CN101356265B - 提高生产率的蛋白因子、新颖细胞系和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用其基因组中稳定地整合了编码特定异源调节蛋白之基因的有效表达细胞系来制备非腺病毒靶病毒或靶蛋白的方法。

Description

提高生产率的蛋白因子、新颖细胞系和其应用
本发明提供用其基因组稳定地整合了编码特定异源调节蛋白的基因的有效表达细胞系来制备非腺病毒靶病毒或靶蛋白的方法。
发明背景
来自真核细胞的生物药物制品是现代医药的组成部分。然而，增加生产率和提高安全性是仍需要实质性优化的重要参数。在优化努力中的最主要的瓶颈就是细胞基质本身。能够被导入已准许用于生物制药方法的细胞系以提高来自这样的操作细胞的产物之产率的安全转基因极为有价值。
腺病毒为感染广谱动物的非包膜(裸露)双链DNA病毒。最好的已表征成员中有人腺病毒血清型5(Ad5)。所述病毒为感冒症状的常见病因，感染通常发生在孩童时期。
可以对腺病毒进行遗传操作，复制缺陷的腺病毒，包括Ad5(其序列的GenBank登录号为：AC_000008)，被用作基因治疗和治疗性疫苗接种用的载体。为了得到复制缺陷病毒，基因组DNA的很大的区域被非病毒序列置换。丧失的病毒功能由用载体中所缺失基因稳定转染的宿主细胞系以反式来提供。开发的早期系统之一由腺病毒载体组成，该载体缺失细胞系上产生的提供相应E1蛋白的调节E1区。
用于该目的的最普通的细胞系为293细胞系。该细胞系于1977年通过将片段化的腺病毒基因组DNA转染到原代人细胞中而产生(Graham等，J.Gen.Virol.36，59-74(1977))，在此之前很久人们认识到可将腺病毒用作基因治疗载体。随后证明所得到的细胞系含有包括E1区在内的基因组DNA的核苷酸1-4344(Louis等，Virology 233，423-429(1997))；这一表征证明E1区可用于使原代细胞无限增殖化和转化。
邻近E1区的是pIX的基因(“蛋白9”；在基因组DNA中为核苷酸3609-4031)。pIX的启动子植埋于E1区的E1B组分内。称为启动子封堵的机制允许pIX在病毒感染周期病毒DNA复制开始的延迟早期表达，同时病毒DNA拷贝数量增加(Fessler和Young，J.Virol.72，4049-4056(1998))。尽管该基因存在于已整合入293细胞中的4344个核苷酸内，但即使用灵敏的放射性标记方法也不能检测到pIX表达(Spector等，J.Virol.36，860-871(1980))。
如上所述，业已通过使病毒基因组缺失E1区产生了复制缺陷型腺病毒载体。E1产物对病毒复制必不可少，因此，E1区功能必须通过腺病毒包装细胞(例如293细胞系)中的稳定E1转基因以反式来提供。由于pIX基因接近E1区，因而pIX基因导致在缺失型腺病毒载体和宿主基因组中的E1之间频繁重组。这种重组事件产生复制型腺病毒(RCA)，对于载体制备而言这是严重的污染。为了抑制这种重组事件，使pIX从腺病毒基因组缺失。在这些实验进程中，认识到pIX通过增加主要结构单元六邻体的相互作用而使腺病毒衣壳对热应激和空间应激稳定(Colby和Shenk，J.Virol.39，977-980(1981)；Ghosh-Choudhury等，EMBO J.6，1733-1739(1987))。在缺失pIX情况下的形态发生产生温度敏感型病毒，这种病毒不能递送大于野生型35938个碱基对的105％的基因组DNA分子。为了仍允许具有正常的包装能力和热稳定性，将pIX蛋白稳定导入计划作为腺病毒载体的包装细胞的细胞系(Krougliak和Graham，Hum.Gene Ther.6，1575-1586(1995)；WO 99/57296和Imler等，Gene Therapy 3，75-84(1996))。
随着认识到pIX修饰病毒粒子表面，业已产生pIX-融合蛋白，目的是扩大腺病毒载体的宿主范围，或了解病毒粒子的形态发生和细胞内迁移(由Parks综述，Mol.Ther.11，19-25(2005))。
尽管很明显pIX为结构蛋白，但也有提示pIX为腺病毒复制的调节蛋白。pIX作为转录的反式激活蛋白起作用，以增强E1A表达，这是一种甚至可能通过在感染步骤中从衣壳引入PIX蛋白而作为病毒因子发挥作用的功能(由Parks综述，Mol.Ther.11，19-25(2005))。还阐述了PIX连同早期蛋白E4Orf3与称作PML小体的亚核包含物相互作用(Puvion-Dutilleul等，Exp.Cell.Res.218，9-16(1995)；Leppard和Everett，J.Gen.Virol.80，997-1008(1999))。它们是250nm-500nm大小的动态聚合物，已提出其参与细胞分化的调节(Wang等，Science279，1547-1551(1998))、细胞凋亡的控制(Quignon等，Nature Gen.20，259-265(1998))和对病毒感染的反应(和Schmitz，Arch ImmunolTher Exp(Warsz)51，295-300(2003))。
因为PIX蛋白的多效性，我们将其导入到细胞系，以检查PIX是否增加细胞增殖或与腺病毒或腺病毒载体无关的生物药物制品的生产特性。普遍需要在已建立的细胞系中调节这些特性的因子。
举例而言，减毒(弱毒)病毒是有希望的疫苗候选者：接种时它们模拟天然感染，但需要更长时间使受接种者建立所期需的保护性免疫应答。随着无免疫应答患者(例如由于HIV感染)人数越来越多，高减毒株合乎需要。然而，减毒株仍然发生(通常为良性)感染，即使在缺乏功能性免疫系统时高减毒株在细胞水平也被封阻。建立和保持减毒的常用方法是在不同宿主组织中进行病毒传代。举例而言，意欲用于人类疫苗接种的麻疹病毒和腮腺炎病毒在原代细胞、在鸡胚或来自鸡胚的组织培养中传代。新一代疫苗基于也依靠原代鸡细胞生产的高减毒痘病毒。因此，能取代原代鸡细胞并且同时因二次操作(secondary manipulation)(例如将PIX转基因导入)甚至不太有效保护其本身抵抗病毒感染的细胞系可提供高度期需的基质。
为了其它目的可优选哺乳动物(而不是禽类)细胞系。这样的优选细胞系已经存在，并已通过了卫生当局关于由生物药物制品引起的安全性和风险的检查。此时，也非常期望能增加可利用的应用范围或生产效率而不危及安全性特征的二次操作(例如导入PIX转基因)。
发明概述
当制备业已被腺病毒基因pIX(或其嵌合融合类似物)稳定转染的细胞系时，我们出乎意料地观察到pIX在禽类细胞和人细胞中起表型作用。对于禽类细胞，这一点尤其令人意想不到，因为禽类细胞不能被不人腺病毒感染，而禽腺病毒(例如CELO或禽腺病毒8型)并不编码PIX同系物的(Ojkic和Nagy，J.Gen.Virol.81，1833-1837(2000))。此外，我们观察到，PIX的稳定存在增加了细胞对由双链RNA类似物诱导的易感性，其很可能是通过toll样受体3。可能由于这个原因，我们还出人意料地观察到：PIX蛋白的存在提高了高减毒痘病毒在禽类宿主细胞中的产量。由于痘病毒感染的细胞不太被双链RNA类似物诱导，因此我们可能发现了先前未曾阐述过的PIX蛋白和痘病毒抗干扰素基因之间的相互作用。我们还观察到稳定转染的细胞系所释放的蛋白质产物(不仅仅是病毒)的产量意想不到地提高了。
因此，本发明提供：
(1)用于制备非腺病毒靶病毒或一种或多种靶蛋白的方法，该方法包括：
