CN1934243B - 用于病毒生产的永生化的禽类细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适于生产用于接种的生物制剂或病毒的永生化的禽类细胞系。特别是，细胞系来自用至少两个病毒基因或细胞基因转化的原代细胞，其中的一个导致细胞周期进展而另一个干扰由异常调节的复制所诱导的细胞的先天保护机制。本发明此外涉及所述永生化细胞系的生产和它们在生产用于接种的生物制剂或病毒中的用途。

Description

用于病毒生产的永生化的禽类细胞系
本发明涉及适于生产用于接种的生物制剂或病毒的永生化的禽类细胞系。特别地，该细胞系来自用至少两个病毒基因或细胞基因转化的原代细胞，两个基因中的一个基因导致细胞周期进展，而另一个干扰由调节异常的复制所诱导的细胞的先天保护机制。本发明此外涉及所述永生化细胞系的生产以及它们在生产用于接种的生物制剂或病毒中的用途。
背景
受孕的鸡蛋仍然是生产人类疫苗的主要底物之一。它们能支持很大范围的人类和动物病毒的复制。该范围包括减毒的病毒，即已削弱了在人或哺乳动物细胞中复制的潜在性并可因此用作疫苗的缺陷病毒。减毒作用可通过在受孕卵中连续传代而产生或保持。必需证明用于人类疫苗生产的鸡蛋是无明确的病毒和细菌污染(无特异性病原体或SPF)。SPF蛋可从商业供应商中获得。尽管有明确的缺点，但是广泛的适用性和长久的国际跟踪记录使得该策略继续有效：
鸡和受孕蛋的SPF群是昂贵的并最多可能构成疫苗费用的40％。此外，很难连续保持SPF群完全无病原体，这是通过疾病在SPF群中的周期性暴发证明。不能释放疫苗批量，直到SPF供应商证明用于生产疫苗批量的受孕蛋的素代鸡完全无任何疾病。这种不确定性显著增加了制备这些疫苗的成本。在突然需要特定疫苗(例如，流感)的大流行的情况中，SPF蛋的供应可能严重受限。另外，用于大规模感染蛋并保持病毒生长的方法是费时的并且有时在不同的疫苗批次之间也不一致。
随着细胞培养技术的发展，疫苗生产者已用分离的鸡胚成纤维细胞取代了受孕蛋。虽然使用原代细胞培养物提高了生产过程的安全谱、效率和可靠性，但是其也进一步增加了费用：通过将胚胎切碎以建立和扩增活细胞，从SPF蛋中制备鸡成纤维细胞。对原代动物细胞，典型的是成纤雏细胞经历衰老：倍增时间随着传代而增加，最后所有细胞都死亡。这个过程发生在大约20次传代后，对于当前在疫苗(如MRC-5或WI-38)生产中所使用的啮齿动物或某些人类细胞底物来说这个过程更早。必需在存在5-10％胎牛血清时才能保持成纤维细胞培养物，这给生产过程增加了额外的危险因素。它们也需要固体表面用于增殖而且不在悬液中生长，悬液是一种生物反应器应用的优选状态。甚至随着多层培养箱因子的使用，这也基本上限制了大规模过程。由于有限的存活时间，因此必需对每批鸡成纤维细胞应用完整的一系列安全试验。
成纤维细胞是鸡胚胎的各种不同组织中仅有的能很好增殖的细胞类型。与其它细胞类型相比占优势的成纤维细胞在某些情况中降低理论上的病毒产量，因为在蛋中典型地尿囊绒毛膜，即，一种上皮细胞层，是病毒扩增的主要部位。
所讨论的问题导致最近两年(2003和2004)中严重的流感疫苗短缺。为了克服这些局限性，非常期望在合成地确定成分的培养基中，优选地在悬液中或者至少在载体上生长的永久细胞系。
已经使一些典型地在鸡成纤维细胞中生长的病毒适应了某些细胞系。BHK-21(幼仓鼠肾)细胞支持各种牛痘、流感和狂犬病疫苗株的生长(Drexler，I.等，J.Gen.Virol.79(Pt2)：347-52(1998)；Gumusderelioglu M.等，Biotechnol.Appl.Biochem.33：167-72(2001)；Merten，O.W.等，Adv.Exp.Med.Biol.397：141-51(1996))并且在无血清的条件下很容易地在大发酵罐中的载体上生长(Pay，T.W.等，Dev.Biol.Stand 60：171-4(1985)；Gallegos Gallegos，R.M.等，Arch.Med.Res.26：59-63(1995))。对于牛痘，这甚至应用到在鸡细胞上发育的高度减毒株Ankara(MVA)。BHK-21细胞系适用于某些家畜动物疫苗的生产(Lubinieckl，A.S.，Bioprocess Technol.10：495-513(1990))。然而，BHK-21系不满足对人类活疫苗的安全要求。BHK细胞自发形成，是高度致瘤的并且没有充分报道它们的历史。
根据FDA，2000年5月12日关于对细胞底物的CBER讨论，不提倡在来源于人类和其它哺乳动物的天然发生的肿瘤的赘生性细胞，或者来源于通过未知机制转化的人类细胞和哺乳动物细胞中研发“最低纯化的减毒活病毒疫苗和病毒作为载体的疫苗”。
作为该规则的例外，基于所证明的安全谱和对明确的传代次数缺乏转化的表型，允许VERO细胞系(起源于非洲绿猴)作为疫苗生产的细胞底物。该细胞系一直广泛用于生产临床使用的脊髓灰质炎和天花疫苗。然而，VERO细胞必需附着并且仅在基于载体的方法中生长。
另外，已将具有描述史的MDCK细胞(狗肾上皮的自发细胞系)用于流感病毒的生产(Tree，J.A.等，Vaccine 19：3444-50(2001))。
更近地，由基于载体的疫苗和基因治疗方法的开发所引发，人来源的新的所谓设计者细胞系被热烈讨论并且包括在用于疫苗生产的潜在的细胞底物谱内(疫苗和相关生物产品顾问委员会，2001年5月16日的会议)。建立新的永久细胞系以便为在生产系统外是复制缺陷的重组病毒提供补充基因。然而，将补充基因的稳定引入需要延长培养时间，其在全部转化发生前超过原代细胞传代数量的自然限度或者VERO细胞传代数量的容许的限度。
根据大量参考文献，使用用于转化的表征的基因在体外生产设计者细胞系。例如，腺病毒E1区的补充基因自身显示转化性质并允许建立人类细胞系，例如PER.C6(Fallaux，F.J.等，Hum.Gene Ther.9：1909-17(1998))。这些细胞系的应用不限于设计它们的病毒载体，可被延伸到其它病毒。例如，可在PER.C6上繁殖流感病毒(Pau，M.G.等，Vaccine 19：2716-21(2001))。然而，该发现不能应用到与疫苗开发有关的所有病毒，特别是禽病毒如马立克病、传染性囊病、新城疫、火鸡疱疹或者鸡贫血病毒。尽管这些病毒中的一些可在哺乳动物细胞系中很好地复制，但是病毒生长通常不良。对于其它病毒，复制不良并且限于特定的特别适应的病毒株。
另外，随着对灵长类动物来源细胞底物的适应，病毒上的受体结合位点可能改变，导致修饰的抗原模式并且因此全面影响免疫原性。该遗传适应可能反过来通过在禽类细胞，如MVA或适应鸡的麻疹病毒中传代降低病毒株的毒性(Escoffier，C.，Gerlier，D.，J.Virol.73：5220-4(1999))，或者使新病毒株与它们的野生型分离物相比，更有效地在人类细胞中复制。这种病毒也可能获得更高的致病潜能。
由于上述原因，疫苗生产者不情愿的转向哺乳动物细胞系并且需要研发永生的禽类细胞系。
通过禽类α逆转录病毒在鸟类中诱导肿瘤的研究大体上提供了对细胞转化的最初的分子了解。逆转录病毒的癌基因来自必需调节区被突变或缺失的细胞基因。一些在这些研究过程中鉴定的因子，如v-myc或v-Fas，直接影响成视网膜细胞瘤(RB)和p53途径的成分。其它蛋白，如v-src或v-erbB，组成型地激活(因此，调节异常)模拟冲击细胞外促细胞分裂原的信号转导蛋白。这些因子的问题是它们仅靶向有效转化所需的几个途径之一。v-src或v-myc的存在使细胞易于转化并且需要细胞内用于完全转化的另外的，自发的和不可预知的改变。很难估计由用病毒的癌基因之一转化的细胞对患者所造成的危险。
在另一种情况中单一强肿瘤抗原(例如，v-jun)能够直接导致肿瘤形成(Hartl，M.等，Curr.Cancer Drug Targets 3：41-55(2003))。许多禽类病毒癌基因在哺乳动物细胞中保持它们的致癌潜能。
通过这些病毒所产生细胞系不适于疫苗生产。携带癌基因的逆转录病毒可能被活化并与疫苗在一起被转移。当其能在不需要互补抗原的帮助转化哺乳动物细胞时，甚至不被病毒LTRs封闭的肿瘤抗原可能造成高危险。该危险典型地通过考虑转化潜能、接种者的数量以及用疫苗病毒转移的细胞核酸的量来估计。该量受到纯化方法效率的限制，当前不能被减少到10pg/剂量以下。该标准对于疫苗的生产尤其严格，其中健康群体常常在非常小的年龄接种。
