RU2359999C2 - Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов - Google Patents
Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2359999C2 RU2359999C2 RU2006119447/13A RU2006119447A RU2359999C2 RU 2359999 C2 RU2359999 C2 RU 2359999C2 RU 2006119447/13 A RU2006119447/13 A RU 2006119447/13A RU 2006119447 A RU2006119447 A RU 2006119447A RU 2359999 C2 RU2359999 C2 RU 2359999C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- cells
- cell
- cell line
- protein
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 294
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 58
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 57
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 44
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 37
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 31
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 29
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 29
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 28
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 24
- 241000701796 Fowl aviadenovirus 1 Species 0.000 claims description 22
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 18
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 17
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 13
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 claims description 12
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 claims description 11
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 10
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 7
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 102000001388 E2F Transcription Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010093502 E2F Transcription Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 claims description 6
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 101150024228 mdm2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 4
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 108700019031 adenovirus E1B55K Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 claims description 2
- 241001443586 Atadenovirus Species 0.000 claims description 2
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000733249 Homo sapiens Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 claims description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000272522 Anas Species 0.000 claims 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 claims 1
- 101710132594 Protein E6 Proteins 0.000 claims 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 claims 1
- 101150040063 orf gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 8
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 abstract 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 55
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 22
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 21
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 15
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 13
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 10
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108010058765 Oncogene Protein pp60(v-src) Proteins 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 4
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 4
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 4
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710199711 Early E1A protein Proteins 0.000 description 3
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 3
- 102100037173 Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Human genes 0.000 description 3
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 2
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940095293 mumps vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 229940123373 Adenovirus E1A gene Drugs 0.000 description 1
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241001213911 Avian retroviruses Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000051485 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 1
- 108700038897 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 241000334119 Coturnix japonica Species 0.000 description 1
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 1
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 1
- 108010058545 Cyclin D3 Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 102000019274 E2F Family Human genes 0.000 description 1
- 108050006730 E2F Family Proteins 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101000893906 Fowl adenovirus A serotype 1 (strain CELO / Phelps) Protein GAM-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024185 G1/S-specific cyclin-D2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037859 G1/S-specific cyclin-D3 Human genes 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 101000798007 Homo sapiens RAC-gamma serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 1
- 241000202942 Mycoplasma synoviae Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049358 Oncogene Protein p65(gag-jun) Proteins 0.000 description 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108700023219 Phosphoglycerate kinases Proteins 0.000 description 1
- 206010035673 Pneumonia chlamydial Diseases 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032314 RAC-gamma serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010038802 Reticuloendothelial system stimulated Diseases 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000287231 Serinus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710185500 Small t antigen Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108700032993 adenovirus CELO Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009949 anti-apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011018 current good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000002976 reverse transcriptase assay Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000016596 traversing start control point of mitotic cell cycle Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 229960001515 yellow fever vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
- C12N2710/10222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
- C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Линию клеток получают из первичных клеток, которые трансформируют, по меньшей мере, двумя вирусными или клеточными генами, один из которых вызывает прогрессию клеточного цикла, тогда как другой препятствует природным защитным механизмам клетки, индуцируемым дисрегуляцией репликации. Кроме того, раскрыто получение указанных линий клеток и их применение для получения биологических препаратов или вирусов для вакцинации. 5 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к иммортализованным линиям клеток птиц, подходящим для получения биологических препаратов или вирусов для вакцинации. В частности, линии клеток получают из первичных клеток, которые трансформируют, по меньшей мере, двумя вирусными или клеточными генами, один из которых вызывает прогрессию клеточного цикла, тогда как другой препятствует врожденным защитным механизмам клетки, индуцированным дисрегуляцией репликации. Кроме того, изобретение относится к получению указанных иммортализованных линий клеток и их применению для получения биологических препаратов или вирусов для вакцинации.
Уровень техники
Яйца кур с эмбрионом по-прежнему представляют собой один из главных субстратов для получения вакцин для человека. Они способны поддерживать репликацию широкого спектра вирусов человека и животных. Этот спектр включает ослабленные вирусы, то есть дефектные вирусы, у которых ослаблена способность к репликации в клетках человека или млекопитающих и, таким образом, их можно использовать в качестве вакцин. Ослабление можно получать или поддерживать путем непрерывного пассирования в яйца с эмбрионом. Отсутствие определенного набора вирусного и бактериального заражения в яйцах кур, используемых для получения человеческой вакцины должно быть заверено сертификатом (без специфичного патогена или SPF). Яйца SPF поставляются промышленно. Широкая применимость и длительный международный опыт работы поддерживали эту стратегию, несмотря на очевидные недостатки.
SPF группы кур и яиц с эмбрионом являются дорогостоящими, и их стоимость может составлять до 40% стоимости вакцин. Кроме того, трудно непрерывно поддерживать группы SPF, полностью свободные от патогенов, для которых наблюдаются периодические вспышки заболевания в группах SPF. Партия вакцины не может быть выпущена до тех пор, пока поставщик SPF не удостоверится в том, что родительские куры для яиц с эмбрионом, используемые для производства партии вакцины, были полностью свободны от любого заболевания. Эта неопределенность значительно увеличивает стоимость получения данных вакцин. В ситуациях пандемии с внезапной потребностью в специфической вакцине (например, грипп) поставка яиц SPF может быть строго ограничена. Кроме того, крупномасштабные процессы для инфицирования яиц и поддержания роста вируса являются длительными и иногда неустойчивыми в различных сериях вакцин.
С развитием методик клеточной культуры производители вакцины заменили яйца с эмбрионом изолированными зародышевыми фибробластами курицы. В то время как применение первичных клеточных культур улучшает профиль безопасности, эффективность и надежность производственного процесса, оно также дополнительно увеличивает затраты: фибробласты кур получают из яиц SPF путем измельчения эмбрионов, для создания и амплификации жизнеспособных клеток. Как характерно для первичных клеток животных, фибробласты претерпевают старение: время удвоения при пассировании увеличивается и, в конечном счете, все клетки умирают. Этот процесс наблюдается приблизительно после 20 пассажей, намного раньше, чем в клеточных субстратах грызунов или в некоторых клеточных субстратах человека, используемых в настоящее время в производстве вакцин (таких как MRC-5 или WI-38). Культуры фибробластов необходимо поддерживать в присутствии 5-10% фетальной телячьей сыворотки, что привносит в производственный процесс дополнительные факторы риска. Они также требуют твердой поверхности для роста и не растут в суспензии, предпочтительном состоянии для применения в биореакторе. Даже с применением многослойных клеточных фабрик это значительно ограничивает процедуры в увеличенном масштабе. Вследствие ограниченного времени жизни для каждой партии фибробластов кур необходимо проводить полный набор тестов на безопасность.
Фибробласты представляют собой единственный тип клеток из широкого разнообразия различных тканей эмбриона курицы, которые хорошо размножаются. Преобладание фибробластов по сравнению с другими типами клеток в некоторых случаях уменьшало теоретический выход вируса, поскольку в яйцах главной областью для амплификации вируса обычно является хориоаллантоисная мембрана, слой эпителиальных клеток.
Рассмотренные проблемы внесли свой вклад в серьезный дефицит вакцины гриппа в последние два года (2003 и 2004). Для преодоления этих ограничений была бы высоко востребована постоянная линия клеток, растущая в искусственной среде определенного состава, предпочтительно в суспензии или, по меньшей мере, на носителях.
Некоторые из вирусов, обычно растущие в фибробластах кур, были адаптированы к определенным линиям клеток. Клетки BHK-21 (почки эмбриона хомяка) поддерживают рост различных штаммов вакцинии, гриппа и аутовакцины (Drexler I. et al., J. Gen. Virol. 79(Pt2):347-52 (1998); Gumusderelioglu M. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 33:167-72 (2001); Merten O.W. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 397:141-51 (1996)) и беспрепятственно растут в больших ферментерах на носителях в бессывороточных условиях (Pay T.W. et al., Dev. Biol. Stand 60:171-4 (1985); Gallegos Gallegos R. M. et al., Arch. Med. Res. 26:59-63 (1995)). Для вакцинии это относится даже к сильно ослабленному штамму Анкара (MVA), который был получен в клетках кур. Линия клеток BHK-21 принята для получения определенных вакцин для домашнего скота (Lubiniecki A.S., Bioprocess Technol. 10:495-513 (1990)). Однако линия BHK-21 не удовлетворяет требованиям безопасности для живых вакцин для человека. Клетки BHK формировались спонтанно, они являются чрезвычайно онкогенными и об их истории сообщалось недостаточно.
Согласно обсуждению FDA, CBER от 12 мая 2000 клеточных субстратов, разработка "минимально очищенных живых ослабленных вирусных вакцин и вакцин на вирусных векторах" в опухолевых клетках, полученных из естественно встречающихся опухолей от людей и других млекопитающих, или из человеческих клеток и клеток млекопитающих, трансформированных за счет неизвестных механизмов, неприемлемо.
В качестве исключения из правила линия клеток VERO (происходящая от африканской зеленой обезьяны) приемлема в качестве клеточного субстрата для производства вакцины, что основано на доказанном профиле безопасности и на отсутствии трансформированного фенотипа при определенном количестве пассажей. Данную линию клеток широко использовали для производства вакцин против полиомиелита и оспы для клинического применения. Однако для клеток VERO необходимо прикрепление и они пригодны только для процессов, основанных на носителе.
Кроме того, в производстве вируса гриппа применялись клетки MDCK (спонтанная линия клеток из эпителия почки собаки) с описанной историей (Tree J. A. et al., Vaccine 19:3444-50 (2001)).
Позднее, как следствие разработки вакцины, основанной на векторе, и подходов генной терапии, интенсивно обсуждались новые, так называемые сконструированные линии клеток, полученные от человека, и они были включены в спектр потенциальных клеточных субстратов для получения вакцины (Vaccines and Related Biological Products advisory committee (совещательный комитет по вакцинам и связанным с ними биологическим продуктам), сессия от 16 мая, 2001). Были созданы новые постоянные линии клеток для обеспечения комплементарных генов для рекомбинантных вирусов с недостаточной репликацией вне системы продуцирования. Однако устойчивое введение комплементарных генов требует увеличения времени культивирования, которое либо превышает естественный предел количества пассажей, доступных для первичных клеток, либо возникает допустимый предел количества пассажей для клеток VERO до полной трансформации.
Сконструированные линии клеток производят in vitro с подробным документированием с применением охарактеризованных генов для трансформации. Например, комплементарные гены из области E1 аденовирусов непосредственно демонстрируют трансформирующие свойства и позволяли получать линии клеток человека, например, PER.C6 (Fallaux F.J. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998)). Приложение этих линий клеток не ограничено вирусным вектором, для которого они разработаны, но может быть распространено на другие вирусы. Например, в PER.C6 можно размножать вирус гриппа (Pau M.G. et al., Vaccine 19:2716-21 (2001)). Однако этот вывод не относится ко всем вирусам, имеющим отношение к разработке вакцины, в частности к вирусам птиц, таким как вирусы заболевания Марека, инфекционного бурсита, болезни Ньюкастла, герпеса индеек или анемии кур. Несмотря на то что некоторые из этих вирусов хорошо реплицируются в линиях клеток млекопитающих, рост вируса часто является недостаточным. Для других вирусов репликация является недостаточной и ограничена отдельными, особенно адаптированными штаммами.
Кроме того, при адаптации к клеточному субстрату, полученному от примата, вероятно, сайты связывания рецептора на вирусе изменятся, что приведет к модифицированному антигенному рисунку и, таким образом, общему действию на иммуногенность. Данная генетическая адаптация может обратить ослабление для штаммов, которые выращивали путем пассирования в клетках птиц, таких как MVA, или адаптированный к курам вирус кори (Escoffier C., Gerlier D., J. Virol. 73:5220-4 (1999)), или создать новые штаммы, более эффективно реплицирующиеся в клетках человека по сравнению с изолятами дикого типа. Такие вирусы могут также достичь более высокого патогенного потенциала.
По указанным выше причинам производители вакцины отказываются переходить на линии клеток млекопитающих, и развилась потребность в бессмертных линиях клеток птиц.
Исследование индукции опухолей у птиц с помощью птичьих альфаретровирусов обеспечило первые данные на молекулярном уровне о трансформации клетки в целом. Ретровирусные онкогены получают из клеточных генов со значительной частью мутированных или делетированных регуляторных доменов. Некоторые из факторов, которые идентифицировали в ходе этих исследований, такие как v-myc или v-ras, непосредственно поражают компоненты путей как ретинобластомы (RB), так и p53. Другие белки, такие как v-src или v-erbB, представляют собой конститутивно активируемые (следовательно, дисрегулируемые) трансдукторы сигнала, которые имитируют проникающие внеклеточные митогены. Связанная с данными факторами проблема заключается в том, что их мишенью является только один из нескольких путей, необходимых для эффективной трансформации. Присутствие v-src или v-myc предрасполагает клетку к трансформации и требует дополнительных спонтанных и непредсказуемых изменений в клетке для полного превращения. Следовательно, трудно оценить риск для пациента, представляемый клетками, трансформированными одним из ретровирусных онкогенов.
В других случаях отдельный сильный опухолевый антиген (например, v-jun) может непосредственно вызвать формирование опухоли (Hartl M. et al., Curr. Cancer Drug Targets 3 :41-55 (2003)). Множество птичьих вирусных онкогенов сохраняют онкогенный потенциал в клетках млекопитающих.
Линии клеток, созданные этими вирусами, не подходят для производства вакцин. Ретровирус, несущий онкоген, можно активировать и перенести вместе с вакциной. Даже опухолевый антиген, не заключенный в вирусные LTRs, может представлять большой риск, если он может трансформировать клетки млекопитающих без помощи комплементарных антигенов. Данный риск обычно оценивают путем рассмотрения трансформирующего потенциала, количества вакцинируемых и количества клеточной нуклеиновой кислоты, перенесенной с вакцинным вирусом. Данное количество ограничено эффективностью процесса очистки и в настоящее время не может составлять менее чем 10 пг/доза. Данный критерий является особенно жестким для получения вакцины, где здоровую популяцию часто инокулируют в очень молодом возрасте.
Те же аргументы относятся к трансформации ДНК-вирусов, таких как папилломавирусы и полиомавирусы. Эти вирусы содержат агрессивные онкогены: большой T-антиген SV40 представляет собой многофункциональный белок, который воздействует как на контролирование контрольного пункта в G1 клеточного цикла, так и на активность p53. Поэтому большой T-антиген легко иммортализует и трансформирует множество тканей млекопитающих, полученных от грызуна и человека. С добавлением малого T-антигена (дополнительно усиливающего действие большого T-антигена и дополнительно модулирующего путь AKT3) было возможно иммортализовать клетки птиц (часть заявки на патент США 2001-0016348). Однако даже со сложными современными способами очистки большой T-антиген SV40 считают слишком агрессивным для применения в линиях клетки, полученных для применения в медицине человека. В отличие от приведенных выше, гены, предложенные в этом изобретении, нарушают контрольный пункт клеточного цикла и инактивацию p53 посредством раздельных факторов: необходимый одновременный перенос двух различных факторов для трансформации резко уменьшает любой теоретический риск для вакцинируемого.