(a)培养表达细胞，该表达细胞可通过用所述靶病毒、或携带编码所述靶病毒的核酸序列的载体、或携带编码所述一种或多种靶蛋白的核酸序列的载体感染或转染宿主细胞而得到，该表达细胞在其基因组中已经稳定整合了编码作为异源调节蛋白的腺病毒PIX或其功能变异体的基因，并稳定表达所述调节蛋白或其功能变异体(其中该非腺病毒靶病毒不含调节蛋白，且所述靶蛋白不同于所述调节蛋白或其功能变异体)，和
(b)分离所述靶病毒或靶蛋白；
(2)上述(1)的优选实施方案，其中所述PIX蛋白或其功能变异体与非同源病毒因子合作，调节除所述蛋白质之外的因子的亚细胞分布，调节转录和/或细胞生长，提高细胞生产不含所述调节蛋白的病毒和生产不同于所述调节蛋白或其功能变异体的蛋白质的生产率；
(3)上述(1)和(2)的优选实施方案，其中腺病毒pIX作为具有另一种蛋白的融合蛋白来提供，其中所述另一种蛋白调节或扩大腺病毒pIX的活性或亚细胞分布，例如腺病毒pIX与视黄酸受体α融合，优选为具有SEQ ID NO：4中所示序列的融合蛋白，或与GFP融合并含有NLS，优选为具有SEQ ID NO：23中所示序列的融合蛋白；
(4)上述(1)-(3)的优选实施方案，其中宿主和表达细胞为脊椎动物细胞，包括哺乳动物细胞和禽类细胞，优选哺乳动物细胞为来自人脑的细胞，禽类细胞为来自鸭视网膜的细胞或来自鸭体节的细胞；
(5)上述(1)-(4)的优选实施方案，其中宿主和表达细胞来自人脑，优选来自人胎脑，最优选为NC5T11细胞，并且所述细胞携带编码作为异源调节蛋白的腺病毒PIX或其功能变异体的核酸序列，优选所述异源调节蛋白由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22中所示的核酸编码；
(6)上述(5))的优选实施方案，其中宿主细胞为NC5T11#34细胞，表达细胞来自NC5T11#34细胞，所述NC5T11#34细胞保藏于DSMZ，保藏号为DSM ACC2744；
(7)上述(1)-(4)的优选实施方案，其中宿主和表达细胞为禽类细胞，优选来自鸭视网膜或鸭体节，所述细胞携带编码作为异源调节蛋白的腺病毒PIX或其功能变异体的核酸序列，优选所述异源调节蛋白由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22中所示的核酸编码；
(8)上述(7)的优选实施方案，其中宿主细胞为CR.PIX(17a11b)细胞，表达细胞来源于CR.PIX(17a11b)细胞，所述CR.PIX(17a11b)细胞保藏于DSMZ，登录号为DSM ACC2749；
(9)如上(1)-(8)中所定义的用于生产靶病毒或一种或多种靶蛋白的表达细胞，优选所述表达如上(5)-(8)中所定义；
(10)用于制备如上(9)中所定义的表达细胞的方法，该方法包括用病毒、或用携带编码所述病毒的核酸序列的载体、或用携带编码所述一种或多种靶蛋白的核酸序列的载体来感染或转染如上(1)-(8)中所定义的宿主细胞系；
(11)如上(5)-(8)中所定义的宿主细胞；
(12)用于制备上述(11)的宿主细胞的方法，该方法包括用携带所述调节蛋白或其功能变异体的载体来转染合适的起始细胞；
(13)如上(7)中所定义的表达细胞用于制备靶病毒或一种或多种靶蛋白的用途；
(14)融合蛋白，其包含至少一个包含调节蛋白的第一结构域和至少一个第二结构域，第二结构域包含如上(2)或(3)中所定义的作为转录调节物和/或作为亚细胞靶向的信号的蛋白质或肽；和
(15)编码如上(14)中所定义的融合蛋白的核苷酸序列。
附图简述
图1：细胞系NC5T11的历史。A：生长在无血清条件下的原代细胞的神经干细胞球(neurosphere)。B：生长在含5％FCS的DMEM/F12中的原代细胞单层。C：用p79转染后2周的原发灶。箭头表示原代细胞和无限增殖细胞之间的交界。D：在含5％FCS的DMEM/F12中的无限增殖化细胞的均一贴壁培养物。E：在振荡试管内EXcell VPRO中的NC5T11悬浮培养物。
图2：NC5T11中检测E1A和E1B的免疫荧光。在用甲醇固定后，分别用针对E1A和E1B 55k的大鼠抗体处理细胞，接着用缀合了得克萨斯红的抗大鼠抗体处理细胞。如图2中所示，样品中的所有细胞皆显示出典型的E1A核染色和E1B细胞质染色。在用甲醇固定后，分别用针对E1A和E1B 55k的大鼠抗体处理细胞，接着用缀合了得克萨斯红的抗大鼠抗体处理细胞。如此处所示，样品中的所有细胞皆显示出典型的E1A核染色和E1B细胞质染色。
图3：所选aat克隆的比产出率。在12孔板中以7×104个细胞接种用C55转染并用嘌呤霉素(puromycin)选择的NC5T11细胞克隆，在接种后第1天、第2天和第3天测定细胞数目和aat滴度，计算每日最大细胞比产出率。
图4：NC5T11puro#8在分批振荡培养物中的表达分析。在50ml聚丙烯振荡管(TPP，Switzerland)中将细胞以6×104个细胞/ml接种于12ml的EXCELL VPRO，使其以1cm半径和160rpm速度旋转。在第4天、第7天、第9天、第11天、第15天、第18天和第21天取200μl样品。用锥虫蓝染色后用血细胞计数器测定细胞密度和存活率。
图5：在克隆混合物中通过PCR检测pIX-RARA cDNA。通过用F67转染和潮霉素(hygromycin)选择，从NC5T11puro#8产生携带pIXRARA基因的克隆混合物。用RNA提取试剂盒(Machery Nagel，Germany)提取RNA，用AMV逆转录酶(Invitrogen)合成cDNA。分别用引物1和1和164扩增单独的pIX片段的cDNA或全pIXRARA基因。
图6：通过PCR在NC5T11puro#8和NC5T11的潮霉素抗性亚克隆(#34、35、36、37、38)中检测作为融合蛋白一部分的pIX序列。通过SDS裂解接着用苯酚提取和沉淀，从6孔板中生长的细胞克隆中分离DNA。用引物1和2经28个循环扩增DNA。
图7：测定相对于E1B而言pIXRARA和pIX基因在稳定转染的NC5T11中的稳定性：E1A+E1B和pIXRARA在分开的转染和E1基因中导入，并在无选择的情况下保持超过2年，因此，被认为是稳定整合。在2个时间点从所选择的细胞克隆分离基因组DNA：在hyg选择停止后立即(早期)；在无选择压力下2个月后(晚期)。同时实时PCR测定PIX和E1B DNA水平。
图8：在NC5T11和NC5T11puro#8的pIXRARA重组克隆中通过RA处理诱导的生长阻滞。在存在或不存在6μg/ml视黄酸(retinoic acid)时以2×105在6孔板接种细胞。在接种后4天以4×放大率用相衬成像摄取到在经RA处理的克隆#12和#34中显示出生长阻滞但在NC5T11中未显示出生长阻滞的照片。
图9：PIXRARA防止干扰素对病毒复制的抑制。用EMCV这种干扰素敏感型病毒，在经β干扰素处理的细胞中以0.004的MOI感染NC5T11和NC5T11#34细胞。通过在A549细胞上形成蚀斑来进行细胞裂解物的滴度测定。
图10：表达来自载体C55的α-1-抗胰蛋白酶的细胞系NC5T11puro#8和其亚克隆#10、#12、#14的表达分析，所述亚克隆除携带C55之外，还携带载体F67(pEFpIX-RARA)。在50ml聚丙烯振荡管(TPP，Switzerland)中以6×104个细胞/ml将细胞接种于EXCELLVPRO(JRH Biosciences)中，总体积为12ml，使其以1cm半径和160rpm速度旋转。
图11：鸭视网膜CR细胞中PIX的表达。左图：在pIX细胞的基因组DNA中针对PIX基因的PCR反应。凝胶上样从左到右：1kb-标记(Invitrogen)；来自CRpIX的基因组DNA的PCR；非模板对照；CRpIX转染所用的质粒的阳性对照。右图：用于在CRpIX细胞中检测pIX蛋白的蛋白质印迹。第1道：293细胞；第2道：CRpIX细胞中的pIX蛋白。