同样的理由适用于转化DNA病毒如乳头瘤病毒和多瘤病毒。这些病毒具有攻击性癌基因：SV40大T抗原是一种多功能蛋白，其影响细胞周期G1中的关卡(checkpoint)控制和p53活性。因此，大T易于永生化并且转化啮齿动物和人来源的多种哺乳动物组织。随着小T抗原的加入(进一步提高大T作用并且另外调节AKT3途径)，可能使禽类细胞永生化(专利申请US 2001-0016348的一部分)。然而，甚至用复杂的现代纯化方法，SV40大T抗原也被认为太具有攻击性而无法在所产生的细胞系中用于人类药物的应用。与上述相反，在本发明中所建议的基因通过独立的因子影响细胞周期的关卡控制和p53的灭活：必需同时转移用于转化的两个不同因子的事件，显著降低疫苗的任何理论危险。
美国专利申请2001-0016348描述了与本发明完全无关的抗凋亡途径的用途。由于由第一基因迫使细胞周期进展，因此其不提供抵消凋亡的内部信号的第二基因。凋亡也可由各种外部slmull诱导，例如缺乏生长因子或者丧失固着。可通过bcl-2家族基因抑制该类型促凋亡信号的传输，这是美国专利申请2001-0016348的焦点。
尽管90％宫颈癌携带乳头瘤病毒序列，但是认为C型腺病毒(其包括2型和5型)在体内不诱导肿瘤，并且在人类肿瘤组织中一直没有检测到腺病毒的序列。
可选择地，一直尝试通过鸡胚胎成纤维细胞的连续传代来产生细胞系。尽管啮齿动物细胞似乎进行自发性永生化非常容易(Curatolo等，In Vitro20：597-601(1984))，但是禽类和灵长类动物细胞非常抵抗这种方法(Harvey，等，Genes and Development 5：2375-2385(1991)；Pereira-Smith，J.Cell Physiol.144：546-9(1990)；Smith等，Science 273：63-67(1996))。禽类或灵长类来源的体细胞缺乏端粒酶，衰老是由染色体末端(端粒)的缩短所致。然而，使用该方法已研发了鸡成纤维细胞系UMNSAH-DF1(美国专利5,672,485和6,207,415)。通过这种方法的永生化是由在多个癌基因或肿瘤抑制基因中的白发突变所致。这是罕见的事情，其尤其不可能在其它组织来源的细胞中繁殖。最重要地是，这种方法与作为人类活疫苗总原则的确定的危险方法相矛盾，后者提出关于使基因永生化的详细知识以评估癌基因转移的危险。此外，根据FDA(2000年5月12日关于细胞底物的CBER讨论)，不提倡使用来自天然存在的肿瘤的赘生性细胞或者通过未知机理转化的细胞用于产生最低纯化的减毒活病毒疫苗和以病毒为载体的疫苗。
自发产生的UMNSAH-DF1鸡成纤维细胞系显示E2F和p53活性的改变(Kim等，Oncogene 20：2671-82(2001))。这不奇怪，因为提高细胞周期活性需要有活性的E2F，而且因为从哺乳动物细胞研究中知道高E2F活性在存在活性p53时诱导凋亡。该研究的特点是永生化阶段并不使病因事件清晰：许多基因中的突变可能导致永生化。
可通过使用化学诱变剂增强自发转化过程(美国专利5,989,805)。使用该方法产生的特定细胞系克服了衰老但维持成纤维细胞样外观而且是非致瘤的。尽管这代表了重大的安全特性，但是这些细胞对于大规模发酵技术来说价值很低。此外，这种基于偶然性的方法也与确定的危险指导方针相矛盾。
也建议来源于天然存在的肿瘤如鹌鹑成纤维细胞瘤的禽类细胞系(WO97/08307)用于生物生产。此外，通过基于偶然事件的方法违反了用于人类疫苗生产的确定的危险指导方针。
在上述研究中所采用的方法与活跃引入根据本发明的永生化基因的特定组形成鲜明对照，后者确定永生化的原因并允许评估危险，提供关于各种组织选择的高度灵活性，并且允许调整所得细胞系的某些特征。
尽管鸡蛋和成纤维细胞有相当多的跟踪报道，但是它们也与仅在最近才成为更受人关注焦点的非常特异性的危险因素有关：鸡细胞释放至少两种类型的逆转录病毒颗粒，即内源性禽类逆转录病毒(EAV)和内源性禽类造白细胞组织增生病毒(ALV-E)。该组织类似在用于生产重组蛋白的小鼠细胞(如NSO)中存在内源性逆转录病毒颗粒。然而，与小鼠细胞相反，已证明鸡细胞含有逆转录酶。由于更有效的检测技术，也已在鸡细胞来源的麻疹、腮腺炎和黄热病疫苗中检测到了RT活性(Hussain，A.I.等，J.Virol.77：1105-11(2003)；Shahabuddin，M.等，J.Clin.Microbiol.39：675-84(2001))。在传染性逆转录病毒中是否存在逆转录酶活性结果仍然有争论：更详细的分析已经显示CEF(来自白来杭鸡)含有5个具有完整EAV的基因座，其中的两个可表达传染性ALV-E，而其它三个有缺陷(Johnson，J.A.，Heneine，W.，J.Virol.75：3605-12(2001))。Tsang，S.X.等，J.Virol.73：5843-51(1999)也发现了RT活性和病毒颗粒的释放，但是在接受腮腺炎疫苗的儿童的血液单核细胞中仔细搜索EAV序列后，没有观察到任何传播。根据WeeklyEpidemiological Record of the WHO(73)28(1998)。独立实验室通过大量共培养研究了颗粒对各种人类和其它哺乳动物细胞的传染性，没能检测到RT活性的传播或生产性感染。这个发现得到流行病学研究的支持，其显示使用鸡细胞来源的疫苗与癌症，包括儿童的癌症的发生率之间没有联系。
此外，在上述每周流行病学记录中，WHO强调鸡宿主细胞对保持某种疫苗毒株的减毒的重要性。当前没有其它可选择的生产方法，这种选择方法的缺乏是承认病毒污染物是已知的和持续来源的重要原因。
然而，流行病学研究使群体叠加并且没有进行偶然事件或情况的研究。流行病学研究不能反驳理论危险，例如：公认的内源性RT活性可能掩盖不受欢迎的外源性污染物的RT活性，如果将包装构建体引入到细胞中可能动员并激活内源性病毒(Ronfort，C.等，Virology 207：271-5(1995))。
然而，证明鸭和鹅的细胞不含有EAV和ALV相关序列，日本鹌鹑无逆转录酶(Smith，LM.等，J.Gen.Virol.80(pt1)：261-8(1999)；Brudno，I.A.等，Vopr.Virusol.97-100(1980))。
腺病毒(AdV)是被充分表征的，裸露的(无包膜的)普遍存在的病毒。对于最常见的血清型Ad2和Ad5来说，在人群中血清阳性率接近90％。使用这些病毒的不能复制形式在用人类患者的试验中作为基因治疗和疫苗的载体。已经使用人腺病毒5的E1区的基因体外转化某些特定人类细胞(293和PER.C6细胞系；Fallaux，F.J.等，Hum.GeneTher.9：1909-17(1998)；Graham，F.L.等，J.Gen.Virol.36：59-74(1977)).与更强的多功能癌基因如SV40大T抗原相比，一般方法是无效的。基于293显示神经元特异性标记以及PER.C6来源于神经外胚层的观察，表明基于Ad5El的转化限于神经元细胞(Shaw等Faseb J 16(8)：869-71(2002))。考虑到人类和禽类细胞之间的显著的物种障碍，甚至更无法预期能通过转染使多种禽类组织有效地永生化。
已经使用哺乳动物E1转化的细胞系生产临床试验中的活的纯化的腺病毒载体。随着在疫苗制备中仔细监控污染的细胞DNA的量和其大小，不认为Ad5的转化基因是安全障碍(疫苗和相关生物产品顾问委员会，2001年5月16日的会议)。
腺病毒在所感染的细胞核中复制。由于静息的宿主细胞不允许完整的病毒生活周期，因此腺病毒已进化了迫使细胞进入S期的机制。为了使后代病毒的裂解量最大，它们也已经进化了机制以逃避作为宿主细胞对衣壳侵入和病毒复制反应的凋亡。调节细胞周期进展和抑制凋亡的基因组区是E1区。
E1区实际上由两个不同的表达盒，E1A和E1B构成，它们串联排列并且每个都具有其自己的启动子和聚腺苷酸化位点。至少3种蛋白是通过可变剪接从E1A初级转录物翻译。在其它中，已发现E1A蛋白使RB/E2F复合体破裂并且干扰p300和CBP转录辅激活物。E2Fs从RB阻遇物中的逃脱诱导细胞周期从G1进展到S期，而E1A/p300复合体通过几种途径诱导凋亡(Pulzer，B.M.等，CeH Death Differ.7：177-88(2000))，包括MdM2的转录抑制，MdM2是凋亡的关键传感器p53的负调节蛋白。
由于E1A使细胞对TNF诱导的凋亡敏感，因此认为其是抗肿瘤剂，并且在肿瘤治疗的试验方法中使用(Lee，W.P.等，Cancer Res.63：6229-36(2003))。
此外，作为转录调节剂，其驱动细胞去分化，这是一种对潜在的细胞底物有益的特性。
