본 발명은 조류 세포주를 바이러스 입자들로 감염시키는 것을 포함하는, 조류 세포주, 구체적으로 조류 배아 줄기세포를 이용하여, 천연의 또는 변형된, 생 또는 약독화 폭스바이러스, 구체적으로 우두바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

역사적으로, WHO에 따르면 우두 백신은 1980년대에 천연두에 대해 면역화되어 천연두의 박멸을 유도하는데 성공적으로 사용되어 온 것으로 알려져 있다. 그 이후로, 예방접종은 중단되었다. 오늘날, 상기 바이러스의 재유행은 보호되지 않은 집단을 철저하게 파괴시킬 수 있는 잠재적인 위험으로 간주된다. 문제는 미국 내에 단지 1500만명 분량의 천연두 백신만이 이용가능하다는 것으로, FDA는 천연두에 대해 대량의 백신 단위 투여량을 생산하기 위한 지침들 및 약정서들을 발포하였다. 추가적인 정보는 http://www.bt.cdc.gov/Agent/Smallpox/SmallpoxConsensus.pdf에서 이용가능하다.

그러나, 신속한 생산은 새로운 생산방법들과 적당한 세포주들을 요구한다. 본 발명에서, 우리는 제약 회사들에 의한 백신 생산에 기질로 사용될 수 있는 조류 종 유래의 (부착성 또는 비-부착성) 새로운 세포주를 기술한다. 이들 새로운 세포들은 조류 배아들로부터 유래되고, 현재 사용되는 충란들이나 일차 배아 섬유아세포들을 대체할 수 있다.

전통적으로, 백신은 감염원의 약화된 혹은 불활성화된 형태를 사용함으로써 질환에 대한 면역성을 유도한다. 오늘날, 인간 세포에서 복제의 부재 및 면역반응의 우수한 유도능과 같은 약독화된 폭스바이러스의 특성들은, 예를 들면 벡터로서 MVA (Modified Virus Ankara)를 이용한 새로운 백신 전략들의 개발을 가능케한다. MVA는 이 질환이 박멸되기 전에 천연두에 대한 안전한 백신으로서 초기에 개발된 우두바이러스 (vaccinia virus, VV)의 고도로 약독화된 균주이다. MVA는 원발성 계배섬유아세포 (primary chick embryo fibroblast, CEF)를 통한 570회 이상의 연속 계대접종에 의해 앙카라 균주 (Ankara strain)로부터 유래되었고, 이러한 적응의 결과로서, 모 균주와 비교할 때 몇 개의 거대한 게놈 결실들을 포함한다. MVA는 대부분의 포유동물 세포주들에서 더 이상 복제할 수 없고 동물에게 비-병원성이다. 더욱 중요하게는, MVA가 면역이 저하된 (immuno-depressed) 개인들을 포함하여, 100,000명 이상의 인간들에게 천연두 백신으로 투여되었을 때, 어떠한 심각한 합병증의 유발도 보고되지 않았다는 것이다. 분자생물학의 표준 기술들에 의해, 치료 목적의 특정 펩티드들 또는 단백질들을 암호화하는 외래 DNA를 포함하는 재조합 MVA를 획득하는 것이 가능하다. 이들 재조합 바이러스들은 주사된 후에, 생체 내에서 종양성 항원들과 같은 특정 항원들에 대한 면역 체계를 자극할 수 있다. 현재, 이들 새로운 세대의 백신 벡터들이 인간 혹은 동물 감염성 질환들에 대하여, 그리고 매우 다양한 종양 유형들 (흑색종, 전립샘암, 유방암, 폐암, 난소암, 간암...)에 대하여 개발되거나 개발될 수 있다.

드렉슬러 등 (Drexler I, et al., 1988, J. Gen Virol . 79: 347-352)은 고도로 약독화된 변형 우두바이러스 앙카라 (MVA)가 다양한 인간 형질전환 및 원발성 세포들이 아니라 BHK (baby hamster kidney) 세포들에서 복제될 수 있음을 관찰하였다; 따라서, MVA의 숙주범위는 한정적이다. 더욱이, 이 고도로 약독화된 폭스바이러스 균주는 재현적인 감염을 만들지 못한다 (Moss B, Dev . Biol . Stand 1994: 55-63). 예를 들면, 블란차드 등 (Blanchard TJ, et al., 1988, J. Gen. Virol . 79: 1159-1167)은 변형 우두바이러스 앙카라는 인간 세포들에서 제한적인 복제를 거치고 몇몇 면역-조절 (immuno-modulatory) 단백질들이 결여되어 있다고 보고하였다. 또한, 생산 수율은 천연두 백신 대량 생산의 경제적인 실용성과 함께 고려되어야 한다.

면역접종된 개인들에게서 유도된 MVA의 강력한 안전성 기록과 잠재적인 세포성 및 체액성 면역반응은 인간 및 동물 감염성 질환들, 특히 HIV 및 암에 대해 면역화시키기 위한 재조합 벡터로서 MVA의 용도에 있어서의 상당한 과학적 및 산업적 관심을 유발하였다. CEF에 적용되는 경우, MVA는 상기 세포들에서 고 역가로 성장할 수 있고, 재조합 MVA 백신 후보물질들의 현행 임상 배치들이 원발성 CEF상에서 생산된다. 그러나, CEFs의 확립은 원발성 조직 배양에 있어서의 경험을 요구하고 특정한 병원성-부재 조건들 하에서 유지된 닭으로부터 얻은 충란들에 의존한다. 또한, 원발성 세포들이 소수의 계대접종에서만 생존하고 그로 인해 발육란 (embryonated eggs)으로부터 지속적으로 제조되어야 하기 때문에, 생산 공정이 매우 번거롭고 표준화가 어렵다. 백신 제조자들은 임상시험 Ⅰ 및 Ⅱ기 동안에 MVA 물질의 배치들의 생산을 위해서 이러한 제한들을 다룰 수 있지만, 임상시험 Ⅲ기 동안 및 최종적으로 최근의 생산물 산업화 동안에는 CEF-기반 생산 공정의 스케일-업 (scaling-up)이 심각한 장애물로서 여전히 남아있다.

본 발명에 의해 해결되는 기술적 과제는 상기에 언급된 문제들을 미연에 방지할 수 있고 관리 기관의 요구조건들을 만족할 수 있는 우두바이러스의 복제를 위한 세포주를 제공하는 것이다. 이것이 본 발명의 목적이다.

이상적으로, 이러한 세포주는 완벽하게 조절적 순응 (regulatory compliant)이어야 한다; 상기 세포는 공지된 이력으로 상세하게 특정될 것이다. 더욱이, 상기 세포주는 비-발암성이고, 유전적으로 변형되지 않으며, 장기 배양 하에서 안정해야할 것이다. 상기 세포주는 바이러스를 복제할 수 있고 무-혈청 배지에서 안정한 부착 및 부유 성장에 적응할 수 있어야할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 바이러스의 복제를 위한 조류 세포들의 용도를 조사하였다. 본 발명자들은 자신들의 동시-계류중인 출원 PCT/FR03/00735 (WO03/076601)에 기술된 새로이 확립된 조류 배아 유래 줄기세포주들이 폭스바이러스, 특히 우두바이러스와 같은 오르소폭스바이러스를 복제하는데 특히 적당함을 보고한다.

무제한적인 세포 증식이 백신의 대량생산을 위해 요구되기 때문에, 본 발명 자들은 바이러스들을 복제하는 조류 배아 유래 줄기세포의 능력을 조사한다. 그러나, 장시간 동안 조류 배아 유래 줄기세포들을 시험관 내 (in vitro)에서 유지하기 위해서는, 패인 등 (Pain et al., 1966, Development 122: 2339-2348); 미국 특허 제6,114,168호 및 EP 특허 제787 180호에 기술된 바와 같은 특정한 배양 및 유지 조건들을 관찰할 것이 요구되고, 이러한 배양 조건들은 추가적인 비용 부담을 야기한다. 상기 문제점은 세포성 분화 및 노화와 같은 문제점들은 방지하면서 경제적인 배지에서 배양 상태로 조류 배아 유래 줄기세포들을 유지할 수 있여야 한다는 것이다. 이러한 관점에서, 본 발명은 성장인자들, 혈청 및/또는 영양층의 제거가 조류 배아 유래 줄기세포 집단들의 분리를 초래하고, 그 결과로 기본 배양배지에서 무한정으로 성장할 수 있음을 발견하였다.

또한, 대부분의 비-부착성 세포들을 위한 조혈 줄기세포들과는 별도로, 종래기술에 따라 획득된 상기 세포들은 부착성 표현형을 나타낸다. 그러나, 비-부착성 세포들이 바이러스 백신의 산업적 생산을 위해 선호되고 있다. 이러한 표현형은 생체 외에서 배양된 비-부착성 세포들에 의해 달성된 해리 및 높은 세포 밀도를 위한 단백질 분해 효소의 사용을 피할 수 있어 다루기가 용이하므로, 양쪽 모두에 바람직하다. 본 발명은 자연적으로 비-부착성이 될 수 있거나 영양층의 제거에 의해 비-부착성을 나타내는 조류 배아 유래 줄기세포주들의 생산을 기술한다. 부유 상태에서의 이들의 성장으로 인해, 이들 세포주들은 생체반응기 내에서 백신의 산업적 생산에 완벽하게 적당하다.

기본 배양배지에서 성장하는 이들의 특성에 더하여, 이들 세포주들이 통상적 인 방법들을 이용하여 얻어진 수율과 등등하거나 심지어 그보다 높은 수준으로 특정 바이러스들의 복제를 허용한다는 것이 확인되었는데, 이러한 사실은 이들 세포들을 백신의 대량생산에 특히 유용하게 만든다.

따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 바이러스, 보다 구체적으로는 우두바이러스, 예컨대 천연형 또는 재조합 우두바이러스를 조류 배아 유래 줄기세포들에서 복제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 상기 조류 배아 유래 줄기세포들에 바이러스 입자들을 접종하고 상기 세포들을 성장인자들, 영양세포들 및/또는 동물 혈청이 결핍된 배지에서 세포 용해가 야기되고 새롭게 생산된 바이러스 입자들이 상기 배지 내로 방출될 때까지 배양하는 단계들을 포함한다. 본 발명의 조류 줄기세포들의 접종은 0.001 내지 0.5, 바람직한 실시양태에서는 0.01 내지 0.5, 가장 바람직한 실시양태에서는 0.01 내지 0.1의 m.o.i. (감염다중도, multiplicity of infection)로 수행된다. 상기 방법은 백신, 특히 천연두와 같은 폭스바이러스에 대한 백신 생산에 유용하다.

상기 조류 배아 유래 줄기세포주들은 하기 단계로 구성된 방법에 의해 얻어질 수 있다:

a) 조류 세포들, 바람직하게는 조류 배아를, 바람직하게는 불활성화된, 이들의 성장을 위한 모든 인자들 및 영양층을 포함하고, 혈청이 보충된 완전 배양 배지에서 배양하는 단계;

b) 상기 인자들, 혈청 및/또는 영양층의 점진적 또는 완전한 제거를 위하여 상기 배양 배지를 변형시켜 계대접종하는 단계; 및

c) 외인성 성장인자들 및/또는 불활성화 영양층의 부재 및/또는 저농도의 혈청 또는 무-혈청 기본 배지에서 증식할 수 있는 부착성 또는 비-부착성 조류 세포주들을 확립하는 단계;

이 과정에서, 상기 단계 c)의 기본 배지는 여전히 저농도의 혈청 (즉, 약 2% 미만)을 포함하고 있고, 상기 방법은 다음 중에서 선택되는 배양 배지 내에 더 이상의 성장인자, 더 이상의 영양층 및 저농도의 혈청을 포함하지 않는 기본 배지로 교환하는 부가적인 단계 d)를 선택적으로 포함할 수 있다:

- 혈청이 보충되고 (ⅰ) 무-혈청 배지로 희석된 기본 배지로 교환한 후 외인성 성장인자, 불활성화 영양층 및 저농도 혈청을 포함하지 않는 상기 기본 배지가 완전히 제거될 때까지 무-혈청 배지의 비율을 점차적으로 증가시키면서, 연속적인 계대접종 동안에 상기 조류 세포들을 이 기본 배지 (ⅰ)에서 배양하는 단계;

- 혈청이 보충된 무-혈청 배지 (SFM)(ⅱ)로, 그 후에 무-혈청 배지가 얻어질 때까지 혈청의 비율을 점차적으로 감소시키면서, 상기 배지 (ⅱ)에서 상기 조류 세포들을 연속적인 계대접종 동안에 배양하는 단계;

- 무-혈청 배지 (SFM)(ⅲ), 그 후에 상기 조류 세포들을 배지 (ⅲ)에서 배양하고, 그리고 나서 배지 교환에 적응된 상기 조류세포들을 무-혈청 배지에서 유지하는 단계.