图12：鸭视网膜细胞中PIX转基因的稳定保持。左上图：MCX和DXS为平行培养超过3个月并且未经选择的CRpIX克隆的独立等份样。3个月后，用TaqMan PCR计数MCX和DXS中E1B和PIX转基因的拷贝量。由于E1B转基因独立于PIX而保持，所以这两种基因的比率指示PIX转基因的保持情况。在MCX和DXS之间该比率不变。此外，PIX mRNA与E1B mRNA之比也未改变，PIX mRNA超过E1BmRNA则表示PIX表达。右图：在有或无潮霉素选择压力下培养MCX和亲代(PIX阴性)CR.HS细胞2周(在x轴上用黑条表示)。在各个时间点分离基因组DNA(由“A”、“B”和“C”表示)，进行TaqMan定量(左下)。MCX细胞存活，而亲代细胞被潮霉素杀灭。转基因的比率保持不变，再次表明PIX转基因在存在选择压力下也稳定保持。亲代细胞的倍增时间大约为32小时，但MCX细胞的倍增时间仅为41小时。
图13：PIX对CS细胞中MVA复制的影响。用MVA感染CS和CSpIX细胞，分析感染后48h和72h的MVA复制。在PIX阳性CS细胞中MVA产量显著更高。在相衬显微图像中，也很明显CSpIX细胞在48h的细胞病变效应似乎延迟了。然而，在感染后72h，两种培养物都对病毒易感，其程度相似，因为明显完全裂解。
图14：PIX对CR细胞中MVA复制的影响。用各种感染复数以各种细胞密度感染悬液中的CR和CRpIX细胞。感染后48h分析MVA产量，该产量在y轴上表示。泡的大小显示接种细胞密度。实心泡表示CRpIX细胞的值，空心泡表示亲代细胞的值。在所有构形中，PIX都使得MVA的扩增率明显增加。
图15：PIX-GFP在鸭细胞中的亚细胞分布。GFP标记的PIX以少数细胞质亮点和弥漫性细胞质染色出现，主要排除了细胞核。其它克隆表现出更强的弥漫性细胞质染色和正好在细胞核外的更强烈的积聚。
图16：PIX-GFP变异体在CHO细胞中的亚细胞分布。为了研究细胞内PIX分布的诱导变化，制备了融合变异体，包括插入核定位位点(NLS)和与视黄酸受体α融合，视黄酸受体α是一种已经含有NLS的胞内蛋白。显示了用PIX-GFP变异体表达质粒瞬时转染的CHO细胞。
图17：在PIX存在下干扰素诱导的作用。用poly I:poly C(已知的I型干扰素应答的诱导物)处理CSpIX和CRpIX细胞并与亲代细胞比较。与CS细胞相比，CSpIX细胞与poly I:poly C的反应更敏感。CRpIX和CR细胞的反应相当，和CS细胞比较它们的反应程度较低。
图18：在PIX-GFP存在下MVA感染和干扰素诱导的作用。CSp9GFP和CRp9GFP细胞用poly I:poly C处理，用MVA按照指示以0.1的M.O.I.感染。CS来源的细胞再次对干扰素诱导的反应更强烈。出人意料的是，在这两个细胞系中诱导或感染后，亮PIX体的数目似乎减少了，然而，PIX-GFP的总信号强度增加了。此外，在处理后22h仍有更多数量的CS细胞贴壁，这表明用MVA平行感染后poly I:polyC诱导的作用得到改善。
发明详述
本发明实施方案(1)的方法使用表达细胞，该细胞在其基因组中整合了编码异源调节蛋白(即pIX或其功能变异体)的基因。所述调节蛋白具有以下特性：
1.其调节转录，尤其是若与合适调节物(modulator或regulator)连接，则其还影响细胞生长。
2.其提高该细胞生产不含所述调节蛋白的病毒(即该调节蛋白不是该病毒所缺失蛋白的替代物)和/或生产不同于所述调节蛋白或其功能变异体的蛋白的生产率。
根据本发明，异源调节蛋白为腺病毒血清型5的pIX蛋白(例如具有SEQ ID NO：2中所示aa序列的蛋白)、其突变异体(包括添加、置换和/或缺失突变异体)、其变异体(例如自不同血清型腺病毒获得的变异体)等等。
本发明的“异源调节蛋白的功能变异体”包括来自血清型5以外的腺病毒的同源物、相应野生型调节蛋白的特定氨基酸残基的所有突变型(添加、置换和/或缺失)、通过融合其它活性蛋白或肽序列的修饰物等等。尤其优选融合蛋白，即包含至少一个包含如前所述的调节蛋白的第一结构域和至少一个包含起转录调节物作用的蛋白或肽的第二结构域的融合蛋白。在本发明的优选实施方案中，所述转录调节物为包括视黄酸受体α在内的转录因子，其可以完全或不完全(即截短的)的形式存在。调节物还可是转运肽，其包括NLF序列，例如示于SEQ ID NO：21中的序列。本发明的第一和第二结构域彼此直接连接，或通过肽接头彼此共价连接。合适的肽接头包括柔性和亲水结构，例如多聚gly-ser。
以下详细描述中所用的术语“细胞”和“细胞系”指表达细胞/表达细胞系和宿主细胞/宿主细胞系。
按照本发明，优选异源调节蛋白或其功能变异体在细胞中以至少1pg/μg胞内蛋白的量、优选以至少10pg/μg胞内蛋白的量表达，以使其表达可通过蛋白质印迹分析来测定。
在本发明细胞中，异源调节蛋白或其功能变异体优选在稳定的同源或异源启动子控制下。合适的启动子为组成型细胞启动子或其变异体，例如人易位延伸因子2启动子。在本发明内所用的人易位延伸因子2启动子的特定变异体具有示于SEQ ID NO：12中的序列。所示序列代表位于人染色体19：3,935,325-3,936,638的启动子的“短”形式(human genome assembly 2004年5月)，其提供稳定的中等水平表达。对于更强的表达，可使用位于染色体19：3,935,349-3,938,957的启动子的“更长”形式(human genome assembly May 2004)。
按照本发明，所述细胞为脊椎动物细胞，包括哺乳动物细胞、禽类细胞等。合适的哺乳动物细胞为人细胞和啮齿动物细胞，包括小鼠、大鼠、仓鼠等。尤其优选的本发明哺乳动物细胞为来源于人脑尤其是人胎脑的细胞、小鼠NSO或Sp2/0细胞、BHk或CHO细胞。合适的禽类细胞为鸭、鸡、鹌鹑和鹅的细胞。尤其优选的本发明禽类细胞为来源于鸭视网膜细胞或体节细胞的细胞。
另一方面，本发明的细胞可来源于原代细胞或来源于以前的无限增殖化细胞。此外，细胞可进一步携带无限增殖化(病毒)基因，包括腺病毒的E1蛋白，例如哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)C组5型的E1蛋白等等。本发明尤其优选的细胞为进一步携带SEQ ID NO：5中所示的腺病毒E1A和/或E1B基因的细胞。
在本发明实施方案(1)的方法中使用的细胞可进一步携带功能序列，例如其用作表达细胞所需的序列，例如选择标记序列、剪接供体/受体位点和/或使得待表达的靶核酸序列可以整合入细胞中的重组酶识别序列。
在本发明实施方案(1)、(10)和(12)的方法中实现的“感染”、“转染”和“转化”，可根据技术人员已知的标准程序来实施。若需要，所述方法可进一步包括合适的选择、分离和扩增步骤。
在实施方案(1)的方法中，靶病毒包括来自野生型、突变型或缺失型病毒、冷适应病毒或减毒病毒、疫苗株、携带异源基因的病毒载体、诸如慢病毒、痘病毒、腺伴随病毒(aav)、疱疹病毒、黄病毒等病毒载体。
另外，在实施方案(1)的方法中，所述一种或多种靶蛋白包括抗体、重组蛋白(例如促红细胞生成素、α-1-抗胰蛋白酶、凝血因子VIII和IX和干扰素)、病毒抗原(例如流感HA和NA和M、HBV-S、疱疹病毒G蛋白和狂犬病毒G蛋白)、肽激素等等。尽管所述方法允许生产能同时表达不止一种靶蛋白的细胞，但尤其优选其仅编码一种靶蛋白。
本发明实施方案(1)方法中的培养和分离可根据技术人员易于得到的标准方法来实施。所述方法可进一步包括靶病毒或靶蛋白的标准纯化步骤以及随后的修饰步骤。
