BRPI0415622B1 - uso de uma linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada, bem como métodos para preparar uma linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada, e para produção de vírus - Google Patents
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Abstract
LINHAS DE CÉLULAS AVIÁRIAS IMORTALIZADAS PARA PRODUÇÃO DE VÍRUS. A presente invenção refere- se a uma linha de célula de aves imortalizada, adequada para produtos biológicos ou vírus para vacinação. Particularmente, as linhas de células são derivadas de células primárias, que são transformadas com pelo menos dois genes virais ou celulares, um dos quais ocasiona o progresso do ciclocelular, enquanto o outro, interfere com os mecanismos protetores intrínsecos da célula, induzidos por replicação desregulada. A invenção, além disso, refere-se à produção de tais linhas de células imortalizadas e a seu emprego em produtos biológicos ou vírus para vacinação.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a linhagens de células de ave imortalizadas, adequadas para produção de produtos biológicos ou vírus para vacinação. Em particular, as linhagens de células são derivadas de células primárias que são transformadas com pelo menos dois genes virais ou celulares, um dos quais causa o progresso do ciclocelular, enquanto o outro interfere com os mecanismos intrínsecos protetores da célula induzidos por replicação desregulada. A invenção, refere-se além disso, à produção de tais linhagens de células imortalizadas e a seu uso para produtos biológicos ou vírus para vacinação.
[0002] Ovos de galinha embrionários são ainda um dos substratos principais para produção de vacinas humanas. Eles são capazes de suportar a replicação de uma grande faixa de vírus humanos e animais. Este espectro inclui vírus atenuados, ou seja, vírus defeituosos que tiveram o potencial prejudicado para replicação em células humanas ou de mamífero e podem, portanto, ser usados como vacinas. A atenuação pode ser gerada ou mantida por passagem contínua em ovos embrionários. Ovos de galinha usados para produção de vacina humana devem ser certificados de estar isentos de um conjunto definido de contaminação por vírus e bactérias (isentos de patógeno especifico ou SPF). Ovos SPF estão disponíveis de fornecedores comerciais. A aplicabilidade ampla e um longo registro de comércio internacional manteve esta estratégia viva, apesar de desvantagens óbvias.
[0003] Flocos SPF de galinha e ovos embrionários são onerosos e podem constituir-se em até 40% do custo das vacinas. Além disso, é difícil manter, continuamente, flocos SPF completamente isentos de patógenos, o que se evidencia por interrupções periódicas da doença em flocos SPF. Um lote de vacina não pode ser liberado até que o fornecedor de SPF verifique que as galinhas matrizes para os ovos embrionários usadas na fabricação do lote de vacina estavam completamente isentos de qualquer doença. A esta incerteza soma-se um custo significativo para a preparação dessas vacinas. Em situações pandê- micas com necessidade repentina para uma dada vacina, (por exemplo, gripe) o fornecedor de ovos SPF pode ficar gravemente limitado. Além disso, os processos em grande escala para infectar os ovos e manter o crescimento de vírus são consumidores de tempo e, algumas vezes, incoerentes por todas as bateladas de vacina diferentes.
[0004] Com o desenvolvimento de técnicas de cultura celular os fabricantes de vacina substituíram os ovos embrionários com fibroblas- tos embrionários de galinha isolados. Embora o uso de culturas de célula primária melhore o perfil de segurança, a eficiente e a confiabilidade do processo de fabricação, também aumenta os custos: fibroblas- tos de galinha são preparados de ovos SPF por fragmentação dos embriões a fim de estabelecer e ampliar células viáveis. Típicos para células animais primárias os fibroblastos sofrem de senescência: o tempo duplicado aumenta com a passagem e, eventualmente todas as células morrem. Este processo ocorre após 20 passagens, muito mais cedo do que para roedores ou alguns substratos celulares humanos atualmente usados na fabricação de vacinas (tais como MRC-5 ou WI- 38). Culturas de fibroblasto têm de ser mantidas na presença de soro bovino fetal a 5-10%, adicionando mais fatores de risco ao processo de fabricação. Elas também requerem uma sólida superfície para propagação e não se desenvolvem em suspensão, um estado preferido para aplicações em biorreator. Mesmo com o uso de instalações de célula de múltipla camada, isto imita substancialmente procedimentos em escalonamento. Devido ao tempo de vida limitado, um conjunto completo de testes de segurança têm de ser aplicado para cada lote de fibroblastos de galinha.
[0005] Os fibroblastos são o único tipo de célula fora da ampla série de diferentes tecidos de um embrião de galinha que prolifera bem. A predominância de fibroblastos comparada com outros tipo de célula, possui, em alguns casos, rendimento de vírus teórico reduzido, porque, tratando-se de ovos, tipicamente, a membrana cório-alantóide, uma camada celular epitelial, é o sítio principal para ampliação de vírus.
[0006] Os problemas apresentados contribuíram para carência de vacina da gripe nos últimos dois anos (2003 e 2004). Para superar essas limitações, um permanente desenvolvimento de linhagem de células em um meio sinteticamente definido, preferivelmente em suspensão ou pelo menos e veículos seria altamente desejado.
[0007] Alguns vírus, que crescem, tipicamente em fibroblastos de galinha, foram adaptados para algumas linhagens de células. Células BHK-21 (rim de hamster jovem) suportam o desenvolvimento de várias cepas de vacina da varíola, gripe e hidrofobia (Drexler, I. et al., J. Gen. Virol. 79(Pt2):347-52 (1998); Gumusderelioglu M. et al., Biotechnol. Appl. Biochem, 33:167-72(2001); Merten, O.W. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 397:141-51 (1996)) e desenvolvem-se facialmente em grandes fermentadores ou veículos sob condições isentas de soro. (Pay, T.W et al., Dev. Biol. Stand 60:171-4 (1985); Gallegos Gallegos, R.M. et al., Arch. Med. Res. 26:59-63 (1995)). Para a catapora isto aplica-se mesmo à cepa altamente atenuada Ankara (MVA) que foi desenvolvida em célula de galinha. A linhagem de células BKH-21 é aceita para produção de algumas vacinas para gado (Lubiniecki, A.S. Bioprocess Technol. 10:495-513 (1990). Contudo, a linhagem BHK-21 não satisfaz os requisitos de segurança para vacinação de seres humanos. Células BHK foram formadas espontaneamente, são altamente tumorigênicas e seu histórico é inadequadamente relatado.
[0008] De acordo com FDA, o Debate CBER de 12/maio/2000, em substratos celulares, o desenvolvimento de "Minimally-Purified Live- Attenuated Viral Vaccines and Vírus-Vectored Vaccines" em células ne- oplásicas derivadas de tumores de ocorrência natural, de humanos e de outros mamíferos, ou de células humanas e células de mamífero que foram transformadas por mecanismos desconhecidos é desencorajado.
[0009] Como exceção à regra a linhagem de células VERO (que se originou do macaco verde africano) é permitida como um substrato celular para fabricação de vacina com base em um perfil de segurança provado e a falta de fenótipo transformado para um dado número de passagens. A linhagem de células foi usada extensivamente para a fabricação de vacinas de pólio e de varíola pra uso clínico. Contudo, células VERO requerem ligação e são sensíveis apenas aos processos tendo veículo como base.
[00010] Adicionalmente, células MDCK (uma linhagem de células espontânea de epitélio de rim de cachorro) com uma história descrita foram aplicadas à fabricação do vírus da gripe (Tree, J. A. et al., Vaccine 19:3444-50 (2001)).
[00011] Mais recentemente, desencadeadas pelo desenvolvimento de vacinas tendo vetor como base, e abordagens de terapia genética, novas linhagens de células denominadas planejadas, de origem humana são intensamente debatidas e incluídas no espectro de substratos celulares potenciais para produção de vacina (Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee, seção de maio/16/2001). Novas linhagens de células permanentes foram criadas para providenciar genes complementares para vírus recombinantes que são deficientes de replicação fora do sistema de produção. Contudo, a introdução estável dos genes de complementação requer tempos de cultivo prolongados, que, ou excedem o limite natural de números de passa- gem disponíveis pára células primárias, ou o limite tolerado de números de passagem para células VERO antes que ocorra a transformação completa.
[00012] Linhagens de células planejadas são geradas in vitro com extensa documentação usando genes caracterizados para transformação. Por exemplo, os genes de complementação da região E1 de ade- novírus por si próprios, apresentam propriedades de transformação, e têm estabelecimento permitido de linhagens de células humanas, por exemplo, PER.C6 (Fallaux, F.J. et al., Hum. Gene Ther. 9: 1909-17 (1998)). A aplicação dessas linhagens de células não está limitada ao vetor viral para o qual elas foram planejadas, mas pode ser estendida a outros vírus. Por exemplo,o vírus da influenza pode ser propagado e PER.C6 (Pau M. G. et al., Vaccine 19:2716-21 (2001)). Contudo, esta descoberta não se aplica a todos os vírus relevantes ao desenvolvimento da vacina, em particular vírus de ave, tais como doença de Marek, doença bursal infecciosa, doença de Newcastle, herpes de peru, ou vírus da anemia de galinhas. Embora alguns desses vírus repliquem-se bem em linhagens de células de mamífero, o desenvolvimento do vírus é freqüentemente fraco. Para outros vírus, a replicação é fraca e está limitada a cepas particulares, especialmente adaptadas.
[00013] Além disso, com a adaptação a um substrato de célula derivada de primatas, os sítios de ligação ao receptor, no vírus são prováveis de alteração, resultando em um padrão de antígeno modificado e assim, um efeito geral de imunogenicidade. Esta adaptação genética pode reverter a atenuação para cepas, que foram desenvolvidas via passagem em células de ave tais como MVA ou vírus do sarampo adaptado para galinha (Escoffier, C., Gerlier, D., J. Virol. 73:5220-4 (1999)), ou criar novas cepas que repliquem mais eficientemente em células humanas, comparado com seus isolados de tipo selvagem. Tais vírus também podem obter um maior potencial patogênico.
[00014] Pelos motivos supra mencionados os fabricantes de vacina estão relutantes em mudar para linhagens de células de mamífero, sendo por isso, desenvolvida uma necessidade para linhagens de células de ave imortais.
[00015] A investigação de indução de tumor em pássaros por alfa- retrovírus de ave, providenciou, em geral, os primeiros vislumbres moleculares de transformação celular. Os oncogenes retrovirais são derivados de genes celulares, com domínios reguladores essenciais passados por mutação ou deletados. Alguns dos fatores que foram identificados no curso desses estudos, tais como v-myc ou v-ras, afetam diretamente, os componentes de, ambos os caminhos de retinoblastoma (RB) e p53. Outras proteínas tais como v-src ou v-erbB, são constitutivamente, transdutores de sinal ativados (portanto, desregula- das), que imitam mitógenos extracelulares incidentes. O problema com esses fatores é que eles visam apenas um dos vários caminhos requeridos para transformação eficiente. A presença de v-src ou v-myc predispõe a célula à transformação e requer alterações adicionais, espon-tâneas e imprevisíveis dentro da célula para transformação completa. Portanto, os riscos para o paciente impostos por células transformadas com um dos oncogenes retrovirais, é difícil de estimar.