Заявка на патент США 2001-0016348 описывает применение антиапоптотического пути, никак не связанного с настоящим изобретением. Он не обеспечивает второй ген, противостоящий внутреннему сигналу апоптоза, в виду принудительной прогрессии клеточного цикла, вызванной первым геном. Апоптоз также можно индуцировать различными внешними стимулами, например нехваткой факторов роста или откреплением от подложки. Передача данного типа проапоптотического сигнала может быть ингибирована генами семейства bcl-2, главными объектами заявки на патент США 2001-0016348.
Ввиду того, что 90% карцином шейки матки несут последовательности папилломавируса, полагают, что аденовирусы C-типа (которые включают типы 2 и 5) не индуцируют опухоли in vivo, и аденовирусные последовательности не были обнаружены в ткани опухоли человека.
Альтернативно была сделана попытка выведения линий клеток путем непрерывного пассирования фибробластов эмбрионов кур. Ввиду того, что клетки грызунов, как представляется, довольно легко претерпевают спонтанную иммортализацию (Curatolo et al., In Vitro 20:597-601 (1984)), клетки птиц и примата с этой точки зрения очень устойчивы (Harvey, et al., Genes and Development 5:2375-2385 (1991); Pereira-Smith, J. Cell Physiol. 144:546-9 (1990); Smith et al., Science 273:63-67 (1996)). Соматические клетки птиц или приматов испытывают недостаток в теломеразе, и старение вызвано укорачиванием концевых участков хромосом (теломеров). Тем не менее, линия фибробластов кур UMNSAH-DF1 была выведена с применением данного подхода (патенты США 5 672 485 и 6 207 415). Иммортализация с применением данного подхода вызвана спонтанными мутациями множества онкогенов или генов-супрессоров опухоли. Это редкое явление, вероятность повторения которого мала, особенно в клетках ткани другого происхождения. Что наиболее важно, такой подход противоречит подходу «Определенного Риска», который является общим правилом для живых вакцин человека и представляет подробную информацию о генах иммортализации для оценивания риска переноса онкогена. Кроме того, согласно FDA (Обсуждение CBER от 12 мая, 2000, клеточных субстратов), применение опухолевых клеток, полученных из естественно встречающихся опухолей или клеток, которые были трансформированы за счет неизвестных механизмов, не приемлемо для разработки минимально очищенных живых ослабленных вирусных вакцин и вакцин на вирусных векторах.
Спонтанно развившаяся линия фибробластов кур UMNSAH-DF1 демонстрирует изменения в активности E2F и p53 (Kim et al., Oncogene 20: 2671-82 (2001)). Это не является неожиданностью, поскольку увеличенная активность клеточного цикла требует активного E2F и поскольку из исследований клеток млекопитающих известно, что высокая активность E2F индуцирует апоптоз в присутствии активного p53. Исследование характеризует бессмертную стадию, не проясняя причинные явления: возможно, иммортализацию вызвали мутации в большом количестве генов.
Процесс спонтанной трансформации может быть усилен при помощи химических мутагенов (патент США 5 989 805). Отдельные линии клеток, полученные с применением этого подхода, преодолевали старение, но остались похожими на фибробласты и не являются онкогенными. Несмотря на то что это представляет важную особенность с точки зрения безопасности, эти клетки имеют малое значение для методик крупномасштабной ферментации. Кроме того, этот подход, основанный на случайном событии, также противоречит руководящим принципам «Определенного Риска».
Для биологического производства также были предложены линии клеток птиц, происходящие из естественно встречающихся опухолей, таких как фибросаркома перепела (WO 97/08307). Кроме того, руководящие принципы «Определенного Риска» для применения в получении вакцины для человека нарушаются способом, основанным на случайных событиях.
Подходы, предпринятые в исследованиях, описанных выше, отчетливо контрастируют с активным введением специфичных групп генов иммортализации в соответствии с настоящим изобретением, которое определяет причинные факторы иммортализации и позволяет оценивать риск, обеспечивает высокую гибкость в отношении выбора различных тканей и позволяет регулировать определенные характеристики получающейся линии клеток.
Несмотря на то что с яйцами и фибробластами кур работают давно, с ними также связан очень характерный фактор риска, которому только недавно стали уделять большее внимание: клетки кур высвобождают, по меньшей мере, два типа ретровирусных частиц, эндогенный ретровирус птицы (EAV) и эндогенный вирус лейкоза птицы (ALV-E). Проблема сходна с присутствием эндогенных ретровирусных частиц в клетках мыши, которые используются для производства рекомбинантных белков (таких как NS0). Однако в отличие от клеток мыши клетки кур продемонстрировали наличие обратной транскриптазы. Благодаря более эффективным методикам обнаружения, активность RT была также обнаружена в произведенных клетками кур вакцинах против кори, свинки и желтой лихорадки (Hussain A.I. et al., J. Virol. 77:1105-11 (2003); Shahabuddin M. et al., J. Clin. Microbiol. 39 :675-84 (2001)). Вопрос о том, приводит ли наличие активности обратной транскриптазы к передаваемым ретровирусам, остается спорным: более подробный анализ показал, что CEF (от белого леггорна) содержит пять локусов с интегрированными EAVs, два из которых могут экспрессировать инфекционный ALV-E, тогда как остальные три - дефектны (Johnson J.A., Heneine W., J. Virol. 75:3605-12 (2001)). Tsang S.X. и др., J. Virol. 73: 5843-51 (1999) также обнаружили активность RT и высвобождение вирусных частиц, но не наблюдали передачи после тщательного поиска последовательностей EAV в мононуклеарных клетках крови детей, получавших вакцину против свинки. В соответствии с Weekly Epidemiological Record, WHO (73) 28 (1998), независимые лаборатории исследовали инфекционность частиц для различных клеток человека и других млекопитающих путем обширного совместного культивирования и не могли обнаружить передачу активности RT или продуктивной инфекции. Эти сведения поддерживают эпидемиологические исследования, которые не выявили связи между применением произведенных клетками кур вакцин и частотой возникновения рака, в том числе и в детском возрасте.
Кроме того, в указанном Weekly Epidemiological Record, WHO подчеркивает значение клеток-хозяев кур для поддержания ослабления определенных штаммов вакцин. Альтернативные процессы получения в настоящее время не доступны, и данное отсутствие альтернатив является важной причиной для принятия известного и непрерывного источника вирусного загрязнителя.
Однако эпидемиологические исследования привносят популяции и не касаются случайных событий или детальных исследований. Эпидемиологические исследования не могут опровергнуть теоретические риски, например: допущенная эндогенная активность RT может маскировать активность RT от недопустимой экзогенной инфекции, и эндогенные вирусы могут быть мобилизованы и активированы, если в клетки введены конструкции оболочки (Ronfort C. et al., Virology 207:271-5 (1995)).
Однако было показано, что клетки уток и гусей не содержат последовательности, родственной EAV и ALV, а у японского перепела отсутствует обратная транскриптаза (Smith L.M. et al., J. Gen. Virol. 80(ptl):261-8 (1999); Brudno L.A. et al., Vopr. Virusol. 97-100 (1980)).
Аденовирусы (AdV) представляют собой хорошо охарактеризованные, голые (без оболочки) повсеместные вирусы. Для наиболее распространенных серотипов Ad2 и Ad5 доминирование среди населения приближается к 90%. Некомпетентные по репликации версии этих вирусов используют в качестве генной терапии и вакцинных векторов в исследованиях с пациентами-людьми. Гены из области E1 Аденовируса 5 человека использовали для трансформации некоторых специфических клеток человека in vitro (линии клеток 293 и PER.C6; Fallaux F.J. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998); Graham F.L. et al., J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)). Общий процесс неэффективен по сравнению с более сильными многофункциональными онкогенами, такими как большой T-антиген SV40. На основании наблюдения, что 293 демонстрирует специфичные маркеры нейронов и PER.C6 имеют нейроэктодермальное происхождение, было выдвинуто предположение, что транформация Ad5, основанная на E1, ограничена нейронными клетками (Shaw et al. Faseb J 16(8): 869-71(2002)). Учитывая значительный видовой барьер между клетками человека и птиц, эффективная иммортализация множества тканей птиц за счет трансфекции ожидается в еще меньшей степени.
Линии клеток млекопитающих, трансформированные по E1, использовали для получения живых очищенных векторов аденовируса в клинических исследованиях. При тщательном контроле количества загрязняющей клеточной ДНК в препарате вакцины и ее размера трансформирующие гены Ad5 не рассматривают как защитный барьер (Vaccines and Related Biological Products advisory committee, session from May 16, 2001).
Аденовирусы реплицируются в ядре зараженной клетки. Поскольку неделящиеся клетки-хозяева не допускают полного жизненного цикла вируса, аденовирусы развили механизм, чтобы перевести клетки в S-фазу. Для увеличения размера вспышки дочерних вирусов до максимума они также развили механизм избегания апоптоза как реакции клетки-хозяина на проникновение капсида и репликацию вируса. Область генома, которая обеспечивает как прогрессию клеточного цикла, так и торможение апоптоза, представляет собой область E1.
E1 область фактически состоит из двух отдельных кассет экспрессии, E1A и E1B, выстроенных в тандеме, и каждая из которых наделена собственным промотором и сайтом полиаденилирования. По меньшей мере, три белка транслируются из первичного транскрипта E1A за счет альтернативного сплайсинга. Было обнаружено, что среди прочих белки E1A разрушают комплексы RB/E2F и противостоят коактиваторам транскрипции p300 и CBP. Освобождение E2Fs от репрессора RB индуцирует прогрессию клеточного цикла из фазы G1 в S в то время как комплекс E1A/p300 индуцирует апоптоз через несколько путей (Putzer B.M. et al., Cell Death Differ. 7:177-88 (2000)), включая репрессию транскрипции MdM2, отрицательного регулятора ключевого сенсора апоптоза, p53.
Поскольку E1A сенсибилизирует клетки к TNF-индуцированному апоптозу, он считается противоопухолевым агентом, и он используется в экспериментальных подходах для лечения опухолей (Lee W.P. et al., Cancer Res. 63:6229-36 (2003)).
Кроме того, действуя как модулятор транскрипции, он ведет клетки к де-дифференциации, особенности, предпочтительной для потенциального клеточного субстрата.
Guilhot и др. (Guilhot C. et al., Oncogene 8:619-24 (1993)) показали, что ретровирусная трансдукция белка 12S E1A из Ad5 может привести к иммортализации клеток перепела. По всей видимости это является следствием взаимодействия между RB птицы и E1A. Однако процесс не осуществляется, когда ген вводят путем трансфекции голой ДНК вместо инфекции ретровируса (собственное наблюдение). Авторы заявки предполагают, что чрезвычайно эффективная и устойчивая трансдукция путем инфекции ретровируса создала пул клеток, достаточно большой, чтобы накопить отдельные клетки со спонтанными геномными изменениями, которые блокировали апоптоз, который в норме индуцируется при инактивации RB. Эти необходимые, но неизвестные изменения увеличивают риск для вакцинируемых, и получающуюся линию клеток нельзя считать сконструированной линией клеток (результат определенных блоков в специфичных проводящих путях). Кроме того, трансформирующий ген, введенный посредством ретровирусов, фланкирован инвертированными концевыми повторами и, следовательно, может быть мобилизован. Такое явление может даже быть более выраженным в линиях клеток, которые экспрессируют обратную транскриптазу из эндогенных ретровирусов.
Сущность изобретения
Ввиду изложенного выше, по-прежнему требуется разработка линии клеток птицы с удобными свойствами роста для крупномасштабного производства, с применением определенного сочетания иммортализующих/трансформирующих генов. Кроме того, желательно, чтобы ни один из этих генов не мог трансформировать клетки млекопитающих, вне зависимости от других генов. Кроме того, отдельный ген не должен оказывать иммортализующего/трансформирующего действия или приводить к апоптозу клеток, экспрессирующих соответствующий ген. Риск сопряженного переноса реципиенту вакцины дополнительно должен быть сведен к минимуму путем размещения соответствующих генов на отдельных блоках экспрессии. Наконец, поскольку население обычно подвергнуто воздействию соответствующих генов, было бы желательно, чтобы эти гены не были связаны с формированием опухолей у людей. Производимая линия клеток не должна высвобождать инфекционные вирусные частицы из эндогенных ретровирусов или вообще не проявлять активность обратной транскриптазы.
Было обнаружено, что трансформация клеток птиц двумя специфическими вирусными и/или клеточными генами, один из которых действует на белки ретинобластомы, а другой действует на белок p53, обеспечивает линию клеток, хорошо подходящую для получения вирусов для вакцинации.
Таким образом, изобретение обеспечивает:
(1) линию клеток птиц, иммортализованную с помощью сочетания вирусных и/или клеточных генов (которые ниже будут коротко называться "ген (гены)"), по меньшей мере, одного первого гена, воздействующего на функцию белка ретинобластомы и, по меньшей мере, одного второго гена, воздействующего на белок p53 или представителя данного семейства, где, предпочтительно, первый ген подавляет контролирование контрольного пункта G1 и второй ген подавляет апоптоз, индуцированный первым геном;
(2) способ получения линии клеток, как определено выше в (1), содержащий трансформирование/трансфицирование исходной клетки первым и вторым геном;
(3) применение линии клеток, как определено в (1) выше, для получения биологических препаратов или вирусов, предпочтительно, для получения вакцины или для генотерапии; и
(4) способ получения вирусов или биологических препаратов, с применением линии клеток, как определено выше в (1).
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - схематические отрезки плазмид экспрессии, используемые для усиленной иммортализации первичных клеток утки (пример 2). Сигналы полиаденилирования опущены для ясности. Буквенно-цифровые обозначения слева представляют собой короткие идентификаторы плазмид. mPGK и hPGK - промоторы фосфоглицераткиназы мыши и человека соответственно; ad5, E1-эндогенный промотор Ad5; moCMV, быстродействующий ранний промотор CMV мыши; tk - промотор киназы тимидина вируса простого герпеса; orf 22 и gam1 - гены вируса CELO; E1A и E1B - гены области E1 аденовируса 5.
Фиг.2 - изображения фазовоконтрастной микроскопии в качестве примера формирования очага в трансфицированных Ad5-E1 эмбриональных клетках печени утки (плазмида 49E). A - начальное увеличение 4 x, для отображения полного очага, заключенного в стареющих первичных клетках. B - начальное увеличение 20 x: периметр крупного округлого очага малых клеток, собранных в компактный монослой, видимый в правой части рамки, быстро стареющие первичные клетки ближе к левой части.