关于实施方案(9)和(11)各自的表达和宿主细胞系的优选实施方案，以及实施方案(10)和(12)中所述细胞系的生产方法的优选实施方案，可参考上文所提供的与实施方案(1)有关的详细论述。
根据实施方案(14)和(15)，本发明分别提供融合蛋白和编码所述融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白包含至少一个包含调节蛋白的第一结构域，和至少一个包含如上文中所定义的起转录调节物作用的蛋白或肽的第二结构域。本发明还分别涉及所述实施方案(14)和(15)的融合蛋白(例如在诊断和制药应用等中)和编码其的核苷酸序列，在例如所有类型的载体构建体、细胞系、组织培养、转基因动物等中的应用。
细胞系NC5T11#34于2005年11月4日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(the DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)，保藏号为DSM ACC2744。细胞系CR.PIX(17a11b)于2005年11月24日保藏号为DSM ACC2749保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(the DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany)。
借助以下实施例将更详细地说明本发明，然而，这些实施例不能解释为限制本发明。
实施例
实施例1：细胞系NC5T11的开发
该细胞系由胎脑细胞混合物通过用腺病毒5E1A和B基因经非病毒转染进行无限增殖化发展而来。
由人工流产后的胎儿脑室周区采集组织样品。用剪刀剪碎，在基于含有20ng/ml hFGF(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008，USA)、20ng/mlhEGF(Invitrogen)、1×N2补充物(Invitrogen)和8μg/ml肝素(SigmaAldrich，St.Louis，USA)的DEMEM/F12的神经细胞培养基中，用组织培养吸管通过吹打匀浆。以200g离心3分钟来沉降细胞。用锥虫蓝和碘化丙啶(propidium jodide)并用流式细胞计数器(BD Biosciences，Jose，CA 95131，USA)来评估细胞的存活率。该存活率为75％。将0.5×106个细胞接种到T25细胞瓶中。细胞在37℃和5％CO2中孵育。在培养的第5天细胞形成神经干细胞球。神经干细胞球示于图1A中。在第8天将细胞转移到补充5％FCS的DMEM/F12中，以使其贴壁并刺激增殖。细胞形成均一单层，如图1B中所示，每周以1∶5传代一次。将该原代神经细胞培养物命名为NC5。
2周后，按照制造商说明在分会合6孔板中用Effectene(Qiagen，40724Hilden，Germany)作为转染试剂，在含血清培养基中用载体p79转染细胞。质粒p79含有以下元件：pBluescript(Stratagene，USA)作为质粒骨架，其中氨苄青霉素(ampicillin)抗性标记被由细菌启动子驱动的卡那霉素(kanamycin)抗性基因取代，使得可在大肠杆菌(E.coli)中生长和选择。载体包含来自野生型腺病毒5型的片段(SEQ ID NO：5)，其含有E1A(分别含或不含CR3结构域的剪接变异体13S和12S)和E1B55k和19k的可读框以及E1A上游的序列。磷酸甘油酸激酶启动子(小鼠)位于E1A基因之前。腺病毒序列之后接来自单纯疱疹(Herpessimplex)胸苷激酶基因的聚腺苷酸化信号，其取代E1B的聚腺苷酸化信号。从相应的生物体或从供体质粒通过PCR获得元件，用常规重组DNA技术克隆，通过序列分析进行验证。转染2天后用胰蛋白酶处理细胞，并转移到10cm的培养皿中。2周以后，在转染细胞中形成具有高核/质比和清晰可辨边界的小细胞灶(图1C)，但在经模拟处理的细胞中没有此细胞灶。从第11次转染(the 11th transfection)开始，用胰蛋白酶和克隆缸(cloning cylinders)(Corning，USA)分离出8个独立的细胞灶，将其接种到24孔板的孔中，经12孔板、6孔板到T25培养瓶进行扩大培养。所有分离的细胞灶皆含有两类细胞：具有明显边界的小细胞和伸长的成纤维细胞样细胞。
在转染后3周，在转染T11中肉眼可见15个另外的克隆，它们中的某些可能起源于已经分离的原代克隆的残留细胞。
克隆T11a.1和T11a.6显示出最快速的生长，在转染后8周低温保存在DMEM/F12、10％DMSO、25％血清中。这时所有克隆仍然含有一部分具有类似原代表型的增大的细胞质的细胞。然而，T11a.1和T11a.6用1∶5的分传比时过度生长，在转染后大约3个月被消除了。实施免疫荧光实验以使形态改变与E1A和E1B的表达相联系。在用甲醇固定后，用分别针对E1A和E1B 55k的大鼠抗体处理细胞，接着用得克萨斯红缀合抗大鼠抗体处理细胞。如图2中所示，样品中的所有细胞都显示出典型的E1A细胞核染色，E1B细胞质染色。
转染后3个月，在胰蛋白酶处理后通过接种1.6×106个细胞将克隆T11a.1和T11a.6转移到无血清培养基ProPER(Cambrex，Belgium)。通过离心收获细胞，每周一次通过离心更换培养基。细胞群存活下来，但即使在转染后6个月，细胞仍表现出存活率低，以60-80小时的高培增时间来生长。
当在ProPER培养基中3个月后将细胞转移回含5％FCS的DMEM/F12中时，两个克隆都形成了倍增时间为40小时的均一和高活力的培养物。选择T11a.1作为更为有活力的细胞克隆用于进一步的实验，命名为NC5T11(图1D)。
实施例2：NC5T11puro克隆#8的建立
细胞系中的蛋白生产取决于有效转染和选择方法。尚不知晓常用的选择标记G418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素(blasticidin)、MTX、组胺醇(histidinol)对于NC5T11的适合性。在第一个评估步骤中，按照制造商说明试验不同市购转染试剂Lipofectamine(Invitrogene)、Fugene(Roche，Germany)、Polyfect(Qiagen)和Effectene。用表达来自人CMV启动子的gfp的质粒pEGFP-N1(Clonetech，USA)来测定瞬时转染效率。用Effectene(Qiagen)得到最高转染效率，当用于生长于DMEM/F1210％FCS中的贴壁细胞时视细胞密度转染效率可达到20-50％。
为了测试选择标记基因，构建了含有人α-1-抗胰蛋白酶(aat)基因的表达载体，所述基因在人CMV启动子控制下，后接牛生长激素PolyA信号和由弱启动子控制的各个选择标记。更具体而言，为了测试嘌呤霉素选择，用载体C55，其含有由人PGK启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因，后接SV40早期聚腺苷酸化信号。
转染后，将细胞接种于含有0.75μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F125％FCS，每周更换一次培养基，进行3周的选择。得到克隆混合物，用山羊多克隆抗α-1-抗胰蛋白酶抗体(Innogenetics，USA)，然后用生物素标记的第二兔抗山羊抗体和链霉抗生物素-得克萨斯红缀合物，通过免疫荧光来验证表达。