여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "조류"는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 되새류 (finches), 매, 까마귀, 타조, 에뮤 (emu) 및 화식조 (cassowary)와 같은 생물체들과 같이, 분류학적 분류 "ava"의 임의의 종, 아종 또는 속을 나타낸다. 상기 용어는 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 일반적으로 사육되는 다른 가금류의 종족들뿐만 아니라 갈루스 갈루스 ( Gallus gallus ) 혹은 닭 (예를 들면, 백색 레그혼, 갈색 레그혼, 바드-락, 서섹스, 뉴햄프셔, 로드 아일랜드, 오스스트라롭, 미노르카, 암록스, 캘리포니아 그레이, 이태리 파르티지-칼라드)의 다양한 종들을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조류 세포는 닭 세포이다.

여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "이들의 성장을 허용하는 인자"는 배양시 상기 조류 세포들의 생존 및 성장에 필요한 성장인자를 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 성장인자들은 영양인자들 및 사이토카인들을 포함한다. 영양인자들은 주로 SCF, IGF-1 및 bFGF이다. 사이토카인들은 주로 그의 작용이 LIF, 인터류킨-11, 인터류킨-6, 인터류킨-6 수용체, CNTF, 온코스타틴 및 카디오프로핀 (cardiotrophin)과 같은 gp130 단백질과 관련된 수용체를 통해 이루어지는 사이토카인들이다.

단계 a)의 조류 세포들은 조류 배아세포들, 더욱 바람직하게는 조류 배아 줄기세포들 및 조류 원발성 세포들 중에서 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포들은 조류 배아, 더욱 바람직하게는 닭 배아로부터 얻어진 해리 단계 X의 배반포 세포들의 모집단 현탁액으로부터 분리된 전능성 또는 다능성 조류 배아 줄기세포들이다 (EYAL-GILADI의 분류 참조: EYALGILADI 및 KOCHAN, 1976, From cleavage to primitive streack formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick "General Morphology" Dev. Biol. 49: 321-337). 이들 조류 배아 줄기세포들은 39℃에서 배양시 48 내지 72시간 범위를 포함하는 느린 배가시간을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서 배양 배지의 변형은, 성장인자들, 혈청 및/또는 영양세포의 점진적 또는 완전한 제거를 위하여, 동시에, 연속적으로 또는 개별적으로 이루어질 수 있다. 배양 배지의 이탈의 순서는 다음 중에서 선택될 수 있다:

- 영양층 / 혈청 / 성장인자들;

- 영양층 / 성장인자들 / 혈청;

- 혈청 / 성장인자들 / 영양층;

- 혈청 / 영양층 / 성장인자들;

- 성장인자들 / 혈청 / 영양층;

- 성장인자들 / 영양층 / 혈청.

바람직한 실시양태에서, 상기 이탈의 순서는 성장인자들 / 영양층 / 혈청이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로, 확립된 세포주들은 불활성화 영양층의 부재시에 증식하는 부착성 줄기세포들이다. 이와 관련하여, 상기에서 기술된 방법에 있어서, 단계 b)는 상기 배지 성분들의 제거로 구성된다 (성장인자들 단독 또는 혈청 단독 또는 성장인자들 및 혈청 또는 다르게는 혈청 및 그 후에 성장인자들).

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 방법에 관한 것으로, 상기 확립된 세포주들은 외인성 성장인자들이 없는 배지 내에서 부유 상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들이다. 이와 관련하여, 상기에 기술된 방법에 있어서, 단계 b)는 영양층을 점진적으로 또는 완전히 제거하고, 그 후에 선택적으로 배지의 다른 성분들 (성장인자들 및 혈청)을 제거하는 것으로 구성된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 방법에 관한 것으로, 상기 확립된 세포주들은 혈청이 없는 배지 (무-혈청 배지) 내에서 부유 상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 방법에 관한 것으로, 상기 확립된 세포주들은 외인성 성장인자들 및 혈청이 없는 배지 내에서 부유 상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들이다.

또 다른 실시양태에서, 단계 b)는 상기 성장인자들의 점진적 또는 완전한 제거와 이에 선택적으로 수반되는 혈청의 점진적인 제거로 구성된다.

또 다른 대안에서, 단계 b)는 상기 성장인자들 및/또는 혈청의 점진적 또는 완전한 제거와 이에 선택적으로 수반되는 영양층의 점진적인 제거로 구성된다.

또한, 상기 확립된 세포주들은 혈청-결핍 배지, 구체적으로는 혈청이 없는 배지에서 증식하는 세포들일 수 있다. 상기 표현 "혈청-결핍"은 규정 시간 외에 전개된 혈청 농도의 점차적인 감소를 의미하는 것으로 이해된다. 이 방법은 혈청-결핍 배지 또는 완전히 혈청이 없는 배지에서 성장할 수 있는 안정한 세포주들이 획득될 때까지, 이렇게 새롭고, 점점 격렬해지는 조건들에 적응하는 클론들의 선별을 가능케 한다.

좀더 구체적으로는, 상기 방법의 단계 a)는 완전 배양 배지를 포함하는 배양 플라스크에 약 7×10⁴/㎠ 내지 8×10⁴/㎠의 조류 세포들을 접종하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 접종은 약 7.3×10⁴/㎠ (4×10⁶/55 ㎠ 또는 4×10⁶ 세포들/100 ㎜ 접시)로 이루어진다.

"완전 배양 배지"는 성장인자들 및 동물 혈청이 보충된 기본 배지를 의미한다. 완전 배양 배지의 예시는 패인 등 (Pain et al., 1966, Development 122: 2339-2348), EP 특허 제787,180호, 미국 특허 제6,114,168호, 제5,340,740호, 제6,656,479호 및 제5,830,510호에 기술되어 있다. 본 발명에 따르면, "기본 배지"는 그 자체로, 적어도 세포 생존 및, 한층 더 좋게는, 세포 성장을 가능케 하는 전통적인 배지 조성을 갖는 배지를 의미한다. 이러한 기본 배지의 예시로는 BME (basal Eagle Medium), MEM (minimum Eagle Medium), 배지 199, DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium), GMEM (Glasgow modified Eagle medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's medium), MacCoy's 5A 배지, RPMI 1640이 있다. 기본 배지는 무기염류 (예를 들면, CaCl₂, KCl, NaCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄, MgSO₄ 등), 아미노산류, 비타민류 (티아민, 리보플라빈, 엽산, D-Ca 판토텐산 [panthothenate] 등) 및 글루코스, 베타-머캅토에탄올, 소듐 파이루베이트와 같은 기타 성분들을 포함한다.

성장인자들은 두 패밀리로 개략적으로 구분될 수 있다: 사이토카인들 및 영양인자들. 상기 사이코카인들은 주로 그의 작용이 gp130 단백질과 연관된 수용체를 통해 이루어지는 사이토카인들이다. 따라서, LIF, 인터류킨-11, 인터류킨-6, 인터류킨-6 수용체, CNTF, 온코스타틴 및 카디오트로핀은 특정 사슬의 수용체 수준에서의 보충 및 단량체 또는 때로는 이량체 형태에서 상기 gp130 단백질과 후자와의 조합을 갖는 유사한 작용기작을 갖는다. 상기 영양인자들은 주로 SCF, IGF-1 및 bFGF이다. 더욱 바람직하게는, 상기 완전 배지는 기본 배지, 인슐린 성장인자-1 (IGF-1), 섬모 신경영양인자 (Ciliary Neurotrophic factor, CNTF), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-6 수용체 (IL-6R), 줄기세포인자 (SCF), 기본 섬유모세포 성장인자 (bFGF), 선택적으로 인터류킨-11 (IL-11) 및 동물 혈청을 포함한다. 상기 단계 a)의 조류 세포들, 바람직하게는 조류 배아세포들은 상기 완전 배지 내에서 수차례의 계대접종 동안 배양된다. 상기 배지는 LIF, IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, IL11, 온코스타틴, 카디오트로핀의 그룹 내에서 선택된 성장인자들 중의 적어도 하나에 의해 보충된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 완전 배양 배지는 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, 선택적으로 IL-11이 보충된 기본 배지이다. 상기 기본 배지 내 성장인자들 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, bFGF, 선택적으로 IL-11의 농도는 0.01 내지 10 ng/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 5 ng/㎖, 및 더욱 바람직하게는 약 1 ng/㎖ 범위로 포함된다.

3 내지 10회의 계대접종 이후에, 상기 완전 배지는 성장인자들이 결핍된다 (단계 b). 바람직하게는, 각각의 성장인자에 대해, 상기 결핍은 한 계대접종으로부터 다른 계대접종으로, 한 단계에서 직접적으로 이루어진다. 다르게는, 상기 성장인자 결핍은 상기 완전 배지 내 상기 성장인자 농도의 점진적인 감소에 의해, 점차적으로 수행된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 성장인자 결핍은 적어도 두 종류의 성장인자들에 대해 동시에 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 성장인자에 있어서 상기 결핍은 2회 순환의 결핍 내에서 이루어진다: 먼저, SCF, IL6, IL6R, 선택적으로 IL-11이 상기 완전 배지로부터 직접적으로 제거되고; 상기 조류 세포들은 그 후에 IGF1 및 CNTF, 선택적으로 IL-11을 포함하고 동물 혈청이 보충된 완전 배지 내에서 적어도 1회 계대접종 동안에 배양 상태로 유지된다. 두 번째로, IGF1 및 CNTF, 선택적으로 IL-11이 상기 완전 배지로부터 직접적으로 제거되고, 궁극적으로는 혈청만이 보충된 기본 배지를 포함하게 된다. 일반적으로, 상기 배지는 약 20 내지 30회 계대접종에서 성장인자들이 완전하게 결핍된다.

바람직한 실시양태에서, 상기 영양세포들의 결핍은 성장인자들의 결핍 이후에 수행된다. 상기 영양세포들의 결핍은 점진적이고 수차례의 이상의 계대접종에서 수행된다. 상기 조류 세포들은 단계 a)에서보다 낮은 농도, 약 4×10⁴ 세포/㎠ 내지 5×10⁴ 세포/㎠의 농도로 플라스크에 접종된다. 상기 영양세포들은 약 4.2×10⁴ 세포/㎠의 농도로 플라스크에 접종된다. 점차적으로, 플라스크 내 상기 영양세포들의 농도는 감소한다. 실제로는, 동일한 농도의 영양세포들이 2 내지 4회 계대접종 동안에 사용되고, 그 후에 상기 영양세포들의 보다 낮은 농도가 추가적인 2 내지 4회 계대접종 동안에 사용된다. 상기 플라스크는 그 후에 약 4.2×10⁴ 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 2.2×10⁴ 영양세포들/㎠, 다음에는 약 1.8×10⁴ 영양세포들/㎠, 다음에는 약 1.4×10⁴ 영양세포들/㎠, 다음에는 1.1×10⁴ 영양세포들/㎠, 다음에는 0.9×10⁴ 영양세포들/㎠, 다음에는 0.5×10⁴ 영양세포들/㎠로 접종된다. 그리고 나서, 상기 플라스크는 영양세포들 없이 6.5×10⁴ 조류세포들/㎠ 내지 7.5×10⁴ 조류세포들/㎠로 접종된다. 조류 세포들이 상기 플라스크 내 영양세포들 농도의 감소를 수반하는 양호한 모양이 아니라고 가정한다면, 그 후에 상기 조류 세포들은 상기 영양세포들 결핍을 수행하기 전에 동일한 영양세포들 농도로 부가적인 계대접종들 동안에 배양된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 혈청 결핍은 상기 성장인자 및 영양세포들 결핍 이후에 수행된다. 상기 기본 배지는 하기 중에서 선택된 배지로 교체된다:

- 혈청이 보충되고 신규한 무-혈청 배지 (ⅱ)로 희석된 기본 배지 (ⅰ). 그 후에 상기 조류 세포들은 혈청이 보충된 상기 기본 배지가 완전히 사라질 때까지 (점진적 희석) 무-혈청 배지의 비중이 점차적으로 증가되는 상기 배지 (ⅰ) 내에서 연속적인 계대접종들을 통해 배양된다.

