CN112739374A - 唾液酸酶向癌细胞、免疫细胞和肿瘤微环境的递送 - Google Patents
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Abstract
描述了用于表达唾液酸酶的重组溶瘤病毒及其在治疗癌症，特别是治疗实体瘤中的用途。
Description
背景
在美国，癌症是第二大死亡原因。近年来，癌症免疫疗法，包括免疫检查点抑制剂、具有嵌合抗原受体的T细胞和溶瘤病毒取得了巨大进步。
溶瘤病毒是天然存在的或经遗传修饰的病毒，其在使健康细胞不受伤害的情况下感染癌细胞，在癌细胞中复制，并且最终杀死癌细胞。报道了溶瘤性单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)T-VEC在436例具有不可切除的IIIB、IIIC或IV期黑素瘤的患者中的最近完成的III期临床试验满足其主要终点，与在接受GM-CSF的患者中持久响应率为2.1％相比，接受T-VEC的患者中的持久响应率为16.3％。基于来自该试验的结果，FDA在2015年批准了T-VEC。
来自至少8种不同物种的溶瘤病毒构建体已经在临床试验的各个阶段中被测试，所述物种包括腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1、新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、麻疹病毒(measles virus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、塞内加谷病毒(Seneca Valley virus)和痘苗病毒(vaccinia virus)。已经变得清楚的是，溶瘤病毒在患有癌症的患者中是良好耐受的。然而，溶瘤病毒作为独立治疗的临床益处仍然有限。由于担心溶瘤病毒的安全性，在临床前和临床研究两者中仅使用高度减毒的溶瘤病毒(天然无毒的或通过遗传工程减毒的)。由于溶瘤病毒的安全性现在已经被良好地确立，是时候设计和测试具有最大抗肿瘤效力的溶瘤病毒。具有稳健溶瘤作用的溶瘤病毒将释放大量的肿瘤抗原，从而产生强的免疫治疗作用。
概述
本文提供了包含重组溶瘤病毒的组合物，所述重组溶瘤病毒包含编码一种或更多种人类唾液酸酶或细菌唾液酸酶或其功能部分的核酸分子。溶瘤病毒可以来源于痘病毒(poxvirus)、腺病毒、疱疹病毒(herpes virus)或任何其他合适的溶瘤病毒。合适的重组溶瘤病毒可以通过将包含编码唾液酸酶或其具有唾液酸酶活性的部分的序列的表达盒插入溶瘤病毒来产生。
许多癌细胞是高唾液酸化的。本文描述的重组溶瘤病毒能够向肿瘤细胞和肿瘤细胞环境递送唾液酸酶。所递送的唾液酸酶可以减少肿瘤细胞上存在的唾液酸，并且使肿瘤细胞更容易被免疫细胞、基于免疫细胞的疗法和其他治疗剂杀死，这些免疫细胞、基于免疫细胞的疗法和治疗剂的有效性因癌细胞的高唾液酸化而降低。
还提供了用于将唾液酸酶递送至肿瘤微环境的方法。在肿瘤微环境中，唾液酸酶可以除去癌细胞上的末端唾液酸残基，从而降低免疫疗法试剂进入的障碍并促进针对癌细胞的细胞免疫。
当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞来源于如此修饰的细胞。
术语“病毒”或“病毒颗粒”根据其在病毒学中的一般普通含义被使用，并且是指包括病毒基因组(例如DNA、RNA、单链、双链)、病毒衣壳和相关蛋白，以及在包膜病毒(例如疱疹病毒、痘病毒)的情况下，包含脂质和任选地宿主细胞膜的组分的包膜，和/或病毒蛋白的病毒体。
术语“痘病毒”根据其在病毒学中的一般普通含义被使用，并且是指能够感染脊椎动物和无脊椎动物，在其宿主细胞质中复制的痘病毒科(Poxviridae family)的成员。在实施方案中，痘病毒病毒体具有直径约200nm和长度约300nm的尺寸，并且具有单个、线性、双链区段形式的DNA的基因组，通常为130-375千碱基。术语痘病毒包括但不限于痘病毒科的所有属(例如乙型昆虫痘病毒(betaentomopoxvirus)、亚塔痘病毒(yatapoxvirus)、鹿痘病毒(cervidpoxvirus)、丙型昆虫痘病毒(gammaentomopoxvirus)、野兔痘病毒(leporipoxvirus)、猪痘病毒(suipoxvirus)、软疣痘病毒(molluscipoxvirus)、鳄鱼痘病毒(crocodylidpoxvirus)、甲型昆虫痘病毒(alphaentomopoxvirus)、山羊痘病毒(capripoxvirus)、正痘病毒(orthopoxvirus)、禽痘病毒(avipoxvirus)和副痘病毒(parapoxvirus))。