Фиг.3 - иммунофлюоресцентный анализ для белков E1A и E1B 55К (пример 3). Два верхних ряда - смесь иммортализованных плазмидой 49E и первичных клеток печени утки; нижние два ряда - клетки положительного контроля 293. Левый столбец - фазовоконтрастные изображения; средний столбец - иммунное окрашивание белков E1A или E1B 55К, как обозначено на фигурах; правый столбец- окрашивание DAPI. Белок E1B 55К характерным образом локализуется к цитоплазме и собирается в скопления, что дает неравномерное распределение пятнами. E1A является ядерным белком. Следует отметить уплотненные ядра, которые ярко окрашиваются DAPI в трансформированных клетках утки.
Фиг.4 - анализ Q-PERT (количественный анализ PERT) супернатанта клеток для обнаружения активности ретровирусов (пример 4). Полужирные квадраты - положительный контроль CHO; незаполненные квадраты - отрицательный контроль воды; полужирные ромбы - фибробласты эмбрионов кур; полужирные треугольники - отрицательный контроль линии клеток 293; серые круги - отрицательный контроль только с субстратом; незаполненные треугольники - клетки печени утки, иммортализованные плазмидой 49E; дельта Rn - излучение репортерного красителя над уровнем начальной фоновой флюоресценции.
Фиг.5 - амплификация MVA в некоторых из описанных линий клеток утки и CEFp (пример 5). Инфицирование было выполнено с MOI (множественностью заражения) 0,1. Титрование было выполнено на клетках VERO спустя 48 часов после инфицирования (Пример 2). CEFp - первичные фибробласты эмбрионов кур.
Фиг.6 - серийное пассирование MVA в клетки сетчатки утки, иммортализованные плазмидой 49E (пример 5). Полужирные квадраты - размер вспышки; столбцы - вводимое количество вируса, доведенное до MOI 0,1. Вводимое количество вируса дается как стандарт для демонстрации, что размер вспышки не зависит от экспериментальных флуктуаций в количестве клеток (которое в свою очередь определяет вводимое количество вируса посредством MOI).
Список последовательностей - текст в произвольной форме
| SEQ ID NO: | Описание - текст в произвольной форме |
| 1 | Праймер VS182 |
| 2 | Праймер VS183 |
| 3 | Праймер VS184 |
| 4 | Праймер VS185 |
| 5 | Праймер VintSA-F |
| 6 | Праймер VintSA-R |
| 7 | Плазмида pEFAd5E1A |
| 8 | Плазмида pEFAd5E1BSA |
| 9 | Плазмида 49E |
| 10 | Плазмида 25F |
| 11 | Праймер V206 |
| 12 | Праймер V207 |
| 13 | Праймер V208 |
| 14 | Праймер V209 |
| 15 | Праймер RT |
| 16 | Праймер cDNA 1 |
| 17 | Праймер cDNA 2 |
| 18 | Плазмида 60E |
| 19 | Плазмида 36E |
Подробное описание изобретения
Термины "иммортализованный", "иммортализованные клетки" и "иммортализованная линия клеток" в соответствии с настоящим изобретением относятся к клетке или линии клеток, которую трансфицировали/трансформировали определенными функциональными последовательностями ДНК, придающими возможность, по меньшей мере, 200 пассажей, предпочтительно, неограниченного количества пассажей, то есть бессмертия, соответствующим исходным клеткам.
Термин "генная кассета" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как последовательность ДНК, содержащую ген, препятствующий функции белка ретинобластомы, то есть который прямо или косвенно (например, после экспрессии) добивается разрушения комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F и который, кроме того, содержит ген вируса, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоза за счет p53, такой как белок аденовируса E1B 55К всех групп, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно из папилломавирусов человека низкого риска (HPV) (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз за счет p53, такой как mdm2.
Более подробно описанная выше генная кассета содержит "первый ген", который в предпочтительном аспекте (1) прямо или косвенно (например, посредством клеточных индукторов) обеспечивает разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Этот первый ген может представлять собой ген вируса, такой как E1A мастаденовируса, gam1 и orf22 CELO или E7 папилломавирусов, предпочтительно папилломавирусов человека низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, такой как конститутивно активный CDK4 или сверхэкспрессируемый циклин типа D. Активность первого гена обеспечивает прогрессию клеточного цикла обычно за счет индукции апоптоза или торможения роста при увеличении пассирования.
"Второй ген" присутствует в описанной выше генной кассете для противостояния данному эффекту первого гена. Он предотвращает апоптоз или торможение роста и предпочтительно действует путем ингибирования активации транскрипции за счет p53 посредством увеличения расщепления p53 или преобразования p53 из трансактиватора в репрессор транскрипции. Предпочтительно "второй ген" способен предотвращать активацию транскрипции за счет p53, в том числе подавлять функцию p53 и обеспечивать уменьшение стабильности p53. "Второй ген" может представлять собой ген вируса, такой как белок аденовируса E1B 55К всех групп, orf22 CELO, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно папилломавирусов человека низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз посредством p53, такой как mdm2. Предпочтительно "второй ген" представляет собой orf22 CELO или E1B 55k аденовируса.
Это полностью противоположно введению экзогенного активного p53 дикого типа, которое было связано с получением линии фибробластов кур, за счет неизвестного механизма (US 5 879 924).
"Биологические препараты" в контексте настоящего изобретения содержат терапевтические и рекомбинантные белки, включая антитела, ферменты, гормоны, рецепторы или их лиганды и продукты их слияния. Предпочтительными биологическими препаратами являются рекомбинантные белки.
Одним предпочтительным аспектом варианта выполнения (1) является применение линии клеток, полученной из эмбриона или вылупившейся курицы, утки, гуся, перепела и т.п., предпочтительно из курицы или утки. В особенно предпочтительном аспекте (1) данная линия клеток дополнительно не обладает активностью обратной транскриптазы, получена в результате иммортализации первичной клетки, происходящей из эмбрионов кур, вылупившейся курицы, эмбрионов уток или вылупившихся уток, получена из экстраэмбриональной оболочки и/или культивирована в среде определенного химического состава. Среда предпочтительно не содержит сыворотку животного.
Другим предпочтительным аспектом варианта выполнения (1) является то, что клетки, подвергнутые иммортализации, являются первичными клетками, включая фибробласты, клетки из выделенных сегментов тела (сомитов) или выделенные одиночные органы, включая ткани нейронов, мозга, сетчатки, почек, печени, сердца, мышц и экстраэмбриональные ткани и мембраны, предохраняющие эмбрион. Наиболее предпочтительно клетки из экстраэмбриональных мембран или сетчатки.
Иммортализацию, приводящую к клеткам варианта выполнения (1), предпочтительно проводят путем невирусной трансфекции, включая, без ограничений, трансфекцию, опосредованную липосомами, преципитатами дендримеров или гидроксиапатита ("фосфата кальция") и электропорацию.
Предпочтительно первый ген в варианте выполнения (1), представляет собой ген вируса, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Он включает, без ограничений, ген E1A аденовируса из мастаденовирусов (предпочтительно из мастаденовирусов группы С), белок E7 папилломавирусов, предпочтительно из вируса папилломы человека низкого риска (HPV) (такого как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), ген orf 22 аденовирусов птиц и/или открытые рамки считывания E43 из атаденовируса овцы. Альтернативно первый ген варианта выполнения (1) представляет собой ген клетки, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F. Он включает, без ограничений, циклин Dl, циклин D2, циклин D3 и/или мутированный CDK4, не восприимчивый к инактивации за счет p16INK4a.
Второй ген варианта выполнения (1) предпочтительно представляет собой ген вируса, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоз за счет p53. Он включает, без ограничений, гены, кодирующие белок E1B55K аденовируса всех групп, GAM-1 из CELO, белок E6 папилломавирусов, предпочтительно из HPV низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18). Наиболее предпочтительными являются гены, кодирующие белок E1B55K аденовируса и GAM-1 из CELO. Альтернативно второй ген кодирует клеточный белок, предотвращающий торможение роста и апоптоз за счет p53, такой как mdm2.
Первый и второй гены варианта выполнения (1) предпочтительно пространственно разделены гетерогенными последовательностями или расположены на различных сегментах нуклеиновой кислоты или плазмидах.
В особенно предпочтительном аспекте варианта выполнения (1) первый ген представляет собой E1A, и второй ген представляет собой область E1B аденовируса рода Mastadenovirus, предпочтительно из аденовируса 5. Наиболее предпочтительно указанные области E1A содержат последовательность из п.о. 1193-2309, предпочтительно п.о. 1239-2309, из SEQ ID NO:7 или последовательность, комплементарную п.о. 4230-3113, из SEQ ID NO:9. Кроме того, наиболее предпочтительно указанные области E1B содержат последовательность из п.о. 1145-3007, предпочтительно п.о. 1197-2810, из SEQ ID NO:8 или последовательность, комплементарную п.о. 2345-550, из SEQ ID NO:9.
В дополнительно предпочтительном аспекте варианта выполнения (1) первый ген представляет собой orf22, и второй ген представляет собой GAM-1 из аденовируса, предпочтительно, рода aviadenovirus CELO, которые, предпочтительно, содержат последовательность, представленную последовательностью, комплементарной п.о. 1252-635, из SEQ ID NO:10, и последовательность, комплементарную п.о. 3138-2290, из SEQ ID NO:10.
В еще более предпочтительном аспекте варианта выполнения (1) и (2) для иммортализации клеток используют плазмиды 36E (SEQ ID NO: 19), 37E (фиг.1), 49E (SEQ ID NO:9), 25F (SEQ ID NO: 10) или 60E (SEQ ID NO: 18).
Кроме того, предпочтительными аспектами варианта выполнения (1) являются сочетания нуклеиновых кислот, кодирующих E1A и/или E1B с GAM-1 и/или Orf22, как определено выше.
Линия клеток в соответствии с вариантом выполнения (1) может дополнительно нести неприродные функциональные последовательности, включая, без ограничений, трансгены, такие как гены, комплементарные дефицитным вирусам (например, EBNA1 и т.д.), промоторы (например, PGK-, EF1.alpha-, CMV-промотор, E1-промоторы Ad5, tk-промотор и т.д.), энхансеры (например, RSV-LTR), селективные маркеры, такие как резистентности к неомицину, резистентности к пуромицину и т.д. В одном предпочтительном аспекте первый и второй гены находятся под контролем различных промоторов, независимо выбранных из PGK-, CMV-, E1- и tk-промоторов.
Линия клеток в соответствии с вариантом выполнения (1) входит в один предпочтительный аспект, еще более подходящий для получения биологических препаратов или вирусов, включая штаммы вакцин (вирусы заболевания Марека, инфекционного бурсита, болезни Ньюкастла, герпеса индеек, анемии кур, гриппа, вакцинии (MVA), краснухи, бешенства и т.д.) и рекомбинантные вирусные векторы (например, рекомбинантные MVA или альфавирусы). Большинство предпочтительных вирусов для вакцинации представляют собой вирусы гриппа и MVA. Самым предпочтительным рекомбинантным вирусным вектором является MVA.
В одном аспекте варианта выполнения (1) линия клеток представляет собой линию клеток 12A07-A10 (DSM ACC2695), полученную путем иммортализации клеток экстраэмбриональной мембраны утки плазмидой 49E (пример 2).
Кроме того, предпочтительным является получение линий клеток в соответствии с вариантом выполнения (1) при условиях cGMP, делающих их подходящими для фармацевтического применения.
Способ варианта выполнения (2) предпочтительно включает невирусную трансфекцию исходной клетки, такую как приведенные выше. Наиболее предпочтительной является липосомальная трансфекция, особенно трансфекция с помощью реактива Effectene.
Предпочтительным применением в соответствии с вариантом выполнения (3) является применение для получения вакцины или для генной терапии. Штамм вирусной вакцины или вектор генной терапии вводят в контакт с клетками линии клеток в соответствии с вариантом выполнения (1) так, что происходит инфицирование, и вирус амплифицируется указанными клетками. Непрерывное пассирование вируса (повторенные циклы инфицирования и сбора вируса на указанных клетках) приводит к ослаблению или адаптации вируса к данной частной линии клеток-хозяев. Таким образом, производят вирусный вектор или штамм вакцины с меньшей вирулентностью для предполагаемого вакцинируемого (который не является уткой, предпочтительно не является птицей). Ослабленные вирусы позволяют иммунной системе вакцинируемого запустить реакцию, которая является более эффективной защитой, чем вакцинация полностью инактивированными частицами, и менее тяжелой, чем инфекция инфекционным агентом дикого типа (естественным). Предпочтительными вирусами для данного варианта выполнения являются вирусы кори и бешенства.
Способ получения вирусов в соответствии с вариантом выполнения (4) предпочтительно содержит контактирование указанных вирусов с линией клетки в соответствии с вариантом выполнения (1) и/или культивирование указанных вирусов в указанной линии клеток. Особенно, этот способ может использоваться для получения вируса оспы, предпочтительно штамма MVA, в линии клеток утки, предпочтительно в линии клеток, происходящей из сомитов утки или нейронной ткани утки, еще более предпочтительно из сетчатки утки. Особенно клетки, происходящие из сетчатки и сомитов утки, полученные трансфекцией области Ad5-E1 при условиях cGMP, устойчиво поддерживают амплификацию MVA с эффективностью, сопоставимой или лучшей, чем первичные фибробласты эмбрионов кур (Пример 5).
Способ получения биологических препаратов, особенно рекомбинантных белков, в соответствии с вариантом выполнения (4) содержит введение гена, кодирующего рекомбинантный белок, функционально связанного с промотором, в линию клеток в соответствии с вариантом выполнения (1), культивирование указанной модифицированной линии клеток и сбор рекомбинантного белка.
Способ варианта выполнения (4) используется предпочтительно для получения вирусов и биологических препаратов, пригодных для вакцинации или генной терапии.
Исторически яйца кур и соответствующие клетки (фибробласты кур) являются доминирующим субстратом для производства вакцин. Для фармацевтических целей доступны куры из микроклимата с контролем доступа патогенов с обширной системой контроля. В многочисленной литературе яйца кур предлагаются как первичная цель для развития линий клеток. В связи с этим клетки кур являются предпочтительным источником для исходных клеток в соответствии с изобретением. Однако клетки и линии клеток, полученные из кур, наиболее вероятно являются RT-положительными. Литературные данные предлагают низкий уровень риска высвобождения инфекционного вируса. Однако отсутствие передающегося вируса следует контролировать для любой линии клеток, используемой в производстве. Действительно, большинство линий клеток птиц, устоявшихся до настоящего времени, получены из курицы (US 5 830 723, US 5 879 924). Несмотря на то что было возможно вывести ряд поколений курицы (линия 0), не содержащих вирус лейкоза птиц, эндогенные ретровирусы птиц (EAV-HP) (Boyce-Jacino et al., J. Virol 66(8):4919-29 (1992)) присутствуют в клетках кур, включая линию 0. EAVs, обеспечивают активную обратную транскриптазу, но уровни экспрессии существенно варьируют. В связи с этим, даже первичные клетки и линии клеток кур, такие как DF1, которые определены, как RT-отрицательные, в менее чувствительных анализах (Crittenden et al., Virology 57(1): 128-38 (1974)), по всей видимости, будут определены как RT-положительные в современных подходах ПЦР в реальном времени и могут скрывать ретровирусы, которые активируются при определенных условиях роста.