- 혈청이 보충된 신규한 무-혈청 배지 (ⅱ). 그 후에 상기 조류 세포들은 무-혈청 배지를 얻을 때까지 (점진적 이탈) 상기 혈청의 비중이 점차적으로 감소되는 상기 배지 (ⅱ) 내에서 연속적인 계대접종들을 통해 배양된다.

- 혈청이 보충되지 않은 신규한 무-혈청 배지 (ⅱ). 그 후에 상기 조류 세포들은 상기 무-혈청 배지 (ⅱ) 내에서 직접적으로 배양된다 (직접적 이탈).

바람직한 실시양태에서, 상기 혈청 결핍은 점진적 이탈에 의해 수행된다.

제1 실시양태에서, 혈청 결핍의 방법은 proce

본 발명에 따르면, "무-혈청 배지" (SFM)는 사용될 준비가 된 세포 배양 배지, 즉 다시 말하면 세포 생존 및 세포 성장을 허용하는 혈청의 추가를 요구하지 않는 배지를 의미한다. 이 배지는 화학적으로 정의될 필요가 없으며, 다양한 기원, 예컨대 식물 유래의 가수분해물들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 SFM은 "비-동물 기원"으로 한정되는데, 다시 말하면 이는 동물 또는 인간 기원의 성분들을 포함하지 않는다 (FAO 지위: "동물기원이 없는")는 것이다. SFM에서, 상기 천연 혈청 단백질들은 재조합 단백질들로 대체된다. 다르게는, 본 발명에 따른 SFM 배지는 단백질을 포함하지 않고/않거나 (PF 배지: "무-단백질 배지") 화학적으로 합성된다 (CDM 배지: "화학 합성 배지"). SFM 배지는 몇 가지 장점을 갖는다: (ⅰ) 첫 번째 장점으로 이러한 배지들의 조절 순응성 (regulatory compliance)(실제로 BSE, 바이러스와 같은 우발적 요인들에 의한 오염 위험이 존재하지 않음); (ⅱ) 정제 공정의 최적화; (ⅲ) 더 나은 한정 배지 (defined medium)로 인한 상기 공정상에서의 더 나은 반복재현성. 상업적으로 이용가능한 SFM 배지의 예시는 다음과 같다: VP SFM (InVitrogen Ref 11681-020, catalogue 2003), Opti Pro (inVitrogen Ref 12309-019, catalogue 2003), Episerf (InVitrogen Ref 10732-022, catalogue 2003), Pro 293 S-CDM (Cambrex ref 12765Q, catalogue 2003), LC17 (Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5CDM (Cambrex ref 12-766Q, catalogue 2003), HyQ SFM4CHO (Hyclone Ref SH3051502), HyQ SFM4CHO-Utility (Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293 (Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero (Hyclone Ref SH30352.02), Ex 세포 293 배지 (JRH Biosciences ref 14570-1000M), Ex 세포 325 PF CHO 무-단백질 배지 (JRH Biosciences ref 14335-1000M), Ex 세포 VPRO 배지 (JRH Biosciences ref 14560-1000M), Ex 세포 302 무-혈청 배지 (JRH Biosciences ref 14312-1000M).

본 발명은 또한 무-혈청 배지에서 성장할 수 있는 조류 세포주들, 바람직하게는 비-형질전환된 세포주들을 얻는 방법에 관한 것이다; 이들 세포주들은 선택적으로 영양세포들을 포함하는 완전 배양 배지에서 배양된다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 상기 조류 세포, 바람직하게는 비-형질전환된 조류 세포를 선택적으로 영양층을 포함하는 완전 배양 배지 내에서 배양하는 단계. 상기 조류 세포는 상기 단계 a)의 조류 세포, 예컨대 EBl, EB14 또는 S86N45 (또한 EB45로도 명명됨)와 같이 본 발명의 방법에 따라 확립된 조류 세포주들 또는 DF1 (미국 특허 제5,672,485호 및 제6,207,415호)과 같은 다른 조류 배아 유래 세포주일 수 있다;

- 혈청의 점진적 또는 직접적 제거에 의해, 혈청의 완전한 이탈을 얻기 위하여 상기 배양 배지를 변형하거나 교환함으로써 배양 상태로 적어도 한 번의 계대접종;

- 무-혈청 배지 내에서 성장할 수 있는 부착성 또는 비-부착성 조류 세포주들을 확립하는 단계.

본 발명은 동물 혈청이 보충된 기본 배양 배지로부터 무-혈청 배지로의 계대접종이 상기 기본 배양 배지로부터 혈청의 단순한 제거에 의해서 수행되는 것이 아니라 무-혈청 배지 (SFM)여야 하는, 상기 배양 배지의 유형에 있어서의 변화가 필요하다는 발견에 근거한 것이다. 더욱이, 상기 조류 세포주들이 성장인자들 또는 영양세포들을 이용하여 성장하는 것이 요구될 때, 상기 혈청 이탈은 성장인자들 및/또는 영양세포들 내에서의 이탈 후에 수행되는 것이 바람직하다.

상기 영양세포들은 바람직하게는 방사선 조사 또는 마이토마이신으로의 화학적 처리에 의해 불활성화된 동물세포들이다. 상기 영양세포들은 SCF와 같은 성장인자들을 발현하기 위하여 유전적으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 상기 영양세포들은 STO (American Type Culture Collection ATCC N^OCRL-1503)와 같은 마우스 섬유모세포 세포주들이다.

상기에 기술된 방법은 단계 c)에서 얻어진 세포들을 인간 또는 동물 치료를 목적으로 하는 백신들의 생산에 적합한 클론들을 얻기 위하여 대규모 생산에 유용한 배양 배지 내에서의 선별 또는 적응을 수행하는 단계를 부가적으로 포함할 수 있다.

이 방법은 상당한 기간 이상으로 생체 외에서 배양 상태로 유지되는 새로운 조류 배아 유래 세포주들의 확립을 유도한다. 유익하게는, 상기 단계 c)에서 얻어진 세포주들로부터 유래된 세포들은 적어도 50일, 100일, 300일 또는 바람직하게는 적어도 600일간 증식할 수 있다. 상기에서 얻어진 세포주들은 훨씬 더 긴 기간 이후에도 여전히 생존하고 있기 때문에, 상기 600일이 시한을 구성하는 것은 아니다. 따라서, 이들 세포주들은 외인성 성장인자들, 혈청 및/또는 불활성화 영양층이 없는 기본 배양 배지 내에서 무한적으로 성장할 수 있는 것으로 간주된다. 상기 표현 "세포주 (line)"는 동일한 형태학적 및 표현형적 특징들을 보다 크거나 보다 작은 정도로 유지하면서 생체 외에서 무한정으로 증식할 수 있는 세포들의 임의의 집단을 의미하는 것으로 이해된다. 물론, 상기에 언급된 방법은 확립된 세포주들로부터 얻어진 세포들로부터 유래된 세포성 클론들을 획득하는 것을 가능케 한다. 이들 클론들은 그들이 분열에 의해 유도된 세포와 유전적으로 동일한 세포들이다.

상기 확립된 세포주들 및 그의 유도된 세포들 (단계 c 또는 d)은 바람직하게는 조류 배아 유래 줄기세포주들이고, 더욱 바람직하게는 이들 세포들은 다능성 조류 배아 유래 줄기세포들이다. 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 상기 조류 배아 유래 줄기세포들은 39℃에서 약 24시간 미만의 배가시간을 갖는 작고, 둥근, 개별화된 세포들이다. 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 상기 세포들은 적어도 계대접종 p60, 적어도 p70, 적어도 p80, 적어도 p90, 적어도 p100, 적어도 p110, 적어도 p120 또는 적어도 p130 또는 더 이후의 것이다. 본 발명에 따른 상기 조류 배아 유래 줄기세포들은 하기 특징들의 적어도 하나를 갖는다:

- 높은 핵-세포질 비 (nucleo-cytoplasmic ratio),

- 내인성 알칼라인 포스파타제 활성,

- 내인성 텔로머라제 활성,

- 항체들 SSEA-1 (TEC01), SSEA-3, 및 EMA-1의 그룹으로부터 선택된 특이적 항체들에 대한 반응성.

- 본 발명의 방법에 의한 단계 a)의 조류 세포들의 배가시간보다 짧은 배가시간 (39℃에서 48 내지 72시간), 동일한 배양 조건들 하에서 약 24시간 미만의 배가시간.

- 이들 세포주들 및 이들로부터 유래된 세포들은 적어도 50일, 100일, 150일, 300일, 또는 바람직하게는 적어도 600일간 기본 배지, 구체적으로는 당분야의 숙련자에 의해 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제들이 보충된 DMEM, GMEM, HamF12 또는 McCoy와 같은 배지에서 증식할 수 있다. 이들 첨가제들 중에서, 비-필수 아미노산류, 비타민류 및 소듐 파이루베이트가 언급될 수 있다. 그러나, 상기 세포들은 글루타민이 없는 기본 배지에서 증식할 수 있다.

- 이들 세포주들 및 이들로부터 유래된 세포들은 부착성 세포들 또는 부유성 세포들로서 성장하는 특징을 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 세포들은 상기에 언급된 특징들을 모두 갖는다.

본 발명의 조류-확립된 세포주들 및 이들로부터 유래된 세포들은 재조합 펩티드들 및 단백질들 (즉, 항체류, 호르몬류, 사이토카인류 등), 바이러스, 바이러스 백터들, 바이러스 입자들 및 바이러스 백신들과 같은 생물제제의 생산에 유용하다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 조류 확립 세포주들 및 이들로부터 유래된 세포들은 암 및 감염성 질환들과 같은 질환들에 대한 생 또는 약독화된, 재조합되거나 그렇지 않은, 백신들의 생산을 위한 바이러스 및/또는 관련된 벡터들 및 입자들의 복제에 유용하다. 상기 바이러스들, 관련된 바이러스 벡터들, 바이러스 입자들 및 바이러스 백신들은 바람직하게는 아데노바이러스, 헤파드나바이러스, 허피스바이러스, 오르소믹소바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 폭스바이러스, 레오바이러스 및 레트로바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 바이러스들, 관련된 바이러스 벡터들, 바이러스 입자들 및 바이러스 백신들은 폭스바이러스 패밀리, 더욱 바람직하게는 코르도폭스바이러스에 속한다. 더욱 바람직하게는, 상기 바이러스 또는 관련된 바이러스 벡터들, 바이러스성 입자들 및 바이러스 백신들은 조류 폭스바이러스, 카나리아 폭스바이러스 (즉, ALVAC), 쥬네 폭스바이러스 (juneopox virus), 구관조 폭스바이러스 (mynahpox virus), 비둘기 폭스바이러스 (pigeonpox virus), 앵무새 폭스바이러스 (psittacinepox virus), 메추라기 폭스바이러스 (quailpoxvirus), 참새 폭스바이러스 (sparrowpoxvirus), 찌르레기 폭스바이러스 (starling poxvirus), 칠면조 폭스바이러스로부터 선택된 조류 폭스바이러스 (avipoxvirus)이다. 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 바이러스는 우두바이러스이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 바이러스들, 관련된 바이러스 벡터들, 바이러스 입자들 및 백신들은 오르소믹소바이러스의 패밀리, 구체적으로는 독감바이러스 및 파라믹소바이러스, 구체적으로는 홍역, 볼거리 및 루벨라바이러스에 속한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조류 확립 세포주들 내에서 발현되고/되거나 생산된 생물제제들, 구체적으로는 단백질들 및 백신들에 관한 것이다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 유전적으로, 생물학적으로 혹은 화학적으로 변형되지 않고, 배양 상태로 무한정으로 증식할 수 있고, 오르소믹소바이러스 패밀리의 생 또는 약독화된 바이러스들, 좀더 구체적으로는 생 또는 약독화된 우두바이러스 및 재조합 우두바이러스를 복제하기 위한 상기 특징들을 갖는, 본 발명의 부착성 또는 비-부착성 조류 확립 세포주들의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 상기에 기술된 방법에 따라 단계 c) 또는 d)에서 확립된 부착성 또는 비-부착성 세포주들을 배양하고, 상기 세포들에 바이러스 입자들을 접종하고, 상기 세포들을 세포 용해가 야기될 때까지 기본 배지 내에서 배양하고, 상기 배지 내로 분비된 새롭게 생산된 바이러스 입자들을 회수하는 것을 포함하는, 생 또는 약독화 백신들을 생산하기 위하여 상기에 정의된 바와 같은 부착성 또는 비-부착성 세포들의 용도를 목표로 한다. 본 발명은 오르소믹소바이러스의 패밀리, 구체적으로는 우두바이러스, 리스터-엘스트리 (Lister-Elstree) 바이러스 균주, ATCC로부터 입수가능한 변형 우두바이러스 앙카라 (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA)(ATCC Number VR-1508), NYVAC (Tartaglia et al., 1992, Virology 188: 217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine 12: 675-681), CV178 (Kempe et al., 1968, Pediatrics 42: 980-985) 및 다른 재조합 우두바이러스와 같은 변형된 우두바이러스에 속하는 약독화 바이러스의 생산에 특히 유용하다. 유익하게는, 상기 확립된 세포주들로부터 유래된 세포들은 변형된 우두바이러스 및/또는 재조합 우두바이러스인 생 우두바이러스 또는 약독화 바이러스를 생산하기 위하여 감염된다. 상기 세포들은 당분야의 숙련자에게 이용가능한 임의의 방법들에 의해 감염될 수 있다.