为分离单个细胞克隆，将克隆混合物的10000个细胞接种于15cm培养皿中。4周后用克隆缸(Corning)分离克隆，分析#1、2、7、8、9、10号克隆的aat表达。更具体而言，将细胞以7×104个细胞接种到12孔板，测定细胞数目和aat表达。计算的细胞比产出率示于图3中。克隆NC5T11puro#8显示出比产出率高于100pg/细胞●天，被选择用于进一步开发。
实施例3：将NC5T11和NC5T11puro#8转移到生产培养基和在分批 振荡培养物中的表达分析
与含血清培养基比较，在ProPER培养基(Cambrex)中NC5T11和NC5T11puro#8二者的生长率大约降低至1/2。因此，测试Xcell VPRO(JRH Biosciences)作为替代品。通过直接在T25培养瓶中的5ml EXcellVPRO中接种4.5×106个细胞来进行适应。在2周后细胞重新开始生长，确定每周一次分传比为1∶3。在下一步骤中让两个克隆适应在存在剪应力下的生长。在50ml聚丙烯振荡管(TPP，Switzerland)中将细胞以6×104个细胞/ml接种于12ml的EXCELL VPRO中，使其以1cm半径和160rpm速度旋转。在重复传代后，进行批料分析，以测定指数生长期和稳定生长期的最高细胞密度和产物积聚。观察到以下情况：克隆NC511puro表现出高存活率，一直到第18天存活率保持在70％以上。最高细胞密度不超过1×106。在稳定期期间继续积聚产物(图5)。由此得出结论：需要开发特定的培养基或进一步改进细胞，以达到与从CHO细胞所得到的细胞密度相当的高细胞密度。这将很可能导致产物滴度大幅度增长。
实施例4：融合蛋白pIX-RARA和用于pIX-RARA与pIX二者的整 合载体的构建
分别用以下引物通过PCR从腺病毒5型和人基因组DNA得到腺病毒PIX序列和视黄酸受体α(RARA)序列
1.AACCAGCGCTACCATGAGCACCAACTCGT(SEQ ID NO：6)
2.AATGGTGGCAACCGCATTGGGAGGGGAGG(SEQ ID NO：7)用于PIX；和
3.CCAATGCGGTTGCCACCATTGAGACCCAGA(SEQ ID NO：8)
4.AAGGAGCGCTGGCGAGGGCTGTGTCCAT(SEQ ID NO：9)用于RARA。
分别扩增两个片段。引物2和3之间的重叠使得用引物3和4通过PCR可连接两个片段。将融合基因克隆到载体pEFpromhyg，得到pEFpIXRARA。该载体含有位于chr19：3,935,325-3,936,638的人延伸因子2启动子(human genome assembly May 2004；SEQ ID NO：12)。其含有上游元件和EF2基因的第一个内含子。通过诱变除去了位于第一个内含子5’的EF2的天然起始密码子。在pEFpromhyg载体中，EF2序列后接用于插入pIX-RARA的独特的限制性位点(AfeI)。AF1位点后的内部核糖体结合位点使得潮霉素抗性基因在所述连接的RNA中作为第二可读框与pIX-RARA一起表达。该构型支持pIX-RARA在所有潮霉素抗性细胞中的表达。
用引物AACCAGCGCTACCATGAGCACCAACTCGT(SEQ IDNO：10)和ACCGAGCGCTTGTTTTAAACCGCATTGG(SEQ ID NO：11)扩增wt pIX基因，将其整合到pEFpromhyg的Afe位点代替pIX-RARA，得到pEFpIX。
实施例5：含有PIX基因和PIX-视黄酸受体融合蛋白的细胞系 NC5T11和NC5T11puro#8的修饰
制备细胞克隆NC5T11和NC5T11puro#8，用于通过将细胞在DMEM/F12，5％FCS中以1.3×106个细胞/孔接种，在6-孔板中进行转染。用限制性酶Asp700(Roche)将质粒F67(pEFpIXRARA)和质粒F76(pEFpIX)线性化，在乙醇沉淀后用Effectene(Qiagen)转染：使DNA与16μl Enhancer(增强剂)和200μl EC缓冲液混合。在室温2分钟后，加入18μl Effectene，室温10分钟形成脂质体。将转染混合物加入到于前一天在6孔板中接种至80％会合的细胞上，至培养物体积为1ml。通过pEGFP-N1(Clontech，Palo Alto，CA 94303-4230，USA)的平行转染确证了高转染效率。转染后一天将培养基更换为含10％FCS的DMEM/F12，并加入75或100μg/ml(NC5T11)和50μg/ml(NC5T11puro#8)潮霉素。每周更换2次选择培养基。在18天后，每孔中可见15-20个清晰的克隆。用胰蛋白酶处理克隆混合物，再继续选择2周。通过RTPCR测试克隆混合物的PIXRARA表达。在大部分克隆混合物中，用引物1和2检测到强信号，用引物1和4检测到弱信号。为了分离单个的细胞克隆，将克隆混合物的10000个和1000个细胞接种到15cm培养皿中。4周后用克隆缸(Corning)分离克隆。对于来自F76转染的克隆，应用不同的策略。用胰蛋白酶处理克隆混合物，转移到50ml振荡管内含有75μg/ml潮霉素的EXCELL VPRO中，悬浮培养2周后，将2000个活细胞与12ml克隆矩阵(Genetix，UK)混合，接种到6孔板(Greiner)(2ml/孔)，进行自动克隆挑选(clonepixFL，Genetics，UK)。将来源于NC5T11puro#8的克隆标记为#10-21。将来源于NC5T11的克隆标记为#34-45。将用pEF2PIX转染的克隆命名为NC5T11PIXA-NC5T11PIXE。通过PCR测试克隆是否存在各自载体。图6提供了用引物1和2的初始测试。将所有显示阳性信号的克隆转为在EXCELL VPRO中生长。通过直接在T25培养瓶内的5ml EXCELL VPRO中接种4.5×106个细胞来重新适应。6周后，将稳定期培养物细胞以转移到50ml聚丙烯振荡管(TPP，Switzerland)内的EXCELL VPRO中，接种密度为6×104个细胞/ml，且总体积为12ml，使其经受1cm半径和160rpm速度的旋转。克隆#10、#12、#14(NC5T11puro#8pIXRARA)和#34、#43(NC5T11pIXRARA)和NC5T11PIXB、NC5T11PIXC因其在剪应力下有最高存活率而被选中。对克隆#34、43和NC5T11PIXC重新克隆，分析所整合DNA的稳定性。测定PIX和E1B之间的基因比率来评估稳定性，因为E1A+E1B和pIXRARA在分开的转染和E1基因中被导入，并且在缺乏选择的情况下保持超过2年，因此，被认为是稳定整合。在以下2个时间点从所选择的细胞克隆分离基因组DNA：在hyg选择停止后立即(早)进行；在无选择压力下2个月后(晚)进行。以2种DNA浓度通过实时PCR(ABI 7000，CYBR Green)测定PIX和E1B的DNA水平。该评估实例示于图7中。载体pEF2PIXRARA以每E1B大约0.4-0.6个PIXRARA拷贝稳定保持在#34和#43亚克隆中。克隆NC5T11PIXC最初含有每E1B 4个拷贝。在本实验过程中该数目降低至1/2。
实施例6：NC5T11pIX-RARA的视黄酸依赖性生长
视黄酸(RA)为细胞分化的诱导剂。分化通常与细胞生长降低相关。对RA的应答有赖于视黄酸受体α这种由RA激活的转录因子的表达。RA对PML(早幼粒细胞白血病)具有深远的影响，其通过生长阻滞转化的表型回复。