Альтернативно предпочтительными видами птиц в соответствии с настоящим изобретением для развития линии клеток являются не содержащие эндогенные ретровирусы или экспрессирующие обратную транскриптазу (RT). Они включают уток, которые являются подходящими по двум дополнительным причинам: яйца уток также доступны из контролируемых запасов без патогенов, и у уток, в отличие от гусей, меньше вероятность развития спонтанных опухолей. В то время, как известно, что многие из важных штаммов вакцин хорошо реплицируются в (эмбриональных) клетках уток, так же как и в (эмбриональных) клетках кур (например, вирус заболевания Марека (Witter R.L, Avian Dis. 46:925-37 (2002)) или краснуха (Rocchi G., Salvadori A., Nuovi Ann. Ig Microbiol. 21:336-40 (1970))), это еще следует продемонстрировать для штаммов вирусов, представляющих первостепенный интерес. Для других вакцин такие данные недоступны.
Насколько известно, новым и неожиданным открытием данного изобретения является то, что высоко ослабленный штамм вируса оспы MVA (измененная вакциния Анкара) реплицируется в линиях клеток утки с подобной или более высокой эффективностью, чем в обычно используемых первичных фибробластах эмбрионов кур. Один замысел изобретателей состоял в том, чтобы обеспечить безопасную и надежную альтернативу первичным клеткам для амплификации вирусов, которые нуждаются в организме птицы, или штаммов вакцин, где предпочтителен хозяин, не являющийся млекопитающим. Важным вирусом, для которого недоступны подходящие клетки-хозяева, является MVA (измененный вирус вакцинии Анкара). MVA представляет собой высокоослабленный вирус оспы и является чрезвычайно перспективным инструментом для терапевтических и защитных приложений вакцин. MVA выступает в роли модельного вируса для исследования клеток утки, но его не следует принимать в качестве единственного примера: описанные эксперименты могут также быть выполнены с рядом других вирусов или инфекционных агентов или терапевтических векторов, таких как вирусы кори, краснухи, бешенства или гриппа.
Фибробласты были выбраны в качестве предпочтительного типа клеток, главным образом, по историческим и практическим соображениям. Фибробласты представляют собой наиболее быстро растущие первичные клетки млекопитающих, а также птиц. Когда суспензию клеток от целых эмбрионов кур вносят в культуру, они являются не единственным, но преобладающим типом клеток. Однако растущие фибробласты чрезвычайно адгезивны и ослабляют это свойство только после полной (онкогенной) транформации. Этот процесс требует наличия сильных трансформирующих генов, таких как v-ras, нарушающих пути трансдукции сигналов. Раннее старение культур фибробластов частично вызвано полным отсутствием теломеразной активности у птиц и людей (Forsyth N. R. et al., Differentiation 69 (4-5): 188-97 (2002)).
Первичные фибробласты человека устойчивы к трансформации генами E1 аденовируса типа 5, которые непосредственно не нарушаются данными путями (собственное наблюдение). Эффективная иммортализация и рост в суспензионной культуре с большей вероятностью будут успешными для эпителиальных и нейронных клеток. Кроме того, эпителий, а не фибробласты, как представляется, является первичным сайтом для репликации вируса в яйце птицы. Интересно, что в отличие от ситуации с человеком, почка птицы действительно экспрессирует теломеразу в течение всей жизни, что делает клетки почки птицы хорошей мишенью для иммортализации. Взятые вместе эпителиальные клетки птиц, включая почечный эпителий и нейронные клетки, считают самыми перспективными мишенями для развития линии клеток с требуемыми свойствами.
Следовательно, разработка линии клеток птиц сосредоточена почти исключительно на фибробластах только в связи с простотой получения этих клеток (Cowen B.S., Braune M.O., Avian Dis 32(2):282-97 (1988); US 5,830,723). В некоторых случаях использовали целые эмбрионы (US 2001-0016348).
Вирусы демонстрируют специфичность не только по отношению к виду, но также и к органу и ткани, основанную на распределении рецепторов и клеточных факторов, способствующих репликации. Следовательно, в отличие от типичного подхода, предпочтительным способом выполнения настоящего изобретения является разделение органов до культивирования для получения наиболее предпочтительной клетки-хозяина.
Для вируса гриппа, адекватное вакцине продуцирование которого является главным приложением линий клеток в соответствии настоящим изобретением, типичным сайтом репликации является не эмбрион как таковой, а экстраэмбриональные мембраны. Следовательно, отдельная цель состояла также в разработке линии клеток от экстраэмбрионального материала, включая защитные мембраны эмбриона. Некоторые тканеспецифичные первичные культуры, включая таковые из экстраэмбриональных оболочек, обладают очень малым временем жизни по сравнению с фибробластами. Это дополнительно подчеркивает необходимость предумышленной иммортализации для получения улучшенных клеток-хозяев. Успешная иммортализация множества тканей в ограниченный промежуток времени требует определенного сочетания генов, используемых в рамках настоящего изобретения.
Не было известно, какая из тканей птицы обладает самым высоким потенциалом репликации для вирусов оспы, таких как MVA или оспа канареек. Для типичного производственного процесса для MVA требуется смесь клеток от эмбриона без головы, которую удаляют до измельчения. В связи с этим полной неожиданностью является то, что линия клеток нейронного происхождения, полученная из сетчатки, обладает такой высокой способностью к репликации MVA, в то время как другие ткани ею не обладают.
Такая же тканевая специфичность применяется для продуцирования белка. Способность к транскрипции зависит от доступного набора факторов транскрипции, и даже эффективные повсеместно распространенные вирусные и клеточные промоторы демонстрируют непостоянную эффективность в различных тканях. Кроме того, выход секретируемого белка сильно зависит от способности конкретного типа клетки к правильному сворачиванию и процессингу (например, гликозилат) белка.
Механизмы, приводящие к иммортализации и трансформации первичных клеток, были хорошо описаны (Harm W.C. et al., Nature 400:464-8 (1999)). Заданные элементы препятствуют (1) контролю прогрессии клеточного цикла, (2) запрограммированной гибели клеток, индуцированной нарушением регуляции клеточного цикла, (3) трансдукции сигнала фактора роста и для клеток человека и птиц (4) укорачиванию теломер, линейных концевых участков хромосом. Известно большое количество факторов, которые могут приводить первичные клетки к иммортализованному и трансформированному фенотипу, но иммортализация наступает за счет ингибирования клеточных контрольных пунктов, ответственных за сведение к минимуму формирования опухоли в организме. В связи с этим желательно выбрать трансформирующие факторы, которые могут произвести экспериментальное поколение линии клеток с минимальным риском индукции опухолевого роста у реципиентов биологических препаратов, полученных из сконструированных клеток. В связи с этим, требуется сбалансированная эффективность трансформирующих факторов: они должны быть достаточно эффективными, чтобы вызвать трансформацию без необходимости в накоплении дополнительных спонтанных мутаций, то есть молекулярный путь, приводящий к получающейся линии клеток, должен быть полностью известен (категории I и II в соответствии с заседанием совещательного комитета в мае 2000 офиса презентации вакцины FDA CBER). Кроме того, желательно выбрать синергичное сочетание факторов, которые по отдельности не могут трансформировать первичные клетки, таким образом, требуется согласованный перенос генофонда, который дополнительно сводит к минимуму риск самопроизвольной трансформации в вакцинах или у пациентов. Наконец, желательно, чтобы трансформирующий фактор выявил иммунный ответ у реципиента биологических препаратов так, чтобы в результате внесения продукта активизировался иммунологический надзор опухоли в маловероятном явлении формирования опухоли. Последний критерий можно осуществить, если используются не клеточные, а инородные, например вирусные, трансформирующие белки.
К настоящему времени обнаружено, что область E1 из аденовируса 5 человека (Ad5) идеально подходит для трансформации клеток так, чтобы получающаяся сконструированная клетка соответствовала всем приведенным выше критериям.
Область E1B кодирует две открытые рамки считывания на двуцистронной мРНК, белки 21К и 55К. Белок 55К связывается с p53 и, таким образом, преобразует проапоптотический активатор транскрипции в репрессор. Белок 21К дополняет данную антиапоптотическую активность путем связывания с Bax, таким образом, поддерживая целостность митохондриальной мембраны и предотвращая высвобождение цитохрома C. Этот белок является существенным для перехода адгезивных клеток в независимый от субстрата рост и, следовательно, существенным для процесса ферментации в суспензии.
До настоящего времени не было показано, может ли E1B 55К аденовируса человека воздействовать на птичьи гомологи p53. Кроме того, аденовирусы птиц не содержат генов, схожих с E1B, таким образом, это заключение также не было возможно. Вопреки всем ожиданиям изобретатели обнаружили, что E1B может обеспечить необходимые функции для обеспечения иммортализации E1A.
Новым и ключевым фактором для описанного в настоящем изобретении достижения было удаление E1B из неэффективного естественного контекста и размещение под контролем эффективного рекомбинантного промотора. Данная новая модификация и сочетание обеспечивали эффективную иммортализацию множества тканей утки и курицы путем трансфекции вместо трансдукции ретровируса.
Несмотря на то что механизм, лежащий в основе трасформации за счет E1, является сложным, один признак является наиболее желательным: E1A представляет собой сильный индуктор пролиферации и апоптоза клеток, тогда как белки E1B эффективно препятствуют апоптозу, но не могут ограничивать контроль клеточного цикла.
Следовательно, для поддержания экспериментально индуцированного трансформированного фенотипа необходим не единичный фактор, а непрерывное присутствие белков E1A и E1B.
С тех пор, как в 1970-х был описан v-src (Brugge J.S., Erikson R.L, Nature 269:346-8 (1977)), было открыто и охарактеризовано большое разнообразие трансформирующих факторов. В действительности, это было изучение индукции опухолей у птиц альфаретровирусами, которое обеспечило первые представления о молекулярной структуре (Martin G.S., Nature 227:1021-3 (1970)). Ретровирусные онкогены получают из клеточных генов с мутированными или делетированными важными регуляторными доменами. Некоторые из факторов, которые были идентифицированы в ходе этих изучений, такие как v-myc или v-ras, непосредственно воздействуют на компоненты путей RB и p53. Другие белки, такие как v-src или v-erbB, представляют собой конститутивно активируемые (следовательно, дисрегулируемые) трансдукторы сигнала, которые имитируют проникающие внеклеточные митогены. Проблема с данными факторами заключается в том, что их мишенью является только один из нескольких путей, необходимых для эффективной трансформации. Присутствие v-src или v-myc предрасполагает клетку к трансформации и требует дополнительных, спонтанных и непредсказуемых изменений в клетке для полного превращения. Следовательно, трудно оценить риск для пациента, представляемый клетками, трансформированными одним из ретровирусных онкогенов.
Известно, что другие ДНК-вирусы, такие как папилломавирусы и полиомавирусы, также трансформируют клетки in vitro. Однако выбранные трансгены не должны быть слишком агрессивными для сведения к минимуму риска индукции опухолевого роста у реципиентов биологических препаратов посредством непреднамеренно перенесенной клеточной ДНК. Этот критерий является особенно строгим для получения вакцины, которую часто прививают здоровой части населения в очень молодом возрасте. Даже со сложными современными способами очистки большой T-антиген полиомавируса считается слишком агрессивным для применения в линиях клетки, получаемых для применения в медицине человека. В виду того что 90% карцином шейки матки несут последовательности папилломавируса (Munoz N. et al., N. Engl., J. Med. 34816):518-27 (2003)), полагают, что аденовирусы C-типа (которые включают типы 2 и 5), не индуцируют опухоли in vivo, и аденовирусные последовательности не были обнаружены в ткани опухоли человека.
На основании дополнительных особенностей трансформирующих генов, показанных выше, было обнаружено, что сочетание генов, каждый из которых препятствует отдельному пути в клеточном цикле и апоптозе, должно получить генетически устойчивую линию клеток, растущую в суспензии.
Было показано, что полная область E1 аденовируса 5 может удовлетворить этим требованиям. Принимая во внимание, что было показано, что белок 12S E1A из Ad5 может взаимодействовать с RB птицы (Guilhot C. et al., Oncogene 8:619-24 (1993)), функциональная активность белков 55К и 21К в клетках птиц демонстрируется впервые в настоящем изобретении. Неудивительно, что некоторые клоны клеток перепела, экспрессирующие белок 12S из E1A, демонстрируют свойства трансформированных клеток (Guilhot C. et al., Oncogene 8:619-24 (1993)). Чрезвычайно эффективная и устойчивая трансдукция посредством инфекцирования ретровирусом создает достаточно большой пул клеток, чтобы позволить отдельным клеткам преодолеть блок клеточного цикла или индукцию апоптоза за счет спонтанных геномных изменений. Эти необходимые, но неизвестные изменения увеличивают медицинский риск, и получающуюся линию клетки нельзя считать сконструированной линией клеток, которая должна быть основана на известных генах. Кроме того, методики трансфекции недостаточны, чтобы создать большой пул клонов, необходимый для естественного отбора. Вместо этого была необходима трансдукция ретровируса. Трансформирующий ген, введенный с помощью данного подхода, будет фланкирован ITRs и, следовательно, может быть мобилизован, даже в большей степени в линии клеток, экспрессирующей обратную транскриптазу.
В последнее время аденовирус птиц, названный аденовирусом птиц типа 1 штамм CELO (что расшифровывается как смертельный сиротский вирус эмбрионов кур), был описан более детально (Chiocca S. et al., J. Virol. 70:2939-49 (1996)). Большие, центральные геномные отрезки CELO гомологичны Ad5, но отличаются по важным аспектам - CELO не содержит E1-гомологичную область среди других. Кроме того, CELO не может быть коплементарным Ad5, мутагенизированному в области E1A, и, наоборот, белки E1 Ad5 не могут трансактивировать транскрипцию замедленных ранних генов CELO (Li P. et al., J. Gen. Virol. 65(Pt 10): 1817-25 (1984)). Несмотря на это, CELO может трансформировать клетки хомяка in vitro (May J.T. et al., Virology 68:483-9 (1975)). В вирусе CELO были идентифицированы гены, препятствующие клеточному циклу и апоптозу, orf22 и GAM-1 (Lehrmann H., Cotton M., J. Virol. 73:6517-25 (1999)). Orf22 кодирует белок, который взаимодействуют с RB, и GAM-1 препятствует апоптозу в форме, подобной белку-прототипу 21К (Chiocca S. et al., J. Virol. 71:3168-77(1997)).