在实施方案中，痘病毒是正痘病毒(例如，天花病毒(smallpox virus)、痘苗病毒(vaccinia virus)、牛痘病毒(cowpox virus)、猴痘病毒(monkeypox virus))、副痘病毒(例如，羊痘病毒(orf virus)、假牛痘病毒(pseudocowpox virus)、牛流行性口炎病毒(bovine popular stomatitis virus))、亚塔痘病毒(例如，特纳痘病毒(tanapoxvirus)、雅巴猴肿瘤病毒(yaba monkey tumor virus))或软疣痘病毒(例如，传染性软疣病毒)。在实施方案中，痘病毒是正痘病毒(例如牛痘病毒Brighton毒株、浣熊痘病毒Herman毒株(raccoonpox virus strain Herman)、野兔痘病毒Utrecht毒株、痘苗病毒WR毒株、痘苗病毒IHD毒株、痘苗病毒Elstree毒株、痘苗病毒CL毒株、痘苗病毒Lederle-Chorioallantoic毒株或痘苗病毒AS毒株)。在实施方案中，痘病毒是副痘病毒(例如，羊痘病毒NZ2毒株或假牛痘病毒TJS毒株)。
“唾液酸酶催化结构域蛋白”是包含唾液酸酶的催化结构域的蛋白，或是包含与唾液酸酶的催化结构域基本上同源的氨基酸序列，但不包含催化结构域来源的唾液酸酶的全部氨基酸序列的蛋白，其中唾液酸酶催化结构域蛋白保持与催化结构域来源的完整唾液酸酶基本上相同的活性。唾液酸酶催化结构域蛋白可以包含不是来源于唾液酸酶的氨基酸序列，但这不是必需的。唾液酸酶催化结构域蛋白可以包含来源于一种或更多种其他已知蛋白质的氨基酸序列或与一种或更多种其他已知蛋白质的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列，或者可以包含一个或更多个不是来源于其他已知蛋白质的氨基酸序列或不是与其他已知蛋白质的氨基酸序列基本上同源的氨基酸。
附图描述
图1：通过荧光显微术(通过FITC-SNA)检测A549细胞和MCF细胞上的2,6唾液酸。A549细胞和MCF细胞被固定并在37℃与FITC-SNA一起孵育持续1小时，然后在荧光显微镜下成像以显示FITC-SNA标记的细胞(左)和用明视野细胞的覆盖(右)。
图2：DAS181处理有效除去A549细胞上的2,6唾液酸、2,3唾液酸并暴露半乳糖。将A549在37℃用DAS181处理持续2小时，并且与染色试剂一起孵育1小时，然后在荧光显微镜下成像，以显示肿瘤细胞上唾液酸的有效除去。
图3：DAS181处理而不是DAS185处理有效除去A549细胞上的2,6唾液酸。将A549在37℃用DAS181处理持续30分钟或2小时，并且与FITC-SNA一起孵育持续1小时，然后使用流式细胞术检查以显示肿瘤细胞上2,6唾液酸的有效除去。
图4：DAS181处理而不是DAS185处理有效除去A549细胞上的2,3唾液酸。将A549在37℃用DAS181处理持续30分钟或2小时，并且与FITC-MALII一起孵育持续1小时，然后使用流式细胞术检查以显示肿瘤细胞上2,3唾液酸的有效除去。
图5：DAS181处理而不是DAS185处理有效暴露A549细胞上的半乳糖。将A549在37℃用DAS181处理持续30分钟或2小时，并且与FITC-PNA一起孵育持续1小时，然后使用流式细胞术检查以显示半乳糖在肿瘤细胞上的有效暴露。
图6：DAS181处理和PBMC刺激方案不影响A549-红细胞增殖。将A549-红细胞以2k/孔接种过夜，然后更换含有左侧所列试剂的培养基。在添加试剂(0hr)之后立即开始IncuCyte扫描，并且按计划每3hr扫描一次。通过分析细胞核(红色)计数来监测A549-红细胞增殖。动力学读数揭示，在不存在PBMC的情况下，媒介物、DAS181或各种刺激试剂对A549细胞增殖没有影响。
图7：A549-红细胞在有或没有DAS181处理的情况下在与来自供体1的PBMC共培养之后的细胞毒性的检测。这些结果示出，DAS181处理显著增强来自供体1的PBMC的抗肿瘤细胞毒性。将A549-红细胞以2k/孔接种过夜，然后在存在培养基(无活化)、CD3+CD28+IL-2(T细胞活化)或CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21(T细胞和NK细胞活化)的情况下，与100K/孔供体-1PBMC(E:T＝50:1)共培养。在0hr和添加PBMC后72hr，通过IncuCyte拍摄代表性图像。
图8：A549-红细胞在有或没有DAS181处理的情况下在与来自供体2的PBMC共培养之后的细胞毒性的检测。这些结果示出，DAS181处理显著增强来自供体2的PBMC的抗肿瘤细胞毒性。将A549-红细胞以2k/孔接种过夜，然后在存在培养基(无活化)、CD3+CD28+IL-2(T细胞活化)或CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21(T细胞和NK细胞活化)的情况下，与100k/孔供体-2PBMC(E:T＝50:1)共培养。在0hr和添加PBMC后72hr，通过IncuCyte拍摄代表性图像。