다르게는, 상기 확립된 세포주들로부터 유래된 세포들은 변형된 우두바이러스 및/또는 재조합 우두바이러스인 생 우두바이러스 또는 약독화 바이러스를 생산하기 위하여 형질감염되거나 변형된다. 상기 세포들은 당분야의 숙련자가 이용가능한 임의의 방법, 구체적으로는 동종 또는 동종, 지정 및/또는 조건 조합 (Cre-Lox 또는 FLP-FRT 시스템)에 의해, 임의의 벡터, 플라스미드, 바이러스 또는 재조합 바이러스들, 구체적으로는 레트로바이러스 또는 재조합 레트로바이러스의 도움으로 형질전환에 의해 변형될 수 있다.

하나의 특정 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 기술된 방법에 따라 단계 c) 또는 d)에서 확립된 부착성 또는 비-부착성 세포주들을 배양하고, 상기 세포들에 바이러스 입자들을 접종하고, 상기 세포들을 세포 용해가 야기될 때까지 기본 배지에서 배양하고, 상기 배지 내로 분비된 새롭게 생산된 바이러 입자들을 회수하는 것을 포함하는, 천연두에 대한 백신과 같은 생 또는 약독화 백신을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 폭스바이러스 패밀리, 구체적으로는 우두바이러스, 리스터-엘스트리 우두바이러스 균주, ATCC로부터 입수가능한 변형 우두바이러스 앙카라 (MVA)(ATCC Number VR-1508), NYVAC (Tartaglia et al., 1992, Virology 188: 217-232), LC16m8 (Sugimoto et Yamanouchi, 1994, Vaccine 12: 675-681), CV178 (Kempe et al., 1968, Pediatrics 42: 980-985) 및 다른 재조합 우두바이러스들과 같은 변형된 우두바이러스에 속한다. 예를 들면, 천연두에 대한 백신으로서 MVA가 사용될 수 있다.

두 번째 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 질환들, 보다 바람직하게는 후천적 또는 감염성 질환들에 대한 백신들과 같은 생 또는 약독화 백신들을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다; 상기 방법은 상기에 기술된 방법에 따라 단계 c) 또는 d)에서 확립된 부착성 또는 비-부착성 세포주들을 배양하고, 상기 세포들에 바이러스 입자들을 접종하고, 상기 세포들을 세포 용해가 야기될 때까지 기본 배지에서 배양하고, 상기 배지 내로 분비된 새롭게 생산된 바이러스 입자들을 회수하는 것을 포함한다. 예를 들면, 하기에 대한 항원을 발현하는 재조합 MVA를 사용할 수 있다:

- 제한 없이 예를 들면, 전립샘암, 췌장암, 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종과 같은 후천적 질환들;

- 제한 없이 예를 들면, AIDS (HIV 바이러스), A형 간염, B형 간염, C형 간염, 말라리아, 공수병, 황열병, 일본 뇌염, 볼거리, 홍역, 루벨라와 같은 감염성 질환들.

상기 방법에 의해 생산된 백신들은 본 발명의 일부이다.

상기 서술의 암시를 위하여, 하기 도면들에 대한 범례로서 참고문헌이 만들어질 것이다.

도 1은 세포들의 장시간 복제를 나타내는 본 발명의 한 세포주의 성장 곡선을 나타낸 것이다.

도 2는 S86N45 (EB45)(부착성) 및 EB14 (부유성) 세포들의 모집단 배가시간을 나타낸 것이다.

도 3은 S86N45 (EB45) 세포의 성장 동역학에 대한 온도의 영향을 나타낸 것이다.

도 4는 혈청이 제거된 상태에서 (2% 혈청까지) 세포들의 장시간 복제를 나타내는 본 발명의 한 세포주의 성장 곡선을 나타낸 것이다.

도 5는 무-혈청 배지 (SFM)에서 성장하기 위한 S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들의 적응을 나타낸 것이다.

도 6은 무-혈청 배지를 포함하는 2 ℓ 생체반응기에서 EB14 부유성 세포들의 배양을 나타낸 것이다.

도 7은 영양층이 제거된 상태에서 세포들의 장시간 복제를 나타내는 본 발명의 한 세포주 (S86N16)의 성장 곡선을 나타낸 것이다.

도 8은 조류 줄기세포들의 특징적인 형태를 나타내는 사진이다 (S86N99로부터 분리, ×40 배율, 소니 사이버샷 디지털 카메라로 찍은 사진).

N: 핵, n: 핵소체; C: 세포질

도 9는 부착성이거나 부유 상태인 조류 줄기세포주들의 알칼라인 포스파타아제 활성을 나타내는 사진들이다.

고정 (0.1% 폼알데하이드/0.5% 글루타르알데하이드, 4℃에서 30분) 후, 상기 세포들을 1× PBS로 2회 세척하고 NBT/BC1P 용액 (나이트로블루 테트라졸륨 클로라이드 0.375 ㎎/㎖, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트 0.188 ㎎/㎖, 0.1 M 트리스, pH 9.5, 0.05 M MgCl2, 0.1 M NaCl) 내, 37℃에서 10 내지 30분간 배양하였다. 상기 반응을 1× PBS로 2회 세척하여 정지시킨 후 사진을 찍었다.

A는 어떠한 영양층 또는 성장인자도 없이 배양된 세포주로서, 부착성 세포주 S86N45 p87를 이용하여 얻어진 내인성 알칼라인 포스파타제 활성의 특징적인 보라색 응축을 나타낸 것이다 (×40 배율, 소니 사이버샷 디지털 카메라).

B는 어떠한 영양층 또는 성장인자도 없이 배양된, S86N45 세포들로부터 유래된 세포주로서, 부유 상태에서 8회 계대접종간 유지된 EB14 세포주를 이용하여 얻어진 내인성 알칼라인 포스파타제 활성의 특징적인 보라색 응축을 나타낸 것이다 (×20 배율, 소니 사이버샷 디지털 카메라).

C는 S86N45 (EB45) 세포-특이적인 마커들이다.

도 10은 CEF 및 부착성 S86N45 (EB45) 세포들의 바이러스 감수성을 나타낸 것이다 (감염 후 72시간 경과: MOI 0.1).

도 11은 다양한 감염다중도 (MOI)에서 CEF 및 부착성 S86N45 (EB45) 세포들의 바이러스 감수성을 나타낸 것이다 (감염 후 48시간 경과).

도 12는 부착성 S86N45 (EB45) 세포들 상에서 MVA-GFP 증식의 동역학을 나타낸 것이다.

도 13은 부유성 EB14 세포들 상에서 MVA-GFP 증식의 동역학을 나타낸 것이 다.

도 14는 DMEM-F12 배지에서 성장한 S86N45 (EB45) 세포들 상에서 MVA-GFPD 복제를 나타낸 것이다.

도 15는 DMEM-F12 배지에서 성장한 S86N45 (EB45) 세포들 상에서 야생형 MVA 바이러스의 복제를 나타낸 것이다 (MOI: 0.1).

도 16은 혈청-함유 배지에서 성장한 부유성 MVA EB14 세포들 상에서 MVA 복제를 나타낸 것이다 (MOI: 0.2).

도 17은 무-혈청 배지에서 성장한 부유성 EB14 세포들 상에서 MVA 복제를 나타낸 것이다 (MOI: 0.01).

도 18은 무-혈청 배지에서 성장한 EB14 세포들 상에서 MVA 수율을 나타낸 것이다 (MOI: 0.01).

실시예 1: 부착성 세포들의 생산 및 확립

달걀들을 깨고, 깬 상태에서 난황을 난백으로부터 분리한다. 배아들을 난황으로부터 직접 또는 파스퇴르 피펫을 이용하여 또는 작은 흡착 여과지 (Whatmann 3M paper)를 이용하여 제거하고, 천공기를 이용하여 관통된 고리의 형태로 미리 절단한다. 상기 천공의 직경은 약 5 ㎜이다. 이들 작은 고리들은 오븐에서 약 30분간 건조 가열하여 멸균된다. 이 작은 종이 고리를 상기 난황의 표면에 놓는데, 배아가 상기 종이 고리에 의해 둘러싸이도록 배아를 중앙에 놓았다. 그 후에 작은 가위를 이용하여 절단되고 완전히 제거된 배아를 PBS 또는 생리식염수로 채워진 페트리 디쉬에 놓는다. 상기 고리에 의해 그렇게 제거된 배아는 배지 내에서 과량의 난황으로 세척되고, 그로 인해 과량의 난황이 제거된, 배아 디스크를 파스퇴르 피펫을 이용하여 회수한다.

두 경우 모두에서, 상기 배아들을 생리학적 배지 (1× PBS, 트리스 글루코스, 배지 및 기타 등등)를 포함하는 튜브 내에 놓는다. 그리고 나서 상기 배아들을 기계적으로 분리하고 한정 배양 배지 내에서 "영양세포" 상에 접종한다. 배양을 위한 바람직한 조건들 중에서, 초기 농도 12 내지 8%의 송아지 태아 혈청, 1%의 비-필수 아미노산류, 1%의 상업적 출처의 비타민류 혼합물, 최종 농도 1 mM의 소듐 파이루베이트, 최종 농도 0.2 mM의 베타-머캅토에탄올, 최종 농도 2.9 mM의 글루타민, 최종 농도 10 ng/㎖의 젠타마이신을 포함하는 항생제들의 혼합물, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린 및 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 기본 배지로서 MacCoy 또는 DF12 배지로 구성된 배양 배지를 사용하는 것이 선호된다. 상기 세포들의 첫 번째 계대접종 이후에 신속하게, 항생제들의 혼합물은 더 이상 상기 배지에 첨가되지 않는다. 상기 표현 "신속하게"는 통상적으로 첫 번째 3 내지 5회 계대접종 이후를 의미하는 것으로 이해된다. 뉴클레오시드들의 혼합물이 또한 첨가될 수 있는데, 상기 혼합물은 상기에 기술된 바와 같이 제조된다 (Pain et al., 1996). 이러한 동일한 조건들 하에서 조사되어 동일한 결과들을 나타내는 기본 배지들은 HamF12, Glasgow MEM 및 DMEM 배지들로, 후자는 바이오틴이 8 ㎎/ℓ의 최종 농도로 보충된 것이다. 비교를 위하여, 상기 바이오틴 농도는 MacCoy 배지에 서는 0.2 ㎎/ℓ, HamF12 배지에서는 0.073 ㎎/ℓ 및 상업적인 DMEM 및 GMEM 배지에서는 0 ㎎/ℓ이다.

