JP2021531042A - 癌細胞、免疫細胞及び腫瘍微小環境へのシアリダーゼの送達 - Google Patents
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Abstract
Description
一種以上のヒト又は細菌性シアリダーゼ又はその機能的部分をコードする核酸分子を含む組換え腫瘍溶解性ウィルスを含む組成物がここで提供される。当該腫瘍溶解性ウィルスは、ポックスウィルス、アデノウィルス、疱疹ウィルス又はいずれかの他の適した腫瘍溶解性ウィルスを由来とするであろう。適した組換え腫瘍溶解性ウィルスは、シアリダーゼをコードする配列か、又はシアリダーゼ活性を持つその一部分を含む発現カセットを腫瘍溶解性ウィルスに挿入することにより、作製が可能である。
腫瘍溶解性ウィルス
ワクシニア・ウィルス、コックスサッキー・ウィルス、アデノウィルス、麻疹、ニューカッスル病ウィルス、セネカ・ヴァリー・ウィルス、コックスサッキーA21、水疱性口内炎ウィルス、パルボウィルスH1、レオウィルス、疱疹ウィルス、レンチウィルス、及びポリオウィルス並びにパルボウィルス、ワクシニア・ウィルス・ウェスターン・リザーブ株、GLV-1h68、ACAM2000、及びオンコVEX GFPを含め、多くの腫瘍溶解性ウィルスが入手可能である。これらの腫瘍溶解性ウィルスのゲノムを遺伝子改変して、 シアリダーゼの全部又は触媒部分を含むたんぱく質をコードするヌクレオチド配列を導入することができる。シアリダーゼの全部又は触媒活性部分を含むたんぱく質をコードするヌクレオチド配列は、当該シアリダーゼが感染細胞で発現されるよう、ウィルス発現カセットの制御下に置かれる。
VSVは複数の腫瘍溶解性ウィルス用途に用いられてきた。加えて、VSVは、ワクチン処置(REF 18337377、29998190)を通じてHPV陽性子宮頸部癌を処置する方法としてヒト乳頭腫ウィルス(HPV)の抗原性たんぱく質を発現させるべく、あるいは腫瘍に対する免疫反応を増加させる抗炎症性因子を発現させるべく(REF 12885903)、操作されてきた。付加的な遺伝子をコードするようVSVを操作する多様な方法が解説されている (REF 7753828)。簡単に説明すると、VSV RNA ゲノムを、上流にT7 RNA ポリメラーゼ・プロモータを持つ相補的な二重鎖DNAに逆転写し、VSVゲノム内で遺伝子挿入にとって適した位置(例えばVSV糖たんぱく質(G)をフランクする非コーディング5‘又は3’領域内)を特定する (REF 12885903)。制限酵素消化を、例えばMlu I 及び Nhe Iで行うことで、直線化DNA分子を生じさせることができる。適した制限部位でフランクされた目的の遺伝子をコードするDNA分子から成るインサートをこの直線化したVSVゲノムDNAに連結することができる。得られたDNAをT7ポリメラーゼで転写すると、目的の挿入遺伝子を含有する完全なVSVゲノムRNAが出来上がる。このRNA分子を、例えばトランスフェクション及びインキュベーションなどで哺乳動物細胞に導入すると、目的の遺伝子にコードされたたんぱく質を発現するウィルス子孫ができる。
Ad5は、必須E1aウィルス遺伝子の発現を駆動してウィルス複製とRb経路欠陥腫瘍細胞への細胞障害性とを制限する網膜芽細胞腫(Rb)経路欠陥腫瘍特異的転写調節因子であるヒトE2F-1プロモータを含有する(REF 16397056)。腫瘍細胞の特質は、Rb経路の欠陥である。目的の遺伝子のAd5内への操作はAd5ゲノムへの連結を通じてなされる。目的の遺伝子を含有するプラスミドを作成し、例えばAsiSI 及びPacIで消化する。PSF-AD5 (REF シグマ社 OGS268)などのAd5 DNAプラスミドをAsiSI 及び PacI で消化し、組換え細菌性リガーゼで連結するか、又は、Ad5を発現するヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の作成について報告されているように、REで消化した目的の遺伝子と一緒に寛容性E.coli内に同時トランスフェクトする(REF 16397056)。DNAを回収し、ヒト胚性腎細胞(HEK293)又はHeLaなどの寛容性ホストにトランスフェクトすると、目的の遺伝子を発現するウィルスができる。