图9A-图9C：A549-红细胞在有或没有DAS181处理的情况下在与来自供体1的PBMC共培养之后的细胞毒性的检测。这些结果示出，DAS181处理显著增强来自供体1的PBMC的抗肿瘤细胞毒性。绿线指示没有DAS181的情况，并且蓝线指示有DAS-181处理的情况。将A549-红肿瘤细胞以2k细胞/孔接种在96孔板中。在过夜孵育之后，将与(A)培养基、(B)CD3/CD28/IL-2或(C)CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21混合的来自供体1的PBMC按指示的E:T比添加到每个孔中。同时，添加DAS 181(100nM)。通过IncuCyte每3hr扫描一次板，持续共72hr。通过分析RFP细胞计数来监测增殖。
图10A-图10C：A549-红细胞在有或没有DAS181处理的情况下在与来自供体2的PBMC共培养之后的细胞毒性的检测。这些结果示出，DAS181处理显著增强来自供体2的PBMC的抗肿瘤细胞毒性。绿线指示没有DAS181的情况，并且蓝线指示有DAS-181处理的情况。将A549-红肿瘤细胞以2k细胞/孔接种在96孔板中。在过夜孵育之后，将与(A)培养基、(B)CD3/CD28/IL-2或(C)CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21混合的来自供体2的PBMC按指示的E:T比添加到每个孔中。同时，添加DAS 181(100nM)。通过IncuCyte每3hr扫描一次板，持续共72hr。通过分析RFP细胞计数来监测增殖。
图11：如通过MTS测定测量的，DAS181增强痘苗病毒引起的NK介导的肿瘤裂解。
表明与无酶活性的(enzyme-dead)DAS185相比，DAS181单独促进体外NK细胞介导的U87肿瘤杀伤。*＝T-检验P值<0.05。
图12：如通过MTS测定测量的，DAS181增加痘苗病毒引起的NK介导的肿瘤杀伤。*＝T-检验P值<0.05，表明DAS181增加VV引起的体外NK细胞介导的对U87细胞的杀伤。
图13：DAS181显著增强单独培养或暴露于VV感染的肿瘤细胞的人类DC细胞中成熟标志物(CD80、CD86、HLA)的表达。*＝T-检验P值<0.05。
图14：DAS181显著增强THP-1来源的巨噬细胞的TNF-α产生。*＝T-检验P值<0.05。
图15：DAS181处理促进溶瘤腺病毒介导的肿瘤细胞杀伤和生长抑制。将A549-红肿瘤细胞以2K细胞/孔接种在96孔板中。在过夜孵育之后，按指示添加DAS181媒介物、溶瘤腺病毒和DAS181。CD3/CD28/IL-2也以先前描述的量添加到每个孔中。图示出，DAS181加溶瘤腺病毒有效地降低肿瘤细胞增殖。
图16A-图16B:DAS181处理增强痘苗病毒引起的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤。将A549-红肿瘤细胞以2K细胞/孔接种在96孔板中。在过夜孵育之后，以10K/孔(A)或40K/孔(B)的密度添加新鲜的PBMC。如图中所指示的添加CD3、CD28、IL-2、DAS181和溶瘤腺病毒，然后通过IncuCyte进行定时扫描。图示出，DAS181加溶瘤腺病毒显著增强人类PBMC介导的肿瘤细胞根除。
图17：用于表达唾液酸酶的痘苗病毒构建体的一部分的示意图。
图18：用于表达唾液酸酶(DAS181)的痘苗病毒构建体中某些元件的序列。
图19：用于表达唾液酸酶(DAS181)的痘苗病毒构建体的一部分的序列。
图20A-图20B:由唾液酸酶-VV表达的DAS181具有针对含有唾液酸的底物的体外活性。(A)0.5nM、1nM和2nM的DAS181活性的标准曲线。(B)感染有唾液酸酶-VV的1×106个细胞在体外在1ml培养基中表达相当于0.78nM-1.21nM DAS181的DAS181。
图21：唾液酸酶-VV增强树突状细胞成熟。将GM-CSF/IL4来源的人类DC与唾液酸酶-VV或VV感染的U87肿瘤细胞裂解物一起培养持续24小时。LPS的DAS181用作对照。收集DC，并且用针对CD80、CD86、HLA-DR和HLA-ABC的抗体染色。DC成熟标志物的表达通过流式分析来确定。结果表明唾液酸酶-VV增强DC成熟。*＝T-检验P值<0.05。
图22：唾液酸酶-VV诱导T细胞表达IFN-γ和IL2。将CD3抗体活化的人类T细胞在存在唾液酸酶-VV或VV感染的肿瘤细胞裂解物的情况下与A594肿瘤细胞共培养持续24小时，并且通过ELISA测量细胞因子IFNr或IL-2表达。结果表明唾液酸酶-VV细胞裂解物诱导人类T细胞表达IFNr和IL2。*＝T-检验P值<0.05。
图23：唾液酸酶-VV增强T细胞介导的肿瘤细胞裂解活性。将CD3 Ab活化的人类T细胞与唾液酸酶-VV或VV感染的A594肿瘤细胞共培养持续24小时，并且通过MTS测定确定肿瘤细胞生存力。结果表明，肿瘤细胞的唾液酸酶-VV感染导致肿瘤杀伤增强。*＝T-检验P值<0.05。
详细描述
溶瘤病毒