К настоящему времени обнаружено, что гены orf22 и GAM-1 из вируса CELO представляют собой подходящие замены E1A и E1B. Вследствие этого спектр доступных трансгенов для трансформации клеток птиц расширяется. Эти белки прежде не использовали для трансформации клеток птиц.
Кроме того, один из вирусных генов может быть замещен клеточным геном. Кандидатами на такую замену являются представители семейства E2F или циклины группы D для области E1A аденовируса и mdm2 для области E1B.
Следующие линии клеток были депонированы в DMSZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany:
1. PBG04 как DSM ACC2577, депонированная 18 сентября, 2002;
2. 12A07-A10 как DSM ACC2695, депонированная 20 октября, 2004.
Изобретение будет более подробно пояснено со ссылкой на следующие примеры, которые, однако, не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.
Примеры
Пример 1: Иммортализация первичных клеток утки посредством E1A, B аденовируса 5
Последовательности E1A и E1B аденовируса амплифицировали из культуры пассажа 8 первого поколения (E1 делетированный) аденовируса Admuc, выращиваемого в HEK 293, со значительными примесями вирусом дикого типа, с применением полимеразы provestart (Qiagen).
Использовали следующие праймеры:
VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (SEQ ID NO:l)
VS183 CACACGCAATCACAGGTT (SEQ ID NO:2)
для амплификации области E1A и
VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (SEQ ID NO:3)
VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (SEQ ID NO:4)
для амплификации области E1B. Оба фрагмента сначала клонировали в pPCR4blunttopo (Invitrogene).
В конструкции E1B отсутствует акцепторная точка сплайсинга из первичного транскрипта E1B. В связи с этим ее заменяли синтетической последовательностью, амплифицированной с применением праймеров от лидерного интрона тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В качестве матрицы использовали геномную ДНК от PBG04 (DMSZ ACC2577), гетерогибридомы мыши и человека.
Праймеры:
VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA (SEQ ID NO:5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG (SEQ ID NO:6)
Для создания составных белков данную акцепторную точку сплайсинга непосредственно клонировали в pEFmyc, содержащей альфа промотор aEFl и лидерный пептид myc. Область E1A удаляли из ptopoE1A с применением сайтов EcoR I и Xho I и непосредственно клонировали в pEFmyc, удаляя лидерную последовательность myc и связывая E1A с поли-A гормона роста быка. Область E1B повторно удаляли с помощью ферментов рестрикции EcoR I и Xho I и клонировали в pEFmycSA, содержащей ксеногенный сайт акцепторной точки сплайсинга. Получающиеся плазмиды назвали pEFAd5E1A (SEQ ID NO:7) и pEFAd5E1BSA (SEQ ID NO:8).
Яйца утки с эмбрионом инкубировали при 37°C, 60% влажности воздуха в течение 12 дней (более ранние эмбрионы давали больше клеток, но также содержали и большее количество загрязняющих, дифференцированных фибробластов). Скорлупу стерилизовали 70% изопропанолом, вскрывали на тупом конце, и эмбрион асептически переносили на стерильную чашку Петри. Эмбриональный мозг и почки удаляли, переносили на отдельные чашки Петри, заполненные трипсином/EDTA и измельчали. После краткосрочного инкубирования суспензию смешивали с избытком среды F12 (Gibco/Invitrogen), с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (Biochrom) и 2% Ultroser G (Ciphergen). Данную суспензию перенесли в чашку Петри и проводили культивирование при 37°C (что ниже, чем 41,6°C, физиологическая температура курицы) и 5% CO2. Культуральную среду с неадгезивными остатками меняли на следующий день и продолжали культивирование до тех пор, пока, по меньшей мере, 5 x 105 клеток на каждую 3,5 см чашку не было доступно для трансфекции плазмид pEFAd5E1A и pEFAd5E1BSA.
Начальные эксперименты, сравнивающие реактивы для трансфекции с помощью липосом (Effectene; Qiagen) и дендромеров (Polyfect; Qiagen), продемонстрировали, что эффективность Effectene выше. Трансфекцию проводили с применением реактива Effectene; кратко: 2 мкг плазмидной ДНК разбавляли в 200 мкл буфера EC, содержащего 16 мкл энхансера. После инкубирования в течение 5 минут добавляли 16 мкл Effectene. После инкубирования в течение 10 минут из культуры в 3,5 см чашках удаляли супернатант и заменяли 1 мл свежей среды, содержащей смесь для трансфекции. После инкубирования в течение 2 часов при 37°C и 5% CO2 в культуру добавляли дополнительные 2,5 мл свежей среды.
Трансфицируемым клеткам позволяли достичь слияния, их трипсинизировали, ресуспендировали в среде F12 FCS/Ultroser с добавкой G и повторно высевали в две 6-луночные плашки (что соответствует 12-кратному размножению). По истечении 5 и 10 дней среду заменяли на F12 с добавкой только 5% FCS. Плашки просканировали на образование очагов клеток с измененной морфологией (уменьшение полного размера клетки, увеличенное ядро, повышенная видимость плазматических мембран в фазовом контрасте) и повышенным слиянием.
По истечении приблизительно 14 дней после трансфекции, когда очаги достигают в диаметре 1-3 мм, среду аспирировали и дважды промывали культуру трипсоном/EDTA (Gibco). Пропитанные трипсином диски для клонирования (Sigma) размещали на аспирированных культурах в течение 3 минут, затем переносили в лунки 24-луночной плашки, заполненной 500 мкл среды F12, с добавкой 5% FCS.
Клонированным, трансформированным клеткам позволяли расти до слияния, их трипсинизировали, ресуспендировали в среде F12 с добавкой 5% FCS и переносили в 6-луночные плашки. Как только культура достигала слияния в 6-луночной плашке, клетки переносили в колбы T25 для непрерывного пассирования.
Для криоконсервации в определенные интервалы клетки трипсинизировали, ресуспендировали в среде F12, содержащей 5% FCS, собирали путем центрифугирования при 100 g в течение 10 мин, ресуспендировали в среде F12, содержащей 50% FCS и 10% DMSO (Sigma) до концентрации приблизительно 3×106 клеток на мл, и размещали в криопробирках в охлаждающем устройстве на основе изопропанола при -75°C. Охлаждающее устройство обеспечивало постоянную скорость охлаждения 1°C в мин. По истечении 24 часов клетки переносили в жидкий азот для длительного хранения.
Пример 2: Улучшенное получение иммортализованных линий клеток птиц
a) Получение первичных клеток
Группа производителей утиных яиц была сертифицирована на отсутствие Salmonella enteritidis и S. typhimurium; Mycoplasma gallisepticum и M. synoviae; случай лейкоза, ретикуло-эндотелиоза, орнитоза, птичьего гриппа, гепатита уток и болезни Держи. Животных преднамеренно не вакцинировали против парвовируса, и случаи парвовирозов не были обнаружены. Животных в группе производителей вакцинировали против S. enteritidis и S. typhimurium; Pasteurella multicodica; метапневмовирус трахеит индейки и парамиксовируса, вызывающего болезнь Ньюкастла.
Яйцам позволяли прийти в равновесие без встряхивания при комнатной температуре и по истечении двух дней инкубировали при 38°C в часто вращающейся влажной камере, с чередованием +45° и -45°.
Эмбрионы уток умерщвляли для выделения первичных клеток по истечении одной или трех недель инкубирования. Яйца переносили в секцию cGMP (закрытую лабораторию, работающую, как отмечено Current Good Manufacturing Practices), и стерилизовали скорлупу путем протирания 70% изопропанолом в ламинарном вытяжном шкафу. Все последующие этапы выполняли в установке секции GMP в стерильных условиях с определенными растворами или средами.
Яйца осторожно вскрывали, эмбрионы переносили на большую чашку Петри и сразу умерщвляли путем декапитации. Извлекали образцы из следующих органов: мозг, сетчатка, печень, пищевод, сердце и экстраэмбриональные оболочки.
Кроме того, клетки из сомитов готовили из 8-дневного эмбриона.
Все образцы промывали PBS (фосфатно-буферным солевым раствором; Gibco/Invitrogen, США), обрабатывали трипсином (Gibco/Invitrogen, США) в течение 1-10 минут и измельчали в культуральной среде DMEM:F12 (Gibco/Invitrogen, США) с добавкой 10% FCS (Biochrom AG, Германия) путем повторного пассирования через шприц 18G. Гомогенизированные образцы выращивали при 37°C и 5% CO2. Остатки удаляли из адгезивных клеток путем замены среды на следующий день.
b) Плазмидные конструкции
Плазмиды экспрессии для E1A, E1B, Orf22 и Garni были сконструированы путем извлечения подходящих целевых областей из геномной ДНК аденовируса серотипа 5 или смертельного сиротского вируса эмбрионов кур (CELO) дикого типа соответственно с помощью ПЦР и вставки в векторы, содержащие промоторы фосфоглицераткиназы человека или мыши (hPGK или mPGK), CMV мыши (moCMV) или tk (фиг.1).
Последовательности аденовирусов для E1A и E1B амплифицировали из вируса дикого типа с применением полимеразы ProofStart (Qiagen, Германия). Использовали следующие праймеры:
VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (SEQ ID NO:1)
VS183 CACACGCAATCACAGGTT (SEQ ID NO:2)
для амплификации области E1A и
VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (SEQ ID NO:3)
VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (SEQ ID NO:4)
для амплификации области E1B. Оба фрагмента сначала клонировали в pPCR4-Blunt-TOPO (Invitrogene, США).
В конструкции E1B отсутствует акцепторная точка сплайсинга из первичного транскрипта E1B. В связи с этим ее заменили синтетической последовательностью, амплифицированной с применением праймеров от лидерного интрона тяжелой цепи иммуноглобулина человека. В качестве матрицы использовали геномную ДНК от PBG04 (DMSZ ACC2577), гетерогибридомы мыши и человека.
Праймеры, используемые для амплификации:
VintSA-F MGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA (SEQ ID NO:5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG (SEQ ID NO:6)
Гены GAM-1 и ORF-22 амплифицировали из вируса CELO дикого типа с праймерами
V206 AAC CTC GAG ACC CCC CTG TAC ATT CTA (SEQ ID NO: 11)
и V207 GCC GTT AAC TTC AGG GAT TGG TTA CAG (SEQ ID NO: 12) и
V208 CAC CTC GAG TCC GGA TTA AGA TGA ACG (SEQ ID NO: 13) и
V209 CCA GTT AAC AGG TGA ACC ATT TAT ACA G (SEQ ID NO: 14) соответственно.
Репрезентативные примеры получающихся плазмид приводятся с плазмидой 49E (факторы аденовируса под контролем промоторов PGK человека и CMV мыши; SEQ ID NO:9), плазмида 25F (факторы CELO под контролем промоторов PGK мыши и человека; SEQ ID NO: 10), плазмида 60E (факторы аденовируса под контролем промоторов PGK и tk человека; SEQ ID NO: 18) и плазмида 36E (фактор CELO под контролем промотора PGK мыши; SEQ ID NO: 19) (см. также фиг.1).
Целостность плазмид экспрессии подтверждалась секвенированием. Плазмиды не наделены способностью экспрессировать факторы резистентности к антибиотикам (таким как ампициллин) в эукариотических клетках.
c) Трансфекция
Первичные культуры трансфицировали плазмидами экспрессии для E1 или Orf22/Gam1 вскоре после выделения или после единичного субкультивирования. В зависимости от эксперимента плазмиды трансфицировали в виде суперспиралей или после линеаризации с помощью фермента рестрикции Sca I (New Englands Biolabs, США). Начальные эксперименты для сравнения реактивов для трансфекции с помощью липосом (Effectene; Qiagen, Германия) и дендромеров (Polyfect; Qiagen, Германия) продемонстрировали, что эффективность Effectene выше. Трансфекцию проводили следующим образом: 2 мкг полной ДНК разбавили в 200 мкл предоставленного буфера EC и смешали с 16 мкл предоставленного энхансера. После инкубирования в течение 2-5 минут при комнатной температуре добавили 20 мкл реактива Effectene. По истечении 5-10 минут при комнатной температуре данную смесь использовали на клетках в 8 см2 чашке, покрытых 1 мл культуральной среды. По истечении 2-5 часов добавили дополнительные 1,5 мл культуральной среды. На следующий день среду заменяли 2 мл свежей культуральной среды и после этого раз в неделю. Успешная трансфекция была подтверждена в параллельном эксперименте с геном-репортером.
Клетки непрерывно пассировали в среде DMEM:F12, содержащей 10% FCS.
По истечении двадцати дней после трансфекции наблюдались изменения морфологии в определенных субпопуляциях (очаги; фиг.2) некоторых культур; в других культурах очаги не появлялись или были не в состоянии конкурировать с интенсивной пролиферацией первичных клеток; кроме того, другие культуры претерпевали массовую гибель и старение клеток вскоре после трансфекции.
Большое количество независимых очагов размножили из культур с клетками, полученными из печени, сетчатки и экстраэмбриональной мембраны, трансфицированными плазмидой 49E. При пассаже 10, например, линию клеток 12A07-A10, происходящую из клеток экстраэмбриональной мембраны утки, трансформированных плазмидой 49E, выделили и депонировали в DSMZ.
Очаги были также получены от культур с клетками из сетчатки и сомитов, трансфицированными плазмидой 60E.
В плазмиде 49E PGK и промоторы CMV мыши управляют экспрессией E1A и E1B соответственно. Плазмида 60E (SEQ ID NO: 18) также кодирует полную Ad5-E1 область, но экспрессия защитной области E1B управляется tk, то есть промотором, который не такой эффективный, как промотор CMV мыши (но более эффективный, чем нативный промотор E1B). По сравнению с результатами с плазмидой 49E с данной конструкцией было получено гораздо меньше очагов в меньшем количестве образцов клеток, что согласуется с защитным эффектом, придаваемым E1B.
В культурах печени, трансфицированных плазмидами CELO 36E (SEQ ID NO:19) и 25F (SEQ ID NO:10), также наблюдалось формирование очагов, выглядящих как первичные клетки и с трансформированным фенотипом.
Культуры с очагами размножали путем обработки трипсином в течение 2-3 минут и ресуспендирования в среде DMEM:F12 для переноса в свежие культуральные сосуды.
Для криоконсервации через регулярные промежутки времени клетки удаляли с помощью трипсина, ресуспендировали в среде DMEM:F12, содержащей 10% FCS, собирали путем центрифугирования при 200×g в течение 10 минут, ресуспендировали в среде DMEM:F12, содержащей 50% FCS и 10% DMSO (Sigma, США) до концентрации приблизительно 3×106 клеток на мл и охлаждали со скоростью 1°C в минуту до -80°C. По истечении 24 часов клетки переносили в жидкий азот для длительного хранения.