[00016] Em outros casos um único antígeno tumoral forte (por exemplo, v-jun) é capaz de ocasionar diretamente, formação de tumor (Hartl, M. et al., Curr. Cancer Drug Targets 3:41-55 (2003)). Muitos oncogenes virais de aves mantém seu potencial oncogênico em células de mamífero.
[00017] Linhagens de células criadas por esses vírus não são adequadas para fabricação de vacina. Um retrovírus portando um oncogene pode ficar ativado e ser transferido juntamente com a vacina. Até mesmo um antígeno de tumor não encerrado por LTRs virais pode colocar um alto risco, quando ele for capaz de transformar células de mamífero sem a ajuda de antígenos complementares. Este risco é tipicamente estimado por consideração do potencial transformante, do número de pessoas vacinadas, e da quantidade de ácido nucléico celular transferido com o vírus da vacina. Esta quantidade está limitada pela eficiência do processo de purificação e atualmente, não pode ser reduzido para abaixo de 10 pg/dose. Este critério é especialmente rigoroso para produção de vacina onde uma população saudável é fre- qüentemente inoculada em uma idade muito precoce.
[00018] Os mesmos argumentos aplicam-se aos vírus de DNA em transformação tais como papilomavírus e poliomavírus. Esses vírus são equipados com oncogenes agressivos: antígeno T de grande SV40 é uma proteína multifuncional que afeta tanto o controle do ponto de referência em G1 do ciclocelular e atividade de p53. Portanto, T grandes imortaliza prontamente e transforma tecidos múltiplos de origem murídea e humana. Com a adição do antígeno T pequeno (intensificando mais ainda a ação de T grande e modulando, adicionalmente, o caminho de AKT3) foi possível imortalizar células de ave (parte do pedido de patente US 2001-0016348). Contudo, mesmo com os métodos de purificação modernos sofisticados o antígeno T de grande SV40 é considerado agressivo demais para ser empregado em linha-gens de células geradas para aplicação na medicina humana. Em contraste com o exposto, os genes propostos nesta invenção, afetam o controle do ponto de referência do ciclocelular e inativação de p53 via fatores separados: um evento de transferência simultânea necessário de dois distintos fatores para transformação, diminui dramaticamente qualquer risco teórico para as pessoas vacinadas.
[00019] O pedido de patente US 2001-0016348 descreve o uso de um caminho antiapoptótico completamente não relacionado com a presente invenção . Ele não providencia um segundo gene que se contrapõem a um sinal interno para a apoptose devido ao progresso do ciclocelular forçado ocasionado por um primeiro gene. A apoptose também pode ser induzida por uma série de estímulos externos, por exemplo, falta de fatores de crescimento ou perda da ancoragem. A transmissão deste tipo de sinal pró-apoptótico pode ser inibida pelos genes da família bcI-2, o foco do pedido de patente US 2001-0016348.
[00020] Enquanto 90% de carcinomas de cérvice foram seqüências de papilomavírus, adenovírus tipo C (que inclui tipos 2 e 5) são considerados por não induzirem tumores in vivo, e as seqüências adenovi- rais não foram detectadas em tecido tumoral humano.
[00021] Alternativamente, tentou-se desenvolver linhagens de células por passagem contínua de fibroblastos embrionários de galinha. Embora célula de roedores pareçam passar por imortalização espontânea bastante facilmente (Curatolo et al., In Vitro 20:597-601 (1984)), células de ave e de primatas são altamente resistentes a esta abordagem (Harvey, et al., Genes and Development 5:2375-2385 (1991); Pereira-Smith, J. Cell Physiol. 144:546-9 (1990; Smith et al., Science 273:63-67 (1996)). Células somáticas de origem de ave ou primata carecem de telomerase e a senescência é ocasionada pelo encurtamento das extremidades cromossômicas (telômeros) .Não obstante, uma linhagem de fibroblasto de galinha UMNSAH-DF1 foi desenvolvida usando esta abordagem (patentes US 5.672.485 e 6.207.415). A imor- talização por esta abordagem é causada por mutações espontâneas em oncogenes múltiplos ou genes supressores de tumor. Este é um evento raro, sem probabilidade de ser reproduzido, especialmente em células de outra origem tissular. Mais importante, uma tal abordagem contradiz a abordagem de Risco Definido como uma regra geral para vacinas em humanos vivos propondo conhecimento detalhado acerca dos genes de imortalização, com o fito de se avaliar o risco de transferência de oncogene. Novamente, de acordo com FDA (Debate CBER de maio/12/2000 em substratos celulares) o uso de células neoplási- cas derivadas de tumores de ocorrência natural, que foram transformadas por mecanismos desconhecidos, é desencorajado para o desenvolvimento de vacinas virais atenuadas in vivo, minimamente purificadas e vacinas cujo vetor é o vírus.
[00022] A linhagem de fibroblasto de galinha UMNSAH-DF1 espontaneamente desenvolvida apresenta alterações na atividade de E2F e p53 (Kim et al., Oncogene 20:2671-82(2001)). Isto não é surpresa, porque a atividade do ciclocelular intensificado requer E2F ativo, e devido ao conhecimento de testes de célula de mamífero em que a alta atividade de E2F induz apoptose na presença de p53 ativo. O teste caracteriza o estágio imortal sem esclarecer os eventos causativos: mutações em um grande número de genes pode ter ocasionado imor- talização.
[00023] Um processo de transformação espontâneo pode ser intensificado pelo uso de mutagênese química (Patente US 5.989.805). As linhagens de células particulares geradas usando esta abordagem superaram a senescência, mas mantiveram uma aparência similar a fi- broblasto e não são tumorigênicas. Embora isto represente uma característica de segurança significativa, essas células são de baixo valor para técnicas de fermentação em grande escala. Além disso, esta abordagem aleatória também contradiz as linhagens de referência de Risco Definido.
[00024] Linhagens de células de ave originando-se de tumores de ocorrência natural, tais como um fibrosarcoma de codorniz (WO 97/08307) também foram propostos para biofabricação. Novamente, as linhagens de referência de Risco Definido para uso na produção de vacina humana, são violadas por um método que está baseado em eventos fortuitos.
[00025] As abordagens tomadas nos testes descritos supra estão em contraste marcante com a introdução ativa dos grupos específicos de genes de imortalização de acordo com esta invenção, o que define os agentes causadores para imortalização e permite avaliar riscos, providencia alta flexibilidade com relação à seleção de vários tecidos, e permite modular algumas características da linhagem de células resultante.
[00026] Apesar do fato de que, ovos de galinha e fibroblastos têm um considerável registro de sucessões, eles também estão associados com um fator de risco bem específico, que apenas recentemente entrou em um maior ponto de convergência: células de galinha liberam pelo menos dois tipos de partículas retrovirais, o retrovírus de ave endógeno (EAV) e o vírus de leucose de ave endógeno (ALV-E). A con- seqüência é similar à presença de partículas retrovirais endógenas em células de camundongo, que são usadas para fabricação de proteínas recombinantes (tais como NSO). Contudo, em contraste com células de camundongo, células de galinha demonstraram conter transcriptase reversa. Devido a técnicas de detecção mais eficientes, a atividade RT também foi detectada em vacinas de sarampo, caxumba e febre amarela derivadas de célula de galinha (Hussain, A.I et al., J. Virol. 77:1105-11 (2003); Shahabuddin, M. et al., J. Clin. Microbiol. 39:67584 (2001)). A questão da presença de atividade transcriptase reversa resultar em retrovírus transmissíveis permanece controvertida: uma análise mais detalhada demonstrou, que CEF (de raça Leghorn) contém cinco loci com EAVs integrados, dois dos quais, podem expressar ALV-E infeccioso, enquanto os outros três são defeituosos (Johnson, J.A Heneine, W., J. Virol. 75:3605-12 (2001))). Tsang, S.X et al., J. Virol. 73:5843-51 (1999) também descobriu atividade RT e liberação de partículas virais, mas não observou qualquer transmissão após uma pesquisa cuidadosa para seqüências EAV em células mononucleares do sangue de crianças, que receberam vacina contra caxumba. De acordo com o Registro Epidemiológico Semanal de WHO (73) 28 (1998), laboratórios independentes investigaram a capacidade infecciosa das partículas para uma série de células humanas e de outros mamíferos por co-cultivo extenso e não puderam detectar a transmissão de atividade RT ou infecção produtiva. Esta descoberta é apoiada por testes epidemiológicos que não revelaram qualquer associação entre o uso de vacinas derivadas de célula de galinha e incidência de cânceres, incluindo aqueles da infância.
[00027] Além disso, no mencionado Registro Epidemiológico Semanal o WHO enfatiza a importância de células hospedeiras de galinha para manter a atenuação de algumas cepas de vacina. Processos de produção alternativos não estão atualmente disponíveis, e esta carência de alternativas é um motivo importante para a aceitação de uma fonte conhecida e contínua para um contaminante viral.
[00028] Contudo testes epidemiológicos superimpõem-se a populações e não investigam eventos fortuitos ou testes de ocorrências. Testes epidemiológicos não podem refutar riscos teóricos, por exemplo, a atividade RT endógena aceita pode mascarar a atividade RT de contaminação exógena inaceitável e os vírus endógenos podem ser mobilizados e ativados, caso construtores de envoltório sejam introduzidos para as células (Ronfort, C. et al., Virology 207:271-5 (1995)).
[00029] Demonstrou-se, contudo, que as células de patos e gansos não contêm EAV e a seqüência relacionada a ALV e as codornizes japonesas são isentas de transcriptase reversa (Smith, L. M. et al., J. Gen. virol. 80 (pt1): 261-8 (1999); Brudno, I.A. et al., Vopr. Virusol. 97100 (1980)).
[00030] Adenovírus (AdV) são vírus bem caracterizados, nus (desprovidos de envoltório) onipresentes. Para a maioria de sorotipos comuns Ad2 e Ad5 a soro-prevalência na população humana aborda 90%. Versões incompetentes de replicação desses vírus são usadas como terapia genética e vetores de vacina em testes com pacientes humanos. Os genes da região E1 de Adenovírus 5 humano foram usados para transformar algumas células humanas específicas in vitro ( linhagens de células 293 e PERC6; Fallaux, FJ. et al., Hum. Gene Ther. 9:1909-17 (1998); Graham F.L. et al., J. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)). O processo geral é ineficaz comparado com oncogenes multifuncionais mais robustos tais como o antígeno SV40 de T grande. com base na observação que 293 marcadores específicos para neurônio e PER.C6 são de origem neuroectodérmicas sugeriu-se que, a transformação com base em Ad5 E1esteja limitada a células neuronais (Shaw et al., Faseb J 16(8): 869-71 (2992)). Considerando a significativa barreira das espécies, entre células humanas e de aves, a imortalização eficiente de tecidos de aves múltiplos por transfecção é até mesmo mais inesperada.