许多溶瘤病毒，包括痘苗病毒、柯萨奇病毒、腺病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、塞内加谷病毒、柯萨奇病毒A21、水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、细小病毒H1、呼肠孤病毒、疱疹病毒、慢病毒和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)以及细小病毒、痘苗病毒Western Reserve、GLV-1h68、ACAM2000和OncoVEX GFP是可获得的。这些溶瘤病毒的基因组可以被遗传修饰，以插入编码包含唾液酸酶的全部或催化部分的蛋白质的核苷酸序列。编码包含唾液酸酶的全部或催化活性部分的蛋白质的核苷酸序列被置于病毒表达盒的控制下，使得唾液酸酶被感染的细胞表达。
水疱性口炎病毒(VSV)
VSV已经用于多种溶瘤病毒应用。此外，VSV已经被工程化以表达人乳头瘤病毒(HPV)的抗原蛋白，作为一种经由接种疫苗治疗HPV阳性宫颈癌的方法(REF 18337377、29998190)，并且表达促炎因子以增加对肿瘤的免疫应答(REF 12885903)。已经描述了用于工程化VSV以编码额外基因的各种方法(REF 7753828)。简言之，VSV RNA基因组用上游T7RNA聚合酶启动子逆转录成互补的双链DNA，并且鉴定了VSV基因组内用于基因插入的合适位置(例如，在VSV糖蛋白(G)侧翼的非编码5’或3’区域内)(REF 12885903)。限制酶消化可以例如用Mlu I和Nhe I完成，产生线性的DNA分子。由侧接合适的限制性位点的DNA分子(所述DNA分子编码感兴趣的基因)组成的插入物可以连接到线性化的VSV基因组DNA中。产生的DNA可以用T7聚合酶转录，产生包含插入的感兴趣的基因的完整VSV基因组RNA。将该RNA分子例如经由转染和孵育引入到哺乳动物细胞，导致病毒后代表达由感兴趣的基因编码的蛋白质。
腺病毒血清型5(Ad5)
Ad5含有人E2F-1启动子，这是一种视网膜母细胞瘤(Rb)途径缺陷的肿瘤特异性转录调节元件，其驱动必需的E1a病毒基因的表达，限制病毒复制和对Rb途径缺陷的肿瘤细胞的细胞毒性(REF 16397056)。肿瘤细胞的标志是Rb途径缺陷。将感兴趣的基因工程化到Ad5中是通过连接到Ad5基因组中来完成的。含有感兴趣基因的质粒经由例如AsiSI和PacI产生并消化。Ad5 DNA质粒，例如PSF-AD5(REF Sigma OGS268)，用AsiSI和PacI消化，并且用重组细菌连接酶连接，或者与感兴趣的RE消化的基因共转化到允许的大肠杆菌(E.coli)中，如关于表达人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的Ad5的产生报道的(REF16397056)。回收DNA并转染到允许的宿主，例如人类胚胎肾细胞(HEK293)或HeLa中，产生表达感兴趣的基因的病毒。
痘苗病毒(VV)
各种VV毒株已经被用作用于OV疗法的模板；统一的特征是病毒胸苷激酶(TK)基因的缺失，使得病毒依赖于活跃复制细胞，即赘生性细胞进行生产性复制，并且因此这些VV具有癌细胞的优先感染性，通过VV的Western Reserve(WR)毒株例示(REF 25876464)。在基因组中插入的感兴趣的基因的VV的产生是通过利用lox位点的同源重组来完成的，如在下文更详细描述的。
用于溶瘤病毒表达的具有唾液酸酶活性的多肽
重组溶瘤病毒表达包含唾液酸酶的全部或催化部分的多肽，唾液酸酶能够从人类细胞上的聚糖中去除唾液酸(N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac))。一般来说，Neu5Ac通过各种唾液酸转移酶中的任一种，经由α2，3、α2，6或α2，8键连接至蛋白质上的聚糖中的倒数第二个糖。常见的人类唾液酸转移酶总结在表1中。
表1.Neu5Ac唾液酸转移酶的命名
HGNC：Hugo基因命名委员会(www.genenames.org)
具有唾液酸酶活性的多肽中的结构域
除了唾液酸酶或其催化部分之外，表达的多肽可以任选地包含有助于蛋白质的治疗活性的肽或蛋白质序列。例如，蛋白质可以包含促进蛋白质和细胞表面之间的相互作用的锚定结构域。锚定结构域和唾液酸酶结构域可以以允许蛋白质结合在靶细胞膜处或靶细胞膜附近的任何合适的方式排列，使得治疗性唾液酸酶可以表现出去除唾液酸残基的细胞外活性。蛋白质可以具有多于一个锚定结构域。在多肽具有多于一个锚定结构域的情况下，锚定结构域可以相同或不同。蛋白质可以具有多于一个唾液酸酶结构域。在化合物具有多于一个唾液酸酶结构域的情况下，唾液酸酶结构域可以相同或不同。在蛋白质包含多个锚定结构域的情况下，锚定结构域可以串联排列(有或没有接头)或在其他结构域诸如唾液酸酶结构域的交替侧上排列。在化合物包含多于一个唾液酸酶结构域的情况下，唾液酸酶结构域可以串联排列(有或没有接头)或在其他结构域的交替侧上排列。