如图8所示，6μg/ml浓度的RA处理对NC5T11或α-1-抗胰蛋白酶表达克隆NC5T11puro#8的生长没有任何影响。然而，通过用6μg/ml RA对含5％FCS的DMEM/F12中的贴壁培养物处理5天，可阻滞克隆#14(NC5T11puro#8pIXRARA)和#34(NC5T11pIXRARA)的生长。
实施例7：PIXRARA防止干扰素对病毒复制的抑制
将NC5T11和NC5T11#34细胞以8.0×105个细胞/孔接种到6孔板内的DMEM/F 125％FCS中。12h后以1和8IU/ml的浓度向各孔中加入干扰素β(Serono的rebif 44)。30分钟后，用脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)以0.004的感染复数(MOI)感染NC5T11和NC5T11#34两者的经干扰素处理的细胞和对照细胞。24h后，收获培养物，在-80℃冷冻以使细胞破裂。将该悬液解冻，并通过800×g离心10分钟来澄清。通过在A549细胞上的蚀斑分析来进行细胞裂解物的病毒滴度测定：简言之，将A549细胞接种到24孔板，培养达到会合，与稀释到2×108倍的澄清裂解液一起孵育30分钟，用存于RPMI 10％FCS中的0.2％的低熔点琼脂糖VII型覆盖，在37℃孵育24h。吸出琼脂糖层，细胞在20℃用存于PBS的2％戊二醛固定20分钟，用水洗涤，在室温用存于50％乙醇的1％Kristallviolett液孵育30分钟以计数病毒蚀斑。示于图9的结果证明：NC5T11细胞中的EMCV复制效率相当低，其对感染前的干扰素处理高度敏感。在8IU/ml下，从该培养物未能回收活病毒。与此相反，NC5T11#34中的病毒复制仅略微受干扰素处理的影响。此外，即使在缺乏外源IFN时，对于NC5T11#34也可观察到较高滴度。所显示的现象模拟典型的疫苗作用过程，因为很多疫苗株在具完整IFN途径的生产细胞中诱导IFN应答，以生产过程中优选的低感染复数(MOI)的感染可导致IFN分泌，进而导致阻断最初未受感染的细胞的病毒复制。因此，PIX表达可允许以低MOI开始进行病毒高滴度生产。
实施例8：pIX-RARA对蛋白生产的刺激
用摇瓶批料测定，将携带载体F67以及α-1-抗胰蛋白酶的NC5T11puro#8pIXRARA与起始克隆NC5T11puro#8进行比较，比较其产α-1-抗胰蛋白酶的能力。在50ml聚丙烯振荡管(TPP，Switzerland)中以6×104个细胞/ml将细胞接种于EXCELL VPRO(JRH Biosciences)中，总体积为12ml，使其以1cm半径和160rpm速度旋转。继续培养直到第22天。除了悬浮细胞外，还形成粘附在管壁上的细胞群环。在整个过程中这些群中的细胞保持坑于70％的存活率。因为未能成功地用胰蛋白酶或Acutase(PAA)使这些群脱离管壁，所以没有测定生长动力学和最高细胞密度。在第9、13和22天采集样品，用α-1-抗胰蛋白酶ELISA测定滴度。结果示于图10。
实施例9：表达pIX的鸭视网膜细胞的产生
在别处(专利申请说明书WO05042728，转染了质粒60E的视网膜细胞)阐述了来源于原代鸭视网膜细胞并按照规定的风险指南无限增殖化的细胞系CR。将该细胞在39℃和7.5％CO2中培养在补充5％胎牛血清(Biochrom AG，12213 Berlin，Germany)的DMEM:F12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA 92008，USA)中。为了传代，用TrypLE Express(Invitrogen)短暂处理细胞。用Ssp I和Xmn I限制性酶(二者皆来自NewEngland Biolabs，Beverly，MA 01915-5599，USA)使质粒76F pEFPIX1线性化，通过亲和色谱法(来自Qiagen的凝胶提取试剂盒，40724Hilden，Germany)纯化为400ng/μl。用Effectene试剂(Qiagen)使5μl(2μg)纯化的DNA转染到CR细胞内：使DNA与16μl Enhancer(增强剂)和200μl EC缓冲液混合。室温2分钟后，加入18μl Effectene，室温10分钟让其形成脂质体。将转染混合物加入到6孔板中在前一天接种至80％会合的细胞上，至培养物体积达1ml。用pEGFP-N1(Clontech，PaloAlto，CA 94303-4230，USA)平行转染确证了高转染效率。
转染后3天将pIX转染培养物在T75培养瓶中扩大培养，用25μg/ml潮霉素B(Invitrogen)开始选择。每周换一次培养基，且将潮霉素B提升到50μg/ml。3周后，总计四个大转化灶存活，将其重新接种到T25培养瓶中：用TrypLE分离细胞，以100×g离心10分钟，重新悬浮于新鲜培养基中，铺种到T25培养瓶中。
转染后4周，用TrypLE将来自T25培养瓶中的健康亚会合培养物的细胞分离到5ml DMEM:F12，5％FCS中。使其中2ml与培养基#63032-1000M(JRH Biosciences，KS 66215，USA)混合，这是一种意欲用于维持悬浮培养物的不含动物来源成分的培养基。加入潮霉素B达到50μg/ml。从2ml培养物分离基因组DNA，用引物V293和V294实施针对pIX转基因的PCR。由不含DNA的平行反应提供阴性对照，阳性对照由含质粒76F的平行反应提供。图11中的所预期的PCR产物(左图)证明pIX转基因稳定插入到CR细胞，该细胞现在称作“CRpIX”。
通过蛋白质印迹分析来确证PIX蛋白的表达：通过在(20mM TrispH 7.4，300mM NaCl，1％脱氧胆酸钠，1％Triton
Figure S2006800506905D00221
X-100，0.1％SDS)中煮沸来破碎6×105个细胞，通过凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到尼龙膜。PIX用pIX第一抗体(由W.Seidel博士惠赠，Ernst-Moritz-Arndt-
Figure S2006800506905D00222
Greifswald，Germany)检测，然后与针对前述抗体并用碱性磷酸酶标记的第二抗体反应。
图11中预期大小的信号(右图)确证了pIX在CRpIX细胞中表达。在来自平行反应中制备的293细胞的阴性对照中不存在信号。
细胞在培养基#63032-1000M中再传代2次，然后转移到培养基#14561-1000M(也来自JRH Biosciences)中再传代2次。所有JRH培养基都补充1×Glutamax I(Invitrogen)和100μg/ml潮霉素B。
对于在培养基#14561-1000M中的第二次传代，将小部分(大约5ml悬浮培养物的2％)完全重新悬浮到DMEM:F12，FCS培养基中，铺种到15cm直径的培养皿。6天后，将11个转化灶转移到12孔板的单个孔中，保持在DMEM:F12，FCS培养基中。对于克隆转移，吸出培养基，用TrypLE浸泡克隆盘(Sigma，MO，USA)，将其简单地直接应用于克隆，然后转移到填充有培养基的孔中。将单个克隆扩大用于进一步实验和测定生长特性。
为了分析PIX在稳定转染的细胞中的保持，用QIAamp DNA血液试剂盒(QIAamp DNA Blood kit，Qiagen)从1×106个细胞分离基因组DNA，用ABI 7000TaqMan反应与SYBR Green(ABI)检测化学，测定25ng和50ng基因组DNA中的E1B和PIX分子数目。用于定量测定的引物对于E1B为gTggTTgCTTCATgCTAgTg(SEQ ID NO：13)和TCTTCAgCAggTgACAgTTg(SEQ ID NO：14)，对于PIX为ACCTACgAgACCgTgTCTg(SEQ ID NO：15)和gAgCCgTCAACTTgTCATC(SEQ ID NO：16)。由于E1B独立导入，必须保留以使细胞存活，故该基因用作内部标记，以使PIX拷贝数量和基因表达强度标准化。