상기 배양 배지에 첨가되는 성장인자들 및 사이토카인들은 최종 농도 1 ng/㎖의 마우스 SCF, 최종 농도 5 ng/㎖의 IGF-1, 최종 농도 1 ng/㎖의 CNTF, 최종 농도 1 ng/㎖의 IL-6 및 최종 농도 0.5 ng/㎖ 내지 1 ng/㎖의 IL-6 수용체를 포함하는, 재조합된 인자들 및 사이토카인들인 것이 바람직하다. 동일한 실험들에서, 일부 다른 인자들이 첫 번째 계대접종 동안에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 3 또는 10회 계대접종까지는, 상기 배지에 bFGF를 1 ng/㎖의 최종 농도로, IL-11을 1 ng/㎖의 최종 농도로 첨가할 수 있다.

상기 접종은 세포주들로서 확립된 마우스 섬유모세포인 STO 세포들로 구성된 불활성화 "영양세포" (feeder) 상에서 이 배지 내로 수행된다. 일부 경우에, 이들 세포들은 연속적으로 상기 STO 세포들 내에서, 조류 SCF와 같은 성장인자들의 발현을 허용하는 단순 발현벡터들로 형질감되었다. 따라서, 그러한 "영양세포"는 수용성이고/이거나 상기 세포들의 원형질막에 부착된 형태의 인자들을 생산한다.

상기 세포들의 이 배지 내로의 직접적인 초기 접종 후에, 신선한 배지를 첨가하거나 다음날 상기 배지를 부분적으로 교체할 수 있고, 그 후에 원발성 세포들에 대해 관찰된 부착 비율에 따라, 이후 기간 동안에 부분적으로 또는 완전히 교체할 수 있다. 경우에 따라서 약 4 내지 7일 후에, 초기 배양액은 분리되어 불활성화 영양세포 상에 동일한 초기 배지를 포함하는 새로운 디쉬들 내로 옮겨진다. 3 내지 5회 계대접종 후에, 상기 세포들을 네오마이신, 하이그로마이신 및 퓨로마이 신 등에 대한 내성을 갖는 유전자와 같이 항생제에 대한 내성을 암호화하는 발현벡터로 형질감염되지 않은 또는 형질감염된 STO 세포들의 불활성화 영양세포 상에서 배양한다. 약 20회 계대접종 후에, 상기 세포들은 점진적으로 성장인자류 및 사이토카인들이 결핍된다. 상기 표현 "점진적 제거"는 상기 배양 배지로부터 성장인자가 하나 하나씩 또는 성장인자들의 그룹이 하나 하나씩 제거되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 첫 번째 실시양태에서는, 1회 계대접종에서, SCF가 먼저 제거되고, 그리고 나서, 2 또는 3회 계대접종 이후에, 예를 들면 IGF-1과 같은 다른 성장인자가 제거된다. 만약 상기 세포들이 형태학적 변형 또는 그들의 평균 증식율에서의 다양성을 나타내지 않는다면, 예컨대 CNTF 및 IL-6과 같은 다른 성장인자들이 그 후에 제거된다. 두 번째 바람직한 실시양태에서, 성장인자들의 제거는 성장인자들의 그룹 하나하나에 대해 수행된다. SCF, IL6, IL6R 및 IL11로 구성된 성장인자들의 첫 번째 그룹이 먼저 제거되고, 그 후에 IGF1 및 CNTF로 구성된 두 번째 그룹이 제거된다. 세 번째 실시양태에서, 상기 제거는 또한 급격하게 진행될 수 있다. 모든 인자들은 이 경우에 한번에 제거된다. 그리고 나서, 상기 세포들은 관찰되고, 만약 그들의 증식율이 변형된다면 이후 수일간 바로 계대접종된다. 후자의 방법이 통상적으로 실행되고 있다.

그로부터 다양한 분리물들이 얻어지고 매우 긴 시간 동안 유지된다. 상기 표현 "매우 긴 시간 동안"은 시간에 제한 없이 최소 50일의 연속적인 수 주간, 바람직하게는 200 내지 400일 이상의 연속적인 수 주간의 기간을 의미하는 것으로 이해된다. 600일 이상의 기간 동안 관찰된다.

사용된 지지체에 관계없이, 부착성인 모든 세포들은 프로네이즈, 콜라게나제, 디스파제, 트립신 및 기타 등등과 같은 단백질분해 해리 효소 (proteolytic dissociation enzyme)를 이용하여 분리된다. 바람직하게는, 세균 기원의 단백질분해 효소가 동물 기원의 임의의 단백질 오염을 피하기 위하여 사용된다. 이들 세포들은, 예시로서, 도 8의 사진에 의해서 표시되는 특이적인 형태, 즉 작은 크기, 큰 핵-세포질 비율, 명확하게 육안으로 확인되는 적어도 한 개의 핵소체를 갖는 핵, 및 매우 작은 세포질의 형태를 갖는 배아 줄기세포들의 특징들을 나타낸다. 이들 세포들은 다소 조밀한 고형 덩어리 형태로 성장하는 것을 특징으로 한다. 상기 부착성 및 비-부착성 세포들은, 패인 등 (Pain et al., 1996), 미국 특허 제6,114,168호 및 EP 특허 제787,180호에서 기술된 바와 같이, 많은 항체들에 대해 교차-반응성을 나타낸다. 내인성 텔로머라제 활성 성분이 또한 존재하고 이들 세포들의 "줄기" 성질에 중요한 인자이다.

다른 분리물들의 세포들이 얻어지고 매우 긴 시간 동안 유지된다. 표 1은 이들 분리물들의 몇몇 특징들을 나타낸 것이다.

상기 용어 "정지 (stoppage)"는 상기 세포들의 증식의 종결에 해당하는 것이 아니라 실험자에 의한 상기 세포 배양물들의 계획적인 정지에 해당하는 것임이 인식될 것이다. 세대 n의 숫자는 수학식 X=2ⁿ에 의해 얻어지고, X는 이론적으로 축적된 세포들의 숫자이다. 이 숫자는 상기 세포들이 각 계대접종에서, 그리고 각 접종 동안에 세어진 것이기 때문에 이용가능하다. 상기 배양의 완전한 기록은 따라서 이용가능하다. S86N45 세포들은 또한 E1345로 명명된다.

실시예 2: 세포들의 계대접종

줄기세포들, 구체적으로는 체세포 줄기세포들 (somatic stem cells) 및 배아줄기세포들의 특징들 중 하나는 상당한 기간 동안 생체 외에서 증식할 수 있는 그들의 능력이다. 상기 세포들을 증식시키고 계대접종하기 위하여, 상기 배양 배지를 그들의 계대접종 몇 시간 전에 교환하고 새로운 배지로 대체하였다. 도 1에 나타난 곡선은 세포 성장 및 확립의 프로파일을 나타낸다.

실시예 3: 배가시간 및 평균 분열시간

3.1 배양 상태로 확립된 세포들 및 앞선 실시예들에서 제시된 세포들을 이용하여, 평균 분열시간이 계산될 수 있다. 얻어진 모든 개별적인 분리물들에 대하여, 증식율은 연속적인 계대접종 동안 약간 증가하였는데, 이는 상기 세포들의 확립 동안에 평균 분열시간의 변화를 야기한다. 부착기에서, 상기 세포들은 초기에 불활성화된 영양층 상에 접종되고, 100 ㎜ 디쉬 (55 ㎠ 디쉬) 당 1 내지 2×10⁶ 세포들의 초기 접종 밀도로 정기적으로 계대접종된다. 표 2는 배양시간에 대한 함수로서 3개의 확립된 세포 유형들에 대하여 배가시간 (d) 및 평균 분열시간 (시간으로 MDT)을 나타낸 것이다. 상기 평균 배가시간은 확립기간 동안에 감소하는 것으로 관찰된다.

평균 배가시간 d는 하기 수학식을 이용하여 일수로 표시되는 시간의 기간에 대해 정해진다:

d=(1/Log2×(LogX2/X1))×1/(T2-T1)

상기에서, X2 및 X1은 시간 T2 및 T1에서의 총 세포수이다. 상기 수학식은 실시예 1에 나타낸 수학식 X=2ⁿ에 의한 세대 N의 수를 계산하여 얻은 직접적인 결과이다. 그 후에, 상기 평균 분열시간 (MDT)은 24시간을 d로 나눔으로써 시간으로 얻어진다.

* Valo 세포들은 영양세포가 존재하지 않는 상태에서 플라스틱 지지체 상에서 이러한 확립기간 동안에 계대접종된다. 배가시간은 감소하고, 그 후에 상기 세포들이 이 새로운 환경에 재적응하게 되면 다시 증가한다.

3.2 닭들은 39℃의 체온을 갖는다. 따라서, S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들의 세포 성장 동역학 분석은 초기에는 39℃에서 수행되었다. 이러한 조건들 하에서, 세포들은 일반적으로 15 내지 20시간 범위를 포함하는 매우 짧은 세대시간에 의해 특정되었다 (도 2).

실시예 4: 세포 배양 온도

39℃에서 S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들의 매우 신속한 주기성 (rapid cycling)은 효과적인 MVA 바이러스 생산을 위한 차선일 수 있다. 따라서, 37℃ 및 35℃에서의 세포 성장이 또한 분석되었다 (도 3). 예상대로, 세포 주기성은 37℃에서 감소한다. 이러한 조건들은 원칙적으로는 바이러스 증식에 훨씬 더 적당해야하고, 따라서 하기에 기술된 MVA 실험들에서 선택될 것이다. S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들 역시 비록 훨씬 감소된 동역학을 나타내기는 하지만, 35℃에서 성장할 수 있는 것으로 인식하는 것이 적절하다. S86N45 및 EB14 세포들의 낮은 온도 (35℃ 및 심지어 33℃)에의 적응은 생 약독화 열-민감성 바이러스 백신들의 생산을 위해 특히 유용하다.

실시예 5: 새포주들의 증식을 위한 혈청 농도의 조절

5.1-저-혈청 농도를 갖는 배지

이러한 세포주들을 획득하는 동안, 사용되는 배양 배지는 비-필수 아미노산류, 비타민류, 및 소듐 파이루베이트와 같은 다양한 첨가제들이 보충된 기본 배지 (DMEM, GMEM, HamF12, McCoy, 및 기타 등등)를 포함하는 통상적인 배양 배지이다. 이러한 복합 배지는 송아지 태아 혈청을 포함하는데, 이는 식물 성분들을 포함하는 다른 기원들의 성분들이 점차적으로 사용가능하다고 하더라도, 상기 배양의 핵심 성분으로 남게된다. 송아지 태아 혈청의 상대적으로 낮은 비율에 대해 세포들이 조절하고 적응하는 과정이 나타난다. 따라서, 낮은 혈청 비율 (예를 들면, S86N16 세포들의 경우에는 2%)에서 높은 증식율 (분열시간>1)로 세포들을 유지하는 것이 가능하다.

도 4에 나타난 곡선들은 주어진 세포 유형: S86N16 세포들에 대한 혈청의 상대적인 감소를 나타낸 것이다. 배가시간 및 평균 분열시간 역시 계산되어 표 3에 나타내었다. 상기 평균 분열시간은 혈청에 있어서 상대적인 감소의 함수로서 증가한다는 것이 인식될 것이다. 그럼에도 불구하고, 회복기는 상기에 언급된 조건들 하에서 얼마 후에 배양 상태로 관찰된다. 그럼에도 불구하고, 이 시간은 여전히 24시간 미만인데 (d>1), 이는 이미 상대적으로 낮은, 2%의 혈청 농도에서조차도 산업적 측면에서는 매우 유용한 증식을 나타낸 것이다. 사용되는 서로 다른 대사산물들과 관련한 향상이 이 시간을 증가시키고 배양 조건들을 보다 더욱 최적화하기 위하여 고안될 수 있다.

S86N16 세포들에 대한 배가시간 및 평균 분열시간

예시들로는 10% 조건에 대해서 계대접종 p204 및 p179 범위, 7.5%에 대해서 계대접종 p198 및 p176 범위, 3.75%에 대해서 계대접종 p224 및 p201 범위, 그리고 2%에 대해서 계대접종 p216 및 p199 범위를 들 수 있다.