唾液酸酶结构域
由溶瘤病毒表达的唾液酸酶结构域可以是对于经由α2,3键连接的Neu5Ac特异的、对于经由α2,6连接的Neu5Ac特异的，或者可以裂解经由α2,3键或α2,6键连接的Neu5Ac。在表2-表5中描述了多种唾液酸酶。
在本公开内容的化合物中可以使用可以裂解唾液酸残基和底物分子的剩余部分之间的多于一种类型的键的唾液酸酶，特别是可以裂解α(2,6)-Gal键和α(2,3)-Gal键两者的唾液酸酶。所包括的唾液酸酶是可以降解受体唾液酸Neu5Acα(2,6)-Gal和Neu5Acα(2,3)-Gal的大型细菌唾液酸酶。例如，可以使用来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)(GenBank登录号X87369)、粘放线菌(Actinomyces viscosus)(GenBankX62276)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)(GenBank AY934539)或Micromonospora viridifaciens(Genbank登录号D01045)的细菌唾液酸酶。本公开内容的化合物的唾液酸酶结构域可以包含大型细菌唾液酸酶的全部或部分氨基酸序列，或者可以包含与大型细菌唾液酸酶的全部或部分氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。在一种优选的实施方案中，唾液酸酶结构域包含由粘放线菌编码的唾液酸酶，诸如SEQ ID NO:1或2的唾液酸酶，或者诸如与SEQ ID NO:12基本上同源的唾液酸酶序列。在又另一种优选的实施方案中，唾液酸酶结构域包含从SEQ ID NO:12_的氨基酸274延伸至666的粘放线菌唾液酸酶的催化结构域，或基本上同源的序列。
另外的唾液酸酶包括人类唾液酸酶，诸如由基因NEU2(SEQ ID NO:8；Genbank登录号Y16535；Monti,E,Preti,Rossi,E.,Ballabio,A and Borsani G.(1999)Genomics 57:137-143)和NEU4((SEQ ID NO:9；Genbank登录号NM080741；Monti等人.(2002)NeurochemRes 27:646-663)编码的那些。本公开内容的化合物的唾液酸酶结构域可以包含唾液酸酶的全部或部分氨基酸序列，或者可以包含与唾液酸酶的全部或部分氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。优选地，在唾液酸酶结构域包含天然存在的唾液酸酶的一部分氨基酸序列，或包含与天然存在的唾液酸酶的一部分氨基酸序列基本上同源的序列的情况下，该部分包含与完整唾液酸酶基本上相同的活性。本公开内容还包括唾液酸酶催化结构域蛋白。如本文使用的，“唾液酸酶催化结构域蛋白”包含唾液酸酶的催化结构域，但不包含催化结构域来源的唾液酸酶的全部氨基酸序列。唾液酸酶催化结构域蛋白具有唾液酸酶活性。优选地，唾液酸酶催化结构域蛋白包含催化结构域序列来源的唾液酸酶的至少10％、至少20％、至少50％、至少70％的活性。更优选地，唾液酸酶催化结构域蛋白包含催化结构域序列来源的唾液酸酶的至少90％的活性。
唾液酸酶催化结构域蛋白可以包含其他氨基酸序列，诸如但不限于另外的唾液酸酶序列、源自其他蛋白质的序列、或非源自天然存在的蛋白质的序列的序列。另外的氨基酸序列可以执行许多功能中的任何一种，包括为催化结构域蛋白贡献其他活性，增强唾液酸酶催化结构域蛋白的表达、加工、折叠或稳定性，或者甚至提供蛋白质的期望的尺寸或间距(spacing)。
优选的唾液酸酶催化结构域蛋白是包含粘放线菌(A.viscosus)唾液酸酶的催化结构域的蛋白质。优选地，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸270-666。优选地，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含从粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸270至氨基酸290中的任何一个氨基酸开始，并在所述粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸665至氨基酸901中的任何一个氨基酸终止的氨基酸序列，并且缺少从氨基酸1延伸至氨基酸269的任何粘放线菌唾液酸酶蛋白序列。