VVの多用な株が、OV治療法のテンプレートとして用いられてきた。一致する特徴はウィルス性チミジンキナーゼ(TK)遺伝子の削除であり、それによりウィルスの生産的複製が、活発に複製する細胞、即ち新生物細胞に依存的になるため、これらのVVは、VVのウェスターン・リザーブ(WR)株を例とする癌細胞の優先的感染性を有することになる(REF 25876464)。ゲノムに目的遺伝子を挿入したVVの作成は、下に詳述する通り、lox部位を用いた相同組換えで達成される。
当該の組換え腫瘍溶解性ウィルスは、ヒト細胞上のグリカンからシアル酸(N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)を除去することができるシアリダーゼの全部又は触媒部分を含むポリペプチドを発現する。一般的にはNeu4Acは、多種のシアリルトランスフェラーゼのいずれかにより、アルファ2,3、アルファ2,6又はアルファ2,8結合を介してたんぱく質上のグリカンの最後から2番目の糖に結合する。通常のヒトシアリルトランスフェラーゼを表1に要約する。
発現されるポリペプチドには、シアリダーゼ又はその触媒部分に加え、選択に応じて、当該たんぱく質の治療的活性に寄与するペプチド又はたんぱく質配列を含めることができる。例えば、当該たんぱく質は、当該たんぱく質と細胞表面との間の相互作用を促進するアンカードメインを含むことができる。該アンカードメイン及びシアリダーゼドメインは、治療的シアリダーゼがシアル酸残基を除去する細胞外活性を呈することができるように、当該たんぱく質が標的細胞膜に結合できる、又は標的細胞膜近傍に結合できるいずれかの適した方法で配置することができる。当該たんぱく質は二つ以上のアンカードメインを有することができる。当該のポリペプチドが二つ以上のアンカードメインを有する場合、当該アンカードメインは、同じであっても、又は異なっていてもよい。当該たんぱく質は二つ以上のシアリダーゼドメインを有していてもよい。化合物が二つ以上のシアリダーゼドメインを有する場合は、当該シアリダーゼドメインは同じ出逢っても、又は異なっていてもよい。当該たんぱく質が複数のアンカードメインを含む場合、当該アンカードメインは(リンカーの有無に関係なく)直列に並んでいても、あるいはシアリダーゼドメインなどの他のドメインと交互に並んでいてもよい。化合物が複数のシアリダーゼドメインを含む場合、当該シアリダーゼドメインは(リンカーの有無に関係なく)直列に並んでいても、あるいは他のドメインと交互に並んでいてもよい。
腫瘍溶解性ウィルスが発現するシアリダーゼドメインはアルファ2,3を介して結合したNeu4Acに特異的であっても、アルファ2,6を介して結合したNeu5Acに特異的であってもよく、あるいはアルファ2,3結合又はアルファ2,6結合を介して結合したNeu5Acを切断してもよい。多種のシアリダーゼが表2−5に解説されている。
ここで用いられる「細胞外アンカードメイン」又は「アンカードメイン」とは、標的細胞上の外側表面にある、又は外側表面上にある実体、あるいは、標的細胞の外側表面上の近傍にある実体と相互作用するいずれかの成分である。アンカードメインは、本開示の化合物を標的細胞の外側表面上又は外側表面近傍に保持するのに役立つ。細胞外アンカードメインは、好ましくは1)癌細胞の表面上に発現した分子、あるいは、癌細胞の表面上に発現した分子の成分、ドメイン、又はエピトープ、2)癌細胞の表面上に発現した分子に付着した化学的実体、あるいは3)癌細胞周囲の細胞外マトリックスの分子、に結合するとよい。
シアリダーゼ又はその触媒ドメインを含むたんぱく質は、選択的に、当該化合物のドメインを接合する1つ以上のポリペプチドリンカーを含むことができる。リンカーは、あるたんぱく質のドメインの最適な距離、又は折り畳みを提供するために用いることができる。リンカーにより接合される、たんぱく質のドメインは、シアリダーゼドメインでも、アンカードメインでも、あるいは、たんぱく質の安定性を高めたり、精製を容易にするなどの付加的な機能を提供するような、当該化合物のいずれか他のドメイン又は成分であってもよい。いくつかの好適なリンカーにはアミノ酸グリシンがある。例えば、nが1-20である配列 (GGGGS (SEQ ID NO:10))を有するリンカーである。