Пример 3: Иммунофлюоресцентный анализ для устойчивой трансфекции
Культуры потенциально иммортализованных клеток высевали на предметные стекла, и их оставляли делиться в течение нескольких дней перед фиксацией ледяным метанолом в течение 10 мин. Фиксированные клетки инкубировали с антителами против белков E1A и E1B 55K, вторичными антителами и флуоресцентным красителем, специфичным к последним в соответствии со стандартом иммунофлуоресцентных способов (Becton Dickinson, Великобритания, антитело #554155 против E1A, разбавленное 1:30; Oncogene, США, антитело #DP08-100UG против E1B 55K, разбавленное 1:30; вторичное антитело, направленное против мыши или крысы, соответственно, и конъюгированное с биотином, от Jackson Immuno Research, США, разбавленное 1:80; визуализация с помощью конъюгата стрептавидин-Texas Red #016-070-084 от Jackson Immuno Research, США, разбавленного 1:100). Первичные клетки, еще присутствующие в большом количестве в ранних, еще не полностью адаптированных, иммортализованных линиях клеток и легко различимые по морфологии, обеспечили удобный внутренний отрицательный контроль для специфичности антитела. Клетки 293 (клетки почек эмбрионов человека), которые устойчиво экспрессируют область E1 Ad5, служили положительным контролем. На конечном этапе инкубирования добавляли DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол; Sigma, США) до концентрации 1 мкг/мл для окрашивания ядер клеток с целью ориентации.
Сильный сигнал для E1A и 55K наблюдался только в клетках, которые претерпевали типичные изменения морфологии, подтверждающие успешную иммортализацию за счет трансфицируемых плазмид (фиг.3). Кроме того, не наблюдалась спонтанная трансформация, формальная возможность, поскольку все клетки с измененным фенотипом были E1-положительными. Ни одна из клеток с первичным фенотипом не экспрессировала белки E1. Несмотря на возможность трансфекции суперспиралей, у которых линеаризация плазмиды в процессе интеграции происходит в произвольных положениях, ни один из исследованных очагов не продемонстрировал экспрессию E1A в отсутствие экспрессии E1B, что дополнительно подчеркивает необходимость в двойном разрыве путей для иммортализации.
Пример 4: Анализ на эндогенный и экзогенный ретровирусы
Обычной проблемой при продуцировании вакцин в первичных фибробластах курицы является заражение экзогенным или эндогенным ретровирусами. Многообразие семейства ретровирусов слишком велико, чтобы предсказать, является ли данный вид носителем ретровирусов. В связи с этим отчеты из литературы обычно ограничиваются субпопуляцией семейства ретровирусов, например, EAV-HP/ALV подгруппа J (Smith L.M. et al., J. Gen. Virol. 80(ptl):261-8 (1999)) и в дальнейшем только субпопуляцией вида птицы.
Следовательно, достоверное подтверждение наличия заражения ретровирусами должно сосредотачиваться на общем мотиве, присутствующем в этих вирусах. Разнообразие последовательностей препятствует способам обнаружения на основе нуклеиновых кислот. Однако общим для всех ретровирусов является наличие фермента обратной транскриптазы. В связи с этим супернатант размноженных очагов от клеток печени утки, иммортализованных плазмидой 49E, анализировали с помощью ПЦР, стимулированного продуктом, на основе количественной пробы для обратной транскриптазы (Q-PERT) и сравнивали с несколькими контрольными группами, среди прочего, CHO в качестве положительного контроля и клетками 293 в качестве отрицательного контроля (см. ниже и фиг.4) для обнаружения эндогенных ретровирусных активностей или примесей свободных ретровирусов. Анализ является модификацией метода из литературы (Lovatt A. et al., J. Virol. Methods 82(2): 185-200 (1999)). Кратко: ретровирусы концетрировали из супернатанта культуры путем ультрацентрифугирования при 100000×g через барьер 20% сахарозы в PBS для удаления продуктов разрушения клеток. Вирионы (если присутствуют) ресуспендировали в буфере для лизиса (50 мМ Трис pH 7,8, 80 мМ KCl, 2,5 мМ DTT, 0,75 мМ EDTA, 0,5% Triton X-100) и смешивали с субстратным буфером (по 10 мМ дАТФ, дЦТФ, цГТФ и дТТФ; 15 мкМ специфичного праймера [GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG; SEQ ID NO: 15]; и 0,5 мг/мл фрагментированной ДНК из спермы сельди [Promega Corp, #D1811]), содержащим модельную РНК (5 мкг/мл РНК вируса мозайки костра [Promega Corp, США, #D1541]), которая подвергается обратной транскрипции, если активность в образце присутствует RT. кДНК от модельной РНК амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами (AAA CAC TGT ACG GCA CCC GCA TT; SEQ ID NO: 16) и (GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG; SEQ ID NO: 17) и регистрировали посредством зеленой флюоресценции SYBR в системе детекции последовательности AB 7000, использующей Смесь QPCR SYBR Green ROX #AB-1163 от Abgene, Великобритания, в соответствии с инструкциями производителя.
На фиг.4 продемонстрирована высокая активность RT в клетках CHO, как ожидалось в связи с отчетами в литературе (например, Anderson K.P. et al., Virology 181(1): 305-311 (1991)). С помощью этих клеток в качестве положительного контроля и клеток 293 человека, не содержащих ретровирусную активность, в качестве отрицательного контроля были определены рамки, которые позволяют интерпретировать неизвестную активность RT в супернатанте клеточных культур (фиг.4, полужирные квадраты и полужирные треугольники).
Авторы изобретения обнаружили умеренную активность RT в фибробластах эмбрионов кур (фиг.4, символы в виде полужирных ромбов).
Сигнал активности RT в супернатанте клеток утки был сравним с сигналом активности RT в клетках 293, и они оба были сравнимы с контролем, представляющим предел чувствительности анализа, состоящего из модельной РНК, не инкубированной с RT (фиг.4, ср. кривые с незаполненными и полужирными треугольниками и серыми кругами). Эквивалентные уровни интенсивности сигнала (дельта Rn) были разделены, по меньшей мере, двумя номерами циклов между образцами от клеток CHO и фибробластов эмбрионов кур (которые для этих экспериментов получены из источника, для которого известно, что он является лишь слабо RT - положительным), и, по меньшей мере, четырьмя номерами циклов между образцами от клеток CHO и отрицательного контроля 293 и культуры клеток утки. Таким образом, в противоположность клеткам кур описанные клетки уток не проявляют активности RT и, следовательно, обладают важным признаком для пригодности в фармацевтических применениях.
Пример 5: Модифицированный вирус вакцины Анкара (MVA)
Пригодность размноженных очагов в качестве субстрата для амплификации MVA определяли для линий печени, сетчатки, сомитов и экстраэмбриональной мембраны. В таблице и на фиг.5 показаны результаты, полученные путем инфекцирования линий клеток посевным материалом, приготовленным из массового препарата MVA (ATCC #VR-1508) на CEFp, первичных фибробластах эмбрионов кур. Данные в таблице, полученные путем инфекции с MOI (множественностью заражения или количеством инфекционных частиц на клетку-хозяина), равным 0,1, демонстрируют, что выход вируса в клетках сетчатки и сомитов (в бляшкообразующих единицах на мл) сопоставим или даже превышает выход, полученный с помощью клеток CEFp.
| Выход MVA в бляшкообразующих единицах на мл (по истечении 48 часов, инфекция с MOI 0,1) | |
| CEFp 3,54×107 | |
| сетчатка 2,06×107 | |
| печень 3,20×104 | |
| сомит 4,60×107 | |
| мембрана 4,03×103 |
Таблица: Сравнение титров вирусов, полученных при параллельной инфекции 1 - 5×105 клеток в углублениях 24-луночных плашек. Количество введенного вируса было доведено до значения MOI 0,1. CEFp, свежие первичные фибробласты эмбрионов кур; мембрана, экстраэмбриональная мембрана.
Бляшкообразующие единицы для MVA на клетках утки определяли следующим образом: вирус MVA восстанавливали из зараженных клеток по истечении 48 часов из супернатанта и из адгезивных клеток, разрушаемых путем повторяемого замораживания-оттаивания. Клетки VERO (почки африканской зеленой обезьяны) высевали в 96-луночные плашки (2×104 клеток на лунку) и инфицировали путем серийных 10-кратных разбавлений суспензии, содержащей MVA, на следующий день. Через два дня после этого культуры фиксировали метанолом, и инфицированные клетки инкубировали с поликлональными антителами вируса вакцины (Quartett, Германия, #9503-2057, при разбавлении 1:1000 в PBS, содержащем 1% фетальной телячьей сыворотки) в течение 1 часа при 37°C. Два этапа промывки выполняли с PBS, содержащим 0,05% Tween 20 (Sigma Corp, США), и добавляли вторичное антитело к специфичному к вакцине антителу при разбавлении 1:1000 в PBS, содержащем 1% фетальной телячьей сыворотки. Данное вторичное антитело присоединено к ферменту пероксидазы, который катализирует цветовую реакцию при инкубировании с реактивом AEC (3-амино-9-этилкарбозол; 0,3 мг/мл в 0,1 М ацетатного буфера, pH 5,0, содержащего 0,015% H2O2). Инфицированные очаги идентифицировали с помощью световой микроскопии, и бляшкообразующие единицы рассчитывали из максимального разбавления суспензии MVA, которое дает положительную реакцию красителя.
На фиг.5 отображен выход вируса на клетку. Выход вируса на клетку коррелирует с пермиссивностью данной клетки-хозяина по отношению к конкретному вирусу. На пермиссивность влияют биохимические свойства, такие как плотность рецепторов или эффективность процессинга структурных белков вируса. На фиг.5 продемонстровано, что количество инфекционных частиц, выпущенных в каждую клетку сетчатки или в каждую клетку сомита, сравнимо с полученным количеством инфекционных частиц в каждом фибробласте эмбриона курицы.
Деление "выхода вируса на клетку" на "MOI" дает размер вспышки, отношение входного количества вируса к выходному количеству вируса. Размер вспышки эквивалентен степени амплификации вируса и, таким образом, является важным показателем для оценки стоимости и необходимых ресурсов для крупномасштабного продуцирования. Определенные размеры вспышки в описанном примере составили 374 для CEFp, 513 для клеток сетчатки и 1108 для клеток, полученных из сомитов. Клетки сетчатки и клетки сомитов дают лучшие значения, чем свежие первичные фибробласты эмбрионов кур, и, таким образом, должны предоставить лучшие субстраты для крупномасштабного продуцирования MVA.
Неудовлетворительные результаты амплификации MVA, полученные с клетками, происходящими из печени или экстраэмбриональной мембраны, нельзя применить к другим семействам вирусов: для специалиста в данной области очевидно, что амплификация других вирусов, например, относящихся к вакцине вирусов гриппа может быть чрезвычайно успешной в этих клетках.
Предположительно с последующим пассированием вируса в данной клетке-хозяине титр выхода уменьшается. Такие явления могут возникать, если клетки-хозяева поддерживают большую часть, но не все этапы в различных стадиях инфекционного цикла. Для рассмотрения этого вопроса на клетках сетчатки утки, трансформированных плазмидой 49E, провели серийное пассирование MVA. Данные на фиг.6 демонстрируют, что MVA не теряется при пассировании в этих клетках: при одинаковых уровнях вводимого вируса, доведенных до MOI 0,3 (показано столбцами на фиг.6), размер вспышки (полужирные квадраты) увеличивается в девять раз от 35 до 315. Причиной увеличения размера вспышки может быть улучшение свойств клетки-хозяина при увеличении количества пассажей.
В заключение, клетки сетчатки и клетки, производные сомитов утки, полученные путем трансфекции области Ad5-E1 при условиях cGMP, устойчиво поддерживают амплификацию MVA с эффективностью, сопоставимой или лучшей, чем первичные фибробласты эмбрионов кур. В связи с чрезвычайно ослабленной природой MVA обычные линии клеток не подходят для крупномасштабного производства вирусов. Неожиданным открытием является то, что сконструированные линии клеток утки лучше подходят для размножения MVA, чем первичные клетки кур и, таким образом, могут обеспечить новые платформы для получения этого важного вакцинного кандидата. Описанные линии получены при условиях cGMP и, следовательно, они подходят для фармацевтического применения.
Claims (13)
1. Линия первичных клеток птиц, пригодная для получения биологических препаратов или вирусов, иммортализованная с помощью невирусной трансфекции сочетанием вирусных и/или клеточных генов, по меньшей мере, одного первого гена, воздействующего на функцию белка ретинобластомы, посредством разрушения комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, и, по меньшей мере, одного второго гена, воздействующего на белок р53 или представителя данного семейства, где второй ген представляет собой вирусный ген, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоза посредством р53, или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз посредством р53.
2. Линия клеток птиц по п.1, где первый ген подавляет контролирование контрольного пункта G1, и второй ген подавляет апоптоз, индуцированный первым геном.
3. Линия клеток по п.1, где
(i) линия клеток получена из эмбриона или вылупившейся курицы, утки, гуся, перепела и т.п., предпочтительно из курицы или утки; и/или
(ii) клетки, подвергаемые иммортализации, представляют собой первичные клетки, включающие фибробласты, клетки из выделенных сегментов тела (сомитов), или выделенные одиночные органы, включая ткани нейронов, мозга, сетчатки, почек, печени, сердца, мышц и экстраэмбриональные ткани и мембраны, предохраняющие эмбрион; и/или
(iii) иммортализация путем невирусной трансфекции включет, без ограничений, трансфекцию, опосредованную липосомами, дендримерами, и электропорацию; и/или
(iv) первый ген представляет собой ген вируса, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, такой как ген Е1А аденовируса из мастаденовирусов, предпочтительно из мастаденовирусов группы С, ген Е7 папилломавирусов, предпочтительно из вируса папилломы человека низкого риска (HPV) (такого как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPVI8), ген orf 22 аденовирусов птиц, открытые рамки считывания Е43 из атаденовируса овцы и т.д.; или представляет собой ген клетки, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, такой как циклины D1, D2 или D3, мутированный CDK4, не восприимчивый к инактивации, посредством p16INK4a и т.д.; и/или
(v) второй ген представляет собой ген вируса, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоз, посредством р53, такой как белок E1B55K аденовируса всех групп, GAM-1 из CELO, белок Е6 папилломавирусов, предпочтительно из HPV низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный белок, предотвращающий торможение роста и апоптоз, посредством р53, такой как mdm2 и т.д.; и/или
(vi) первый ген и второй ген пространственно разделены гетерогенными последовательностями, или расположены на различных сегментах нуклеиновой кислоты или плазмидах.