[00031] Linhagens de células transformadas E1 de mamífero foram usadas para produção de vetores de adenovírus purificados vivos em testes clínicos. Com monitoração cuidadosa da quantidade de DNA celular contaminante, em uma preparação de vacina e seu tamanho, os genes transformantes de Ad5 não são considerados uma barreira segura (Vaccines and Related Biological Products advisory committee, parte de 16/05/2001).
[00032] Os adenovírus replicam-se no núcleo da célula infectada. Devido às células hospedeiras quiescentes não serem permissíveis para um ciclo de vida viral completo, os adenovírus têm mecanismo evolucionário para forças as células para a fase S. A fim de maximizar o tamanho do advento de vírus da progênie eles também têm mecanismo evolucionário para evadir a apoptose como uma resposta da célula hospedeira para penetração de capsídeo e replicação viral. A região genômica que media, tanto o progresso do ciclocelular e inibição de apoptose é a região E1.
[00033] A região E1 atualmente consiste em dois cassetes de ex- pressão distintos, E1A e E1B, dispostos aleatoriamente, e cada qual equipado com seu próprio promotor e sítio de poliadenilação. Pelo menos três proteínas são traduzidas do transcripto E1A primário por emenda alternativa. Dentre outras, as proteínas E1A foram vistas romper complexos RB/2EF para interferir com co-ativadores transcripcio- nais p300 e CBP. A fuga de E2Fs do repressor RB induz o progresso do ciclocelular de G1 para a fase S, enquanto o complexo E1A/p300 induz apoptose via diversos caminhos (Putzer, B.M et al., Cell Death Differ. 7:177-88 (2000)), incluindo a repressão da transcrição de MdM2, um regulador negativo do sensor chave para apoptose, p53.
[00034] Como E1A sensibiliza as células para apoptose induzida por TNF ele é considerado um agente antitumoral e é utilizado em abordagens experimentais para tratamento de tumor (Lee, W.P et al., Cancer REs. 63:6229-36 (2003)).
[00035] Além disso, atuando como um modulador da transcrição ele aciona as células de encontro a desdiferenciação (ação contrária), um aspecto vantajoso para um substrato celular potencial.
[00036] Demonstrou-se por Guilhot et al. (Guilhot, C. et al., Oncogene 8:619-24 1993)) que, a transdução retroviral da proteína 12S de E1A vinda de Ad5 pode conduzir à imortalização de células de codorniz. Isto provavelmente a conseqüência da interação entre RB de ave e E1A. Contudo, o processo falha quando o gene é introduzido por transfecção de DNA nu ao invés de infecção retroviral (pers. observação). É proposto que, a eficiência extrema e transdução estável via infecção por retrovírus cria um grupamento celular grande o suficiente, para coleta de células individuais com alterações genômicas espontâneas, que bloquearam a apoptose, que normalmente é induzida com inativação de RB. Essas alterações necessárias, porém desconhecidas, aumentam o risco para as pessoas vacinadas e a linhagem de células resultante não pode ser considerada um linhagem de células planejada (o resultado de blocos definidos em caminhos específicos). Além disso, o gene transformante introduzido via retrovírus é flanqueado por repetições terminais invertidas e pode, portanto, ser mobilizado. Um tal evento pode até mesmo ser mais pronunciado em linhagens de células, que, expressam transcriptase reversa de retrovírus endógeno.
[00037] Em virtude do exposto, ainda é desejável desenvolver-se uma linhagem de células de ave, com propriedades de desenvolvimento convenientes para fabricação em grande escala, usando uma combinação definida de genes de imortalização/transformação. É ainda desejável que, nenhum desses genes seja capaz de transformar células de mamífero, independente de outros genes. Além disso, a ação de um único gene deveria, ou não ter efeito de imortalização/transformação ou resultado na apoptose de células expressando o respectivo gene. O risco de transferência conjunta para um receptor de vacina deveria ainda ser minimizado por posicionamento dos respectivos genes em unidades de expressão separadas. Por fim, seria desejável - portanto a população humana é tipicamente exposta aos respectivos genes - que esses genes não estejam associados com formação de tumor na população humana. A linhagem de células a ser gerada não deveria liberar partículas virais infecciosas dos retrovírus endógenos, ou, de modo algum, apresentar atividade transcriptase reversa.
[00038] Descobriu-se que, a transformação de células de ave com dois genes particulares, viral e/ou celular, um dos quais afeta as proteínas de retinoblastoma e a outra proteína p53, providenciou uma linhagem de células bem adequada para a produção de vírus para vacinação.
[00039] A invenção portanto, providencia: (1) uma linhagem de células de ave imortalizada com uma combinação de genes virais e/ou celulares (doravante, no presente, referido brevemente como "gene(s)"), pelo menos um primeiro gene afetando a função da proteína de retinoblastoma e, pelo menos um segundo gene afetando a proteína p53 ou um membro da família desta, onde preferivelmente o primeiro gene supera o controle do ponto de referência G1 e o segundo gene previne a apoptose induzida pelo primeiro gene; (2) um método para preparar uma linhagem de células conforme definido em (1) supra, compreendendo a transforma- ção/transfecção de uma célula inicial com o primeiro e o segundo gene; (3) o emprego da linhagem de células conforme indicado em (1) supra, para produção de produtos biológicos ou vírus, preferivelmente para preparação de uma vacina ou para terapia genética; e (4) um método para produzir vírus ou produtos biológicos usando uma linhagem de células como indicado em (1) supra.
[00040] Figura 1: Cortes esquemáticos dos plasmídeos de expressão usados para imortalização melhorada de células de pato primárias (exemplo 2). Os sinais de poliadenilação são omitidos à guisa de nitidez . Os alfanuméricos à esquerda, são identificadores curtos párea os plasmídeos, mPGK e hPGK, promotores de fosfoglicerato quinase de camundongo e humano, respectivamente, promotor E1 endógeno de Ad5; moCMV, promotor primitivo imediato CMV de camundongo; tk, promotor de timidina quinase de vírus de herpes simplex; orf 22 e gam1, genes de vírus CELO; E1A e E1B, genes da região 5E1 de adenovírus.
[00041] Figura 2: Figuras microscópicas de contraste de fase como exemplo de formação de focos em células de fígado embrionário de pato transfectado com Ad5-E1 (plasmídeo 49). A, amplitude inicial 4X para ilustrar um foco completo embutido em células primárias senes- centes. B, amplitude inicial 20X: perímetro de um foco redondo grande de células pequenas dispostas em uma monocamada compacta visível à direita do quadro, células primárias em senescência avançada no sentido da esquerda.
[00042] Figura 3: Ensaio de imunofluorescência para proteínas E1A e E1B de 55K (exemplo 3). Duas fileiras superiores, mistura de células imortalizadas com plasmídeos 49E e células de fígado de pato primárias; duas fileiras inferiores, 293 células de controle positivo. Coluna esquerda, imagens de contraste de fase; coluna central, imunoman- chamento de proteínas E1A ou E1B de 55K, conforme indicado nas imagens; coluna da direita, manchamento DAPI. A proteína E1B de 55K localiza, caracteristicamente, para o citoplasma e acumular-se em agregados rendendo uma distribuição pontilhada, desigual. E1A é uma proteína nuclear. Observar os núcleos compactados que mancham de modo brilhante com DAPI nas células de pato transformadas.
[00043] Figura 4: Ensaio Q-PERT (ensaio PERT quantitativo) no sobrenadante de célula para detecção de atividade retroviral (exemplo 4). Quadrados cheios, controle CHO positivo; quadrados abertos, controle com água, negativo; losangos cheios, fibroblastos embrionários de galinha, triângulos cheios, controle negativo de linhagem de células 293; círculos cinza, controle negativo apenas para substrato; triângulos abertos, células de fígado de pato imortalizadas com plasmídeo 49E; delta RN emissão de corante repórter sobre a fluorescência de fundo inicial.
[00044] Figura 5: Ampliação de MVA em algumas linhagens de células de pato descritas e CEFp (exemplo 5). A infecção foi realizada com um MOI de 0,1. A titulação foi realizada em células VERO 48 horas após infecção (Exemplo 2). CEFp, fibroblastos embrionários de galinha primários.
[00045] Figura 6: Passagem serial de MVA em células da retina de pato imortalizadas com plasmídeo 49E (exemplo 5). Quadrados cheios, tamanho explodido; barras, vírus de entrada ajustados a um moí de 0,1. O vírus de entrada é dado como referência, para demonstrar que, o tamanho explodido é independente das flutuações experimentais nos números de célula (que, por sua vez, definem o vírus de entrada via moí). Listagem da Seqüência = Texto Livre
[00046] "Imortalizada", células imortalizadas" e "linhagem de células imortalizada" de acordo com a presente invenção refere-se a uma cé- lula ou linhagem de células que foi transfectada/transformada por algumas seqüências de DNA que conferem o potencial par pelo menos 200 passagens, preferivelmente número ilimitado de passagens, ou seja, imortalidade, para as respectivas células iniciais.
[00047] Um "cassete de gene" da presente invenção deve ser entendido como uma seqüência de DNA compreendendo um gene que afeta a função da proteína de retinoblastoma, ou seja, que direta, ou indiretamente (por exemplo, após expressão) media o rompimento de complexos entre proteínas de retinoblastoma e fatores de transdução E2F, e que, além disso, compreende um gene viral prevenindo a indução de parada de crescimento e apoptose por p53, tal como a proteína E1B 55K de adenovírus de todos os grupos, a proteína E6 de papilo- mavírus, preferivelmente aqueles papilomavírus (HPV) de baixo risco humano( tal como HPV1, HPV6 e HPV11, porém não HPV16, HPV18) ou um gene celular prevenindo a parada de crescimento e apoptose por p53 tal como mdm2.
[00048] Em mais detalhes, o cassete genético supra compreende um "primeiro gene" que em um aspecto preferido de (1) direta ou indiretamente (por exemplo, via indutores celulares) media o rompimento de complexos entre proteínas de retinoblastoma e fatores da transcrição de E2F. Este primeiro gene pode ser um gene viral, tal como um mastadenovírus E1A, gam1 e orf22 de CELO ou E7 de papilomavírus, preferivelmente de papilomavírus humano de baixo risco, (tal como HPV1, HPV6 e HPV11, porém não HPV16, HPV18) ou um gene celular tal como CDK4 constitutivamente ativo ou uma ciclina do tipo D su- perexpressada. A atividade do primeiro gene media o progresso do ciclocelular, normalmente às custas da indução de apoptose ou parada de crescimento com passagem aumentada.
[00049] Um "segundo gene" está presente no cassete de gene supra para opor-se a este efeito do primeiro gene. Ele previne a apopto- se ou parada de crescimento e, preferivelmente age por inibição da ativação transcripcional por p53, via aumento da degradação de p53 ou convertendo p53 de um transativador a um repressor de transcrição. Preferivelmente, o "segundo gene" é capaz de prevenir a ativação transcripcional por p53, incluindo a repressão da função de p53 e ocasionando uma redução na estabilidade de p53. O "segundo gene" pode ser um gene viral, tal como proteína E1b 55K de adenovírus de todos os grupos, orf22 de CELO, a proteína E6 de papilomavírus, preferivelmente um papilomavírus humano de baixo risco, (tal como HPV1, HPV6 e HPV11, porém não HPV16, HPV18), ou um gene celular que previne a parada de crescimento e apoptose por p53, tal como mdm2. Preferivelmente, o "segundo gene" é orf22 de CELO ou E1b 55K de adenovírus.