実施例1: DAS181処置により腫瘍細胞上の表面シアル酸が減少する
この研究では、いくつかの腫瘍細胞のシアル酸負荷に対するDAS181の影響を調べた。簡単に説明すると、A549 (ヒト肺胞基底上皮腺癌腫)及びMCF(ヒト乳房上皮腺癌腫)腫瘍細胞に対するα-2,3 及び α-2,6 シアル酸修飾のFAC及び画像ベースの定量を行った。A549及びMCF7 細胞のシアル酸除去後のガラクトース露出はPNA-FITCによるフローサイトメトリ分析及び撮像法を用いて検出された。上で論じたように、それぞれマッキア・アムレンシス・レクチン(原語:Maackia Amurensis Lectin)II (MAL II) 及びサンブカス・ニグラ・レクチン(原語:Sambucus Nigra Lectin) (SNA)で検出することのできる二つのシアル酸は、α-2,3 結合又はα-2,6 結合により最後から2番目の糖に最もよく付着している。加えて、表面のガラクトース(例えばシアル酸除去後に露出するガラクトース)はピーナッツ・アグルチニン(原語:Peanut Agglutinin)(PNA)を用いて検出することができる。
A549細胞を赤色蛍光たんぱく質で遺伝子標識した(A549-赤色)。新鮮なヒトPMBCを採集し、多様なサイトカイン及び抗体の組み合わせで刺激して、エフェクターT細胞(CD3、CD38 及びIL-2)又は、場合によっては、T 細胞及びNK細胞(CD3、CD28、IL-15 及び IL-21)を活性化させた。次に、活性化PBMCを、DAS181(100nM)に暴露してあったA549-赤色細胞と一緒に同時培養した。PBMCによる腫瘍細胞致死を生存細胞撮像とInucuCyteによる定量で観察した。細胞培地を採集し、ELISAで分析して、PBMCによるサイトカイン産生を評価した。
この研究では、NK細胞媒介型致死に対する腫瘍溶解性ワクシニアウィルス(ウェスターン・リザーブ)及びDAS181に対する影響が調べられた。シアリダーゼ活性を欠く異型たんぱく質であるDAS185がコントロールとして用いられた。
この研究では、単球由来樹状細胞へのDAS181の影響を調べた。シアリダーゼ活性を欠く異型たんぱく質であるDAS185はコントロールとして用いられた。
A549細胞を赤色蛍光たんぱく質で遺伝子標識した(A549-赤色)。腫瘍細胞の増殖と、腫瘍溶解性アデノウィルス(Ad5)による致死を、DAS181の存在下及び不在下で生存細胞撮像及びIncuCyteによる定量で観察した。細胞培地を採集してPBMCによるサイトカイン産生のELISA測定に向けた。図15に示すように、DAS181は、腫瘍溶解性アデノウィルス媒介型腫瘍細胞致死及び成長阻害を増加させた。
A549細胞を赤色蛍光たんぱく質で遺伝子標識した(A549-赤色)。新鮮なヒトPMBCを採集し、適したサイトカイン及び抗体の組み合わせで刺激してエフェクターT細胞を活性化させた。次に活性化PBMCを、腫瘍溶解性アデノウィルス(Ad5)有り又は無しでDAS181で処置してあったA549-赤色細胞と一緒に同時培養した。PBMCによる腫瘍細胞致死を生存細胞撮像及びIncuCyteによる定量で観察した。細胞培地を採集してPBMCによるサイトカイン産生のELISA測定に向けた。図16に示すように、DAS181は、PBMCの存在下で腫瘍溶解性アデノウィルスと一緒に存在する腫瘍細胞致死を有意に増加させた。
DAS181の発現のためにデザインされた構築物を17に概略的に示す。