5.2-무-혈청 배지에 대한 적응 및 생체반응기에서의 성장

주요한 추가적인 향상이 무-혈청 배지에 대한 S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들의 적응에 의해 달성되었다. 몇몇 제형들이 조사되어졌고, 두 개의 무-혈청 배지 제형들이 S86N45 (EB45) 및 EB14 세포들의 효과적인 성장을 가능케 하는 것으로 규명되었다 (도 5).

또한, 효과적인 성장이 2 ℓ 생체반응기들 내에서 재현성있게 증명되었기 때문에, 혈청-함유 및 무-혈청 배지에서의 EB14 세포들의 배양은 추가적으로 규모가 커질 수 있다 (도 6). 더욱이, EB14 세포들은 또한 3 ℓ 교반 탱크 생체반응기들 내에서 효과적으로 성장할 수 있고 2백만 세포들/㎖ 이상의 밀도에 도달할 수 있다.

실시예 6: 영양층 세포들의 결핍

초기 배양 조건들 하에서, 불활성화 세포들 층의 존재는 상기에 기술된 바와 같이 배아 줄기세포들을 얻기 위하여 필수적인 것처럼 보인다. 이 영양층은 다수의 계대접종 후에는 더 이상 필요하지 않은 것처럼 보인다. 오직 "배양액 처리된" 플라스틱만이 중요한 것처럼 보인다. 실제로, 일부 진핵세포들의 특징들 중의 하나가 부착 형태로 증식하는 것이다. 상기 세포들의 부착을 용이하게 하기 위하여, 사용된 다양한 플라스틱 물질들은 "배양액" 처리된다. 이들은 그들의 제조시에 상기 플라스틱의 표면에 전하들을 부가하는 처리를 거치는데, 상기 전하들은 세포들의 세포외 기질의 부착을 촉진한다. 이와 대비하여, 종종 세균학적 특성의 플라스틱이라 불리는, 세포 배양액 미처리 플라스틱은 특이적인 영양세포들의 부가에 의해 표면이 처리되지 않는다. 여기에 세포들의 부착은 일반적으로 매우 어렵고, 혹은 심지어 불가능하고, 또는 그 후에 종종 급격한 형태 및 행동에 있어서의 변화를 유도한다. 상기 두 개 플라스틱 특성들간의 이러한 차이는, 거기에서 수행되는 접종들에 따라, 다른 행동양식을 갖는 세포들을 획득하게 할 수 있다. 불활성화 "영양세포들"의 일반적인 결핍은, 몇몇 계대접종 후에, "배양액" 처리된 플라스틱 상에 직접적으로 접종된 줄기세포들의 균질한 배양액들을 획득하게 할 수 있다.

불활성화 "영양세포들"의 존재 및 부재하에서 유지된 상기 세포들의 비교 성장 곡선들은 도 7에서 S86N16 세포들을 이용하여 표시되었다. 상기 세포들의 이러한 적응은 "영양세포" 상에서 초기에 유지된 상기 세포들의 줄기세포 특성이 상실되지 않을 정도로 점진적으로 진행된다. 점진적 유도체들이 그렇게 만들어진다. 플라스틱 상에서 증식하는 세포들의 획득은 제거 과정의 성과이다. 표 4에서, 분열시간들은 이러한 환경에 대한 세포들의 민감성을 나타낸다. 혈청의 점진적인 제거의 경우에서와 같이, 적응은 상기에 정의된 조건들 하에서 약간의 계대접종 후에 상기 세포들에 대한 회복 효과에 의해 달성된다.

예시들로는 1.2×10⁶, 0.5×10⁶ 및 0.3×10⁶ 영양세포들의 세 조건들에 대해서 계대접종 p154 및 p131 범위, 그리고 플라스틱 단독 조건에 대해서는 p161 및 p139 범위를 들 수 있다.

실시예 7: 성장인자들에 있어서 세포들의 결핍

초기 배양 조건들 하에서, 성장인자들의 존재는 필수적이다. 개략적으로 성장인자들은 두 패밀리로 구분하는 것이 가능하다: 사이토카인들 및 영양인자들.

사이토카인들은 주로 그의 작용이 gp130 단백질과 관련이 있는 수용체를 통해 이루어지는 사이토카인들이다. 따라서, LIF, 인터류킨-11, 인터류킨-6, CNTF, 온코스타틴 및 카디오트로핀은 특이적 사슬을 갖는 수용체 농도에서의 보충 및 단량체 또는 때로는 이형이량체 형태에서 후자와 gp130 단백질과의 조합을 갖는 유사한 작용 양식을 갖는다. 몇몇 경우에, 상기 수용체들의 수용성 형태의 조합, 인터류킨-6 및 CNTR의 수용체들에 대해 특히 기술된 형태는 관찰된 증식효과를 증가시킬 수 있다. 이러한 사이토카인들의 적어도 하나의 첨가가 배아 줄기세포들을 획득하는데 필수적이라고 여겨진다는 것은 이미 알려져 있다.

상기 영양인자들은 주로 SCF, IGF-1 및 bFGF로, 이들은 또한 상기에 기술된 바와 같이 배양 초기에도 사용된다. 이들의 존재는 또한 상기 세포들을 획득하고 증폭하는데 필수적이다.

이러한 성장인자들을 점진적으로 감소시킴으로써, 약간의 계대접종 후에, 외인성 성장인자들의 첨가 없이도 배아 또는 체세포 줄기세포들의 증식을 가능케하는 배양 조건들을 획득할 수 있다. 이러한 세포들의 특징을 분석하기 위해 사용되는 서로 다른 마커들은 항상 성장인자들 없이 유지된 세포들에 대해 양성을 나타낸다.

실시예 8: 사용된 배지의 비교

서로 다른 배지에 접종된, 상기 세포들은 동일한 빈도로 얻어지지 않는다. 상기 배지의 조성들의 비교는 상기 성분들 중의 하나를 동정하는 것을 특히 어렵게 만든다. 이는 전체 조합이 상기 세포들의 생리학에 있어서 향상을 가능케 하는 것으로 더욱 여겨진다. 바람직한 배지들 중에서, Ham F12 배지, MacCoy 배지, DMEM 배지, DMEM-F12 배지 및 바이오틴이 강화된 DMEM 배지가 인식될 것이다. 그러한 분리물을 이용하여 시작하는 경우, 적응 실험들은 이들 서로 다른 배지들 내에서 수행된다.

실시예 9: 비- 부착성 세포들의 확립

줄기세포들의 연속적인 계대접종 동안에, 세균학적 디쉬 내로의 직접적인 고-밀도 접종은, 약간의 계대접종 후에, 그들의 기질로부터 분리된 작은 규칙적인 응집체들 형태로 부유상태에서 증식하는 배아 세포들의 획득을 가능케 한다. 이러한 증식은 추가 희석, 기계적 분리 및 단백질분해 효소의 비-사용에 의해 여러 계대접종 이상으로 조장된다. 상기 배양액들의 교반은 일반적으로 수행되지만, 비-부착성 세포들을 획득하기 위한 특징적인 인자를 나타내지는 않는다. 부착성 세포들과 같이, 이들 세포들은 줄기세포들의 특징적인 형태, 즉 작은 크기, 높은 핵-세포질 비율, 명확하게 육안으로 확인되는 적어도 한 개의 핵소체를 갖는 핵 및 작은 세포질을 갖는다. 이들 세포들은 다소 치밀한 작은 응집체들 내에서 성장하는 것을 특징으로 한다 (도 8). 이러한 비-부착성 세포들은, 패인 등 (1996)에서 상기에 기술된 바와 같이, 많은 항체들과 교차-반응성을 보인다. 이들 세포들은 또한 내생적 텔로머라제 활성에 대해 (EBl, EB4 및 E135 세포들에 대해 실시예 10에 나타난 바와 같이) 양성이다. 비-부착기에서, 상기 세포들은 서로 다른 배지상에서 높은 증식을 나타낸다. 초기 접종 및 신선한 배지의 매우 규칙적인 공급은 1×106 세포들/㎖ 이상의 범위를 갖는 높은 밀도를 제공한다. 표 5는 소수 분리물들의 주요 특성들을 요약한 것이다 (모세포들, 초기 계대접종의 현탁액으로의 전환, 현탁액 내에서 배양 상태로 유지된 일수, 상기 유지의 자발적인 정지 이전에 얻어진 계대접종들 및 세대들 수). 따라서, 현탁액으로 만들기 위한 계대접종은 한 분리물에서 다른 분리물 (분리물 EB1 및 EF14 참조)로 변경될 수 있고, 상기 증식율 (분리물 EB3 및 EB14 참조)을 변경시킬 수 있음이 인식될 수 있다.

상기 용어 "게시"는 비-부착 상태 하에 놓이는 세포들에 해당하는 것임이 인식될 것이다.

본 발명자들은 또한 비-부착성 세포들의 획득이 일부 계대접종 후에, 임의의 시점에서, 영양층의 존재 혹은 부재시에 증식하는 부착성 줄기세포들로부터 가능하다는 것을 발견한다.

실시예 10: 확립된 세포들의 특성 분석

오랜 배양기간 동안에 유지된 줄기세포들은 상기에 기술된 바와 같은 동일한 기준으로 특정된다 (패인 등, 1996). 따라서, 도 9a 및 9b의 사진들에 의해 나타난 바와 같이, 내인성 알칼라인 포스파타제 활성, 내인성 텔로머라제 활성 (도 9c) 및 항체들 SSEA-1 (TEC-O1) 및 EMA-1와 같은 특정 항체들에 대한 반응성을 규칙적으로 검출할 수 있다.

상기 세포들의 확립 동안에 중요한 기준들 중의 하나는 텔로머라제의 존재여부이다. 다양한 시험들이 TRAP 검출 킷트 (텔로머라제 PCR ELISA, Roche)를 이용하여 배양 상태로 상기 세포들의 유지기간에 수행되었다. 상기 세포들은 배양 상태로 여러 계대접종 후에 양성으로 검출된다. 따라서, 상기 텔로머라제 활성은 S86N16 세포들, S86N45 (EB45) 세포들, 및 비-부착 형태로 이들로부터 유래된 E131, EB4 및 E135 세포들에 대해서 검출가능하다 (표 6 참조). 일차배양 상태로 유지된 CEFs (계 배아 섬유모세포)는 음성대조군으로 간주된다. OD<0.2의 문턱값은 음성 문턱값으로서 상기 킷트에 의해 권장되는 문턱값이다. 모든 분석들은 2000 세포들의 등가물 상에서 수행되었다.

다양한 계대접종에서 다양한 세포주들 내 텔로머라제 활성의 분석

* CEF: 계 배아 섬유모세포 (Chicken Embryonic Fibroblast)

특히 중요하게는, 본 발명의 상기 세포들은 일부 동일한 필수적인 "줄기세포" 특성들이 보존되어 있다. 이들은 마우스, 닭 및 인간 배아 줄기세포들에 존재하는 것으로 알려진 일련의 줄기세포-특이적인 마커들 (예컨대, 알칼라인 포스파타제, SSEA-1, EMA1, 텔로머라제)을 발현한다 (도 9). 예상한대로, 이들 마커들의 발현은 레티노산 (RA) 또는 DMSO의 첨가에 의해 세포 분화의 실험적 유도상태에서 상실된다 (표 7 및 도 9c 참조). 이들은 무한정으로 생체 외에서 복제한다 (도 1); 여러 후보자 세포주들이 분화와 같은, 특정한 장애물 없이 1년 이상 동안 배양되었다.

ES 세포-특이적인 마커들: "마커들 발현은 레티노산을 이용한 분화시 감소된다."

상기 마커들 SSEAl 및 EMA1은 표지된 세포들의 백분율로 나타내어진다.