[00050] Isto é exatamente contrário à introdução do p53 do tipo selvagem ativo exógeno que estava associado com a geração de uma linhagem de fibroblasto de galinha por um mecanismo desconhecido (US 5.879.924).
[00051] "Biológicos" no contexto da presente invenção compreende proteínas terapêuticas e recombinantes, incluindo anticorpos, enzimas, hormônios, receptores ou seus ligantes e fusões destes. Biológicos preferidos são proteínas recombinantes.
[00052] Um aspecto preferido da modalidade (1) é o uso de uma linhagem de células derivada de galinha embrionária ou eclodida, pato, ganso, codorniz ou similares, preferivelmente de galinha ou de pato. Em um aspecto especialmente preferido de (1), adicionalmente, esta linhagem de células é isenta de atividade transcriptase reversa, derivada da imortalização de uma célula primária originando-se de embriões de galinha, galinha eclodida, embriões de pato, ou patos eclodidos, derivada de membrana extra-embrionária e/ou é cultivada em um meio quimicamente indicado. O meio e preferivelmente isento de soro animal.
[00053] Um outro aspecto preferido da modalidade (1) é que as células submetidas à imortalização são células primárias incluindo fi- broblastos, células de segmentos corporais isolados (somitos) ou órgãos individuais separados incluindo neurônio, cérebro, retina, rim, fígado, coração, músculo e tecidos extra-embrionários e membranas protetoras do embrião. Mais preferivelmente, as células são de membranas ou retina extra-embrionária.
[00054] A imortalização conduzindo às células da modalidade (1) é preferivelmente efetuada por transfecção não viral, incluindo, sem limitação, a transfecção mediada por lipossomas, dendrimeros ou hdroxi- apatita ("fosfato de cálcio") precipitados e eletroporação.
[00055] Preferivelmente, o primeiro gene em uma modalidade (1) é um gene viral mediando o rompimento de complexos entre proteínas de retinoblastoma e fatores de transcrição E2F. Isto inclui, sem limitação a, um gene E1A de adenovírus de mastadenovírus (preferivelmente de mastadenovírus do grupo C), uma proteína E7 de papilovamírus, preferivelmente de papilomavírus de humano de baixo risco (HPV), tal como HPV1, HPV6 E HPV11, porém não HPV16, HPV18), um gene orf22 de adenovírus de ave e/ou quadros de leitura abertos E43 de atadenovírus de gado ovelhum. Alternativamente, o primeiro gene da modalidade (1) é um gene celular mediando o rompimento de comple-xos entre proteínas de retinoblastoma e fatores de transcrição E2F. Isto inclui, sem limitação a ciclina D1, ciclina D2, ciclina D3 e/ou um CDK4 que sofreu mutação não suscetível de inativação por p16INK4a.
[00056] O segundo gene da modalidade (1) é preferivelmente um gene viral codificado para uma função de prevenção de proteína da parada de crescimento e apoptose por p53. Este inclui, sem limitação a genes codificando para a proteína E1B55K de adenovírus de todos os grupos GAM-1 de CELO, a proteína E6 de papilomavírus, preferivelmente aquelas de HPV de baixo risco (tais como HPV1, HPV6 e HV11, porém não HPV16, HPV18), Mais preferidos são os genes codificando para a proteína E1B55K de adenovírus e GAM-1 de CELO. Alternativamente, o segundo gene codifica uma proteína celular de prevenção da parada de crescimento e apoptose por p53 tal como mdm2.
[00057] O primeiro gene e o segundo gene da modalidade (1) são preferivelmente, ou separados no espaço por seqüências heterólogas ou localizados em diferentes segmentos de ácido nucléico ou plasmí- deos.
[00058] Em um aspecto especialmente preferido da modalidade (1) o iniciador gene é E1A e o segundo gene é a região E1B, de um ade- novírus do gênero Mastadenovírus, preferivelmente de adenovírus 5. Mais preferivelmente, as regiões E1A têm a seqüência de 2193 a 1309 pares de base, preferivelmente 1239 a 2309 pares de base, da SEQ ID NO: 7 ou a seqüência complementar a 4230 a 3113 bp da SEQ ID NO: 9. Além disso, mais preferivelmente tais regiões E1B têm a seqüência de 1145 a 3007 pares de base, preferivelmente 1197 a 2810 bp da SEQ ID NO: 8 ou a seqüência complementar a 2345 a 550 pares de base da SEQ ID NO: 9.
[00059] Em um aspecto especialmente preferido ainda da modalidade (1) o primeiro gene é orf22 e o segundo gene é GAM-1 de um adenovírus, preferivelmente do gênero aviadenovírus CELo, que, preferivelmente têm a seqüência representada pela seqüência complementar a 1252 a 635 pares de base da SEQ ID NO: 10 , e a seqüência complementar a 3138 a 2290 pares de base da SEQ ID NO: 10.
[00060] Em ainda um outro aspecto especialmente preferido da modalidade (1) e (2) os plasmídeos 36E (SEQ ID NO: 19), 37E (figura 1), 49E (SEQ ID NO: 9), 25F (SEQ ID NO: 10) ou 60E (SEQ ID NO: 18) são usados para imortalização das células.
[00061] Além disso, combinações de ácidos nucléicos codificando E1A e/ou E1B com GAM-1 e/ou Orf22 como indicado supra, são aspectos preferidos da modalidade (1).
[00062] A linhagem de células de acordo com a modalidade (1) pode optar, adicionalmente seqüências funcionais não naturais, incluindo, sem limitação a, transgenes tais como genes complementando vírus deficiente (por exemplo, EBNA1 etc), promotores (por exemplo, PGK-, EF1.alfa-, promotor CMV, promotores E1 de Ad5, promotor tk etc.) intensificadores (por exemplo, RSV-LTR) marcadores de seleção tais como resistência a neomicina, resistência a puromicina, etc. Em um aspecto preferido o primeiro e segundo genes estão sob o controle de promotores separados selecionados independentemente de PGK-, CMV-, E1- e promotores tk.
[00063] A linhagem de células de acordo com a modalidade (1) é em um aspecto preferido mais adequado para produção de produtos biológicos ou vírus incluindo cepas de vacina (doença de Marek, doença bursal infecciosa, doença de Newcastle, herpes de peru, anemia das galinhas, influenza, varíola (MVA), rubéola( vírus da aia, etc.) e vetores virais recombinantes (por exemplo, MVA recombinante ou al- favírus). Vírus mais preferidos para vacinação são vírus MVA e vírus da influenza. O vetor viral recombinante mais preferido é MVA.
[00064] Em um aspecto da modalidade (1) a linhagem de células é a linhagem de células 12A07-A10 (DSMACC2695) derivada da imorta- lização de células de membrana extra-embrionária de pato com o plasmídeo 49E (exemplo 2).
[00065] Adicionalmente preferido é a geração das linhagens de células de acordo com a modalidade (1) sob condições cGMP, que as torna adequadas para aplicação farmacêutica.
[00066] O método da modalidade (2) compreende, preferivelmente, a transfecção não viral da célula inicial tal como mencionado supra. Mais preferido é a transfecção lipossomal, especialmente transfecção por reagente Effecteno.
[00067] Um uso preferido de acordo com modalidade (3), é o uso para preparação de uma vacina ou para terapia genética, Uma cepa de vacina viral ou vetor de terapia genética é levado em contato com as células de uma linhagem de células de acordo com a modalidade (1) de modo que ocorra a infecção e o vírus é ampliado pelas referidas células. A passagem contínua do vírus (ciclos repetidos de infecção e coleta do vírus nas referidas células) levará à atenuação ou adaptação do vírus àquela linhagem de células hospedeira particular. Assim, um vetor viral ou cepa de vacina com menor virulência para os candidados a vacina (que não é de pato, preferivelmente, não de ave) é gerado. Vírus atenuados permite ao sistema imune do candidato à vacina responder que é mais protetor do que a vacinação com partículas completamente inativadas, e que é menos grave do que a infecção com um patógeno do tipo selvagem (natural). Os vírus preferidos para esta modalidade são vírus do sarampo e da raiva.
[00068] O método para produção de vírus de acordo com a modalidade (4) preferivelmente compreende o contato de tais vírus com uma linhagem de células de acordo com a modalidade (1) e/ou o cultivo de tais vírus na linhagem de células. Especialmente, este método pode ser usado para produção de vírus da sífilis, preferivelmente cepa MVA, em uma linhagem de células de pato, preferivelmente uma linhagem de células que se origina de somitos de pato ou tecido neuronal de pato, mesmo mais preferido, de retina de pato. Especialmente retina de pato e células derivadas de somito obtidas por transfecção da região Ad5-E1 sob condições cGMP de amplificação com suporte estável de MVA com uma eficiência comparável ou melhor do que fibroblastos embrionários de galinha primários (Exemplo 5).
[00069] O método para produzir biológicos, especialmente proteínas recombinantes, de acordo com as modalidades (4) compreende a introdução de um gene codificando para uma proteína recombinante, operavelmente ligada a um promotor para uma linhagem de células de acordo com a modalidade (1), cultivo de tal linhagem de células modificada e coleta da proteína recombinante.
[00070] O método da modalidade (4) é usado preferivelmente para produção de vírus e biológicos utilizáveis para vacinação ou terapia genética.
[00071] Historicamente, ovos de galinha e as respectivas células (fibroblastos de galinha) são o substrato dominante para fabricação de vacinas. Para fins farmacêuticos, galinhas estão disponíveis de ambientes com controle de patógeno, com um sistema de monitoração extenso. Um vasto patrimônio literário sugere ovos de galinha como o alvo primário para desenvolvimento de linhagem celular. Portanto, células de galinha são uma fonte preferida para células iniciais da invenção. Contudo, células e linhagens de células derivadas de galinha serão mais provavelmente RT positivas. Os dados da literatura sugerem um baixo risco para liberação do vírus infeccioso. Contudo, a ausência de vírus transmissível terá de ser monitorado para qualquer linhagem de células para uso na fabricação. De fato, a maior parte das linha-gens de células de ave estabelecida desde então, são originárias de galinha (US 5.830.723, US 5.879.924). Embora fosse possível criar uma linhagem de galinha (linhagem 0) isenta de vírus da leucose de ave, retrovírus de ave endógeno (EAV-HP) (Boyce-Jacino et al., J. Virol. 66(8):4919-29 (1992)) estão presentes em células de galinha incluindo a linhagem 0. EAVs providencia uma transcriptase reversa ativa, mas níveis de expressão variam substancialmente. Portanto, mesmo células de galinha primárias e linhagens de células tais como DF1 que deram RT negativo em ensaios menos sensíveis (Crittenden et al., Virology 57(1):128-38 (1974) presumivelmente, serão positivas em abordagens da PCR em tempo real atuais e podem colher retrovírus que são ativados sob algumas condições de crescimento.