(i) линия клеток получена из эмбриона или вылупившейся курицы, утки, гуся, перепела и т.п., предпочтительно из курицы или утки; и/или
(ii) клетки, подвергаемые иммортализации, представляют собой первичные клетки, включающие фибробласты, клетки из выделенных сегментов тела (сомитов), или выделенные одиночные органы, включая ткани нейронов, мозга, сетчатки, почек, печени, сердца, мышц и экстраэмбриональные ткани и мембраны, предохраняющие эмбрион; и/или
(iii) иммортализация путем невирусной трансфекции включет, без ограничений, трансфекцию, опосредованную липосомами, дендримерами, и электропорацию; и/или
(iv) первый ген представляет собой ген вируса, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, такой как ген Е1А аденовируса из мастаденовирусов, предпочтительно из мастаденовирусов группы С, ген Е7 папилломавирусов, предпочтительно из вируса папилломы человека низкого риска (HPV) (такого как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPVI8), ген orf 22 аденовирусов птиц, открытые рамки считывания Е43 из атаденовируса овцы и т.д.; или представляет собой ген клетки, обеспечивающий разрушение комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, такой как циклины D1, D2 или D3, мутированный CDK4, не восприимчивый к инактивации, посредством p16INK4a и т.д.; и/или
(v) второй ген представляет собой ген вируса, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоз, посредством р53, такой как белок E1B55K аденовируса всех групп, GAM-1 из CELO, белок Е6 папилломавирусов, предпочтительно из HPV низкого риска (таких как HPV1, HPV6 и HPV11, но не HPV16, HPV18), или клеточный белок, предотвращающий торможение роста и апоптоз, посредством р53, такой как mdm2 и т.д.; и/или
(vi) первый ген и второй ген пространственно разделены гетерогенными последовательностями, или расположены на различных сегментах нуклеиновой кислоты или плазмидах.
4. Линия клеток по п.3, иммортализованная с помощью (i) областей Е1А (первый ген) и Е1В (второй ген) аденовируса рода Mastadenovirus, предпочтительно указанные области Е1А и Е1В получены из аденовируса 5, более предпочтительно указанные области Е1А содержат последовательность из п.о.1193-2309 из SEQ ID NO:7 или последовательность, комплементарную п.о. 4230-3113 из SEQ ID NO:9, и указанные области Е1В содержат последовательность из п.о. 1145-3007 из SEQ ID NO:8 или последовательность, комплементарную п.о. 2345-550, из SEQ ID NO:9; и/или
(ii) гены orf22 (первый ген) и GAM 1 (второй ген) из аденовируса, предпочтительно рода aviadenovirus CELO, которые предпочтительно содержат последовательность, представленную последовательностью, комплементарной 1252-635 п.о. из SEQ ID NO:10, и последовательность, комплементарную 3138-2290 п.о. из SEQ ID NO:10 соответственно; и/или (iii) сочетания нуклеиновых кислот, кодирующих Е1А и/или Е1В с GAM-1 и/или Orf22, как определено выше в (i) и (ii).
(ii) гены orf22 (первый ген) и GAM 1 (второй ген) из аденовируса, предпочтительно рода aviadenovirus CELO, которые предпочтительно содержат последовательность, представленную последовательностью, комплементарной 1252-635 п.о. из SEQ ID NO:10, и последовательность, комплементарную 3138-2290 п.о. из SEQ ID NO:10 соответственно; и/или (iii) сочетания нуклеиновых кислот, кодирующих Е1А и/или Е1В с GAM-1 и/или Orf22, как определено выше в (i) и (ii).
5. Линия клеток по любому из пп.1-4, которая
(i) дополнительно несет неприродные функциональные последовательности, включая, без ограничений, трансгены, такие как гены, комплементарные дефицитным вирусам (например, EBNA1 и т.д.), промоторы (например, PGK-, EF1.alpha-, CMV-промотор, tk-промотор и т.д.), энхансеры (например, RSV-LTR), селективные маркеры, такие как резистентности к неомицину, резистентности к пуромицину и т.д.; и/или
(ii) подходит для получения биологических препаратов или вирусов, включая вакцинные штаммы и рекомбинантные вирусные векторы.
(i) дополнительно несет неприродные функциональные последовательности, включая, без ограничений, трансгены, такие как гены, комплементарные дефицитным вирусам (например, EBNA1 и т.д.), промоторы (например, PGK-, EF1.alpha-, CMV-промотор, tk-промотор и т.д.), энхансеры (например, RSV-LTR), селективные маркеры, такие как резистентности к неомицину, резистентности к пуромицину и т.д.; и/или
(ii) подходит для получения биологических препаратов или вирусов, включая вакцинные штаммы и рекомбинантные вирусные векторы.
6. Линия клеток по любому из пп.1-4, которая
(i) не обладает активностью обратной транскриптазы; и/или
(ii) получена в результате иммортализации первичной клетки, происходящей из эмбрионов уток или вылупившихся уток; и/или
(iii) получена из экстраэмбриональной оболочки; и/или
(iv) культивирована в среде определенного химического состава, которая предпочтительно не содержит сыворотку животного.
(i) не обладает активностью обратной транскриптазы; и/или
(ii) получена в результате иммортализации первичной клетки, происходящей из эмбрионов уток или вылупившихся уток; и/или
(iii) получена из экстраэмбриональной оболочки; и/или
(iv) культивирована в среде определенного химического состава, которая предпочтительно не содержит сыворотку животного.
7. Линия клеток по любому из пп.1-4, которая представляет собой линию экстраэмбриональных клеток 12А07-А10 птицы (DSM АСС2695).
8. Способ получения линии клеток по любому из пп.1-7, который содержит трансформирование/трансфицирование исходной клетки первым и вторым геном, где первый ген воздействует на функцию белка ретинобластомы, посредством разрушения комплексов между белками ретинобластомы и факторами транскрипции E2F, а второй ген воздействует на белок р53 или представителя данного семейства, где второй ген представляет собой вирусный ген, кодирующий белок, предотвращающий индукцию торможения роста и апоптоза посредством р53, или клеточный ген, предотвращающий торможение роста и апоптоз посредством р53.
9. Способ по п.8, который содержит невирусную трансфекцию исходной клетки.
10. Применение линии клеток по любому из пп.1-7 для получения биологических препаратов или вирусов.
11. Способ получения вируса, который включает
(i) контактирование указанных вирусов с линией клеток по любому из пп.1-7; и/или
(ii) культивирование указанных вирусов в указанной линии клеток;
(iii) выделение указанного вируса из супернатанта или из клеток.
(i) контактирование указанных вирусов с линией клеток по любому из пп.1-7; и/или
(ii) культивирование указанных вирусов в указанной линии клеток;
(iii) выделение указанного вируса из супернатанта или из клеток.
12. Способ по п.11 для получения вируса оспы предпочтительно штамма MVA в линии клеток утки, предпочтительно в линии клеток, происходящей из сомитов утки или нейронной ткани утки, еще более предпочтительно - из сетчатки утки.
13. Способ получения рекомбинантного белка, который включает
(i) введение гена, кодирующего рекомбинантный белок, функционально связанного с промотором, в линию клеток по любому из пп.1-7,
(ii) культивирование указанной модифицированной линии клеток; и
(iii) сбор рекомбинантного белка.
(i) введение гена, кодирующего рекомбинантный белок, функционально связанного с промотором, в линию клеток по любому из пп.1-7,
(ii) культивирование указанной модифицированной линии клеток; и
(iii) сбор рекомбинантного белка.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03025158A EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2003-11-03 | Immortalized avian cell lines for virus production |
| EP03025158.1 | 2003-11-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006119447A RU2006119447A (ru) | 2007-12-20 |
| RU2359999C2 true RU2359999C2 (ru) | 2009-06-27 |
Family
ID=34400514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006119447/13A RU2359999C2 (ru) | 2003-11-03 | 2004-11-03 | Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8940534B2 (ru) |
| EP (4) | EP1528101A1 (ru) |
| JP (1) | JP4658953B2 (ru) |
| KR (1) | KR101027755B1 (ru) |
| CN (1) | CN1934243B (ru) |
| AT (2) | ATE398672T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004285089B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0415622B8 (ru) |
| CA (1) | CA2544462C (ru) |
| CY (1) | CY1110272T1 (ru) |
| DE (2) | DE602004014526D1 (ru) |
| DK (2) | DK1685243T3 (ru) |
| ES (1) | ES2309578T3 (ru) |
| PL (1) | PL1685243T3 (ru) |
| PT (1) | PT1685243E (ru) |
| RU (1) | RU2359999C2 (ru) |
| SI (1) | SI1685243T1 (ru) |
| WO (1) | WO2005042728A2 (ru) |
Families Citing this family (125)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602004027141D1 (de) * | 2003-07-22 | 2010-06-24 | Vivalis | Produktion von poxviren mit adhärenten oder nicht adhärenten vogelzellinien |
| CA2890962A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | Decreasing potential iatrogenic risks associated with influenza vaccines |
| NZ567817A (en) | 2005-11-01 | 2012-01-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell DNA by beta-propiolactone treatment |
| WO2007052061A2 (en) | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines |
| CN102727885A (zh) | 2005-11-04 | 2012-10-17 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 包含颗粒佐剂和免疫增强剂组合的流感疫苗 |
| DK2368572T3 (da) | 2005-11-04 | 2020-05-25 | Seqirus Uk Ltd | Adjuvansvacciner med ikke-virionantigener fremstillet fra influenza-virusser dyrket i cellekultur |
| JP2009514839A (ja) | 2005-11-04 | 2009-04-09 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル | サイトカイン誘導剤を含むアジュバントインフルエンザワクチン |
| US20090304742A1 (en) | 2005-11-04 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant |
| EP1783210A1 (en) | 2005-11-08 | 2007-05-09 | ProBioGen AG | Productivity augmenting protein factors, novel cell lines and uses thereof |
| WO2007085969A2 (en) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg | Influenza vaccines containing hemagglutinin and matrix proteins |
| JP2009534303A (ja) | 2006-03-24 | 2009-09-24 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー | 冷蔵しないインフルエンザワクチンの保存 |
| GB0614460D0 (en) | 2006-07-20 | 2006-08-30 | Novartis Ag | Vaccines |
| CA3016948A1 (en) | 2006-09-11 | 2008-03-20 | Seqirus UK Limited | Making influenza virus vaccines without using eggs |
| NZ577405A (en) | 2006-12-06 | 2012-08-31 | Novartis Ag | Vaccines including antigen from four strains of influenza virus |
| EP1985305A1 (en) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
| CA2692200A1 (en) | 2007-06-27 | 2008-12-31 | Novartis Ag | Low-additive influenza vaccines |
| TWI614342B (zh) | 2007-07-03 | 2018-02-11 | 存斯精菱公司 | 禽類永生化細胞系 |
| US8357531B2 (en) | 2007-07-03 | 2013-01-22 | Transgene S.A. | Immortalized avian cell lines |
| GB0810305D0 (en) | 2008-06-05 | 2008-07-09 | Novartis Ag | Influenza vaccination |
| CA2710480A1 (en) | 2007-12-24 | 2009-07-02 | Novartis Ag | Assays for adsorbed influenza vaccines |
| KR101445433B1 (ko) * | 2008-02-25 | 2014-09-26 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 연속 세포주 제조 방법 |
| EP2098590A1 (en) | 2008-03-04 | 2009-09-09 | ProBioGen AG | Cell line from Rousettus as host cell for pathogen amplification |
| EP2265712B1 (en) | 2008-03-04 | 2014-07-23 | ProBioGen AG | Cell line from rousettus as host cell for pathogen amplification |
| EP2889042A3 (en) | 2008-03-18 | 2015-10-14 | Novartis AG | Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens |
| EP2310494A1 (en) * | 2008-06-25 | 2011-04-20 | ProBioGen AG | Cell line for propagation of highly attenuated alphaviruses |
| EP2199385A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-06-23 | ProBioGen AG | Specific and persistent activation of heat shock response in cell lines using a viral factor |
| WO2010079081A1 (en) | 2009-01-07 | 2010-07-15 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture |
| EP2393922A1 (en) | 2009-02-06 | 2011-12-14 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Purification of virus or viral antigens by density gradient ultracentrifugation |
| US20120093860A1 (en) | 2009-02-10 | 2012-04-19 | Novartis Ag | Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen |
| PL2396032T3 (pl) | 2009-02-10 | 2017-05-31 | Seqirus UK Limited | Szczepionki przeciw grypie o obniżonych zawartościach skwalenu |
| EP2942062A1 (en) | 2009-02-10 | 2015-11-11 | Novartis AG | Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains |
| USH2284H1 (en) | 2009-04-27 | 2013-09-03 | Novartis Ag | Vaccines for protecting against influenza |
| EP3988115A3 (en) | 2009-07-15 | 2022-08-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Rsv f protein compositions and methods for making same |
| SG178904A1 (en) | 2009-09-10 | 2012-04-27 | Novartis Ag | Combination vaccines against respiratory tract diseases |
| WO2011040527A1 (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-07 | 国立大学法人帯広畜産大学 | α-ガラクトースエピトープを発現するトランスジェニック鳥類、ウイルス及びワクチン |
| US20120309056A1 (en) | 2010-02-04 | 2012-12-06 | Leon Arnaud | Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells |
| EP2545172B2 (en) | 2010-03-08 | 2017-12-06 | Novartis AG | Methods of testing for intracellular pathogens |
| WO2011127316A1 (en) | 2010-04-07 | 2011-10-13 | Novartis Ag | Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle |
| WO2011139717A1 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-10 | Novartis Ag | Improved production of virus replicon particles in packaging cells |
| ES2562818T3 (es) | 2010-05-03 | 2016-03-08 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Procedimiento de inactivación del virus de la gripe |
| JP6072677B2 (ja) | 2010-05-06 | 2017-02-01 | ノバルティス アーゲー | 微生物の不活化のための有機ペルオキシド化合物 |
| CN103025350A (zh) | 2010-05-21 | 2013-04-03 | 诺华有限公司 | 流感病毒的重配方法 |
| CA2801149A1 (en) | 2010-06-01 | 2011-12-08 | Novartis Ag | Concentration of vaccine antigens without lyophilization |
| PL2575873T3 (pl) | 2010-06-01 | 2016-06-30 | Novartis Ag | Zatężanie i liofilizacja antygenów szczepionkowych grypy |
| EP2591097A1 (en) | 2010-07-06 | 2013-05-15 | Novartis AG | Norovirus derived immunogenic compositions and methods |
| CA2808965C (en) | 2010-08-20 | 2020-01-07 | Novartis Ag | Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines |
| TR201903651T4 (tr) | 2010-10-11 | 2019-04-22 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Antijen uygulama platformları. |
| EP3257943B1 (en) * | 2010-11-02 | 2019-09-11 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Methods and vectors for cell immortalisation |
| WO2012095514A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Vivalis | Recombinant protein production system |