Guilhot等(Guilhot，C.等，Oncogene 8：619-24(1993))证明Ad5的E1A的12S蛋白的逆转录病毒转导可导致鹌鹑细胞的永生化。这可能是禽类RB和E1A之间相互作用的结果。然而，当基因是通过裸DNA转染而不是逆病毒感染引入时(根据观察)，该方法失败。我们建议通过逆转录病毒感染的非常有效和稳定的转导产生足够大的细胞库以便包含具有自发基因组改变的各个细胞，所述改变阻断正常地在RB失活后诱导的凋亡。这些必需的但未知的改变增加了接种者的危险并且所得到的细胞系不能被认为是设计者细胞系(在特定途径中明确阻断的结果)。此外，通过逆转录病毒引入的转化基因的侧翼是反向末端重复序列，并且因此可被移动。这种事件可能甚至在从内源性逆转录病毒中表达逆转录酶的细胞系中更明显。
发明概述
由于上述情况，仍然期望使用永生化/转化基因的确定组合开发具有便于大规模生产的生长特性的禽类细胞系。进一步期望这些基因中没有一个能不依赖其它基因而转化哺乳动物细胞。此外，单基因的作用应当无永生化/转化效应或者导致表达各自基因的细胞的凋亡。应当通过将各自的基因置于独立的表达单元上进一步将联合转移到疫苗受体的危险降到最小。最后，由于人群典型地暴露于各自的基因，因此将期望这些基因与人群中的肿瘤形成无关。产生的细胞系应当不从内源性逆转录病毒中释放传染性病毒颗粒或者根本不显示逆转录酶活性。
发现用两个特定的病毒基因和/或细胞基因转化禽类细胞能提供完全适于生产用于接种的病毒的细胞系，其中一个基因影响成视网膜细胞瘤蛋白，另一个影响p53蛋白。
本发明因此提供：
(1)用病毒基因和/或细胞基因(以下简短地称作“基因”)的组合永生化的禽类细胞系，至少一种第一基因影响成视网膜细胞瘤蛋白的功能，至少一种第二基因影响p53蛋白或者其家族成员，其中优选地，第一基因克服G1关卡控制，第二基因阻止由第一基因诱导的凋亡；
(2)制备如上述(1)中所限定的细胞系的方法，其包括用第一和第二基因转化/转染起始细胞；
(3)如上述(1)中所限定的细胞系在生产生物制剂或病毒中的用途，优选地用于制备疫苗或用于基因治疗；和
(4)使用上述(1)中所限定的细胞系生产病毒或生物制剂的方法。
附图简述
图1：用于增强原代鸭细胞永生化的表达质粒的图解部分(实施例2)。为了清楚起见省略了聚腺苷酸化信号。左边的字母与数字是质粒的短标识符、MPGK和hPGK，分别是小鼠和人的磷酸甘油酸激酶启动子；ad5，Ad5的E1-内源性启动子；moCMV，小鼠CMV即时早期启动子；tk，单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；orf22和gaml，CELO病毒基因；E1A和E1B，腺病毒5E1区基因。
图2：作为Ad5-E1转染的鸭胚肝细胞(质粒49E)中细胞灶形成实例的相差显微镜照片。A，最初放大4x以描述在衰老的原代细胞中所包埋的全部细胞灶。B，最初放大20x：照片右侧可见位于紧密单层中的小细胞的大圆形细胞灶的周围，年老衰老的原代细胞朝向左侧。
图3：E1A和E1B 55K蛋白的免疫荧光试验(实施例3)。上面两行，质粒49E永生化的和原代鸭肝细胞的混合物；下面两行，293阳性对照细胞。左列，相差图象；中间列，如在图象中所示的E1A或E1B 55K蛋白的免疫染色；右列，DAPI染色。E1B 55K蛋白特征性地局限于细胞质并累积成团块产生不均匀的，点状分布。E1A是一种核蛋白。在转化的鸭细胞中注意到用DAPI亮染色的紧密的核。
图4：用于检测细胞上清液中逆转录病毒活性的Q-PERT试验(定量PERT试验)(实施例4)。粗体正方形，CHO阳性对照；空正方形，水阴性对照；粗体菱形，鸡胚成纤维细胞；粗体三角形，293细胞系阴性对照；灰色圆圈，仅有的底物阴性对照；空三角形，用质粒49E永生化的鸭肝细胞；δRn，报道染料在起始背景荧光以上的发射。
图5：所述鸭细胞系和CEFp中某些细胞上的MVA扩增(实施例5)。用0.1的MOI进行感染。感染后48小时在VERO细胞上进行滴定(实施例2)。CEFp，原代鸡胚成纤维细胞。
图6：MVA在用质粒49E永生化的鸭视网膜细胞上的系列传代(实施例5)。粗体正方形，裂解量；条形，调整到0.1 MOI的输入病毒。根据参考文献给予输入病毒以证明裂解量不依赖细胞数量的实验波动(其又通过MOI确定输入的病毒)。
序列表-独立文本
  SEQ ID NO：   描述-独立文本
  1   引物VS182
  2   引物VS183
  3   引物VS184
  4   引物VS185
  5   引物VintSA-F
  6   引物VintSA-R
  7   质粒pEFAd5E1A
  8   质粒pEFAd5E1BSA
  9   质粒49E
  10   质粒25F
  11   引物V206
  12   引物V207
  13   引物V208
  14   引物V209
  15   RT引物
  16   引物cDNA1
  17   引物cDNA2
  18   质粒60E
  19   质粒36E
发明详述
根据本发明，“永生化的”、“永生化细胞”和“永生化细胞系”涉及已被某些赋予各自的起始细胞至少200次传代，优选地无限的传代数，即永生化的功能性DNA序列转染/转化的细胞或细胞系。
本发明的“基因盒”应当理解为是一种DNA序列，包括影响成视网膜细胞瘤蛋白功能的基因，即其直接或间接地(例如在表达后)介导成视网膜细胞瘤蛋白和E2F转录因子之间复合体的破裂，并且其另外还包括防止由p53诱导的生长停滞和凋亡的病毒基因，如所有组中的腺病毒E1B 55K蛋白，乳头瘤病毒的E6蛋白，优选低危险的人类乳头瘤病毒(HPV)(如HPV1、HPV6和HPV11，但不是HPV16、HPV18)中的那些病毒基因，或者防止由p53诱导的生长停滞和凋亡的细胞基因如mdm2。
更详细地，上述基因盒包括“第一基因”，其中在(1)的优选方面直接或间接地(例如，通过细胞诱导物)介导成视网膜细胞瘤蛋白和E2F转录因子之间复合体的破裂。该第一基因可以是病毒基因如哺乳动物腺病毒E1A、CELO的gaml和orf22或乳头瘤病毒的E7，优选低危险的人类乳头瘤病毒(如HPV1、HPV6和HPV11，但不是HPV16、HPV18)的病毒基因，或者细胞基因如组成型活性的CDK4或过表达的D型细胞周期蛋白。第一基因的活性介导细胞周期进展通常是以随着传代的增加而引起凋亡或生长停滞为代价。
在上述基因盒中存在“第二基因”以抵消第一基因的这种效应。所述第二基因防止凋亡或生长停滞，优选地通过增加p53的降解或者将p53从反式激活蛋白转化成转录的阻遏物，抑制p53引起的转录激活。优选地，“第二基因”能防止由p53引起的转录激活，包括p53功能的抑制并且导致p53的稳定性降低。“第二基因”可以是病毒基因，如所有组中的腺病毒E1B 55K蛋白、CELO的orf22、乳头瘤病毒的E6蛋白，优选地，低危险的人类乳头瘤病毒(如HPV1、HPV6和HPV11，但不是HPV16、HPV18)的病毒基因，或者防止由p53引起的生长停滞和凋亡的细胞基因如mdm2。优选地，“第二基因”是CELO的orf22或腺病毒E1B 55k。
这与引入外源活性的野生型p53完全相反，其通过未知的机理与鸡成纤维细胞系的产生有关(US 5,879,924)。
在本发明的上下文中“生物制剂”包括治疗性蛋白和重组蛋白，包括抗体、酶、激素、受体或它们的配体以及它们的融合体。优选的生物制剂是重组蛋白。
实施方案(1)的一个优选的方面是来自胚胎的或孵化的鸡、鸭、鹅、鹌鹑等，优选地来自鸡或鸭的细胞系的用途。在(1)的特另优选的方面，另外该细胞系无逆转录酶活性，是来自源于鸡胚胎、孵化的鸡、鸭胚胎或孵化的鸭的原代细胞的永生化，来自胚外膜和/或是在化学成分确定的培养基中培养。该培养基优选地无动物血清。
实施方案(1)的另一个优选的方面是进行永生化的细胞是原代细胞，包括成纤维细胞，来自分离的身体节段(体节)或分离的各个器官的细胞，包括神经元、脑、视网膜、肾、肝、心脏、肌肉和保护胚胎的胚外组织和膜的细胞。最优选地，细胞是来自胚外膜或视网膜。
优选地通过非病毒的转染实现导致实施方案(1)细胞的永生化，包括，但不限于，脂质体介导的转染、树枝状聚合物或羟磷灰石(“磷酸钙”)沉淀以及电穿孔。