[00072] Alternativamente, espécies de ave preferidas desta invenção para desenvolvimento de linhagem de células são aquelas que não contém retrovírus endógeno ou expressam transcriptase reversa (RT). Isto inclui, patos, que são adequados por dois motivos adicionais: Ovos de pato também estão disponíveis de estoques monitorados isentos de patógeno e os patos, são, em contraste aos gansos, menos prováveis de desenvolver tumores espontâneos. Embora saiba- se que, muitas cepas de vacina relevantes replicam bem em células (embrionárias) de pato como o fazem em células (embrionárias) de galinha (por exemplo, vírus da doença de Marek (Witter, R.L., Avian Dis. 46:925-37 (2002)) ou rubéola (Rocchi, G., Salvadori, A., Nuovi Ann Ig Microbiol, 21:336-40 (1970))), este permanecendo como demonstração para cepas de vírus de interesse primário. Para outras vacinas tais dados não estão disponíveis.
[00073] Ao que se sabe é uma nova e inesperada descoberta desta invenção que a cepa de vírus da varicela altamente atenuada MVA (varíola modificada Ankara) replica em linhagens de células de pato em eficácia similar ou mais elevada do que em fibroblastos embrionários de galinha primários normalmente usados. Uma intenção dos requerentes era providenciar uma alternativa forte e segura para células primárias para ampliação do vírus que requer um hospedeiro de ave, ou cepas de vacina, onde um hospedeiro que não mamífero fosse preferido. Um vírus importante para o qual convenientes células hospedeiras não estão disponíveis é MVA (vírus da varíola modificado Ankara). MVA é um vírus da catapora altamente atenuado e uma ferramenta extremamente promissora para aplicações de vacina terapêuticas e protetoras. MVA servirá como um vírus modelo para caracterização de células de pato, mas não deve ser tido como um exemplo exclusivo: os experimentos descritos também podem ser realizados com uma faixa de outros vírus, sejam eles patógenos ou vetores terapêuticos, tais como sarampo, rubéola, raiva ou vírus da influenza.
[00074] Fibroblastos foram selecionados como o tipo de célula preferida principalmente por motivos históricos e práticos. Fibroblastos são as células primárias de crescimento mais rápido de mamífero, bem como espécies de ave. Quando uma suspensão de célula de embrião de galinha total é colocado em cultura, isto não é o único, mas é o tipo de célula predominante. Contudo, fibroblastos crescem fortemente aderentes e perdem esta característica apenas após transformação completa (tumorigênica). Este processo requer a presença de genes transformantes fortes tais como v-ras interferindo com caminhos de transdução de sinal. Senescência primária de culturas de fibroblas- tos é, em parte ocasionada pela ausência total de atividade telomerase em pássaros e no homem. (Forsyth, N. R. et al., Differetiation 69 (4- 5):188-97 (2002)).
[00075] Fibroblastos primários humanos são refratários à transformação com os genes E1 do tipo 5 de adenovírus que não interferem diretamente com esses caminhos (observação pessoal). A imortaliza- ção eficiente e crescimento em cultura em suspensão tem uma maior chance de ser bem sucedida para células epiteliais e neuronais. Além disso, o epitélio em vês de fibroblastos parecem ser o sítio primário para replicação viral, dentro do ovo de pássaros. Muito interessante, em contraste com a situação humana, o rim de pássaro não expressa telomerase por toda a vida, o que torna as células renais de pássaro um bom alvo para imortalização. Considerados juntos, células epiteli- ais de pássaro incluindo epitélio renal e células neuronais são considerados os alvos mais promissores para desenvolver uma linhagem de células das características requeridas.
[00076] É portanto apenas pela facilidade com que os fibroblastos são obtidos que, o desenvolvimento da linhagem de células de ave foi quase que exclusivamente focalizada nessas células. (Cowen, B. S., Braune, M.O Avian Dis 32(2):282-97 (1988); US 5.830.723). Em alguns casos, embriões totais foram usados (US 2001-0016348).
[00077] Vírus não apenas apresentam espécies mas também órgão e tecido especificamente baseados na distribuição do receptor e fatores celulares apoiando a replicação. Portanto, em contraste com a abordagem típica, um modo preferido de realizar a presente invenção é a separação de órgãos antes do cultivo para obter uma célula hospedeira mais preferida.
[00078] Para o vírus da influenza, cuja produção adequada de vacina é uma aplicação principal para as linhagens de células da presente invenção , o sítio típico de replicação não é o próprio embrião, mas membranas extra-embrionárias. Portanto, um objetivo especifico foi também desenvolver linhagens de células de matéria extra- embrionário, incluindo membranas protetoras do embrião. Algumas culturas primárias específicas de tecido incluindo aquelas das membranas extra-embrionárias têm tempos de sobrevivência muito curtos, comparado com os fibroblastos. Isto adicionalmente, salienta a necessidade para a imortalização planejada na obtenção de células hospedeiras otimizadas. A imortalização de sucesso dos múltiplos tecidos em um espaço de tempo limitado requer a combinação específica dos genes usados na presente invenção .
[00079] Não se conhecia quais tecidos de aves tinha o maior potencial replicativo para vírus da catapora, tais como MVA ou Canarypox. O processo típico de fabricação para MVA envolve uma mistura de célula de um embrião excluído a cabeça que é removida antes a desintegração. É portanto, completamente inesperado o fato de uma linhagem de células de origem neuronal, desenvolvida da retina, ter uma tal grande capacidade para replicação de MVA enquanto outros tecidos não a têm.
[00080] A mesma especificidade de tecido aplica-se à produção de proteína. A capacidade transcripcional é dependente do conjunto disponível de fatores da transcrição e mesmo, fortes promotores celulares e virais onipresentes apresentam resistência variável em diferentes tecidos. Além disso, rendimentos da proteína secretada depende fortemente da capacidade de um dado tipo de célula para replicação e processo da propriedade da proteína, (por exemplo, glicosilato).
[00081] O mecanismo que conduz à imortalização e transformação de células primárias foi bem descrito (Hahn, W. C. et al., Nature 400:464-8 (1999)). Elementos requeridos interferem com (1) controle do progresso do ciclocelular, (2) morte celular programada induzida pelo ciclocelular desregulado, (3) transdução de sinal do fator de crescimento e para células humanas e de ave (4) encurtamento do telôme- ros, os terminais lineares dos cromossomos. Um grande número de fatores são conhecidos, os quais podem levar as células primárias a um fenótipo imortalizado e transformado, porém a imortalização de aves a custa dos pontos de referência celulares de inibição, que são responsáveis pela minimização da formação de tumor no hospedeiro. É portanto desejado selecionar fatores transformantes, que podem efetuar geração experimental de uma linhagem de células, mas colocam um risco mínimo de indução tumoral nos receptores dos biológicos derivados das células planejadas. Este requisito precisa ser equilibrado com a resistência dos fatores de transformação: eles devem ser fortes o bastante para causar a transformação sem necessidade de acúmulo de mutações espontâneas adicionais; ou seja, o caminho molecular que conduz à linhagem celular resultante deve ser completamente conhecida (categorias I e II de acordo com FDA CBER Escritório de apresentação de Vaccina em maio/2000 Advisory Committee). É ainda conveniente selecionar uma combinação sinérgica dos fatores que, individualmente, não podem transformar células primárias, de modo que, uma transferência concorrente de material genético seja necessária, o que minimiza ainda mais o risco de transformação inadvertida em candidatos a vacina ou pacientes. Finalmente é desejado que, o fator de transformação solicite uma resposta imune no receptor dos biológicos de modo que a fiscalização de tumor imune seja ativada, no evento improvável de formação de tumor, devido à aplicação do produto. O último critério pode ser realizado, caso sejam utilizadas proteínas não celulares, porém estranhas, por exemplo, virais, transfor- mantes.
[00082] Descobriu-se agora, que a região E1 de adenovírus 5 de humano (Ad5) é idealmente adequado para transformar células de ave, de modo que a célula planejada resultante concorde com todos os critérios supra.
[00083] A região E1B codifica dois quadros de leitura abertos em um mRNA bicistrônico, as proteínas 21K e 55K. A proteína 55K liga-se a p53, e portanto, transformar o ativador transcripcional pró-apoptótico em um repressor. A proteína 21K complementa esta atividade anti- apoptótica por ligação a Bax, mantendo assim, a integridade da membrana mitocondrial e prevenindo a liberação do citocromo C. Esta proteína é essencial para conduzir células aderentes no sentido do crescimento independente do substrato, e, daí, essencial para um processo de fermentação em suspensão.
[00084] Não foi demonstrado antes se um adenovírus E1B 55K humano pode afetar os homólogos de aves de p53. Além disso, os ade- novírus de aves não são equipados com genes que se assemelham a E1B, de modo que a inferência também não foi possível. Contrário a todas as expectativas, os inventores descobriram, que E1B pode providenciar as funções essenciais para permitir imortalização por E1A.
[00085] Um novo e crucial fator para a aquisição aqui descrita foi a remoção de E1B de seu contexto fraco natural e colocar sob controle de um promotor recombinante forte. Esta nova modificação e combinação permitiu imortalização eficiente de múltiplos tecidos de pato e de galinha por transfecção no lugar de transdução retroviral.
[00086] Embora o mecanismo subjacente para transformação por E1 seja complexo um contraste notório é uma característica mais desejável: E1A é um forte indutor de proliferação celular e apoptose, enquanto as proteínas E1B interferem eficientemente, com a apoptose, mas não podem liberar restrição no controle do ciclocelular.
[00087] Daí, nem um simples fator, mas a presença contínua de proteínas E1A e E1B são necessárias para sustentar o fenótipo transformado induzido experimentalmente.
[00088] Visto a descrição de v-src nos anos 70 (Brugge, J.S. Erikson, R.L. Nature 269:346-B (1977)) uma panóplia de fatores de transformação foi descoberta e caracterizada. De fato, foi o teste da indução de tumores em pássaros por alfa-retrovírus que providenciou primeiros vislumbres moleculares (Martin, G.S., Nature 227:1021-3 (1970)). Os oncogenes retrovirais são derivados de genes celulares com domínios reguladores essenciais que sofreram mutação ou dele- tados. Alguns dos fatores que foram identificados no curso desses estudos, tais como v-myc ou v-ras, afetam diretamente, os componentes de caminhos RB e p53. Outras proteínas tais como v-src ou v-erbB, são constitutivamente ativadas (daí, desreguladas) transdutores de sinal que imitam mitógenos extracelulares incidentes. O problema com esses fatores, é que eles almejam apenas um dos vários caminhos requeridos para transformação eficiente. A presença de v-rc ou v-myc predispõe a célula para transformação e requer alterações espontâneas e imprevisíveis adicionais dentro da célula para transformação completa. Os riscos para o paciente impostos por células transformadas com um dos oncogenes retrovirais, é portanto, difícil de estimar.