실시예 11: 상기 세포들의 형질감염 및 유도

장시간 이상 성장상태로 유지되는 상기 줄기세포들을 다양한 발현 플라스미드들로 형질감염시킨다. 조류 줄기세포들이 형질감염될 수 있다는 것은 공지되어 있다 (패인 등, 1996). 구체적으로는, 상기 비-부착 세포들은 형질감염되고 다양한 분류 시스템들은 안정적으로 형질감염된 세포들을 동정할 수 있다 (세포 분류, 제한 희석 및 기타 등등). 이러한 유전적 변형들은 상기 줄기세포의 미분화 상태에서 이루어질 수 있다. 일단 이러한 변형이 획득되면, 상기 세포는 그 후에 자연적으로 또는 분화 유도제의 첨가에 의해 분화되도록 유도된다. 이러한 경우에, 10^-8 M 내지 10^-6 M 농도의 레티노산 또는 1 내지 2% 최종 농도의 다이메틸 설폭사이드 또는 10^-4 내지 10^-8 M 농도의 소듐 뷰티레이트, 또는 1 내지 5 ㎍/㎖ 최종 농도의 포볼 에스터 (phorbol ester)(TPA, PMA, 및 기타 등등) 또는 지질다당체들을 사용할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포들은 부유상태에서 배아유사체들을 형성할 수 있는데, 이 배아유사체들은 이들을 구성하는 상기 세포들의 분리 또는 비-분리 (non-dissociation) 후에 플라스틱에 부착되는 것이 야기될 수 있다. 이러한 분화된 세포들은 그 후에 증식하지만 장시간 이상의 증식에 대해 보다 제한된 능력을 갖는다. 상기 세포들의 증식에 영향을 미치는 유전자 상에서 유전적 변형을 표적함으로써, 이러한 분화된 세포들이 장시간 이상 증식할 수 있게 만들 수 있다.

실시예 12: 바이러스로 비- 부착성 조류 세포주 ( EB1 )를 감염시기키 위한 프 로토콜

세포들의 증폭:

상기 EB1 또는 EB14 세포들을 통상적으로 50 ㎖ 초기 부피에 대해 5% 혈청을 0.2×10⁶ 세포들/㎖의 농도로 포함하는, 바람직하게는 MacCoys' 5A, HAMF 12 또는 DMEM 배지, 또는 임의의 다른 목적 배지 내에 접종한다. 이들은 39℃, 7.5% CO₂에서 교반하면서 배양상태로 유지된다. 신선한 배지는 100 내지 250 ㎖의 최종 배양 부피에 대해 1 내지 3×10⁶ 세포들/㎖의 세포 농도에 도달하기 위하여 증폭이 지속되는 3 내지 4일 동안 매일 첨가된다.

부유상태의 상기 세포들은 회수되고 약 1,000 rpm에서 10분간 원심분리된다. 상기 펠렛을 20 내지 50 ㎖의 1× PBS (Phosphate buffer Salt)에 재현탁한다. 상기 세포들은 그 후에 세포수를 세고, 원심분리한 후, 침전된 세포들을 무-혈청 배지에 3 내지 5×10⁶ 세포들/㎖의 최종 농도로 현탁한다. 그리고 나서, 여러 개의 튜브들이 튜브당 3 내지 5×10⁶ 세포들을 포함하는 이러한 조건들 하에서 준비된다.

바이러스 제조 및 감염:

공지된 역가를 갖는 상기 바이러스 스톡을 37℃에서 신속하게 해동시키고 무-혈청 배지를 이용하여 최종 감염을 위해 요구되는 농도인 10× 내지 1000×의 역가로 희석한다. 상기 세포들은 바이러스의 종류에 따라 0.01 내지 0.5의 m.o.i. (multiplicity of infection)로 목적하는 바이러스로 감염되는데, 이는 0.1 내지 10% 부피/부피 범위의 바이러스 현택액을 상기 세포 펠렛에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 바이러스에 대한 최적의 온도, 일반적으로 33℃ 내지 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 상기 세포들을 다시 원심분리하고 배지들을 조심스럽게 제거한다. 이 단계는 이후의 공정에서 초기 바이러스의 효과를 제한하기 위하여 종종 요구되는 것으로 확인된다. 가능성들 중의 하나는 이들을 원심분리하지 않고 상기 세포들을 직접 혈청-함유 배지 (5% 혈청)를 이용하여 0.2 내지 1×10⁶ 세포들/㎖의 최종 농도로 희석하고 다시 배양하는 것이다.

상등액 및 세포들의 회수:

배양하고 2 내지 4일 후, 특정 바이러스들의 바이러스 동역학 및 잠재적인 세포변성 효과에 따라서, 상기 세포들 또는 세포 잔여물을 포함하는 배지를 회수한다. 바이러스들에 따라서, 상기 펠렛 또는 상등액만이 목적이 될 수 있고 바이러스 입자들을 포함할 수 있다. 상기 세포들을 회수하고 원심분리한다. 상기에서 모은 상등액을 다시 2,500 rpm에서 5 내지 10분간 원심분리하고 입자들의 분리전까지 -80℃에서 보관한다. 적정을 수행하기 위하여 분액을 모은다. 상기 세포 펠렛을 5 ㎖의 무-혈청 배지로 현탁하고, 초음파 파쇄하고, 2,500 rpm에서 5 내지 10분간 원심분리한다. 이로부터 얻어진 상등액은 분액의 분리 및 적정 전까지 -80℃에서 보관된다.

바이러스 감염 및 생산 효율성이 수행된 다양한 조건들간에 비교된다. 세포변성 효과들을 갖는 바이러스들에 대해서, 상기 적정은 보통 용해 플라크 방법에 의해 수행된다.

실시예 13: 바이러스로 부착성 조류 세포주 ( S86N45 )를 감염시키기 위한 프 로토콜

세포들의 제조:

세포들을 감염 전에 5% 혈청을 포함하는, 바람직하게는 MacCoy's 5A, HAMF12 또는 DMEM 배지, 또는 임의의 다른 목적 배지 내에 0.03 및 0.06×10⁶ 세포들/㎠ 범위의 농도로 T150 플라스크 내에서 48시간 동안 접종하였다. 이들은 39℃ 및 7.5% CO₂에서 유지된다.

감염:

공지된 역가를 갖는 바이러스 스톡을 37℃에서 신속하게 해동시키고 최종 감염을 위해 요구되는 농도인 10× 내지 1000×의 역가로 무-혈청 배지를 이용하여 희석한다. 상기 세포들을 바이러스 종류에 따라 0.01 내지 0.5 m.o.i. (multiplicity of infection)로 목적하는 바이러스로 감염시키는데, 이는 0.1 및 10% 부피/부피 범위의 상기 세포 단층에 바이러스 현탁액을 첨가하는 것을 포함한다. 상기 감염은 일반적으로 0% 혈청을 포함하는 배지 내에서 최소량의 배지 (75 ㎠의 플라스크에 대해 5 내지 10 ㎖)로 수행된다. 상기 바이러스에 대한 최적 온도, 일반적으로 33℃ 내지 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 5% 배지 20 ㎖을 상기 플라스크들에 첨가한다. 특정한 경우에, 상기 세포들은 상기 세포에 부착될 수 있는 입자들을 제거하기 위하여 PBS로 세척될 수 있다. 세포변성 바이러스의 경우에, 상기 세포들은 감염이 제대로 이루어졌음을 나타내는 세포 용해의 발생을 추적하기 위하여 감염 후 매일 관찰된다.

상등액 및 세포들의 회수:

배양하고 2 내지 4일 후, 특정 바이러스들의 바이러스 동역학 및 잠재적인 세포변성 효과에 따라서, 상등액, 세포들 또는 세포 잔여물을 포함하는 배지를 회수한다. 바이러스에 따라서, 펠렛 또는 상등액만이 목적이 될 수 있고 바이러스 입자들을 포함할 수 있다. 상기 세포들을 회수하고 원심분리한다. 상기에서 모은 상등액은 다시 2,500 rpm에서 5 내지 10분간 원심분리하고 입자들의 분리전까지 -80℃에서 보관한다. 적정을 수행하기 위하여 분액을 모은다. 상기 세포 펠렛을 무-혈청 배지로 현탁하고, 초음파 파쇄하고, 2,500 rpm에서 5 내지 10분간 원심분리한다. 이로부터 얻어진 상등액은 분액의 분리 및 적정 전까지 -80℃에서 보관된다.

바이러스 감염 및 생산 효율성은 수행된 다양한 조건들간에 비교된다. 세포변성 효과들을 갖는 바이러스들에 대해서, 상기 적정은 보통 용해 플라크 방법에 의해 수행된다.

실시예 14: EB45 세포주 및 EB14 세포주의 부착성 및 비- 부착성 조류 줄기세포들 상에서 변형 우두바이러스 앙카라 ( MVA )의 복제

일련의 실험들이 MVA 감염에 대한 이들 각각의 감수성, MVA 증식의 동역학 및 바이러스 생산 수율을 결정하기 위하여 EB45 (S86N45) 및 EB14 세포들을 대상으로 수행되었다. 이들 연구들에 사용된 상기 MVA 바이러스들은 리포터 GFP 단백질 (MVA-GFP)을 발현하는 재조합 MVA 벡터이거나 비-재조합 WA 바이러스였다. 신선하게 준비된 계 배아 섬유모세포들 (CEFs)을 대조군 세포로 모든 실험에 포함시켰다.

14.1-안정성 고려

MVA 바이러스 (0.5 ㎖ 바이알에서 역가 2.5×10⁷ TCID50/㎖)는 냉동된 조건 하에서 입수되었다. 안정성 이유로 인해, 상기 MVA 바이러스 및 감염된 세포들은 조절된 조건들 (-80℃ 냉동기) 하에서 보관되었고, 오염된 플라스틱 소재는 저염산 용액 내에 1시간 이상 방치한 후 완전한 그리고 완벽한 가압증기멸균 불활성화를 위해 백 내에 넣었다.

14.2-바이러스 생산

14.2.1- 부착성 S86N45 ( EB45 ) 세포들

1×10⁶ 부착성 세포들을 감염 하루 전에 20 ㎖ 배지를 포함하는 100 ㎜ 접시에 접종하고, 24시간 후에 상기 배지를 제거한 후 세포들을 접종물 (0.01 또는 0.1 TCID/세포의 감염 다중도에서, 2 ㎖ 무-혈청 배지)과 함께 37℃에서 배양하였다. 1시간 후, 상기 접종물을 제거하고, 미리 데워진 20 ㎖의 배지를 상기 세포들에 첨가하고, 상기 배양은 37℃, 5% CO₂에서 유지된다. 바이러스 제조를 위하여, 상기 감염된 세포들을 스크래퍼를 이용하여 회수하고, 50 ㎖ 팔콘^TM 튜브로 옮기고, 실온에서 1,200 rpm으로 원심분리하였다. 상등액 (세포외 바이러스들, EV)은 모으고, 세포 펠렛 (세포내 바이러스들, IV)은 1 또는 2 ㎖의 배지로 희석한다. EV 및 IV 시료들은 모두 세 번의 해동-냉동 순환들을 거치고, 그 후에 이들은 초음파 분쇄된다. 실온에서 10분간 2,500 rpm으로 원심분리한 후, EV 및 IV 시료들을 분액하고 적정전까지 -80℃에서 보관된다.

14.2.2-부유 EB14 세포들

바이러스 접종물을 첨가하기 하루 전에, 0.4×10⁶/㎖ EB14 세포들을 125 ㎖의 스피너 (spinner) 플라스크 내 40 ㎖의 배지에 상기 배지 내 0.01 또는 0.1 TCID/세포의 m.o.i.로 접종한다. 바이러스 배양 1시간 후에, 80 ㎖의 미리 데워진 배지를 첨가한다. 배양은 목적하는 회전 조건들 및 5% CO₂ 하, 37℃에서 유지된다. 감염된 세포들은 그 후에 감염 후 다양한 시점들에서 회수되고, 50 ㎖ 팔콘^TM 튜브로 옮겨지고, 실온에서 1,200 rpm으로 원심분리된다. 상등액 (세포외 바이러스들, EV)은 모으고, 세포 펠렛 (세포내 바이러스들, IV)은 5 또는 10 ㎖의 배지로 희석된다. EV 및 IV 시료들은 모두 세 번의 해동-냉동 순환들을 거치고, 그 후에 이들은 초음파 분쇄된다. 실온에서 10분간 2,500 rpm으로 원심분리한 후, EV 및 IV 시료들을 분액하고 적정전까지 -80℃에서 보관된다.