优选地，实施方案(1)中的第一基因是介导成视网膜细胞瘤蛋白和E2F转录因子之间复合体破裂的病毒基因。这包括，但不限于，哺乳动物腺病毒(优选C组哺乳动物腺病毒)的腺病毒E1A基因、乳头瘤病毒的E7蛋白，优选地来自低危险的人类乳头瘤病毒(HPV)(如HPV1、HPV6和HPV11，但不是PV16、HPV18)、禽类腺病毒的orf 22基因和/或绵羊attadenovirus的E43可读框。可选择地，实施方案(1)的第一基因是介导成视网膜细胞瘤蛋白和E2F转录因子之间复合体破裂的细胞基因。这包括，但不限于，细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3和/或不易受由pl6INK4a引起的失活影响的突变的CDK4。
实施方案(1)的第二基因优选地是编码防止由p53引起的生长停滞和凋亡的蛋白的病毒基因。这包括，但不限于，编码所有组中的腺病毒E1B55K蛋白、CELO的GAM-1、乳头瘤病毒的E6蛋白的基因，优选地是低危险HPV(如HPV1、HPV6和HPV11，但不是HPV16、HPV18)的那些。最优选的是编码腺病毒E1B55K蛋白和CELO的GAM-1的基因。可选择地，第二基因编码防止由p53引起的生长停滞和凋亡的细胞基因如mdm2。
实施方案(1)的第一基因和第二基因优选地是通过异源序列在空间上分离或者位于不同的核酸片段或质粒上。
在实施方案(1)的特别优选的方面，第一基因是E1A，第二基因是来自哺乳动物腺病毒属腺病毒，优选地来自腺病毒5的E1B区。最优选地，所述E1A区具有SEQ ID NO：7的bp 1193到2309的序列，优选地SEQ ID NO：7的bp 1239到2309，或者与SEQ ID NO：9的bp4230到3113互补的序列。此外，最优选地，所述E1B区具有SEQ ID NO：8的bp 1145到3007的序列，优选SEQ ID NO：8的bp 1197到2810或者与SEQ ID NO：9的bp 2345到550互补的序列。
在实施方案(1)的另一个特别优选的方面，第一基因是orf22，第二基因是来自腺病毒，优选地来自禽腺病毒CELO属的GAM-1，其优选地具有由与SEQ ID NO：10的bp 1252到635互补的序列以及与SEQ ID NO：10的bp 3138到2290互补的序列所表示的序列。
在实施方案(1)和(2)的另一个特别优选的方面，使用质粒36E(SEQ ID NO：19)、37E(图1)、49E(SEQ ID NO：9)、25F(SEQ ID NO：10)或60E(SEQ ID NO：18)对细胞进行永生化。
此外，实施方案(1)的优选方面是编码E1A和/或E1B的核酸与上述所定义的GAM-1和/或Orf22的组合。
根据实施方案(1)的细胞系可能另外携带非天然的功能性序列，包括，但不限于，转基因如互补缺陷病毒的基因(例如，EBNA1等)、启动子(例如，PGK-、EF1.α-、CMV启动子、Ad5的E1-启动子，tk-启动子等)、增强子(例如，RSV-LTR)、选择标记如新霉素抗性、嘌呤霉素抗性等。在一个优选的方面，第一和第二基因在独立地选自PGK-、CMV-、El-和tk-启动子的独立的启动子的控制下。
根据实施方案(1)的细胞系在一个优选的方面此外更适于生产生物制剂或病毒，包括疫苗株(马立克病、传染性囊病、新城疫、火鸡疱疹、鸡贫血、流感、牛痘(MVA)、风疹、狂犬病病毒等)和重组病毒载体(例如，重组MVA或甲病毒)。用于接种的最优选的病毒是MVA和流感病毒。最优选的重组病毒载体是MVA。
在实施方案(1)的一个方面，细胞系是来自用质粒49E使鸭胚外膜细胞永生化的细胞系12A07-A10(DSM ACC2695)(实施例2)。
此外优选的是在cGMP条件下产生根据实施方案(1)的细胞系，这使得它们适于药学应用。
实施方案(2)的方法优选地包括如上所列的起始细胞的非病毒性转染。最优选地是脂质体转染，尤其是通过Effectene试剂的转染。
根据实施方案(3)的优选的用途是用于制备疫苗或用于基因治疗。使病毒疫苗株或基因治疗载体与根据实施方案(1)的细胞系的细胞接触以便发生感染并通过所述细胞扩增病毒。病毒的连续传代(重复病毒在所述细胞上的感染和收获周期)将导致病毒减毒或使病毒适应这种特定的宿主细胞系。因此，产生对预期的接种者(其不是鸭，优选地不是禽类)来说具有更小毒力的病毒载体或疫苗株。减毒的病毒允许接种者的免疫系统产生比用完全灭活的颗粒接种更具有保护性的反应，并且这种反应的严重程度低于用野生型(天然的)病原体的感染。该实施方案优选的病毒是麻疹和狂犬病病毒。
用于生产根据实施方案(4)的病毒的方法优选地包括将所述的病毒与根据实施方案(1)的细胞系接触和/或在所述细胞系上培养所述病毒。尤其是，该方法可用于在鸭细胞系中，优选地是源自鸭体节或鸭神经元组织的细胞系，甚至更优选地源自鸭视网膜的细胞系中生产痘病毒，优选MVA株。特别地在cGMP条件下通过Ad5-El区的转染所获得的鸭视网膜和体节来源的细胞稳定地支持MVA的扩增，具有与原代鸡胚成纤维细胞等同或更高的效率(实施例5)。
生产根据实施方案(4)的生物制剂，特别是重组蛋白的方法，包括将可操作地连于启动子上的编码重组蛋白的基因引入到根据实施方案(1)的细胞系中，培养所述修饰的细胞系以及收获重组蛋白。
优选地用实施方案(4)的方法生产可用于接种或基因治疗的病毒和生物制剂。
历史上，鸡蛋和各自的细胞(鸡成纤维细胞)是疫苗生产的主要底物。对于药物目的，鸡可从具有多种监控系统的控制病原体的环境中获得。大量文献建议鸡蛋作为细胞系开发的主要靶。因此，鸡细胞对于本发明的起始细胞来说是一种优选的来源。然而，鸡来源的细胞和细胞系将最有可能是RT阳性。文献数据提示对于传染性病毒的释放是低危险的。然而，将必需监控将在生产中使用的任何细胞系使其缺乏可传染的病毒。的确，已建立的禽类细胞系中的绝大多数迄今为止都源自鸡(US 5,830,723、US 5,879,924)。尽管可能饲养无禽类造白细胞组织增生病毒的鸡谱系(系0)，但是在包括系0的鸡细胞中存在内源性禽逆转录病毒(EAV-HP)(Boyce-Jacino等，J.Virol 66(8)：4919-29(1992))。EAVs提供活性逆转录酶，但是表达水平显著不同。因此，甚至在不灵敏的试验中检测为RT阴性的原代鸡细胞和细胞系如DF1(Crittenden等，Virology 57(1)：128-38(1974))大概将会在现代实时PCR方法中检验为阳性，并且可能含有在某种生长条件下被激活的逆转录病毒。
可选择地，本发明用于细胞系开发的优选的禽类物种是不含有内源性逆转录病毒或表达逆转录酶(RT)的那些。这包括鸭，其由于两个另外的原因比较适合：鸭蛋也可从无病原体的受监控的鸭群中获得，并且鸭与鹅相反，较少可能产生自发性肿瘤。尽管知道许多相关疫苗株如它们在鸡(胚胎)细胞中一样，也能在鸭(胚胎)细胞中很好复制(例如马立克病病毒(Witter，R.L.，Avian Dis.46：925-37(2002))或风疹(Rocchi，G.，Salvadori，A.，Nuovi Ann.Ig Microbiol.21：336-40(1970)))，对于主要感兴趣的病毒株仍然需要证明这一点。对于其它疫苗没有获得这种数据。
本发明发现高度减毒的痘病毒株MVA(修饰的牛痘安卡拉(Ankara))以与在通常所用的原代鸡胚成纤维细胞中类似的或更高的效率在鸭细胞系中复制，对于我们的知识来说这是新的和意想不到的发现。发明人的一个目的是提供一种安全的和健壮的可供选择的细胞以取代原代细胞用于需要禽类宿主的病毒的扩增，或者优选是非哺乳动物宿主的疫苗株。一种不能获得合适宿主细胞的重要的病毒是MVA(修饰的牛痘病毒安卡拉)。MVA是高度减毒的痘病毒并且对于治疗性和保护性疫苗应用来说是非常有前途的工具。MVA将作为表征鸭细胞的模型病毒，但不应当被认为是唯一的实例：可用许多其它病毒进行所述的试验，无论是病原体或治疗性载体，如麻疹、风疹、狂犬病或流感病毒。
主要由于历史的和实践的原因，一直选择成纤维细胞作为优选的细胞类型。成纤维细胞是哺乳动物以及禽类生长最快的原代细胞。当将整个鸡胚胎的细胞悬液进行培养时，这不仅是而且是占主导地位的细胞类型。然而，成纤雏细胞强烈地粘附生长并仅在完全(致瘤性)转化后才丧失这种特征。该方法需要存在干扰信号转导途径的强转化基因如v-ras。成纤维细胞培养物的早期衰老部分是由在鸟类和人类中完全缺乏端粒酶活性所致(Forsyth，N.R.等，Differentiation 69(4-5)：188-97(2002))。