[00089] Outros vírus de DNA tais como papilomavírus e poliomaví- rus também são conhecidos por transformarem células in vitro. Contudo, os transgenes selecionados não devem ser agressivos demais que minimizem o risco de indução de tumor nos receptores dos biológicos, por DNA celular inadvertidamente transferido. Esse critério é especialmente rigoroso para produção de vacina, onde uma população saudável, freqüentemente é inoculada em uma idade muito jovem. Mesmo com métodos de purificação modernos sofisticados, o antígeno Gran- de-T de poliomavírus é considerado agressivo demais para uso em linhagens de células geradas pra aplicação na medicina humana. Enquanto 90% de carcinomas de cérvice portam seqüências de papilo- mavírus (Munoz, N. et al., N. Engl., J. Med. 34816):518-27 (2003)) adenovírus do tipo C (que incluem tipo 2 e tipo 5) não são considerados induzirem tumores in vivo e adenovirais não foram detectados em tecido tumoral humano.
[00090] Com base em aspectos característicos complementares dos genes transformantes mostrados supra, descobriu-se que, uma combinação dos genes cada qual interferindo com os caminhos simples no ciclocelular e apoptose é necessária para se obter uma linhagem de células geneticamente estável que se desenvolve em suspensão.
[00091] Demonstrou-se que, a região E1 completa do adenovírus 5, pode preencher esses requisitos. Enquanto se demonstrava, que a proteína 12S de E1A de Ad5 pode interagir com RB de ave (Guilhot, C. et al., Oncogene 8:619-24 (1993)) a atividade funcional de proteínas 55K e 21K em célula de ave é demonstrada pela primeira vez na presente invenção . Não é surpreendente que, alguns clones de células de codorniz expressando a proteína 12S de E1A exibam aspectos transformados (Guilhot, C. et al. Oncogene 8:619-24 (1993)). A trans- dução extremamente eficiente e estável via infecção por retrovírus cria um grupamento de célula grande o bastante para permitir que células individuais superem o bloqueio do ciclocelular ou indução de apoptose por alterações genotípicas espontâneas. Essas alterações necessárias, porém desconhecidas aumetam o risco medicinal e a linhagem de células resultante não pode ser considerada uma linhagem de células para planejamento, que deveria estar baseado em genes conhecidos. Além disso, técnicas de transfecção não são suficientes para criar um grupamento de clone grande necessário para seleção natural. Em vez disso, a transdução do retrovírus foi requerida. O gene transformante introduzido via esta abordagem será flanqueado por ITRs e pode, portanto, ser mobilizado, mais ainda em uma linhagem de células expressando transcriptase reversa.
[00092] Recentemente, um adenovírus de ave, denominado cepa tipo 1 de adenovírus de ave CELO (para órfão letal de embrião de pássaro) foi descrito em mais detalhes (Chiocca, S. et al., J. Virol. 70:293949 (1996)). Sulcos genotípicos centrais grandes de CELO são homólogos a Ad5, porém diferem em aspecto importantes - dentre outros, CE- LO não está equipado com uma região homóloga para E1. Além disso, CELO não pode complementar Ad5 mutagenizado em E1A e, de modo inverso, proteínas Ad5 E1 não podem transativar a transcrição de genes CELO precocemente retardados (Li, P. et al., J. Gen. Virol. 65(Pt 10):1817-25 (1984). E ainda assim, CELO é capaz de transformar células de hamster in vitro (May, J.T. et al., Virology 68:483-9 (1975)). Genes que interferem com o ciclocelular e apoptose, orf22 e GAM-1, foram identificados no vírus CELO (Lehrmann, H., Cotton, M., J. Virol. 73:6517-25 (1999)). Orf22 codifica uma proteína que interage com RB, e GAM-1 interfere com a apoptose em um modo similar à proteína 21K prototípica (Chiocca, S. et al., J. Virol. 71:3168-77 (1997)).
[00093] Foi agora descoberto que, os genes orf22 e GAM-1 do vírus CELO são adequados substitutos para E1A e E1B. O espectro de transgenes disponíveis para transformação de células de ave é expandido com ele. Essas proteínas não foram utilizadas previamente para transformar células de ave.
[00094] Além disso, um dos genes virais podem ser substituídos por um gene celular. Candidatos para tal substituição são membros da família E2F ou ciclinas do grupo D para a região E1A de adenovírus e mdm 2 para a região E1B.
[00095] As seguintes linhagens de células foram depositadas junto a DMSZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH, Masheroder Weg 1b, 3814 Braunschweig, Alemanha: 1. PBG04 como DSM ACC2577, depositada em 18 de setembro de 2002; 2. 12A07-A10 como DSM ACC2695, depositada em 20 de outubro de 2004.
[00096] A invenção será explicada em mais detalhes por referência aos seguintes Exemplos que, contudo, não devem ser construídos como limitantes da invenção. Exemplos Exemplo 1: Imortalização de células de pato primárias com Adenovirus 5 E1A.B
[00097] As seqüências de adenovírus para E1A e E1B foram ampliadas da cultura da passagem 8 da primeira geração (E1 deletado) de adenovírus Admuc cultivado em HEK 293, que estava muito contaminado com vírus do tipo selvagem usando provestart polimerase (Qiagen).
[00098] O seguintes iniciadores foram usados: VS182ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (SEQ ID NO: 1) VS183 CACACGCAAATCACAGGTT (SEQ ID NO: 2) para ampliar a região a E1A e VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (SEQ ID NO: 3) VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (SEQ ID NO: 4) para ampliar a região E1B. Ambos os fragmentos foram primeiro clonados em pPCR4blunttopo (Invitrogen).
[00099] O construtor E1B perde o receptor de emenda da mensagem E1B. Ele foi portanto, substituído por um sintético ampliado usando iniciadores do íntron líder de uma cadeia pesada de imunoglobuli- na. Como matriz, foi empregado o DNA genômico de PBG04 (DMSZ ACC2577), um heterohibridoma de murídeo-humano. Iniciadores: VintSA-F AAGGTACCCTCCTAGTCCCAGTGA (SEQ ID NO: 5) VintSA-R CAATGTACAGAGTGGGCTCCTGTGG (SEQ ID NO: 6)
[000100] Este receptor de emenda foi diretamente clonado ao pE- Fmyc, contendo promotor aEF1 alfa e o peptídeo líder myc para criar proteínas de fusão. A região E1A foi removida de ptopoE1A usando sítios EcoR I e Xho e clonada a pEFmyc diretamente, removendo a seqüência líder myc e fundindo o E1A ao hormônio de crescimento bovino poli A. A região E1B foi novamente removida com enzimas de restrição EcoRI e Xho I e clonada ao pEFmycSA contendo o sítio do receptor de emenda heterólogo. Os plasmídeos resultantes foram denominados pEFAd5E1A (SEQ ID NO: 7) e pEFAd5E1BSA (SEQ ID NO: 8)
[000101] Ovos de pato embrionários foram incubados a 37°C, a 60% de umidade do ar, ou 12 dias (os embriões mais velhos produziram mais células, mas também continham um maior número de contami- nante, fibroblastos diferenciados). A casca foi esterilizada com isopropanol a 70%, aberta na extremidade maior, e o embrião foi removido assepticamente para um disco petri estéril. O cérebro fetal e os rins foram removidos transferidos para discos petri separados enchidos com tripsina/EDTA e picados. Após uma breve incubação, uma sus- pensão disto foi misturada com um excesso de meio F12 (Gib- co/Invitrogen) suplementado com soro bovino fetal a 10% (Biochrom) e Ultroser G a 2% (Ciphergen). Esta suspensão foi transferida para um disco petri e realizou-se o cultivo a 37°C (que é menor do que 41,6°C da temperatura fisiológica do pinto) e 5% de CO2. O meio de cultura com restos não aderentes foi substituído no dia seguinte e o cultivo continuou até pelo menos 5 x 105 células por 3,5 cm de pratos estavam disponíveis para transfecção de plasmídeos pEFAd5E1A e pE- FAd5E1BSA.
[000102] Os experimentos iniciais comparando reagentes de trans- fecção lipossomais (Effectene; Qiagen) e dendroméricos (Polyfect; Qiagen) sugeriam melhores eficiências com Effectene. A transfecção foi aí realizada usando reagente Effectene, em resumo: 2 μg de DNA de plasmídeo foi diluído em 200 μl de tampão EC contendo 16 μl de Enhancer. Após um tempo de incubação de 5 mg, 16 μl de Effectene foi adicionados. Após um tempo de incubação de 10 minutos, o sobre- nadante foi removido da cultura em pratos de 3,5 cm e substituídos com 1 ml de meio fresco contendo a mistura de transfecção. ApÓs um tempo de incubação de 2 horas a 37°C e 5% de CO2, mais 2,5 ml de meio fresco foi adicionado para a cultura.
[000103] As células transfectadas foram deixadas atingir a confluência, tripsinadas, ressuspensas em meio F12 suplementado com FCS/Ultroser G, e re-semeadas em duas placas de 6 poços (correspondendo a uma expansão de 12X. Após 5 e 10 dias, o meio foi substituído com F12 suplementado apenas com FCS a 5%. AS placas foram escaneadas quanto à aparência de dois focos de células com morfologia alterada (diminuição no tamanho da célula global, núcleo aumentado, visibilidade aumentada das membranas plasmáticas sob contraste de fase) e confluência aumentada.
[000104] Aproximadamente 14 dias pós-transfecção, uma vez os fo- cos atingiram um diâmetro de 1-3 mm. o meio foi aspirado e a cultura lavada duas vezes com tripsina/EDTA (Gibco). Discos de clonagem embebidos em tripsina (Sigma) foram colocados no topo dos focos aspirados por 3 minutos a seguir transferidos para poços em uma placa de 24 poços enchidas com 500 μl de meio F12 suplementado com FCS a 5%.
[000105] As células transformadas clonadas, foram deixadas proliferar até a confluência, tripsinizadas, ressuspensas em meio F12, suplementado com FCS a 5% e transferidas para placas de 6 reservatórios. Uma vez que a cultura atingiu a confluência na placa de 6 reservatórios as células foram transferidas para frascos T25 para passagem contínua.
[000106] Para a crio-preservação em intervalos definidos as células foram tripsinizadas, ressuspensas em meio F12 contendo FCS a 5%, coletadas por centrifugação a 100 g por 10 minutos, ressuspensas em meio F12 contendo 50% de FCS e 10% de DMSO (Sigma) para uma concentração de aproximadamente 3 x 106 células por ml, e colocadas em frascos criogênicos em um dispositivo de refrigeração a base de isopropanol a -75°C. O dispositivo de refrigeração assegura uma velocidade de resfriamento constante de 1°C por minuto. Após 24 horas as células foram transferidas par nitrogênio líquido para armazenagem permanente. Exemplo 2. Preparação melhorada de linhagens de células de ave imortalizadas a) Preparação de células primárias
[000107] O floco de origem para ovos de pato foi certificado como isento de Salmonella enteritidis e S. typhimurium; Mycoplasma galli- septicum e M. synoviae; casos de leucose, retículo-endoteliose, psita- cose, influenza avícola, hepatite de pato, e doença de Derzsy. Os animais não foram intencionalmente vacinados contra parvovírus e ne- nhum caso de parvovírus foi detectado. Os animais no floco de origem foram vacinados contra S. enteritidis e S. typhimurium; Pasteurella multicodica; o metapneumovírus de rinotraqueíte de peru; e o parami- xovírus que ocasiona doença de Newcastle.