在一些优选的实施方案中，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸274-681并且缺少其他粘放线菌唾液酸酶序列。在一些优选的实施方案中，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含粘放线菌唾液酸酶序列(SEQID NO:12)的氨基酸274-666并且缺少任何其他粘放线菌唾液酸酶序列。在一些优选的实施方案中，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸290-666并且缺少任何其他粘放线菌唾液酸酶序列。在又其他优选的实施方案中，粘放线菌唾液酸酶催化结构域蛋白包含粘放线菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO:12)的氨基酸290-681并且缺少任何其他粘放线菌唾液酸酶序列。
表2：工程化的唾液酸酶
表3：人类唾液酸酶
| 名称 | Uniprot标识符 | SEQ ID NO |
| 人类Neu 1 | Q99519 | 3 |
| 人类Neu 2 | Q9Y3R4 | 4 |
| 人类Neu 3 | Q9UQ49 | 5 |
| 人类Neu 4 | Q8WWR8 | 6 |
| 人类Neu 4同种型2 | Q8WWR8 | 7 |
| 人类Neu 4同种型3 | Q8WWR8 | 8 |
表4：主要与人类共生的生物体中的唾液酸酶
表5：另外的唾液酸酶
锚定结构域
如本文使用的，“细胞外锚定结构域”或“锚定结构域”是与位于靶细胞的外表面处或在靶细胞的外表面上或者与靶细胞的外表面紧邻的实体相互作用的任何部分。锚定结构域用于将本公开内容的化合物保留在靶细胞的外表面处或靶细胞的外表面附近。细胞外锚定结构域优选地结合1)在癌细胞的表面上表达的分子，或在癌细胞的表面上表达的分子的部分、结构域或表位，2)附接至在癌细胞的表面上表达的分子的化学实体，或3)癌细胞周围的细胞外基质的分子。
有用的锚定结构域结合硫酸肝素/硫酸乙酰肝素，一种普遍存在于细胞膜上的GAG。许多蛋白质特异性地结合硫酸肝素/硫酸乙酰肝素，并且这些蛋白质中的GAG结合序列已经被鉴定(Meyer,F A,King,M and Gelman,R A.(1975)Biochimica et BiophysicaActa392:223-232；Schauer,S.编著,第233页.Sialic Acids Chemistry,Metabolism andFunction.Springer-Verlag,1982)。例如，人类血小板因子4(PF4)(SEQ ID No:2)、人类白细胞介素8(IL8)(SEQ ID NO:3)、人类抗凝血酶III(AT III)(SEQ ID NO:4)、人类载脂蛋白E(ApoE)(SEQ ID NO:5)、人类血管相关迁移细胞蛋白(AAMP)(SEQ ID NO:6)或人类双调蛋白(SEQ ID NO:7)的GAG结合序列已经示出对肝素具有非常高的亲和力。
接头
包含唾液酸酶或其催化结构域的蛋白质可以任选地包含一个或更多个可以连接化合物的结构域的多肽接头。接头可以用于提供蛋白质的结构域的最佳间距或折叠。由接头连接的蛋白质的结构域可以是唾液酸酶结构域、锚定结构域或提供另外功能诸如增强蛋白质稳定性、促进纯化等的化合物的任何其他结构域或部分。一些优选的接头包括氨基酸甘氨酸。例如，具有序列(GGGGS(SEQ ID NO:10))n的接头，其中n为1-20。
实施例
实施例1：DAS181处理减少肿瘤细胞上的表面唾液酸
在本研究中，检查DAS181对某些肿瘤细胞的唾液酸负荷的影响。简言之，进行A549(人类肺泡基底上皮腺癌)和MCF(人类乳头上皮腺癌)肿瘤细胞上α-2,3和α-2,6唾液酸修饰的FACS和基于图像的定量。在A549和MCF7细胞中除去唾液酸之后，使用流式细胞术分析和成像方法通过PNA-FITC检测半乳糖暴露。如上文论述的，存在最常通过α-2,3键或α-2,6键附接至倒数第二个糖的两种唾液酸，它们可以分别通过朝鲜槐凝集素II(MAL II)和西洋接骨木凝集素(SNA)检测到。此外，可以使用花生凝集素(PNA)检测表面半乳糖(例如，在唾液酸除去之后暴露的半乳糖)。
图1描绘了通过荧光成像在A549细胞和MCF细胞上用FITC-SNA检测2,6唾液酸。
将A549细胞用不同浓度的DAS181处理，然后染色以对2,6连接的唾液酸(FITC-SNA)、2,3连接的唾液酸(FITC-MALII)或半乳糖(FITC-PNA)成像。如图2中可以看到的，DAS181有效地除去2,3连接的唾液酸和2,6连接的唾液酸两者并暴露半乳糖。
相比之下，由于Y348F突变而缺乏唾液酸酶活性的DAS181的变体DAS185不能除去2,6连接的唾液酸或2,3连接的唾液酸。如图3所示，A549细胞与DAS185的孵育基本上对表面2,3连接的唾液酸没有影响，而DAS181以浓度依赖的方式减少表面2,3连接的唾液酸。类似地，A549细胞与DAS185的孵育基本上对表面2,6连接的唾液酸没有影响，而DAS181以浓度依赖的方式减少表面2,6连接的唾液酸(图4)。与这些结果一致，A549细胞与DAS185的孵育基本上对表面半乳糖没有影响，而DAS181以浓度依赖的方式增加表面半乳糖。
实施例2：DAS181处理增加PBMC介导的肿瘤细胞杀伤