人类原代成纤维细胞抵抗用腺病毒5型E1基因的转化(个人的观察)，其不直接干扰这些途径。对于上皮细胞和神经元细胞来说，悬浮培养物中的有效永生化和生长有更高的机会获得成功。而且，上皮而不是成纤维细胞似乎是鸟蛋内病毒复制的主要部位。有趣地，与人类的情况相反，鸟肾的确在整个一生中都表达端粒酶，这使得鸟肾细胞对于永生化是一种很好的靶。一起考虑，认为包括肾上皮和神经元细胞的鸟上皮细胞是开发具有所需特征细胞系的最有希望的靶。
因此仅仅是因为很容易获得成纤维细胞，因此禽类细胞系开发几乎全部集中于这些细胞(Cowen，B.S.，Braune，M.O.，Avian Dis 32(2)：282-97(1988)；US 5,830,723)。在一些情况中一直使用整个胚胎(US2001-0016348)。
基于受体分布和支持复制的细胞因子，病毒不仅显示物种特异性而且也显示器官和组织特异性。因此，与典型的方法相反，进行本发明的优选的方法是在培养以前，进行器官的分离以获得最优选的宿主细胞。
对于流感病毒，其疫苗充足生产是本发明细胞系的主要应用，复制的典型部位不是胚胎本身而是胚外膜。因此，具体的目标是也从胚外材料，包括胚胎的保护膜中开发细胞系。与成纤维细胞相比，一些组织特异性原代培养物，包括胚外膜的那些原代培养物具有非常短的存活时间。这进一步突出了需要设计永生化以获得优化的宿主细胞。在有限的时间窗口中多种组织的成功永生化需要本发明内所用基因的特定组合。
不知道哪种禽类组织对于痘病毒如MVA或金丝雀痘具有最高复制潜能。MVA的典型生产方法涉及除头以外胚胎的细胞混合物，其中在破碎前除去头。因此完全没有预料到从视网膜中开发的神经元来源的细胞系具有这么高的MVA复制能力，而其它组织则没有。
同样的组织特异性应用于蛋白生产。转录能力取决于可得到的转录因子系列，甚至强的普遍存在的病毒启动子和细胞启动子在不同组织中显示可变的强度。此外，所分泌的蛋白的产量取决于特定类型的细胞正确地折叠和加工(例如，糖基化)蛋白的能力。
已经充分地描述了导致原代细胞永生化和转化的机制(Hahn，W.C.等，Nature 400：464-8(1999))。所需的元件干扰(1)细胞周期进展的控制，(2)由失调的细胞周期诱导的程序化细胞死亡，(3)生长因子信号转导以及对于人类和禽细胞(4)缩短端粒酶，即染色体的线性末端。已知大量因子可驱动原代细胞成为永生化的和转化的表型，但是永生化是以抑制负责将宿主中的肿瘤形成降到最低的细胞关卡为代价。因此期望选择转化因子，其能影响细胞系的实验世代但在来自设计者细胞的生物制剂的接受者中具有肿瘤诱导的最小危险。这种要求需要与转化因子的强度平衡：它们应当足够强以便导致转化，不需要另外的自发突变的累积；即，导致所得细胞系的分子途径应当是完全已知的(根据FDA CBER办公室在2000年5月顾问委员会上作出的疫苗说明的分类I和II)。此外期望选择不能单独转化原代细胞的因子的协同组合，使得需要同时转移遗传材料，其进一步将在受接种者或患者中的偶然转化的危险降到最低。最后，期望转化因子在生物制剂的接受者中引起免疫反应，使得在由于产品应用而不容易发生的肿瘤形成事件中激活免疫肿瘤监视。如果利用非细胞的但是是外源的，例如病毒的转化蛋白，可实现最后的标准。
现在已发现人类腺病毒5(Ad5)的E1区是理想地适于转化禽类细胞，结果所得的设计者细胞遵守所有上述标准。
E1B区编码双顺反mRNA上的两个可读框，21K和55K蛋白。55K蛋白结合p53，因此将促凋亡转录激活物转变为阻遏物。21K蛋白通过结合Bax补充这种抗凋亡活性，因此保持线粒体膜的完整性以及防止细胞色素C的释放。这种蛋白对于驱动粘附细胞不依赖底物的生长是必需的，因此对于悬浮液中的发酵过程是必需的。
以前一直没有证明是否人类腺病毒E1B 55K可影响p53的禽类同源物。此外，禽类腺病毒不具有类似E1B的基因，因此推论也是不可能的。与所有预期都相反，本发明人已经发现E1B可提供必需的功能以允许由E1A的永生化。
对于这里所描述的成绩来说，新的和决定性的因素是从其弱的天然背景中除去E1B并置于强的重组启动子的控制下。这种新的修饰和组合允许通过转染而不是逆转录病毒的转导使鸭和鸡的多种组织永生化。
尽管由E1转化的根本机理是复杂的，但是一个特点是最期望的特征：E1A是细胞增殖和凋亡的强诱导物，而E1B蛋白有效地干扰凋亡但是不能解除对细胞周期控制的限制。
因此，不是单一因素而是必需连续存在E1A和E1B蛋白以维持通过实验诱导的转化表型。
由于在70年代v-src的描述(Brugge，J.S.，Erikson，R.L.，Nature269：346-8(1977))，已经发现和表征了大量转化因子。的确，通过α逆转录病毒在鸟类中诱导肿瘤的研究提供了最初的分子认识(Martin，G.S.，Nature 227：1021-3(1970))。逆转录病毒的癌基因来自细胞基因，具有被突变或缺失的必需调控区。已在这些研究的过程中鉴定了一些因子，如v-myc或v-ras，直接影响RB和p53途径的组分。其它蛋白，如v-src或v-erbB，组成型地活化(因此，异常调节的)模拟冲击细胞外促细胞分裂原的信号转导蛋白。这些因子的问题是它们仅靶向有效转化所需的几个途径中的一个。v-src或v-myc的存在使细胞易于转化并且对于完全转化需要细胞内另外的，自发的和不可预知的改变。因此很难估计由用一种逆转录病毒的癌基因所转化的细胞对患者所造成的危险。
也已知其它DNA病毒如乳头瘤病毒和多瘤病毒在体外转化细胞。然而，所选择的转基因不应当太具有攻击性以至于不能在生物制剂的接受者中将由偶然转移的细胞DNA诱导肿瘤的危险降到最低。该标准对于疫苗生产尤其严格，健康人群常常在非常年幼的年龄进行接种。甚至用复杂的现代纯化方法，认为多瘤病毒大T抗原太具有攻击性，不能用于所产生的在人类药物中应用的细胞系。而90％的宫颈癌携带乳头瘤病毒序列(Munoz，N.等，N.Engi.，J.Med.34816)：518-27(2003))。不认为C型腺病毒(其包括2型和5型)能在体内诱导肿瘤，在人类肿瘤组织中一直没有检测到腺病毒。
基于上述所证明的转化基因的互补特征，发现每种干扰细胞周期和凋亡中单一途径的基因的组合对于获得在悬液中生长的遗传稳定的细胞系是必需的。
据证明腺病毒5的完整E1区可达到这些要求。尽管据证明，Ad5的E1 A的12S蛋白可与禽类RB相互作用(Guilhot，C.等，Oncogene 8：619-24(1993))，但是在本发明中第一次证明了禽类细胞中的55K和21K蛋白的功能活性。表达E1A的12S蛋白的鹌鹑细胞中，一些克隆显示转化的特征并不奇怪(Guilhot，.C.等，Oncogene 8：619-24(1993))。通过逆转录病毒感染的非常有效的和稳定的转导产生足够大的细胞库，允许各个细胞克服细胞周期阻滞或由自发的基因组改变诱导的凋亡。这些必需的但未知的改变增加了药用危险，所得的细胞系可能不被认为是设计者细胞系，其应当是基于已知的基因。此外，转染技术不足以产生自然选择所需的大量克隆库。反而需要逆转录病毒转导。通过该方法引入的转化基因的两侧将是ITR，因此可被移动，甚至在表达逆转录酶的细胞系中更易于移动。
最近，已更详细地描述了禽腺病毒，称作1型禽腺病毒CELO株(鸡胚致死性孤儿)(Chiocca，S.等，J.Virol.70：2939-49(1996))。CELO的大的，中心基因组的一段序列是Ad5的同源物，但是在重要的方面与等其它方面不同，CELO不具有E1同源区。此外，CELO不能补充在E1A中经诱变处理的Ad5，相反地，Ad5 E1蛋白不能反式激活延迟的早期CELO基因的转录(Li，P.等，J.Gen.Virol.65(Pt10)：1817-25(1984))。然而，CELO能在体外转化仓鼠细胞(May，J.T.等，Virology 68：483-9(1975))。已在CELO病毒中鉴定了干扰细胞周期和凋亡的基因，orf22和GAM-1(Lehrmann，H.，Cotton，M.，J.Virol.73：6517-25(1999))。Orf22编码与RB相互作用的蛋白，GAM-1以与原型21K蛋白类似的方式干扰凋亡(Chiocca，S.等，J.Virol.71：3168-77(1997))。
现在发现CELO病毒的基因orf22和GAM-1是E1A和E1B的合适的替代物。于是扩大了可用于转化禽类细胞的转基因谱。这些蛋白以前一直没有用于转化禽类细胞。
此外，可用细胞基因取代病毒基因之一。这种取代的候选物是用于取代腺病毒的E1A区的E2F家族成员或D组细胞周期蛋白以及用于取代E1B区的mdm2。
下列细胞系保藏在DMSZ，即德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weglb，38124 Braunschweig，德国：