[000108] Os ovos foram deixados equilibrar sem agitação a temperatura ambiente e após dois dias foram incubados a 38°C em uma câmara abafada, girada freqüentemente alternado para +45°C e - 45°C.
[000109] Embriões de pato foram sacrificados para isolamento de células primárias após uma ou três semanas de incubação. Os ovos foram transferidos para uma unidade cGMP (um laboratório fechado que realiza como delineado por Current Good Manufacturing Practices) e a casca foi esterilizada por agitação com 70% de isopropanol sob um manto de fluxo laminar. Todas as etapas a seguir, foram realizadas na unidade GMP sob condições estéreis com soluções ou meio definidos.
[000110] Os ovos foram abertos cuidadosamente, os embriões transferidos para um disco petri grande e aniquilados imediatamente por decapitação. Amostras dos órgãos seguintes foram removidas: cérebro, retina, fígado, esôfago, coração, e membranas extra-embrio- nárias.
[000111] Além disso, as células dos somitos foram preparadas de um embrião de 8 dias de idade.
[000112] Todas as amostras foram enxaguadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato; Gibco/Invitrogen, USA) tratadas com tripsina (Gibco/Invitrogen, USA) por 1 a 10 minutos, e trituradas em meio de cultura DMEM:F12 (Gibco/Invitrogen, USA) suplementado com FCS a 10% (Biochrom AG, Alemanha) por passagem repetida através de uma seringa 18G. As amostras homogeneizadas foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2. Os restos foram removidos das células aderentes por troca do meio no dia seguinte. b) Construções de Plasmídeo
[000113] Plasmídeos de expressão para E1A, E1B, Orf 22, e Gam1 foram construídos por extração das regiões alvo relevantes do DNA genômico de adenovírus sorotipo 5 ou vírus do tipo selvagem CELO órfão letal para embrião de galinha, respectivamente, por PCR e a inserção aos vetores equipada com fosfoglicerato quinase humana ou de camundongo (hPGK ou mPGK) camundongo CMV (moCMV) ou promotores tk (figura 1).
[000114] As seqüências de adenovírus para E1A e E1B foram ampliadas de vírus do tipo selvagem usando ProofStart polimerase (Qiagen, Alemanha). Os seguintes iniciadores foram usados: VS182 ACTCGAGCTGACGTGTAGTGTATT (SEQ ID NO: 1) VS183 CACACGCAATCACAGGTT (SEQ ID NO: 2) para ampliar a região E1A e VS184 ACTCGAGTCATGGAGGCTTGGGAGT (SEQ ID NO: 3) VS185 ACACATTTCAGTACCTCA (SEQ ID NO: 4) para ampliar a região E1B. Ambos os fragmentos foram primeiramente clonados no pPCR4-TOPO-cego (Invitrogene, USA).
[000115] O construtor E1B perde o receptor de emenda da mensagem E1B. Foi portanto substituído por um sintético ampliado usando iniciadores do íntron líder de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Como matriz, foi usado o DNA genômico de PBG04 (DMSZ ACC2577), um hetero-hibridoma de murídeo-humano. Iniciadores usados para ampliação: VintSA-F AAGGTACCCTCCCTAGTCCCAGTGA (SEQ ID NO: 5) VintSA-R CAATGTACACAGTGGGCTCCTGTGG (SEQ ID NO: 6) Os genes GAM-1 e ORF-22 foram ampliados de vírus CE- LO tipo selvagem com iniciadores. V206 AAC CTC GAG ACC CCC CTG TAC ATT CTA (SEQ ID NO: 11) e V207 GCC GTT AAC TTC AGG GAT TGG TTA CAG (SEQ ID NO:12), V208 CAC CTC GAG TCC GGA TTA AGA TGA ACG (SEQ ID NO: 13) e V209 CCA GTT AAG AGG TGA ACC ATT TAT ACA G (SEQ ID NO: 14) respectivam ente.
[000116] Exemplos representativos para os plasmídeos resultantes são dados com plasmídeo 49E (fatores adenovirais sob o controle de promotores PGK humano e CMV de camundongo; (SEQ ID NO: 9), plasmídeo 25F (fatores CELO sob controle de promotores PGK de camundongo e humanos; SEQ ID NO: 10), plasmídeo 60E (fatores adenovirais sob controle de promotores PGK humano e tk; SEQ ID NO: 18) e plasmídeo 36E (fator CELO sob controle de promotor PGK de camundongo; SEQ ID NO: 19) (ver também a Figura 1).
[000117] A integridade dos plasmídeos de expressão foi confirmado por seqüenciamento. Os plamídeos não são equipados para expressar fatores de resistência contra antibióticos (tais como ampicilina) em células eucariontes. c) Transfecção
[000118] Culturas primárias foram transfectadas com plasmídeos de expressão para E1 ou Orf22/Gam1 logo após isolamento ou após sub- cultivo único. Dependendo do experimento, os plasmídeos foram transfectados como super-espiralados ou após linearização com a enzima de restrição Sca I (New Englands Biolabs, USA). Experimentos iniciais comparando reagentes de transfecção lipossomal (Effectene; Qiaen, Alemanha) e dendromérico (Polyfect; Qiaen, Alemanha), sugeriram melhores eficiências com Effectene. A transfecção foi realizada como a seguir: 2 μg de DNA total foi diluído e 200 μl de tampão EC fornecido e misturados com 16 μl de intensificador. Após uma incubação de 2-5 minutos a temperatura ambiente, 20 μl de reagente Effec- tene foi adicionados. Após 5-10 minutos a temperatura ambiente esta mistura foi aplicada a células em um disco de 8 cm2 sob 1 ml de meio de cultura. Após 2-5 horas mais 1,5 ml de meio de cultura foi adicionado. No dia seguinte, o meio foi substituído com 2 l de meio de cultura fresco, e a seguir uma vez por semana. A transfecção vitoriosa foi confirmada em experimentos paralelos com um gene repórter.
[000119] As células foram continuamente passadas em meio DMEM:F12 contendo FCS a 10%.
[000120] Vinte dias após a transfecção, alterações na morfologia em sub-populações definidas (focos; figura 2) de algumas culturas foram observadas, em outras culturas os focos não apareceram ou não foram capazes de competir com a proliferação potencial das células primárias; novamente outras culturas sofreram morte celular maciça e senescência logo após a transfecção.
[000121] Um grande número de focos independentes foram expandidos das culturas transfectadas com plasmídeo 49E com células derivadas de fígado, retina e membrana extra-embrionária. Na passagem 10, por exemplo, linhagem de células 12A07-A10 derivada de membrana extra-embrionária de pato as células transformadas com plas- mídeo 49E foram isoladas e depositadas em DSMZ.
[000122] Os focos também foram obtidos de culturas transfectadas com plasmídeo 60E com células da retina e somitos.
[000123] No plasmídeo 49E, PGK e promotores CMV de camundongo, dirigem a expressão de E1A e E1B, respectivamente. O plasmídeo 60E (SEQ ID NO: 18) também codifica a região Ad5-E1 total, mas a expressão da região E1'B protetora é dirigida por tk, ou seja, um promotor que não é forte o bastante como o promotor CMV de camundongo (porém mais robusto do que o promotor E1B nativo). Coerente com o efeito protetor conferido por E1B muito poucos focos em menos amostras de células foram obtidos com este construtor, quando comparado com os resultados com o plasmídeo 49E.
[000124] A formação de focos com , tanto aparência de célula primária e fenótipo transformado também foi observada em culturas de fígado transfectadas com plasmídeo 36E de CELO (SEQ ID NO: 19) e 25F (SEQ ID NO: 10).
[000125] Culturas com focos foram expandidas por tratamento com tripsina por 2-3 minutos e a ressuspensão em meio DMEM:F12 para transferência a vasos de cultura recentes.
[000126] Para preservação altamente refrigerada a intervalos regulares, as células foram removidas com tripsina, ressuspensas em meio DMEM:F12 contendo 10% de FCS, coletadas por centrifugação a 200 x g por 10 minutos, ressuspensas em meio DMEM:F12 contendo 50% de FCS e 10% de DMSO (Sigma, USA) para uma concentração de aproximadamente 3 x 106 células por ml, e resfriadas com uma taxa de 1 °C por minuto para -80°C. Após 24 horas, as células foram transferidas para nitrogênio líquido par armazenagem permanente. Exemplo 3: Ensaio de imunofluorescência para transfecção estável
[000127] Culturas de células potencialmente imortalizadas foram semeadas em laminas de vidro e deixadas proliferar por vários dias, antes da fixação com metanol resfriado em gelo pro 10 minutos. As células fixadas foram incubadas com anticorpos contra proteínas E1A e E1B 55K, anticorpos secundários, e corante fluorescente específico contra os últimos, de acordo com métodos de imunofluorescencia padrão (Becton Dickinson, UK n° 55415 anticorpo contra E1A, diluído 10: Oncogene, USA n° DP08-100UG anticorpo contra E1B 55K, diluído 1:30; anticorpo secundário direcionado contra camundongo ou rato, respectivamente, e conjugado a biotina, ambos de Jackson Immunol Research USA, diluído 1:8; visualização com Jacson Immuno Research, USA n° 016-070-084 conjugado estreptavidina-Texas Red, diluído 1:100). Células primárias ainda abundantes em células primárias imortalizadas não ainda totalmente estabelecidas e prontamente distinguíveis por morfologia, providenciaram um controle negativo interno conveniente para especificidade de anticorpo. 293 células (células de rim embrionário humano) que expressam estavelmente a região E1 de Ad5 prestaram-se como um controle positivo. DAPI (4',6-diamidino-2- fenilindol; Sigma USA) para 1 μg/ml foi adicionados na incubação final para manchar os núcleos das células para fins de orientação.
[000128] Um forte sinal para E1A e 55K foi observado apenas nas células que passaram por alterações característica na morfologia, confirmando imortalização vitoriosa pelos plasmídeos transfectados (Figura 3). Além disso, a transformação espontânea, uma possibilidade formal, não foi observada, porque todas as células com fenótipo alterado era E1-positivas. Nenhuma das células com fenótipo primário expressou proteínas E1. Embora possível na transfecção de superespira- lados, onde a linearização do plasmídeo no processo de integração ocorre em posições aleatórias nenhum dos focos examinados apresentou expressão E1A na ausência da expressão E1B, enfatizando mais ainda o requisito para rompimento de caminho duplo para imorta- lização. Exemplo 4: ensaio para retrovírus endógeno e exógeno
[000129] Um problema comum encontrado, quando são produzidas vacinas em fibroblastos de galinha primários é a contaminação com retrovírus exógeno ou endógeno. A diversidade da família de retrovírus é complexa demais para predizer se uma dada espécie é um portador para retrovírus. Relatos da literatura, portanto, são caso comum, limi- tados a um subconjunto de família de retrovírus, por exemplo, EAV- HP/ALV subgrupo J (Smith, L.M. et al., J. Gn. Virol. 80 (pt1):261-8 (1999)) e então, apenas a um subconjunto de espécies de ave.