图12证明即使在缺乏选择压力时PIX转基因在CR悬浮细胞中仍稳定保持。该图还证明PIX阳性细胞的生长率降低。我们始终观察到：当用PIX表达质粒稳定转染时，我们的所有细胞(禽类和人细胞)的增殖皆降低，这证明了PIX对宿主细胞生物化学有影响。此外，我们在PIX阳性的贴壁CR细胞中观察到避免生长为会合层(接触抑制增加)的趋向。
实施例10：表达pIX的鸭体节细胞的产生
细胞系CS来源于胚体节，这在专利申请WO05042728中也有阐述。PIX阳性CS细胞的产生可用关于上述CR细胞系所述的类似方法来实施。与CRpIX相反，对于CSpIX不建立悬浮培养物。严格的贴壁属性是CS细胞的特征。在悬液中不增殖的细胞可被认为具有较低的致瘤性，因为转移的潜力受到严重削弱。PIX蛋白并不改变CS细胞的这种特性。因此，尽管该蛋白多效，但似乎其不影响转化表型。这一观察结果支持我们关于PIX可安全地用于生物制药方法的设想。
实施例11：PIX对CS细胞中MVA复制的影响
将稳定转染用于PIX表达的CS细胞和作为参照物的亲代CS细胞以2×106个细胞/孔接种到6孔板，第二天用MVA以0.1的m.o.i.感染。感染后48h和72h拍摄了证明CPE进展有差异的照片。在微转化灶测定(microfocus assay)中，测定感染后48h上清液中病毒的产量和感染后72h的全部产量(上清液和裂解的细胞沉淀)。结果示于图13：当与亲代参照物比较时，CS细胞中PIX的存在似乎延迟感染后48h CPE的发作。感染后72h，两种培养物都完全裂解，提示CPE程度的差异并非由CS.PIX群体中MVA不应细胞和MVA易感细胞的混合物造成。
就我们所知，尚未进行过PIX阳性细胞对除同源腺病毒以外的病毒的试验。
实施例12：PIX对CR细胞中MVA复制的影响
也定量分析了PIX蛋白对CR细胞的积极影响。与CS细胞相反，CR细胞适合悬液。对于很多工业应用优选悬浮培养物。因此，我们测定PIX在与贴壁培养相反的这样的系统中的作用。
对于CR细胞，PIX的支持作用并不如在CS细胞中的明显，但我们始终观察到较高的MVA滴度。在一系列的实验中使MVA产量优化，发现以中等细胞密度在感染后48h时最大。图14显示了悬浮克隆CR.HS(从几个克隆中选定为具最大MVA产量的细胞系)和PIX(+)细胞系CR.MCX的比较。横坐标表示m.o.i.(分别为0.01、0.05或0.1)，纵坐标表示裂解量(burst)，泡的大小表示细胞密度(分别为8、2或0.8×106个细胞/ml)。裂解量为输出病毒(或产量)与输入病毒(随细胞数量和m.o.i.而定的接种物)的比率，因此是对扩增效率的度量。在所有构型中，PIX(+)细胞系的性能都超过PIX(-)细胞系。
实施例13：PIX的细胞核排除
产生PIX-GFP融合基因以显现PIX蛋白在活细胞中的分布，并克服可利用的抗体结合活性弱的缺陷：用Acc I und Dra I限制性酶处理质粒76F pEFPIX1，用Klenow聚合酶使末端平端化(所有酶皆来自New England Biolabs，Beverly，MA 01915-5599，USA)。在复杂的带型中，通过琼脂糖凝胶提取(来自Qiagen的凝胶提取试剂盒，40724Hilden，Germany)分离所期需的含有PIX编码序列的447bp片段。Dra I限制性酶识别序列“ttTAAa”，在最后一个胸苷残基后切开，其中中心“TAA”三联密码子为PIX可读框的终止密码子。因此，447bp片段缺乏终止密码子。将该片段融合到用Sma I(也来自New England Biolabs)切开的质粒pEGFP-N1中的EGFP基因，产生PIX之后接EGFP的连续融合基因。在本文中将得到的质粒命名为p9GFP，所表达的融合蛋白命名为PIX-GFP。
用p9GFP转染CS和CR细胞，并用300μg/mL遗传霉素(geneticin)(Invitrogen)选择PIX-GFP稳定表达的细胞。在2周内观察到两个不同的PIX-GFP表达群体：一个群体通常在细胞质中有2-5个PIX-GFP亮点，另一个群体在细胞质中有更均一的PIX-GFP表达，在邻近细胞核的区域有更为弥散的GFP信号积聚。在这两种情况下，细胞核都表现为暗区，提示没有或几乎没有嵌合蛋白进入细胞核。这两类CRpIXGFP克隆的代表性例子示于图15。
与该结果一致的是，通过对PIX一级序列施用搜索算法NetNES(Cour等，Protein Eng.Des.Sel.17，527-536(2004))，我们在PIX可读框中找到了核输出序列。用该程序鉴别的NES为313-GCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTT-342(SEQ IDNO：17)(翻译为：AQLDSLTREL；SEQ ID NO：18)。就我们所知，这是第一次阐述PIX蛋白中的这样的信号。相反，文献中未曾阐述过PIX的核定位序列(NLS)，并且我们不能检测到这样的信号(例如，用由Columbia University 在http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl中提供的算法)。
因此，在我们的鸭细胞中PIX-GFP的细胞质定位与PIX的一级序列一致。
实施例14：PIX GFP融合变异体
用另外的PIX融合构建体研究PIX GFP的令人惊讶的细胞核排除。通过插入合成寡核苷酸i185和i186，由上述p9GFP构建体得到PIX-GFP-NLS表达质粒。让这些寡核苷酸在80℃变性5分钟，使其在10mM MgCl2中经逐渐冷却到室温来退火，产生：
5′-GATGTACAAAGATCCGAAGAAGAACCGCAAAGGTTAACGCGGCCGCAC-3′(SEQ ID NO：19)
3′-CTACATGTTTCTAGGCTTCTTCTTGGCGTTTCCAATTGCGCCGGCGTG-5′(SEQ ID NO：20)
用BsrG I和Not I消化该双链寡核苷酸，将其插入到p9GFP的相同位点。翻译后，该插入将与猿猴病毒40NLS相似的NLS序列(PKKNRK；SEQ ID NO：21)加到PIX-GFP融合蛋白。用该插入片段导入的新Hpa I位点用作诊断标记，以确证成功克隆。将得到的质粒称为p9 GFP NLS，所表达的蛋白PIX-GFP-NLS和编码蛋白pIX-GFP-NLS的可读框分别示于SEQ ID NO：23和22中。
用引物EBR 44A(5′-GGATCCTTCCTCCTCGGGCGGGTGT-3′；SEQ ID NO：24)、V293(5′-AACCAGCGCTACCATGAGCACCAACTCGT 3′；SEQ ID NO：25)和作为模板的质粒#67F pEF PIX RARA NEO，经由PCR扩增含有PIX-RARA的片段，产生GFP标记的PIX-RARA融合蛋白。用多核苷酸激酶处理1926bp的扩增子，插入到用EcoR I线性化并用Klenow酶平端化的pEGFP-C2(Clontech)中(所有酶都来自New EnglandBiolabs)。所产生的质粒称作p9GFP RARA，所表达的蛋白为pIX GFPRARA。
图16所示为在瞬时转染的CHO细胞中各种GFP标记的蛋白的胞内分布。
实施例15：PIX和干扰素