1.PBG04的保藏号为DSM ACC2577，于2002年9月18日保藏；
2.12A07-A10的保藏号为DSM ACC2695，于2004年10月20日保藏。
将通过参考下列实施例更详细地说明本发明，然而其不应当被解释为打算限制本发明。
实施例
实施例1：用腺病毒5E1A，B使原代鸭细胞永生化
使用provestart聚合酶(Qiagen)，从在HEK 293中生长的第一代(E1缺失的)腺病毒Admuc的第8次传代的培养物中扩增E1A和E1B的腺病毒序列，其严重地污染了野生型病毒。
使用下列引物：
VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT(SEQ ID NO：1)
VS183 CACACGCAATCACAGGTT(SEQ ID NO：2)
扩增E1 A区和
VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT(SEQ ID NO：3)
VS185 ACACATTTCAGTACCTCA(SEQ ID NO：4)
扩增E1 B区。首先将两个片段克隆到PCR4blunttopo(Invitrogene)。
E1B构建体遗漏了E1B信息的剪接受体。因此用使用引物从人免疫球蛋白重链的前导内含子扩增的合成的剪接受体取代。使用PBG04(DMSZ ACC2577)，即一种鼠-人异杂交瘤的基因组DNA作为模板。引物：
VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA(SEQ ID NO：5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTG GGCTCCTGTGG(SEQ ID N0：6)
将该剪接受体直接克隆到含有EF1α启动子和myc前导肽的pEFmyc以产生融合蛋白。使用EcoR I和Xho I位点从ptopoE1A中除去E1A区并直接克隆到pEFmyc中，除去myc前导序列并将E1A融合到牛生长激素的聚腺苷酸。再次用EcoR I和Xho I限制性酶除去E1B区并克隆到含有异源剪接受体位点的pEFmycSA。将得到的质粒命名为pEFAd5ElA(SEQ ID NO：7)和pEFAd5ElBSA(SEQ ID NO：8)。
将受孕的鸭蛋在37℃，60％空气湿度中孵育12天(更老的胚胎产生更多的细胞，但是也含有更多的污染的，分化的成纤维细胞)。将壳用70％异丙醇消毒，在大端开口，在无菌条件下将胚胎移到无菌培养皿中。除去胎脑和肾，转移到填充胰蛋白酶/EDTA的单独的培养皿中并切碎。短暂孵育后，将其悬液与补充了10％胎牛血清(Biochrom)和2％Ultroser G(Ciphergen)的过量的F12培养基(Gibco/Invitrogen)混合。将该悬液转移到培养皿中并在37℃(其低于鸡的生理温度41.6℃)和5％CO2中进行培养。第二天置换具有非粘附碎屑的培养基并继续进行培养，直到可获得每3.5cm平皿至少5×105细胞，用于质粒pEFAd5E1A和pEFAd5E1BSA的转染。
比较脂质体(Effectene；Qiagen)和树枝状聚合物(Polyfect；Qiagen)转染剂的最初实验提示用Effectene效率最高。使用Effectene试剂进行转染；简要地：将2μg质粒DNA在含有16μl增强子的200μlEC缓冲液中稀释。孵育5分钟后，加入16μlEffectene。孵育10分钟后，从3.5cm平皿中的培养物中除去上清液并用1ml含有转染混合物的新鲜培养基置换。在37℃和5％CO2孵育2小时后，向培养物中添加额外的2.5ml新鲜培养基。
允许转染的细胞达到汇合，用胰蛋白酶消化，在补充了FCS/Ultroser G的F12培养基中重悬，重新种植到两个6孔平板内(对应12倍扩增)。5天和10天后，培养基用仅补充了5％FCS的F12置换。查看平板是否出现具有形态学改变(在相差下总体细胞大小减小，核的大小增加，质膜的可见性增加)以及汇合增加的细胞灶。
转染后大约14天，一旦细胞灶达到直径1-3mm，吸出培养基并且培养物用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)洗涤2次。将胰蛋白酶浸透的克隆平皿(Sigma)置于所吸出的细胞灶的上面3分钟，然后转移到充满了补充了5％FCS的500μl F12培养基的24孔平板的孔内。
使克隆的，转化细胞进行增殖直到汇合，胰蛋白酶消化，在含有5％FCS的F12培养基中重悬并转移到6孔平板内。一旦培养物在6孔平板内达到汇合，将细胞转移到T25烧瓶进行连续传代。
对于在明确时间间隔的冷藏，将细胞用胰蛋白酶消化，在含有5％FCS的F12培养基中重悬，通过以100g离心10分钟进行收集，在含有50％FCS和10％DMSO(Sigma)的F12培养基中重悬以达到每ml大约3×105个细胞的浓度，并置于-75℃的基于异丙醇的冷却装置中的冷冻管内。冷却装置确保每分钟1℃的恒定冷却率。24小时后，将细胞转移到液氮中永久贮藏。
实施例2：永生化的禽类细胞系的改良制备
a)原代细胞的制备
证明鸭蛋来源的鸭群无肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)和关节液支原体(M.synoviae)；无造白细胞组织增生、网状内皮组织增生、鹦鹉热、禽流感、鸭肝炎以及Derzsy病的病例。动物故意不进行抗细小病毒接种并且没有检测到细小病毒病的病例。对来源群中的动物进行抗肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamulticodica)；火鸡鼻气管炎后肺病毒；以及导致新城疫的副黏病毒接种。
不用摇动使蛋在室温平衡，在38℃在潮湿的室内孵育两天后，通过交替+45度和-45度频繁旋转。
为了分离原代细胞，孵育1周或3周后处死鸭胚。将蛋转移到cGMP单元(进行如Current Good Manufacturing Practices所概述实验的封闭实验室)并在层流罩超静台下将壳用70％异丙醇擦拭消毒。随后的所有步骤都在无菌条件下在GMP单元中进行，使用成分明确的溶液或培养基。
将蛋小心打开，将胚胎转移到大培养皿中并且通过断头术立即杀死。从标本中取出下列器官：脑、视网膜、肝、食管、心脏以及胚外膜。
另外，从8日龄的胚胎中制备体节细胞。
所有标本都用PBS(磷酸缓冲液；Gibco/Invitrogen，USA)冲洗，用胰蛋白酶(Gibco/Invitrogen，USA)处理1到10分钟，并在补充了10％FCS(Biochrom AG，德国)的DMEM：F12培养基(Gibco/Invitrogen，USA)中通过反复经过18G注射器进行研磨。将搅匀的标本在37℃和5％CO2中培养。第二天通过更换培养基从粘附细胞中除去碎屑。
b)质粒构建
通过PCR，分别从腺病毒血清型5或鸡胚胎致死性孤儿(CELO)野生型病毒的基因组DNA中提取相关的靶区域，并插入到具有人类或小鼠磷酸甘油酸激酶(hPGK或mPGK)、小鼠CMV(moCMV)或tk启动子(图1)的载体中，构建E1A、E1B、Orf22和Gam1的表达质粒。
使用ProofStart聚合酶(Qiagen，德国)，从野生型病毒中扩增E1A和E1B的腺病毒序列。使用下列引物：
VS182ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT(SEQ ID NO：1)
VS183CACACGCAATCACAGGTT(SEQ ID NO：2)
扩增E1 A区和
VS184ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT(SEQ ID NO：3)
VS185ACACATTTCAGTACCTCA(SEQ ID NO：4)
扩增E1 B区。首先将两个片段克隆到pPCR4-Blunt-TOPO(Invitrogene，USA)中。
E1B构建体遗漏了E1B信息的剪接受体。因此用使用引物从人免疫球蛋白重链的前导内含子中扩增的合成剪接受体替换。使用PBG04(DMSZ ACC2577)，即一种鼠-人异杂交瘤的基因组DNA作为模板。
用于扩增的引物：
VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA(SEQ ID NO：5)
VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG(SEQ ID NO：6)
用以下引物从野生型CELO病毒中扩增基因GAM-1和ORF-22：分别是
V206 AAC CTC GAG ACC CCC CTG TAC ATT CTA(SEQ IDNO：11)
和V207 GCC GTT AAC TTC AGG GAT TGG TTA CAG(SEQ IDNO：12)，以及
V208 CAC CTC GAG TCC GGA TTA AGA TGA ACG(SEQ IDNO：13)
和V209 CCA GTT AAC AGG TGA ACC ATT TAT ACA G(SEQID NO：14)。
所得质粒的代表性实例是质粒49E(在人PGK和小鼠CMV启动子控制下的腺病毒因子；SEQ ID NO：9)、质粒25F(在小鼠和人PGK启动子控制下的CELO因子；SEQ ID NO：10)、质粒60E(在人PGK和tk启动子控制下的腺病毒因子；SEQ ID NO：18)以及质粒36E(在小鼠PGK启动子控制下的CELO因子；SEQ ID NO：19)(也见图1)。
通过测序证明表达质粒的完整性。质粒在真核细胞中不具有表达抗抗生素(如氨苄青霉素)的抗性因子。
c)转染
分离后不久或一次传代培养后，原代培养物用E1或Orf22/Gaml的表达质粒转染。视实验而定，质粒以超螺旋或用Sca I(New EnglandBiolabs，USA)限制酶线性化后转染。比较脂质体(Effectene；Qiagen，德国)和树枝状聚合物(Polyfect；Qiagen，德国)转染剂的最初实验提示用Effectene的转染效率最高。根据下列步骤进行转染：将2μg总DNA稀释到200μl所提供的EC缓冲液中并与16μl所提供的增强子混合。在室温下孵育2-5分钟后，加入20μl Effectene试剂。在室温下5-10分钟后，将该混合物应用到8cm2平皿中1ml培养基下的细胞中。2-5小时后，加入另外的1.5ml培养基。在第二天，培养基用2ml新鲜培养基替换，其后每周更换一次。在用报道基因的平行实验中证实了成功的转染。
将细胞在含有10％FCS的DMEM：F12培养基中连续传代。
转染后20天在一些培养物的明确的亚群(细胞灶；图2)中观察到形态学的改变；在其它培养物中细胞灶没有出现或者不能与原代细胞的强增殖竞争；转染后不久其它培养物再次遭受大量的细胞死亡和衰老。
从质粒49E转染的具有来自肝、视网膜和胚外膜的细胞的培养物中扩增大量独立的细胞灶。在第10次传代时，例如，分离用质粒49E转化的来自鸭胚外膜细胞的细胞系12A07-A10，并保藏在DSMZ。
也从质粒60E转染的具有来自视网膜和体节细胞的培养物中获得细胞灶。
在质粒49E中，PGK和小鼠CMV启动子分别驱动E1A和E1B的表达。质粒60E(SEQ ID NO：18)也编码全部Ad5-E1区但保护性E1B区的表达由tk驱动，tk是一种不与小鼠CMV启动子一样强的启动子(但比天然E1B启动子强)。当与用质粒49E的结果比较时，与由E1B赋予的保护效果一致，用该构建体在更少的细胞标本中获得少得多的细胞灶。
也在用CELO质粒36E(SEQ ID NO：19)和25F(SEQ ID NO：10)转染的肝培养物中观察到形成既具有原代细胞外观也具有转化表型的细胞灶。
通过用胰蛋白酶处理2-3分钟并在转移到新鲜培养管中的DMEM：F12培养基中重悬，扩增具有细胞灶的培养物。
对于在规律时间间隔的冷藏，将细胞用胰蛋白酶除去，在含有10％FCS的DMEM：F12培养基中重悬，通过以200 xg离心10分钟收集，在含有50％FCS和10％DMSO(Sigma，USA)的DMEM：F12培养基中重悬到每ml大约3×106细胞的浓度，并以每分钟1℃的速度冷却到-80℃。24小时后，将细胞转移到液氮中永久贮藏。
实施例3：稳定转染的免疫荧光试验
将潜在永生化的细胞培养物种植到载玻片上并允许在用冰冷的甲醇固定10分钟前增殖几天。根据标准的免疫荧光方法，将固定的细胞与抗E1A和E1B 55K蛋白的抗体、二抗，以及特异性抗后者的荧光染料一起孵育(Becton Dickinson，UK，#554155抗E1A的抗体，1∶30稀释；Oncogene，USA，#DP08-100UG抗E1B 55K的抗体，1∶30稀释；分别抗小鼠或大鼠的二抗，与生物素缀合，两者都购自Jackson ImmunoResearch，USA，1∶80稀释；用Jackson Immuno Research，USA，#016-070-084链霉抗生物素-德克萨斯红缀合物显色，1∶100稀释)。原代细胞在早期仍然很丰富，然而不是完全建立的永生化细胞系，在有适当的抗体特异性的内部阴性对照的条件下，可很容易地通过形态学进行区别。稳定表达Ad5 E1区的293细胞(人胚胎肾细胞)作为阳性对照。在最后的孵育步骤中加入DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚；Sigma，USA)到1μg/ml，将细胞核进行染色用于定向目的。
仅在经历了形态学上证明通过转染的质粒成功永生化的特征性改变的细胞中，观察到E1A和55K的强信号(图3)。此外，由于具有表型改变的所有细胞都是E1阳性，因此没有观察到自发的转化，一种形式可能性。没有一个具有原代表型的细胞表达E1蛋白。尽管在超螺旋的转染中是可能的，其中在整合的过程中在随机位置上发生质粒的线性化，但是在所检查的细胞灶中没有一个在缺乏E1B表达时显示E1A表达，进一步强调了对于永生化需要破坏两个途径。
实施例4：内源和外源逆转录病毒的试验
当在原代鸡成纤雏细胞中生产疫苗时，常见的问题是外源性或内源性逆转录病毒的污染。逆转录病毒家族的多样性太复杂，无法预测给定的物种是否是逆转录病毒的载体。因此来自文献的报道通常限于逆转录病毒家族的子集，例如EAV-HP/ALV亚组(Smith，L.M.等，J.Gen.Virol.80(ptl)：261-8(1999))，然后仅限于禽类物种的子集。
因此逆转录病毒污染的可靠证明应当集中于这些病毒中存在的共同基序。序列多样性排除了基于核酸的检测方法。然而，所有逆转录病毒相同的是都存在逆转录酶。因此通过对于逆转录酶的基于定量探针的产物增强PCR(Q-PERT)并且与几个对照比较，特别是CHO作为阳性对照以及293细胞作为阴性对照(见下面的描述和图4)，分析从用质粒49E永生化的鸭肝细胞扩增的细胞灶的上清液，检测内源性逆转录病毒的活性或游离逆转录病毒的污染。试验是对文献的修改(Lovatt，A.等，J.Virol.Methods 82(2)：185-200(1999))。简要地：经过PBS中20％蔗糖的屏障除去细胞碎屑，通过100000xg超速离心从培养物上清液中富集逆转录病毒。将病毒体(如果存在)在裂解缓冲液(50mM Tris pH7.8、80mM KCl、2.5mM DTT、0.75mM EDTA、0.5％Triton X-100)中重悬并与含有模型RNA(5μg/ml雀麦草花叶病毒RNA[Promega Corp，USA，#D1541])的底物缓冲液(dATP、dCTP、dGTP和dTTP每种10mM；15μM特异性引物[GCC TTT GAG AGTTAC TCT TTG；SEQ ID NO：15]；和0.5mg/ml片段化的青鱼精子DNA[Promega Corp，#D1811])混合，如果标本中存在RT活性，模型RNA被逆转录。用引物(AAA CAC TGT ACG GCA CCC GCA TT；SEQ ID NO：16)和(GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG；SEQ ID NO：17)通过PCR扩增模型RNA的cDNA，并根据生产商的说明，使用购自Abgene，UK的QPCR SYBR Green ROX混合物#AB-1163在AB7000序列检测系统中通过SYBR绿色荧光检测。
图4证明了从文献(例如Anderson，K.P.等，Virology 181(1)：305-311(1991))的报道中所预期的CHO细胞中的强RT活性。由于这些细胞作为阳性对照，并且无逆转录病毒活性的人293细胞作为阴性对照，确定了允许解释细胞培养物(图4，粗体正方形和粗体三角形)的上清液中未知RT活性的范围。
我们在鸡胚胎成纤维细胞中发现了适度的RT活性(图4，粗体菱形符号)。