CV-1 細胞を6ウェルプレートにDMEM-10% FBS/ウェル中、5x105 個の細胞/2 mlになるように播種し、一晩成長させる。ウィルスストックをDMEM/2% FBSで MOI 0.05に希釈することで親VV ウィルス(1 ml/ウェル) を調製する。CV-1ウェルから培地を取り除き、すぐにVVを加え、1−2時間、培養する。CV-1 細胞はこの時点で 60-80% コンフルエントであるはずである。1.5 ml の試験管でトランスフェクション混合液。各トランスフェクションのために、9 ul のジェネジュースを91 ul の無血清DMEMで希釈し、室温で5分間、インキュベートする。ピペットを2又は3回、出し入れすることで3ug のpSEM-1-TK-DAS181-GFP DNA をやさしく加える。室温に15分間放置する。CV-1ウェルからVVウィルスを吸引し、細胞を2 ml の無血清DMEMで洗う。2 ml のDMEM-2% FBS を加え、DNA-ジェネジュース溶液を一滴一滴、加える。37°C で48-72 時間、又は、細胞すべてが円形化するまでインキュベートする。繰り返しピペッティングして細胞を回収する。回収した細胞をまずドライアイス/エタノール槽内に配置し、その後37℃の水槽中で解凍してボルテックスすることによる、回収した細胞の反復的な凍結−解凍を通じて細胞からウィルスを放出させる。該凍結−解凍サイクルを三回、繰り返す。細胞ライセートは-80℃で保存することができる。
CV-1 細胞を6ウェルプレートにDMEM-10% FBS/ウェル中、5x105 個の細胞/2 mlになるように播種し、一晩、成長させる。細胞ライセートを加えるとCV-1細胞は 60-80% コンフルエントであるはずである。懸濁液中の物質が分散するまで、30秒間の4サイクル、超音波コンバーター・プローブを付けた音波ディスメンブレータを用いて氷上で細胞ライセートを音波処理する。DMEM-2% FBSに細胞ライセートを入れて10倍の連続希釈液を作製する。1ウェル当り1 mlの細胞ライセート−培地を 希釈度10-2、10-3、10-4で加え、37℃でインキュベートする。ピペットの先端を用いて、よく分離されたGFP+ プラークを選ぶ。ピペットの先端を僅かに揺らしてプラーク中の細胞を引き剥がす。0.5 mlのDMEM 培地を含有するマイクロ遠心管に静かに移す。凍結−解凍を三回行って、音波処理する。プラーク分離物の同じプロセスを3−5回、繰り返す。
CV-1 細胞を 5x105 個の細胞/2ml DMEM-10% FBS/ウェルになるように播種し、一晩、6-ウェルプレートで成長させる。本実験を開始する際にはCV-1 はコンフルエントであるはずである。250 ul のプラーク・ライセート/1ml DMEM-2% FBSで1ウェルを感染させ、37℃で2時間、インキュベートする。プラークライセートを取り除き、2 mlの新鮮な DMEM-2% FBSを加え、細胞が円形化するまで48-72 時間、インキュベートする。ピペット吸引を繰り返すことで細胞を収集し、凍結−解凍を三回、行い、音波処理する。細胞ライセートの半分を4ml のDMEM-2%FBS に入れて加え、75-CM2 フラスコ内でCV-1細胞を感染させ、2時間後、ウィルスを取り除き、12 ml のDMEM-2%FBS を加え、(細胞が円形化するまで) 48-72 時間、培養する。細胞を回収し、5分間1800 Gで遠心して沈降させ、上清を廃棄して1 mlのDMEM-2.5% FBSに再懸濁させる。
CV-1 細胞を 5x105 個の細胞/2ml DMEM-10% FBS/ウェルになるように播種し、一晩、6-ウェルプレートで成長させる。ウィルス・ストック用に、ウィルスをDMEM-2% FBSで希釈して 50 ul のウィルス/4950 ul のDMEM-2% FBS (A、10-2)、500ul A/4500ul 培地 (B、10-3)、及び500 ul B/4500 ul 培地(C、10-4)、10-7 乃至10-10 とする。培地を取り除き、PBSで1回、洗浄し、細胞に 1ml のウィルスを複式にして感染させる。該細胞を1時間、インキュベートし、プレートを10分毎に揺動する。1時間後、ウィルスを取り除いて2 ml のDMEM-10% FBSを加え、48時間、インキュベートする。培地を取り除き、20%のエタノールに入れた1 ml の0.1% 結晶性バイオレットを15分間、室温で加える。培地を取り除き、室温で24時間、乾燥させる。プラークを計数し、1ml当りのプラーク形成単位 (pfu) で表す。