很多病毒经由TLR-3(toll样受体3)诱导先天细胞免疫应答。TLR-3识别双链RNA这种病毒复制特征模式。TLR-3功能有活化NFkB和I型干扰素(Alexopoulou等，Nature 413，732-738(2001))。干扰素介导宿主细胞中的抗病毒状态。经由人工双链RNA poly I:poly C(聚次肌苷酸-聚胞苷酸，Sigma)检查干扰素诱导的作用。出人意料地，CR和CRpIX细胞对poly I:poly C几乎不敏感，而CS细胞明显对该诱导物有应答。出乎意料的是，比起亲代CS细胞，PIX阳性的CS细胞应答更快，并且在较低的浓度下应答(图17)。就我们所知，在现有文献中尚未阐述PIX和干扰素之间的关系。
在CS细胞中PIX对MVA的支持作用比在CR细胞中强，并且所述CS细胞对双链RNA替代物的应答好于CR细胞。已知MVA诱导干扰素，并且该病毒还装备减缓干扰素反应的蛋白。因此，测定了poly I:poly C诱导物对CRp9GFP和CSp9GFP细胞中MVA的作用。图18提示，MVA感染的细胞比未被感染的对照受poly I:poly C损害小一些。这一观察结果与MVA既诱导又干扰细胞先天免疫应答的事实一致，并与我们关于来自禽类细胞中的人腺病毒的PIX与高度减毒的痘病毒抗病毒蛋白合作以提高后一种病毒产量这一意料之外的观察结果相关联。
序列表-自由文本
SEQ ID NO           说明
1，2                腺病毒pIX蛋白
3，4                融合蛋白pIX-RARA；
5                   Ad5E1A+E1B
6-11                引物
12                  “短”人翻译延伸因子2启动子
13-16               引物
17-18               NES
19-20               编码NLS的合成寡核苷酸
21                  NLS
22-23               融合蛋白pIX-GFP-NLS
24-25               引物
Figure IYZ000004268637200031
Figure IYZ000004268637200041
Figure IYZ000004268637200071
Figure IYZ000004268637200091
Figure IYZ000004268637200101
Figure IYZ000004268637200111
Figure IYZ000004268637200121
Figure IYZ000004268637200131
Figure IYZ000004268637200141
Figure IYZ000004268637200151
Figure IYZ000004268637200171
Figure IYZ000004268637200191
Figure IYZ000004268637200201

Claims (15)

1.用于制备非腺病毒靶病毒或一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的方法，该方法包括：
(a)培养无限增殖化鸭表达细胞，所述表达细胞可通过用非腺病毒靶病毒、用携带编码所述病毒的核酸序列的载体、或用携带编码一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的核酸序列的载体感染或转染无限增殖化鸭宿主细胞而得到，所述细胞在其基因组中稳定整合了编码腺病毒PIX的基因，并稳定表达所述腺病毒PIX，和
(b)分离所述非腺病毒靶病毒或所述与腺病毒不相关的靶蛋白，
条件是：所述表达细胞和宿主细胞不是胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵。
2.权利要求1的方法，其中
(i)腺病毒PIX以至少1pg/μg胞内蛋白的量在所述鸭宿主细胞和所述表达细胞中表达；和/或
(ii)编码腺病毒PIX的基因在稳定的同源或异源启动子的控制下。
3.权利要求2的方法，其中
(i)腺病毒PIX以至少10pg/μg胞内蛋白的量在所述鸭宿主细胞和所述表达细胞中表达；和/或
(ii)所述启动子为组成型细胞启动子。
4.权利要求1的方法，其中
腺病毒PIX具有SEQ ID NO：2中所示序列。
5.权利要求1的方法，其中
(i)所述鸭宿主细胞和表达细胞为来源于鸭视网膜的细胞或来源于鸭体节的细胞；
(ii)所述鸭宿主和表达细胞携带另外的包括腺病毒的E1蛋白的无限增殖化(病毒)基因；和/或
(iv)所述鸭细胞进一步携带功能序列。 
6.权利要求5的方法，其中
(i)所述E1蛋白是哺乳动物腺病毒C群5型E1蛋白；和/或
(ii)所述功能序列为选择标记序列、剪接供体/受体位点和/或允许待表达靶核酸序列在所述细胞中整合的重组酶识别序列。
7.权利要求5的方法，其中所述细胞携带SEQ ID NO：5中所示的腺病毒E1A和/或E1B基因。
8.权利要求1的方法，其中
(i)所述靶病毒选自野生型、突变型或缺失型病毒、冷适应病毒或减毒病毒、疫苗株、携带异源基因的病毒载体；或
(ii)所述一种或多种靶蛋白选自：抗体；重组蛋白；病毒抗原；和肽类激素。
9.权利要求8的方法，其中
(i)所述病毒载体选自慢病毒、痘病毒和腺相关病毒(aav)；
(ii)所述重组蛋白选自促红细胞生成素、α-1-抗胰蛋白酶、凝血因子VIII和IX和干扰素；或
(iii)所述病毒抗原选自流感HA和NA、HBV-S、疱疹病毒G蛋白和狂犬病毒G蛋白。
10.权利要求9的方法，其中
所述痘病毒为牛痘病毒、禽痘病毒或金丝雀痘病毒。
11.权利要求10的方法，其中所述牛痘病毒为修饰的安卡拉痘苗。
12.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞为CR.PIX(17a11b)细胞，所述表达细胞来源于CR.PIX(17a11b)细胞，所述CR.PIX(17a11b)细胞保藏于DSMZ，保藏号为DSM ACC2749。
13.用于生产非腺病毒靶病毒或一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的无限增殖化鸭表达细胞，所述细胞
(i)在其基因组中稳定整合了编码腺病毒PIX的基因，并且稳定表达腺病毒PIX，并且 
(ii)用非腺病毒靶病毒、用携带编码所述病毒的核酸序列的载体、或用携带编码一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的核酸序列的载体感染或转染，
条件是：所述表达细胞不是胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵。
14.用于制备权利要求13的无限增殖化鸭表达细胞的方法，所述方法包括用非腺病毒靶病毒、用携带编码所述病毒的核酸序列的载体、或用携带编码一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的核酸序列的载体来感染或转染无限增殖化鸭宿主细胞，所述无限增殖化鸭宿主细胞已经在其基因组中稳定整合编码腺病毒PIX的基因，并且稳定表达腺病毒PIX，条件是：所述宿主细胞不是胚胎干细胞、生殖细胞或受精卵。
15.权利要求13的无限增殖化鸭表达细胞用于制备非腺病毒靶病毒或一种或多种与腺病毒不相关的靶蛋白的用途。 
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