鸭细胞上清液中RT活性的信号与293细胞中RT活性的信号一致，两者再次与代表我们试验的检测限度的对照一致，其中对照由不与RT孵育的模型RNA构成(图4，比较具有空的和粗体三角形的曲线与具有灰色圆圈的曲线)。通过CHO细胞和鸡胚胎成纤维细胞的样品之间至少两个循环数(这些实验的样品来自已知仅是弱RT阳性的来源)以及通过CHO细胞和293阴性对照以及鸭细胞培养物的样品之间至少4个循环数，分离同等水平的信号强度(δRn)。因此，与鸡细胞相反，所述的鸭细胞不显示RT活性，因而满足药物应用中适应性的必需属性。
实施例5：修饰的牛痘病毒安卡拉(MVA)
测定所扩增的细胞灶作为MVA扩增的底物对肝、视网膜、体节和胚外膜系的适应性。表1和图5显示通过用在CEFp，原代鸡胚胎成纤维细胞上，大规模制备MVA(ATCC#VR-1508)所得的接种物感染细胞系获得的结果。表中通过用0.1的MOI(感染复数或每个宿主细胞中传染性颗粒的数量)感染所得的数据证明视网膜和体节细胞的病毒产量(每ml的噬斑形成单位)相当于或者甚至超出用CEFp细胞所获得的产量。
MVA产量(pfu/ml)(48小时后，用0.1的MOI感染)
CEFp视网膜肝体节膜     3.54×1072.06×1073.20×1044.60×1074.03×103
表1：比较在24孔平板的孔中1到5×105个细胞的平行感染中所获得的病毒滴度。将输入病毒调整到MOI为0.1。CEFp，新鲜的原代鸡胚胎成纤维细胞；膜，胚外膜。
测定鸭细胞上MVA的噬斑形成单位的方法如下：48小时后从所感染的细胞，从上清液以及从通过反复冻融打开的粘附细胞中回收MVA病毒。将VERO(非洲绿猴肾)细胞种植在96孔板中(每孔2×104个细胞)并在第二天用含有MVA悬液的连续10倍稀释液感染。其后两天，将培养物与甲醇混合并且将感染细胞与多克隆牛痘病毒抗体(Quartett，德国，#9503-2057，在含有1％胎牛血清的PBS中1∶1000稀释)在37℃孵育1小时。用含有0.05％Tween 20(Sigma Corp，USA)的PBS进行两次冲洗步骤，加入在含有1％胎牛血清的PBS中1∶1000稀释的牛痘特异性抗体的二抗。将该二抗偶联到过氧化物酶上，该酶一旦与AEC试剂(3-氨基-9-乙基-carbozole；在含有0.015％H2O2的0.1M醋酸缓冲液pH 5.0中为0.3mg/ml)孵育便催化颜色反应。通过光学显微镜鉴定感染灶，从产生阳性染色反应的MVA悬液的最大稀释液中计算噬斑形成单位。
图5描述了每个细胞中的病毒产量。每个细胞的病毒产量与给定的宿主细胞对特定病毒的容许程度相关。容许程度受生化性质，如受体密度或病毒结构蛋白加工的效率影响。图5证明每个视网膜细胞或每个体节细胞所释放的感染颗粒的数量有利地比得上每个鸡胚成纤维细胞所获得的感染颗粒。
“每个细胞的输出病毒”除以“MOI”得到裂解量，即输入病毒对输出病毒的比。裂解量相当于病毒的扩增，因此对于估计大规模生产的费用和所需的资源很重要。在所描述的实施例中所测定的裂解量对于CEFp是374，对于视网膜细胞是513，对于体节来源的细胞是1108。视网膜细胞和体节细胞比新鲜的原代鸡胚胎成纤维细胞产生更大的值，因此对于MVA的大规模生产来说应当提供较多的底物。
不能将用来自肝或胚外膜的细胞所获得的不令人满意的MVA扩增的结果扩展到其它病毒家族：对于熟悉本领域的人员来说很显然，其它病毒的扩增，例如疫苗相关的流感病毒，可能在这些细胞上非常成功。
能想得到，随着接下来病毒在特定宿主细胞上的传代，输出的滴度降低。如果宿主细胞支持感染周期各种阶段中的大多数但不是所有步骤，那么可能发生这种事件。为了解决这个问题，在用质粒49E转化的鸭视网膜细胞上进行MVA的连续传代。图6的数据证明随着在这些细胞上的传代，MVA不丧失：在输入病毒调整到MOI为0.3的类似水平(通过图6中的条形表示)，裂解量(粗体正方形)从35到315增加了9倍。裂解量增加的原因可能是由于随着传代数量的增加，改良了宿主细胞的性质。
总之，通过在cGMP条件下Ad5-E1区转染所获得的来自鸭视网膜和体节来源的细胞稳定地支持MVA的扩增，效率相当于或高于原代鸡胚胎成纤维细胞。由于MVA的高度减毒特性，因此常规的细胞系不适于病毒的大规模生产。令人惊奇地发现所设计的鸭细胞系对MVA的繁殖好于原代鸡细胞，因此能为这种重要的疫苗候选物提供新的生产平台。所述细胞系在cGMP条件下产生，因此适于药物应用。
Figure IYZ000001503687300021
Figure IYZ000001503687300031
Figure IYZ000001503687300041
Figure IYZ000001503687300061
Figure IYZ000001503687300071
Figure IYZ000001503687300081

Claims (20)

1.用病毒基因的组合通过非病毒转染而永生化的禽类细胞系，一种第一病毒基因影响成视网膜细胞瘤蛋白的功能，一种第二病毒基因影响p53蛋白或其家族成员；
其中所述第一病毒基因介导成视网膜细胞瘤蛋白和E2F转录因子之间复合体破裂，所述第一病毒基因是来自腺病毒5的E1A区，其由SEQ ID NO：7的bp 1193到2309的序列组成或者由与SEQ ID NO：9的bp 4230到3113互补的序列组成，并且其中所述第二病毒基因编码防止由p53诱导生长停滞和凋亡的蛋白，所述第二病毒基因是来自腺病毒5的E1B区，其由SEQ ID NO：8的bp 1145到3007的序列组成或者由与SEQ ID NO：9的bp 2345到550互补的序列组成。
2.权利要求1的禽类细胞系，其中第一基因克服G1关卡控制，第二基因防止由第一基因诱导的凋亡。
3.权利要求1或2的禽类细胞系，其中所述第二基因能防止由p53引起的转录激活。
4.权利要求3的禽类细胞系，其中所述第二基因能够抑制p53的功能和导致p53稳定性的降低。
5.根据权利要求1-4中任何一项的细胞系，其中
(i)细胞系来自胚胎的或孵化的鸡、鸭、鹅或鹌鹑；和/或
(ii)进行永生化的细胞是原代细胞；和/或
(iii)第一基因和第二基因通过异源序列在空间上分离或者位于不同的核酸片段或质粒上。
6.权利要求5的细胞系，其中(ii)中的所述原代细胞选自成纤维细胞、来自分离的身体节段的细胞、来自分离的各个器官的细胞、来自胚外组织的细胞和来自保护胚胎的膜的细胞。
7.权利要求6的细胞系，其中所述各个器官选自脑、视网膜、肾、肝、心脏和肌肉。
8.权利要求1的细胞系，其中所述非病毒转染是脂质体介导的转染、树枝状聚合物介导的转染或电穿孔。
9.根据权利要求1-4中任何一项的细胞系，其
(i)另外携带非天然的功能序列，所述功能序列选自转基因、启动子、增强子和选择标记；和/或
(ii)适于生产生物制剂或病毒，所述生物制剂或病毒选自疫苗株和重组病毒载体。
10.权利要求9的细胞系，其中
(i)所述转基因是补充复制缺陷病毒的基因；
(ii)所述启动子选自PGK-启动子、EF1.α-启动子、CMV-启动子和tk-启动子；
(iii)所述增强子是RSV-LTR；和/或
(iv)所述选择标记是新霉素抗性或嘌呤霉素抗性标记。
11.权利要求10的细胞系，其中所述补充缺陷病毒的基因是EBNA1。
12.根据权利要求1-4中任何一项的细胞系，其
(i)无逆转录酶活性；和/或
(ii)来自源于鸭胚胎或孵化的鸭的原代细胞的永生化；和/或
(iii)来自胚外膜；和/或
(iv)在化学成分确定的培养基中培养，所述培养基无动物血清。
13.权利要求1-4中任何一项的细胞系，其是禽类细胞系12A07-A10并且保藏号是DSM ACC2695。
14.制备根据权利要求1-13中任何一项的细胞系的方法，其包括用第一和第二基因对起始细胞的非病毒转染。
15.根据权利要求1-13中任何一项的细胞系在生产生物制剂或病毒中的用途。
16.生产病毒的方法，其包括
(i)将所述的病毒与根据权利要求1-13中任何一项的细胞系接触和/或
(ii)在所述细胞系上培养所述病毒。
17.权利要求16的方法，其中所述病毒是痘病毒，并且所述细胞系是鸭细胞系。
18.权利要求17的方法，其中所述痘病毒是MVA。
19.权利要求17的方法，其中所述细胞系来自鸭体节、鸭神经元组织或鸭视网膜。
20.生产重组蛋白的方法，其包括
(i)将可操作地连于启动子的编码重组蛋白的基因引入到根据权利要求1-13中任何一项的细胞系，
(ii)培养所述修饰的细胞系，和
(iii)收获重组蛋白。
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