14.3-바이러스 적정

14.3.1- TCID50 종점 희석법에 의한 MVA 의 적정

MVA 바이러스들의 적정은 CEF 또는 DF-1 세포들 상에서 TCID50 종점 희석법 (end-point dilution method)에 의해 수행된다. 상기 분석은 시료가 감염을 일으키기에 충분한 양의 감염성 바이러스를 포함하는지 여부를 결정한다. TCID50은 세포 배양의 누적수의 1/2에서 세포병변 효과 (CPE)를 나타내는 희석율로 결정된다. 한 개의 P96 평평한 플레이트가 하나의 바이러스 시료 적정을 위해 요구된다. 간략하게는, 15,000 CEF 세포들/100 ㎕가 웰당 접종된다. 11개 웰들의 8개 열들이 접종된다. 상기 8개 열들은 바이러스 시료의 연속적인 10-배 희석액들 (즉, 10^-2 내지 10^-9)을 나타낸다. 각각의 연속적인 희석을 위하여, 1 ㎖의 혼합이 무-혈청 배지 내에서 수행되고, 100 ㎕의 상기 혼합물이 상응하는 희석-웰들에 분주되고, 11번째 열은 대조군 비-감염된 웰이다. 상기 P96 플레이트는 37℃, 5% CO₂에서 배양된다. 5 내지 10일 범위 경과 후, 상기 바이러스 역가는 양성 CEP 웰들을 기록함으로써 Reed-Muench 방법에 의해 계산된다.

14.4- MVA 감염에 대한 감수성 및 적정 결과

14.4.1-MVA 감염에 대한 EB45 (S86N45) 및 EB14 세포들의 본태적 감수성이 먼저 재조합 MVA-GFP 벡터를 이용하여 조사되었다. 이 특이적 벡터는 김염된 세포들의 관찰 및 정량을 단순화하기 위하여 이러한 연구들을 위해 선택되었다. EBx 및 CEF 세포들은 따라서 서로 다른 감염다중도 (m.o.i.)로 처리되었고, 세포들은 감염 후 수 일째에 형광현미경 및 형광세포측정기를 이용하여 분석되었다.

도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 감염 후 48시간 째에도 여전히 생존하는 모든 부착성 EB45 세포들은 0.1 TCID50/세포와 같이 낮은 m.o.i.를 사용한 경우조차도, 리포터 GFP 단백질을 강하게 발현하였다. 주목하게는, 도 10은 또한 CEF 세포들과 비교했을 때 EB45 및 EB14 세포들의 크기가 보다 더 작음을 나타낸다.

종합하면, 이러한 결과들은 MVA 감염에 대한 부착성 EB45 및 EB14 세포들의 높은 감수성을 명백하게 증명하는 것이다.

14.4.2-하기 표 8은 수행된 다양한 MVA-GFP 감염 실험들에서 얻어진 결과들을 나타낸 것이다. 모든 시료들은 두 번씩 적정되었다.

적정 결과들

14.3 - EB14 및 EB45 세포들에 대한 MVA 의 증식

부유성 EB14 및 부착성 EB45 세포들에 대한 MVA 증식은 MVA-GFP 복제의 동역학의 정량적 분석에 의해 결정되었다. EB45 세포들은 DMEM-F12 배지를 포함하는 디쉬 내에서 성장되었고 0.1 m.o.i.로 감염된 반면, EB14 세포들은 감염 전에 24시간 동안 DMEM-F12 배지를 포함하는 120 ㎖ 스피너 플라스크 내에서 0.2 m.o.i.로 배양되었다. 그리고 나서, 감염된 세포들의 비율을 감염 후 다양한 시점들에서 FACS 분석에 의해 정량하였다. 도 12 및 13에 나타낸 바와 같이, 여전히 생존하는 모든 세포들은 감염 후 48시간 (EB45) 또는 72시간 (EB14)에도 GFP를 발현하였다.

14.4-혈청-함유 배지에서 성장한 부착성 EB45 세포들에 대한 바이러스 수율

14.4.1-부착성 EB45 세포들의 바이러스 생산성은 DMEM-F12에서 성장한 세포들을 이용하여 분석되었다. MVA는 DMEM-F12 내 EB45에서 매우 효과적으로 복제되고 대조군 CEP 세포들을 이용하여 얻어진 것보다 훨씬 높은 수율이 달성될 수 있음을 확인하였다 (도 14).

14.4.2-추가적인 일련의 실험들에서, 비-재조합 MVA 바이러스 (ATCC로부터 입수)가 CEF 세포들 및 EB45 세포들에 대한 비교 복제 연구를 위해 사용되었다: 이는 MVA-GFP 벡터들을 이용한 이전의 결과를 확인하는 것으로, 높은 생산수율이 이 MVA 바이러스를 이용한 경우에도 다시 달성되었다 (도 15).

종합하면, 이러한 결과들은 부착성 EB45 세포들의 MVA 감염에 대한 높은 감수성 및 효율적인 바이러스 생산을 입증하는 것으로, 이는 계 배아 섬유모세포들에서보다 높다. 또한, 이러한 모든 실험들은 표준 조건들 하에서 수행되었다. 따라서, 더욱 높은 바이러스 수율이 상기 실험 조건들의 최적화시에 그리고, 구체적으로는 최적의 세포 배양 배지를 사용함으로써 달성될 수 있을 것이라고 주장하는 것은 합리적이다.

14.5-혈청 함유 배지에서 성장한 EB14 세포들에 대한 바이러스 수율

EB14 세포들의 바이러스 생산성은 DMEM-F12 배지에서 성장한 세포들을 이용하여 스피너 플라스크 내에서 결정되었다. 0.1의 감염다중도를 이용한 첫 번째 일련의 실험들의 결과들을 도 16에 나타내었다. 이들 결과들은 부착성 세포들을 이용하여 얻은 이전의 결과들을 뒷받침하고, 계 배아 섬유모세포를 이용하여 얻은 수율보다 2배 높은, 100 TCID50/세포에 근접한 수율로 재조합 MVA 바이러스들을 효율적으로 생산할 수 있는 부유성 EB14 세포들의 능력을 확인해준다.

14.6-무-혈청 배지에서 성장한 부유성 EB14 세포들에 대한 바이러스 수율

이상적으로는, 바이러스 백신 생산은 생체반응기 내 무-혈청 배지 내에서 성장한 부유 세포들을 대상으로 수행되어야 한다. 무-혈청 배지에서 MVA의 생산을 조사하기 위하여, EB14 부유성 세포들이 무-혈청 배지를 포함하는 스피너 플라스크들 내에서 두 개의 서로 다른 감염다중도 (0.01 및 0.1)로 MVA-GFP 벡터에 감염되었다. 상기 세포들의 FACS 분석은 두 개의 실험 조건들 하에서 EB14 세포들의 효율적인 감염을 확인한다 (도 17). 또한, 예측한 바와 같이, 이들 실험들은 0.1 m.o.i.를 사용한 경우에 감염이 훨씬 더 신속하게 이루어지는 반면, 0.01 m.o.i.에서는 세포들이 보다 오래 생존하고 보다 긴 기간 동안 바이러스 자손을 생산할 수 있음을 보여준다 (결과 미첨부).

바이러스 수율의 분석은 효율적인 MVA 생산이 무-혈청 및 무-단백질 배지에서 부유상태로 성장한 부유성 EB14 세포들에 의해 달성됨을 확인한다 (도 18). CEF 세포들을 이용하여 일반적으로 획득되는 수율보다 훨씬 높은 바이러스 수율이 통상적으로 획득된다. 또한, 감염성 입자들의 분포 분석은 대부분의 비리온들이 상기 세포들 내에 보유되고 단지 일부만이 상등액 내로 분비됨을 나타낸다 (도 18).

EB14 및 S86N45 세포들은 부유상태 또는 부착성 세포들로서, 무-혈청 배지에서 효과적으로 성장할 수 있는 비-유전적으로 조작된 조류 배아 줄기세포들로서 충분히 특정된다. 본 발명자들은 상기 세포들이 재조합 및 비-재조합 변형-우두바이러스 앙카라의 감염 및 증식에 매우 민감하다는 것을 입증하였고, 이러한 결과들은 바이러스 생산이 대조군 CEF 세포들에서보다 적어도 2 내지 3배 이상 높다는 것을 나타낸다. 종합하면, 이러한 특성들은 MVA-기반 벡터들의 생산을 위한 기존의 난-기반 (egg-based) 또는 CEF-기반 생산 시스템을 대체하기 위하여 본 발명의 세포들, 즉 EB14 및 EB45를 매우 전도유망한 세포 기질로 만들어준다.

참고문헌들

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Claims

조류 배아 유래 줄기세포들에 바이러스 입자들을 접종하고, 세포 용해가 야기되고 새롭게 생산된 바이러스성 입자들이 배지 내로 분비될 때까지 기본 배지에서 상기 세포들을 배양하는 단계들을 포함하는, 폭스바이러스 및 천연형 또는 재조합 우두바이러스와 같은 재조합 유도체들을 복제하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 접종이 0.01 내지 0.5 m.o.i. (multiplicity of infection, 감염다중도)로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 2항의 어느 한 항에 있어서, 상기 우두바이러스가 변형 우두바이러스 앙카라 (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA) 또는 재조합 우두바이러스와 같은 변형된 우두바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 천연두에 대한 백신을 생산하기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 배아 유래 줄기세포주들이 하기로 구성된 방법에 의해 획득가능한 것임을 특징으로 하는 방법:

a) 조유 배아세포들을 이들의 성장을 가능케 하는 모든 인자들 및 불활성화 영양층 을 포함하는 배지 내에서 배양하는 단계;

b) 상기 인자들, 혈청 및/또는 영양층을 점진적으로 또는 완전히 제거하기 위하여 상기 배양 배지를 변형함으로써 계대접종하는 단계;

c) 외인성 성장인자들, 혈청 및/또는 불활성화 영양층이 없는 기본 배지 내에서 증식할 수 있는 부착성 또는 비-부착성 세포주들을 확립하는 단계.
제 5항에 있어서, 상기 단계 c)에서 얻어진 조류 줄기세포들이 적어도 600일간 증식할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 줄기세포들이 조류 배아 줄기세포들 또는 조류 체세포 줄기세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 7항에 있어서, 단계 b)가 상기 배지 성분들의 제거 (성장인자들 단독 또는 혈청 단독 또는 성장인자들 및 그 후에 혈청 또는 반대로 혈청 및 그 후에 성장인자들)로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 영양층의 점진적 또는 완전한 제거 및 그 후에 선택적으로 다른 배지 성분들 (성장인자들 및 혈청)의 제거로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 세포주들은 외인성 성장인자들이 없는 배지 내에서 부유상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 세포주들이 혈청이 없는 배지 (무-혈청 배지) 내에서 부유상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 세포주들이 외인성 성장인자들 및 혈청이 없는 배지 내에서 부유상태로 증식하는 비-부착성 줄기세포들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 세포주들이 하기 특징들 중의 적어도 하나를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:

- 높은 핵-세포질 비 (nucleo-cytoplasmic ratio),

- 내인성 알칼라인 포스파타제 활성,

- 내인성 텔로머라제 활성,

- 항체들 SSEA-1 (TEC01), SSEA-3, 및 EMA-1의 그룹으로부터 선택된 특이적 항체들에 대한 반응성.
제 1항 내지 제 13항에 있어서, 상기 조류 세포주들이 기본 배지, 구체적으로는 비필수 아미노산류, 비타민류 및 소듐 파이루베이트와 같은 첨가제들이 보충된 DMEM, GMEM, HamF12 또는 McCoy와 같은 배지 내에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항 내지 제 14항의 어느 한 항에 정의된 방법에 따르는 단계 c)에서 확립된 부착성 또는 비-부착성 세포주들을 배양하고, 상기 세포들에 바이러스 입자들을 접종하고, 세포 용해가 야기되고 새롭게 생산된 바이러스 입자들이 배지 내로 분비될 때까지 상기 세포들을 상기에 언급된 바와 같은 기본 배지 내에서 배양하는 것을 포함하는, 천연두에 대한 백신과 같이 생 또는 약독화 백신을 생산하기 위한 방법.
오르소믹소바이러스 패밀리, 구체적으로는 우두바이러스, 변형 우두바이러스 앙카라 (MVA)와 같은 변형된 우두바이러스 및 재조합 우두바이러스에 속하는 생 또는 약독화 백신을 생산하기 위한 제 10항 내지 제 12항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 비-부착성 세포들의 용도.
제 16항에 있어서, 천연두에 대한 백신을 생산하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제 16항에 있어서, 암에 대한 백신을 생산하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.