CV-1 細胞に VV-DAS181をMOI 0.2で感染させる。48時間後、 CV-1 細胞を採集した。DNA をウィザードSVゲノミックDAN 精製システムを用いて抽出し、DAS181 PCR 増幅のテンプレートとして用いた。PCR は標準的なPCRプロトコール及びプライマー配列(SialF: GGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCA 及びSialR: CCGGTTGCGCCTATTCTTGCCGTTCTTGCCGCC)を用いて行われた。予想されたPCR 産物 (1251 bp) が見出された。
CV-1 細胞を6ウェルプレートにプレートした。該細胞をMOI 0.1 又はMOI 1のシアリダーゼ-VV又はコントロールVV で形質導入した。24時間後、トランスフェクトした細胞を採集し、単個細胞懸濁液をPBS で3x106/500 ulになるように作製した。たんぱく質抽出用に細胞ライセートをシグマ社の哺乳動物細胞溶解キットを用いて調製し (Sigma、MCL1-1KT)、上清を採集した。シアリダーゼ (DAS181)活性はノイラミニダーゼ検定キット(Abcam、ab138888)をメーカーの指示に従って用いて測定された。1 nM、2 nM、及び10 nMのAS181をコントロールのVV-細胞ライセートに加え、標準曲線を作成した。シアリダーゼ-VV を感染させた1×106個の細胞が、1mlの培地中0.78nM−1.21 nM のDAS181に等しいDAS181発現する。図20に示すように、該DAS181 はin vitroでシアリダーゼ活性を有する。
シアリダーゼ-VVがDC活性化及び成熟を促進できるかを判定するために、接着性ヒトPBMC を5x106 細胞になるように100 ng/ml のGM-CSF 及び50 ng/ml の IL-4 を添加した 3 ml の培地に再懸濁させ、次に、6ウェルプレートで、1ウェル当り同じ濃度のGM-CSF及びIL-4を添加した新鮮な2mlの培地中で培養した。48時間後、該細胞をシアリダーゼ-VV 感染腫瘍細胞ライセート、VV-感染腫瘍細胞ライセート、合成DAS181たんぱく質を加えたVV-感染腫瘍細胞ライセート、又はLPS(陽性コントロール)の存在下で培養した。更に24時間後、CD86、CD80、MHC-II、MHC-I の発現をフローサイトメトリで判定した。図21に示すように、シアリダーゼ-VVは、樹状細胞活性化及び成熟を示すマーカーの発現を促進する。
DAS181がIFN-ガンマ(IFNr) 及びIL-2 発現を誘導することによりヒトT細胞を活性化できるかを評価するために、10 ug/ml のCD3抗体を加えることでヒトPBMCを活性化し、48時間毎にIL-2を加えることで増殖を更に刺激した。15日目に、2.5% FBSに入れたMOI 0.5、1、又は2のVVに腫瘍細胞 (A549) を2時間、感染させた。活性化T細胞を1 ug/mlのCD3抗体の存在下で5:1 又は10:1 のエフェクター:標的比になるように該培養株に加えた。更に24時間後、腫瘍細胞障害性を測定し、サイトカインアレイ向けに細胞培地を収集した。図22に見られるように、シアリダーゼ-VVは、CD3活性化T細胞によるIL2 及びIFN-ガンマ発現をVVよりも有意に大きく誘導する。 加えて、図23に見られるように、シアリダーゼ-VVはVVよりも強い抗腫瘍応答を5:1のE:Tで惹起する。
Claims (16)
- シアリダーゼドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え腫瘍溶解性ウィルスであって、前記シアリダーゼをコードする前記ヌクレオチド配列がプロモータに作動可能に連結されている、組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記腫瘍溶解性ウィルスが、ワクシニアウィルス、レオウィルス、セネカ・ヴァリー・ウィルス(SVV)、水疱性口内炎ウィルス (VSV)、ニューカッスル病ウィルス(NDV)、単純疱疹ウィルス(HSV)、モルビリウィルスウィルス、レトロウィルス、インフルエンザウィルス、シンビスウィルス、ポックスウィルス、麻疹ウィルス、サイトメガロウィルス(CMV)、レンチウィルス、及びアデノウィルスから成る群より選択される、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記腫瘍溶解性ウィルスがポックスウィルスであり、前記ポックスウィルスがワクシニアウィルスである、請求項2に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記ワクシニアウィルスが、ドライヴァックス(原語:Dryvax);リスター(原語:Lister);M63;LIVP;ティアンタン(原語:Tian Tan);改良ワクシニアアンカラ(原語:Vaccinia Ankara);ニューヨーク・シティ・ボード・オブ・ヘルス、ダイレン、イケダ、LC16M8、タシケント、IHD-J、ブライトン、ダイレンI、コノート(原語:Connaught)、エルストリー、ワイエス、コペンハーゲン、及びウェスタン・リザーブ株;ワクシニアウィルス株江ストリー、ワクシニアウィルス株CL、ワクシニアウィルス株レダーレ−コリオアラントイック(原語:Lederle-Chorioallantoic)、ワクシニアウィルス株ASから成る群より選択される、請求項3に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記シアリダーゼがヒトシアリダーゼ又は細菌性シアリダーゼである、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記シアリダーゼが Neu5Ac アルファ(2,6)-Gal シアリダーゼ又はNeu5Ac アルファ(2,3)-Gal シアリダーゼである、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記ヒト又は細菌性シアリダーゼが、クロストリジウム-ペルフリンゲンス・シアリダーゼ、アクチノマイセス-ヴィスコサス・シアリダーゼ、アンスロバクター-ウレアファシエンス・シアリダーゼ、NEU2、及びNEU4から成る群より選択される、請求項1に記載の腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記プロモータがウィルス初期プロモータである、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記腫瘍溶解性ウィルスがポックスウィルスであり、前記プロモータがポックスウィルス初期プロモータである、請求項2に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記腫瘍溶解性ウィルスがタリモジーン-ラヘルパレプヴェック(原語:Talimogene Laherparepve)である、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記ウィルスがレオウィルスである、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記ウィルスがE1ACR2欠失を有するアデノウィルスである、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記シアリダーゼがDAS181である、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記シアリダーゼがSEQ ID NO:1 又は SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 前記ウィルスがワクシニアウィルスウェスターン・リザーブである、上記請求項のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウィルス。
- 請求項1乃至15のいずれかの組換えウィルスを、必要とする患者に投与するステップを含む、充実腫瘍を処置する方法。
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