| PL2667892T3 (pl) | 2011-01-26 | 2019-09-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Schemat szczepień przeciwko rsv |
| LT2707385T (lt) | 2011-05-13 | 2017-12-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Iš anksto sulieti rsv f antigenai |
| WO2013000982A1 (en) | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Vivalis | Method for screening cells |
| EP3508219A1 (en) | 2011-07-06 | 2019-07-10 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Self-replicating rna prime - protein boost vaccines |
| CA2840989A1 (en) | 2011-07-06 | 2013-01-10 | Novartis Ag | Immunogenic combination compositions and uses thereof |
| BR112014008694A2 (pt) | 2011-10-11 | 2017-06-20 | Novartis Ag | moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante |
| WO2013054199A2 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Novartis Ag | Cmv antigens and uses thereof |
| GB201216121D0 (en) | 2012-09-10 | 2012-10-24 | Novartis Ag | Sample quantification by disc centrifugation |
| CA2852857A1 (en) | 2011-10-20 | 2013-04-25 | Novartis Ag | Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming |
| EP2660316A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-06 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Avian cell line and its use in production of protein |
| EP2869842A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-05-13 | Novartis AG | Immunogenic compositions and uses thereof |
| GB201218195D0 (en) | 2012-10-10 | 2012-11-21 | Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie | Composition |
| KR20150085843A (ko) | 2012-11-20 | 2015-07-24 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | Rsv f 융합전 삼합체 |
| CN103060376A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-04-24 | 上海实验动物研究中心 | 一种禽腺病毒转移载体及其制备方法 |
| WO2014108515A1 (en) | 2013-01-10 | 2014-07-17 | Novartis Ag | Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof |
| US20140255447A1 (en) * | 2013-03-05 | 2014-09-11 | Biomune Company | Production of avian embryo cells |
| ES2778928T3 (es) | 2013-08-30 | 2020-08-12 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Producción a gran escala de virus en cultivos celulares |
| CN104726409B (zh) * | 2013-12-19 | 2017-12-29 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法和应用 |
| JP2017512839A (ja) * | 2014-04-02 | 2017-05-25 | アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 治療用タンパク質の生産 |
| EP2974739A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-20 | Novartis AG | RSVF trimerization domains |
| CA3190510A1 (en) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Transgene Sa | Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators |
| MX2017007196A (es) * | 2014-12-04 | 2017-08-28 | Intervet Int Bv | Fibroblastos de embrion de pollo inmortalizados. |
| EP3031822A1 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-15 | Novartis AG | Cytomegalovirus antigens |
| BE1023903B1 (fr) | 2014-12-16 | 2017-09-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Nouveau procédé |
| KR102526616B1 (ko) | 2014-12-17 | 2023-04-27 | 푼다시온 파라 라 인베스티가시온 메디카 아플리카다 | 윌슨병 및 기타 병태의 치료에 사용되기 위한 핵산 구조물 및 유전자 치료용 벡터 |
| JP6956635B2 (ja) | 2014-12-17 | 2021-11-02 | フンダシオン パラ ラ インベスティガシオン メディカ アプリカダ | ウィルソン病及び他の状態の処置に使用するための核酸構築物及び遺伝子治療ベクター |
| EP3047856A1 (en) | 2015-01-23 | 2016-07-27 | Novartis AG | Cmv antigens and uses thereof |
| WO2016131945A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Transgene Sa | Combination product with autophagy modulator |
| JP2018524323A (ja) | 2015-06-26 | 2018-08-30 | セキラス ユーケー リミテッド | 抗原がマッチしたインフルエンザワクチン |
| US10416171B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-09-17 | Seqirus UK Limited | Influenza potency assays |
| US20190134190A1 (en) | 2016-05-04 | 2019-05-09 | Transgene Sa | Combination therapy with cpg tlr9 ligand |
| US20190328869A1 (en) | 2016-10-10 | 2019-10-31 | Transgene Sa | Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy |
| WO2018091680A1 (en) | 2016-11-18 | 2018-05-24 | Transgene Sa | Cowpox-based oncolytic vectors |
| CN107012122A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-08-04 | 江苏省农业科学院 | 一种永生化鸡胚胎肝细胞系及其制备方法和用途 |
| WO2018122088A1 (en) | 2016-12-28 | 2018-07-05 | Transgene Sa | Oncolytic viruses and therapeutic molecules |
| WO2018176103A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | The University Of Queensland | "chimeric molecules and uses thereof" |
| IL271558B2 (en) | 2017-06-21 | 2024-01-01 | Transgene | A vaccine tailored to the individual |
| WO2019020543A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | Transgene Sa | ONCOLYTIC VIRUSES EXPRESSING AGENTS TARGETING METABOLIC IMMUNE MODULATORS |
| WO2019092002A1 (en) | 2017-11-07 | 2019-05-16 | Valneva Se | Pharmaceutical compositions for treatment or prevention of viral infections |
| WO2019219649A1 (en) | 2018-05-14 | 2019-11-21 | Vivet Therapeutics | Gene therapy vectors comprising s/mar sequences |
| WO2020011754A1 (en) | 2018-07-09 | 2020-01-16 | Transgene | Chimeric vaccinia viruses |
| US20210275662A1 (en) | 2018-07-13 | 2021-09-09 | Valneva Se | Method for rescuing and producing a virus in avian cells |
| EP3617230A1 (en) | 2018-09-03 | 2020-03-04 | BioInvent International AB | Novel antibodies and nucleotide sequences, and uses thereof |
| CN110396496B (zh) * | 2018-09-30 | 2023-06-20 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种鸭小肠上皮细胞的培养方法及应用 |
| KR20210086638A (ko) | 2018-10-12 | 2021-07-08 | 비베트 테라퓨틱스 | 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형 (pfic3)의 치료를 위한 코돈-최적화 전이유전자 |
| EP3877000A1 (en) | 2018-11-07 | 2021-09-15 | Vivet Therapeutics | Codon-optimized abcb11 transgene for the treatment of progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 (pfic2) |
| CN109321516A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-02-12 | 贵州大学 | 一种鸭原代肝细胞分离及培养方法 |
| TW202039854A (zh) | 2018-11-16 | 2020-11-01 | 美商編碼製藥公司 | 治療威爾遜氏病的組合物和方法 |
| CN113474449A (zh) | 2018-11-23 | 2021-10-01 | 瓦尔尼瓦公司 | 包括禽类干细胞的食物产品 |
| WO2020136235A1 (en) | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Transgene Sa | M2-defective poxvirus |
| AU2020299718A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-02-24 | Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada | cPLA2e inducing agents and uses thereof |
| EP3999108A1 (en) | 2019-07-21 | 2022-05-25 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Therapeutic viral vaccine |
| WO2021014385A1 (en) | 2019-07-24 | 2021-01-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified human cytomegalovirus proteins |
| MX2022006005A (es) | 2019-11-18 | 2022-10-27 | Seqirus Pty Ltd | Metodo para producir virus de la influenza reagrupados. |
| EP4135757A1 (en) | 2020-04-13 | 2023-02-22 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
| US20230256057A1 (en) | 2020-07-13 | 2023-08-17 | Transgene | Treatment of immune depression |
| EP4192961A2 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | Fundacion para la Investigacion Medica Aplicada | Viral particles for use in treating tauopathies such as alzheimer's diseases by gene therapy |
| US20230265456A1 (en) | 2020-08-10 | 2023-08-24 | Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada | Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis |
| EP4225782A1 (en) | 2020-10-09 | 2023-08-16 | UCB Biopharma SRL | Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles |
| US20240091382A1 (en) | 2020-12-23 | 2024-03-21 | Vivet Therapeutics | Minimal bile acid inducible promoters for gene therapy |
| WO2022148736A1 (en) | 2021-01-05 | 2022-07-14 | Transgene | Vectorization of muc1 t cell engager |
| JP2024502377A (ja) | 2021-01-10 | 2024-01-18 | スーパーミート ザ エッセンス オブ ミート リミテッド | 培養肉産業用の多能性幹細胞凝集体及びそれから得られる微小組織 |
| EP4032547A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv |
| JP2024516400A (ja) | 2021-04-30 | 2024-04-15 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | 修飾されたｍｈｃ発現のための腫瘍溶解性ウイルス |
| WO2023025899A2 (en) | 2021-08-26 | 2023-03-02 | Transgene | Delivery system for targeting genes of the interferon pathway |
| TW202321458A (zh) | 2021-09-22 | 2023-06-01 | 瑞典商生物創新國際公司 | 新穎抗體組合及其用途 |
| WO2023067595A1 (en) | 2021-10-18 | 2023-04-27 | Supermeat The Essence Of Meat Ltd. | Methods for preparing a food ingredient and compositions produced thereby |
| CA3234666A1 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | UCB Biopharma SRL | Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles |
| CN114350601B (zh) * | 2021-12-21 | 2022-12-27 | 广东省华晟生物技术有限公司 | 樱桃谷鸭成纤维细胞系及其构建方法与应用 |
| WO2023144665A1 (en) | 2022-01-28 | 2023-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified human cytomegalovirus proteins |
| CN114908053A (zh) * | 2022-04-24 | 2022-08-16 | 上海交通大学 | 孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用 |
| WO2023213764A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf |
| WO2023213763A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Transgene | Poxvirus encoding a binding agent comprising an anti- pd-l1 sdab |
| WO2024003353A1 (en) | 2022-07-01 | 2024-01-04 | Transgene | Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf |
| WO2024038175A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Transgene | Chimeric poxviruses |
| CN116496992B (zh) * | 2023-04-24 | 2023-12-01 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种鸡胚成肌永生化细胞及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4051416B2 (ja) * | 1995-06-15 | 2008-02-27 | クルーセル ホランド ベスローテン フェンノートシャップ | 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム |
| KR970010968A (ko) | 1995-08-24 | 1997-03-27 | 윤원영 | 오리 배 세포를 이용한 에리스로포이틴의 발현 시스템 |
| US5989805A (en) | 1995-10-27 | 1999-11-23 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines |
| FR2749022B1 (fr) | 1996-05-23 | 2001-06-01 | Rhone Merieux | Cellules aviaires immortelles |
| US5672485A (en) | 1996-08-13 | 1997-09-30 | Regents Of The University Of Minnesota | Immortalized cell lines for virus growth |
| US5830723A (en) | 1996-08-13 | 1998-11-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for immortalizing chicken cells |
| FR2767335B1 (fr) | 1997-08-14 | 2001-09-28 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Adenovirus aviaire celo recombinant comme vecteur vaccinant |
| DE19955558C2 (de) * | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| US7192759B1 (en) * | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| CN1139655C (zh) * | 2001-08-23 | 2004-02-25 | 北京大学人民医院 | 一种人卵巢癌永生化细胞株及其建立方法 |
| US7473536B2 (en) | 2002-08-07 | 2009-01-06 | Bavarian Nordic A/S | Isolated avian cell that expresses Vaccinia virus host range genes |
| CN1692156B (zh) | 2002-09-05 | 2011-05-11 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 在无血清条件下培养原代细胞和扩增病毒的方法 |
| DE602004027141D1 (de) | 2003-07-22 | 2010-06-24 | Vivalis | Produktion von poxviren mit adhärenten oder nicht adhärenten vogelzellinien |
-
2003
- 2003-11-03 EP EP03025158A patent/EP1528101A1/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-11-03 AU AU2004285089A patent/AU2004285089B2/en active Active
- 2004-11-03 DE DE602004014526T patent/DE602004014526D1/de active Active
- 2004-11-03 AT AT04798154T patent/ATE398672T1/de active
- 2004-11-03 CA CA2544462A patent/CA2544462C/en active Active
- 2004-11-03 WO PCT/EP2004/052789 patent/WO2005042728A2/en active IP Right Grant
- 2004-11-03 EP EP08101999.4A patent/EP1939281B2/en active Active
- 2004-11-03 DK DK04798154T patent/DK1685243T3/da active
- 2004-11-03 PL PL04798154T patent/PL1685243T3/pl unknown
- 2004-11-03 SI SI200430843T patent/SI1685243T1/sl unknown
- 2004-11-03 BR BRPI0415622A patent/BRPI0415622B8/pt active IP Right Grant
- 2004-11-03 EP EP10002423A patent/EP2192173A1/en not_active Withdrawn
- 2004-11-03 DE DE602004025996T patent/DE602004025996D1/de active Active
- 2004-11-03 CN CN2004800397218A patent/CN1934243B/zh active Active
- 2004-11-03 JP JP2006537316A patent/JP4658953B2/ja active Active
- 2004-11-03 DK DK08101999.4T patent/DK1939281T4/da active
- 2004-11-03 ES ES04798154T patent/ES2309578T3/es active Active
- 2004-11-03 KR KR1020067010635A patent/KR101027755B1/ko active IP Right Grant
- 2004-11-03 US US10/578,043 patent/US8940534B2/en active Active
- 2004-11-03 AT AT08101999T patent/ATE460473T1/de active
- 2004-11-03 EP EP04798154A patent/EP1685243B1/en active Active
- 2004-11-03 RU RU2006119447/13A patent/RU2359999C2/ru active
- 2004-11-03 PT PT04798154T patent/PT1685243E/pt unknown
-
2008
- 2008-09-18 CY CY20081101019T patent/CY1110272T1/el unknown
-
2012
- 2012-07-26 US US13/558,567 patent/US20120288916A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KIM H. et al. Alterations in p53 and E2F-1 function common to immortalized chicken embryo fibroblasts, Oncogene. 2001 May 10; 20(21):2671-82. BENNETT M.R. et al. Cooperative interactions between RB and p53 regulate cell proliferation, cell senescence, and apoptosis in human vascular smooth muscle cells from atherosclerotic plaques, Circ Res. 1998 Apr 6; 82(6):704-12. WAZER D.E. et al. Immortalization of distinct human mammary epithelial cell types by human papilloma virus 16 E6 or E7, Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Apr 25; 92(9): 3687-91. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2359999C2 (ru) | Иммортализованные линии клеток птиц для получения вирусов | |
| JP4787156B2 (ja) | 付着または非付着の鳥類細胞系を用いた、ポックスウィルスの作製法 | |
| Jordan et al. | An avian cell line designed for production of highly attenuated viruses | |
| JP3754088B2 (ja) | ウィルス増殖のための不死化細胞系 | |
| Maitland et al. | Biochemical transformation of mouse cells by fragments of herpes simplex virus DNA | |
| Renger et al. | Mutation causing temperature-sensitive expression of cell transformation by a tumor virus | |
| Jordan et al. | Cell lines from the Egyptian fruit bat are permissive for modified vaccinia Ankara | |
| JP2015535687A (ja) | 新規ｍｖａウイルス及びその使用 | |
| CN101356265B (zh) | 提高生产率的蛋白因子、新颖细胞系和其应用 | |
| CN114657154B (zh) | 一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用 | |
| EP1500699A1 (en) | Production of vaccinia virus with adherent or non adherent avian cell lines | |
| EP4222250A1 (en) | Bioreactor production of virus from adherent cells | |
| EP2265712B1 (en) | Cell line from rousettus as host cell for pathogen amplification | |
| Kong et al. | Establishment of an immortal turkey turbinate cell line suitable for avian metapneumovirus propagation | |
| EP2098590A1 (en) | Cell line from Rousettus as host cell for pathogen amplification | |
| EP2199385A1 (en) | Specific and persistent activation of heat shock response in cell lines using a viral factor |