将A549细胞用红色荧光蛋白进行遗传标记(A549-红)。收获新鲜的人PBMC，并用各种细胞因子和抗体组合刺激，以活化效应T细胞(CD3、CD38和IL-2)，或者在一些情况下，活化T细胞和NK细胞(CD3、CD28、IL-15和IL-21)。然后将活化的PBMC与已暴露于DAS181(100nM)的A549-红细胞共培养。通过活细胞成像和用IncuCyte定量来监测PBMC的肿瘤细胞杀伤。收集细胞培养基并通过ELISA进行分析，以评估PBMC的细胞因子产生。
图6示出了用于刺激PBMC的处理和DAS181与用于刺激PBMC的处理的组合都不影响A549-红细胞增殖。
图7示出了与仅媒介物对照相比，DAS181显著增加由PBMC(供体1)介导的肿瘤细胞毒性(T细胞介导的肿瘤细胞毒性和NK细胞介导的肿瘤细胞毒性两者)。使用来自不同供体(供体2；图8)的PBMC观察到类似的结果。图9和图10分别呈现了图7和图8中呈现的数据的定量。
实施例3：溶瘤痘苗病毒和DAS181引起的NK细胞介导的肿瘤细胞的杀伤
在本研究中，检查了溶瘤痘苗病毒(Western Reserve)和DAS181对NK细胞介导的杀伤的影响。缺乏唾液酸酶活性的变体蛋白DAS185被用作对照。
简言之，将肿瘤细胞(U87-GFP)以5×104个细胞每孔(100ul)铺板在96孔组织培养板中的DMEM中，并在37℃孵育过夜。在第2天，将细胞在无胎牛血清的培养基中以MOI 0.5、1或2用VV感染持续2小时，并且然后暴露于1nM DAS181或1mM DAS185。然后将肿瘤细胞与纯化的NK细胞以效应物:肿瘤(E:T)＝1:1、5:1、10:1混合。将细胞在补充有2％FBS的培养基中培养，以降低神经氨酸酶/唾液酸酶背景。在24hr之后，通过MTS测定(96孔板)测量肿瘤杀伤，并且收集细胞培养基。通过ELISA测量IFNγ的表达。本研究的结果在图11和图12中示出，其中可以看到DAS181，但不是无活性的DAS185，增加溶瘤痘苗病毒对肿瘤细胞的杀伤。
实施例4：在存在肿瘤细胞的情况下，DAS181对DC成熟和抗原递呈活性的影响
在本研究中，检查了DAS181对单核细胞来源的树突状细胞的影响。缺乏唾液酸酶活性的变体蛋白DAS185被用作对照。
简言之，通过将5×106个贴壁PBMC重悬于3ml的补充有100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的培养基中来制备单核细胞来源的树突状细胞(DC)。在48hr之后，将2ml的补充有100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的新鲜培养基添加到每个孔中。在另外的72hr之后，将肿瘤细胞(U87-GFP)铺板在24孔板中的DMEM中。将肿瘤细胞在无FBS的培养基中以各种MOI用VV感染持续2小时。将在存在1nM DAS181或DAS185的情况下培养的DC与肿瘤细胞以1:1肿瘤细胞:DC比混合。然后分别通过流式细胞术和ELISA来测量和定量树突状细胞成熟(CD86、CD80、MHC-II、MHC-I的表达)和促炎性细胞因子(TNF-α)的产生。
如图13中可以看到的，无论细胞是单独培养还是与痘苗病毒感染的肿瘤细胞一起培养，DAS181都显著增加树突状细胞成熟标志物的表达。
本研究的结果证明，暴露于DAS181增加了树突状细胞的TNF-α分泌(图14)。
实施例5：在不存在免疫细胞的情况下，DAS181增加溶瘤腺病毒肿瘤细胞杀伤
将A549细胞用红色荧光蛋白进行遗传标记(A549-红)。通过活细胞成像和用IncuCyte定量来监测在存在或不存在DAS181的情况下的肿瘤细胞增殖和溶瘤腺病毒(Ad5)杀伤。收集细胞培养基，用于PBMC的细胞因子产生的ELISA测量。如图15所示，DAS181增加溶瘤腺病毒介导的肿瘤细胞杀伤和生长抑制。
实施例6：在存在PBMC的情况下，DAS181增加溶瘤腺病毒肿瘤细胞杀伤
将A549细胞用红色荧光蛋白进行遗传标记(A549-红)。收获新鲜的人PBMC，并用适当的细胞因子和抗体组合刺激以活化效应T细胞。然后将活化的PBMC与用DAS181(有或没有溶瘤腺病毒(Ad5))处理的A549-红细胞共培养。通过活细胞成像和用IncuCyte定量来监测PBMC的肿瘤细胞杀伤。收集细胞培养基，用于PBMC的细胞因子产生的ELISA测量。如图16所示，当在PBMC的存在下与溶瘤腺病毒一起存在时，DAS181显著增加肿瘤细胞杀伤。
实施例7：表达DAS181的溶瘤病毒的构建和表征
在图17中示意性地描绘了被设计用于表达DAS181的构建体。
为了产生表达DAS181的重组VV，修饰pSEM-1载体以包括编码DAS181的序列以及在编码GFP蛋白的序列侧翼的具有相同定向的两个loxP位点(pSEM-1-TK-DAS181-GFP)。DAS181表达在F17R晚期启动子的转录控制下，以将表达限制在肿瘤组织内。在图18和图19中示出了某些组分和构建体的一部分的序列。