[000130] Uma confirmação confiável de contaminação com retrovírus portanto, focalizaria em um motivo comum presente nesses vírus. A diversidade da seqüência impossibilita métodos de detecção à base de ácido nucléico. Contudo, comum a todos os retrovírus é a presença da enzima transcriptase reversa. O sobrenadante de focos expandido de células de fígado de pato imortalizadas com plasmídeo 49E foi, portanto ensaiado por PCR intensificada com produto à base de sonda quantitativa para transcriptase reversa (Q-PERT) e comparado com vários controles inter alia CHO como controles positivos e 293 células como controle negativo (ver abaixo e figura 4) para detectar, tanto atividade retroviral endógena ou contaminação com retrovírus livre. O ensaio é uma modificação da literatura (Lovatt A. et al., J. Virol. Methods 82(2): 185-200 (1999)). Em suma: os retrovírus foram enriquecidos de sobre- nadante de cultura por ultracentrifugação com 100000 x g por uma barreira de 20% de sacarose em PBS para remover restos celulares. Virions (caso presentes) foram ressuspensos em tampão de lise (50 mM Tris pH 7,8, 80 mM Kl,2,5 mM DTT, 0,75 mM EDTA, 0,5% Triton X-100) e misturado com tampão de substrato (10 mM cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP; 15 μM de iniciador específico [GCC TTT GAG AGT TAC TCT TTG; SEQ ID NO: 15], e 0,5 mg/ml de DNA de esperma de arenque fragmentado Promega Corp n° D1811] contendo um RNA modelo (5 μg/ml de RNA de vírus do mosaico de gramínea [ Promega Corp, USA, n° D1541] que é transcrito reversamente caso a atividade RT esteja presente na amostra. cDNA do RNA modelo é am-pliado por PcR com iniciador (AAA CAC TGT ACG GCA CCC GCA TT, SEQ ID NO: 16) e (GCC TTT GAG AGITAÇÃO TAC TCT TTG, SEQ ID NO: 17), e detectado via fluorescência verde SYBR em um Sistema de Detecção de Seqüência AB 7000 usando o QPCR SYBR Green ROX Mix n° AB-1163 de Abgene, UK, de acordo com as instruções do fabricante.
[000131] A figura 4 demonstra forte atividade RT em células de CHO como esperado de relatos na literatura (por exemplo, Anderson K. P et al., Virology 181 (1): 305-311 (1991)). Com essas células como controle positivo e células 293 humanas isentas de atividade retroviral como controle negativo, é definido um parêntese que permite a interpretação de atividade RT desconhecida no sobrenadante de culturas de célula (figura 4, quadrados cheios e triângulos cheios).
[000132] Descobriu-se atividade RT moderada em fibroblastos de embrião de galinha (figura 4, símbolos losangos cheios).
[000133] O sinal para atividade RT no sobrenadante de célula de pato foi congruente com o sinal para atividade RT em 293 células, e tanto novamente congruente como um controle representando a detecção limite para nosso ensaio consistindo do RNA modelo não incubado com RT (Figura 4, comparar curvas com triângulos vazios e cheios e círculos cinza). Níveis equivalentes da intensidade do sinal (delta Rn) foram separados por pelo menos dois números do ciclo entre amostras de células CHO e fibroblastos de embrião de galinha (que, para esses experimentos são derivados de uma fonte conhecida por ser apenas fracamente RT positiva) por pelo menos quatro ciclos de números entre amostras de células CHO e o controle negativo 293 e a cultura de célula de pato. Assim, contrário às células de galinha as células de pato descritas não apresentam atividade RT e assim, preenchem um atributo essencial para adequabilidade nas aplicações farmacêuticas. Exemplo 5 - Vírus Ankara da Varíola Modificado (MVA)
[000134] A adequabilidade dos focos expandidos como substrato para ampliação de MVA foi determinada para linhagens de fígado, retina, somitos e membrana extra-embrionária. A tabela 1 e a figura 5 mos- tram resultados obtidos por infecção das linhagens de células com um inóculo preparado de uma preparação em grande escala de MVA (ATCC n° VR-1508) em fibroblastos embrionários de galinha primários. Os dados na tabela obtidos por infecção com um moí (multiplicidade de infecção ou número de partículas infecciosas por célula hospedeira) de 0,1 demonstra que a produção viral da retina e células de somito (em unidades de formação de placa por ml) são comparáveis com ou até mesmo excede a produção obtida com células CEFp.
[000135] Tabela 1: Comparação de títulos de vírus obtidos e infecções paralelas de 1 a 5 x 105 células em cavidades de placas de 24 poços. O vírus de entrada foi ajustado por uma moí de 0,1. CEFp, fi- broblastos embrionários de galinha primários recentes, membrana, membrana extra-embrionária.
[000136] Unidades formadoras de placa para MVA em células de pato foram determinadas como a seguir: vírus MVA foi recuperado de células infectadas após 48 horas de sobrenadante e de célula aderentes abertas para o congelamento-descongelamento repetido. Células VERO (rim de macaco verde africano) foram semeadas em placas de 96 poços (2 x 104 células por poço) e infectadas com diluições seriais de 10X de suspensão contendo MVA no dia seguinte. Dois dias após, as culturas foram fixadas com metanol, e as células infectadas incubadas com anticorpos de vírus da varíola policlonais (Quartett, Alemanha, n° 9503-2057 a uma diluição de 1:1000 em PBS contendo 1% de soro bovino fetal) durante 1 hora a 37°C. Duas etapas de lavagem foram realizadas com Tween 20 a 0,05% contendo PBS (Sigma Corp, USA) e anticorpo secundário para o anticorpo específico para varíola é adicionados a uma diluição de 1:1000 em soro bovino fetal a 1% contendo PBS. Este anticorpo secundário é acoplado à enzima peroxidase, que catalisa uma reação de cor com incubação com reagente AEC (3-amino-9-etil-carbozol; 0,3 mg/ml em 0,1 M de tampão de acetato pH 5,0 contendo 0,015% de H2O2). Focos infectados são identificados por microscopia óptica e unidades de formação de placa soa calculadas da diluição máxima de suspensão MVA que rende uma reação corante positiva.
[000137] A figura 5 ilustra a produção de vírus por célula. A produção de vírus por célula correlaciona-se com a permissividade de uma dada célula hospedeira para um dado vírus. A permissividade é influenciada por propriedades bioquímicas tais como densidade do receptor ou eficiência de processamento de proteínas estruturais virais. A figura 5 demonstra que o número de partículas infecciosas liberadas por célula da retina ou por célula de somito compara-se favoravelmente com as partículas infecciosas obtidas para o fibroblasto embrionário de galinha.
[000138] A divisão de "produção de vírus por célula" por "moí" rende o tamanho explodido, a relação do vírus de entrada para vírus de saída. Tamanho explodido é equivalente à ampliação do vírus e assim, importante para estimar o custo e recursos necessários par produção em grande escala. Os tamanhos explodidos determinados no exemplo descrito são 374 para CEFp, 513 para células da retina, e 1108 para células derivadas de somito. Células da retina e células de somito rendem melhores valores do que fibroblastos de embrião de galinha primários frescos, e, portanto, deveriam providenciar substratos superiores para produção em grande escala de MVA.
[000139] Os resultados insatisfatórios para ampliação de MVA obti- dos com células derivadas de fígado ou de membrana extra- embrionária não podem ser estendidos a outras famílias de vírus: fica evidente aos peritos na técnica, que, a ampliação de outros vírus, por exemplo, vírus da influenza relevantes para vacina, podem ser extremamente vitoriosos nessas células.
[000140] É conceptível que, com a subseqüente passagem do vírus em uma dada célula hospedeira, o título da produção diminua. Tais eventos podem ocorrer, caso as células hospedeiras suportem a maioria, porém não todas as etapas nos vários estágios do ciclo infeccioso. Para endereçar esta questão, passagens seriais de MVA foram realizadas em células de retina de pato transformada com plasmídeo 49E. Os dados na Figura 6 demonstram, que, MVA não é perdido, com a passagem nessas células; a níveis similares de vírus de entrada ajustados para uma moí de 0,3 (dado em barras na figura 6) o tamanho explodido (quadrados cheios) aumentar em nove vezes de 35 para 315. O motivo para o aumento no tamanho explodido pode ser devido às propriedades melhoradas da célula hospedeira, à medida que aumenta o número de passagens.
[000141] Em suma, retina de pato, e células derivadas de somito obtidas por transfecção da região Ad5-E1 sob condições cGMP suportam, estavelmente, a ampliação de MVA com uma eficiência comparável a ou melhor do que fibroblastos embrionários de galinha primários. Devido à natureza altamente atenuada de MVA, linhagens de células convencionais para produção em grande escala de vírus não são adequadas. É surpreendente a descoberta de que linhagens de células de pato planejadas realizaram melhor do que células de galinha primárias na propagação de MVA e, portanto são capazes de providenciar novas plataformas de produção para este importante candidato a vacina. As linhagens de células descritas foram geradas sob condições cGMP e são, portanto adequadas para aplicação farmacêutica.
Claims (5)
1. Método para preparar uma linhagem de células de somi- to ou retina de pato imortalizada, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de transformar/transfectar uma célula de somito ou retina de pato com pelo menos uma primeira região gênica e pelo menos uma segunda região gênica, em que a pelo menos uma primeira região gênica é a região E1A de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1193 a 2309 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar aos pb 4230 a 3113 da SEQ ID NO: 9, e a pelo menos uma segunda região gênica é a região E1B de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1145 a 3007 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência complementar aos pb 2345 a 550 da SEQ ID NO: 9.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a transformação/transfecção não viral da célula de somito ou retina de pato.
3. Uso de uma linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada, caracterizado pelo fato de que é para produção de vírus, em que a linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada é transformada/transfectada com pelo menos uma primeira região gênica e pelo menos uma segunda região gênica, em que a pelo menos uma primeira região gênica é a região E1A de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1193 a 2309 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar aos pb 4230 a 3113 da SEQ ID NO: 9, e a pelo menos uma segunda região gênica é a região E1B de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1145 a 3007 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência complementar aos pb 2345 a 550 da SEQ ID NO: 9.
4. Método para produção de vírus, caracterizado pelo fato de que compreende (i) o contato de vírus com uma linhagem de células de so- mito ou retina de pato imortalizada, e (ii) o cultivo de tais vírus na referida linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada, em que a linhagem de células de somito ou retina de pato imortalizada é transformada/transfectada com pelo menos uma primeira região gênica e pelo menos uma segunda região gênica, em que a pelo menos uma primeira região gênica é a região E1A de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1193 a 2309 da SEQ ID NO: 7 ou uma sequência complementar aos pb 4230 a 3113 da SEQ ID NO: 9, e a pelo menos uma segunda região gênica é a região E1B de adenovírus humano 5 (Ad5) com uma sequência de pb 1145 a 3007 da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência complementar aos pb 2345 a 550 da SEQ ID NO: 9.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para produção de um vírus da catapora na linhagem de células de somito ou retina de pato.
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