使用Western Reserve VV作为亲本病毒。通过将pSEM-1-TK-DAS181-GFP重组到Western Reserve VV的TK基因中来产生表达DAS181的VV，从而产生VV-DAS181。
重组病毒可以如下产生。
转染：
将CV-1细胞以5×105个细胞/2ml DMEM-10％FBS/孔接种在6孔板中并生长过夜。通过在DMEM/2％FBS中以MOI 0.05稀释病毒储备液来制备亲本VV病毒(1ml/孔)。从CV-1孔中取出培养基并立即添加VV，并且培养持续1-2小时。CV-1细胞此时应该是60％-80％汇合。转染在1.5ml管中混合。对于每次转染，在91ul无血清DMEM中稀释9ul Genejuice，并在室温孵育持续5min。通过上下两次或三次用移液器吸取，轻轻添加3ug的pSEM-1-TK-DAS181-GFPDNA。在室温放置15min。从CV-1孔中抽吸VV病毒，并用2ml无血清DMEM洗涤细胞一次。添加2ml DMEM-2％FBS，并且逐滴地添加DNA-genejuice溶液。在37℃孵育持续48hr-72hr，或者直到所有细胞都聚集起来。通过反复用移液器吸取来收集细胞。通过使收获的细胞反复冷冻-解冻来从细胞释放病毒，即首先将收获的细胞放入干冰/乙醇浴中，并且然后在37℃水浴中使它们解冻并涡旋。重复冷冻-解冻循环三次。细胞裂解物可以储存在-80℃。
噬斑分离(Plaque Isolation)：
将CV-1细胞以5×105个细胞/2ml DMEM-10％FBS/孔接种在6孔板中，并生长过夜。当接受细胞裂解物时，CV-1细胞应该是60％-80％汇合。使用具有超声波转换器探头的声波破碎仪(sonic dismembrator)在冰上声处理细胞裂解物持续4个30s的循环，直到悬浮液中的物质分散。在DMEM-2％FBS中对细胞裂解物进行10倍系列稀释。以稀释度10-2、10-3、10-4添加1ml的细胞裂解物培养基/孔，在37℃孵育。使用移液管吸头挑取良好分离的GFP+噬斑。轻轻摇动移液管吸头，以刮掉并分离噬斑中的细胞。轻轻转移到含有0.5ml DMEM培养基的微量离心管中。冷冻-解冻三次，并且声处理。重复相同的噬斑分离过程3次-5次。
病毒扩增:
将CV-1细胞以5×105个细胞/2ml DMEM-10％FBS/孔接种在6孔板中并生长过夜。当开始实验时，CV-1应该汇合。用250ul噬斑裂解物/1ml DMEM-2％FBS感染1个孔，并在37℃孵育持续2h。取出噬斑裂解物，并且添加2ml新鲜的DMEM-2％FBS，并孵育持续48hr-72hr，直到细胞聚集起来(round up)。通过反复用移液管吸取来收集细胞、冷冻-解冻3次和声处理。在4ml DMEM-2％FBS中添加一半细胞裂解物，并且感染75-CM2烧瓶中的CV-1细胞，在2h之后，除去病毒，并且添加12ml DMEM-2％FBS，并培养48h-72h(直到细胞聚集起来)。收获细胞，在1800G旋降5min，然后弃去上清液并重悬于1ml DMEM-2.5％FBS中。
病毒滴定：
将CV-1细胞以5×105个细胞/2ml DMEM-10％FBS/孔接种在6孔板中并生长过夜。将病毒稀释在DMEM-2％FBS中，50ul病毒/4950ul DMEM-2％FBS(A，10-2)、500ul A/4500ul培养基(B，10-3)和500ul B/4500ul培养基(C，10-4)中，10-7至10-10用于病毒储备液。取出培养基，并用PBS洗涤1次，并且将细胞用1ml病毒稀释液一式两份感染。将细胞孵育持续1h，每10min摇动一次板。1h后，取出病毒，并添加2ml DMEM-10％FBS，并且孵育持续48h。取出培养基，添加1ml的在20％乙醇中的0.1％结晶紫，在室温持续15min。取出培养基并允许在室温干燥持续24hr。对噬斑进行计数并且表示为噬斑形成单位(pfu)/ml。
检测由VV-DAS181表达的DAS181：
将CV-1细胞用VV-DAS181以MOI 0.2感染。48小时后，收集CV-1细胞。使用WizardSV Genomic DAN纯化系统提取DNA，并将其用作DAS181 PCR扩增的模板。使用标准PCR方案和引物序列(SialF:GGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCA和SialR:CCGGTTGCGCCTATTCTTGCCGTTCTTGCCGCC)进行PCR。发现了预期的PCR产物(1251bp)。
实施例8：由痘苗病毒表达的DAS181在体外是有活性的
将CV-1细胞铺板在6孔板中。将细胞用唾液酸酶-VV或对照VV以MOI 0.1或MOI 1转导。在24hr之后，收集转染的细胞，并在PBS中以3×106/500ul制备单细胞悬液。使用用于蛋白提取的Sigma哺乳动物细胞裂解试剂盒(Sigma,MCL1-1KT)制备细胞裂解物，并收集上清液。唾液酸酶(DAS181)活性使用神经氨酸酶测定试剂盒(Abcam,ab138888)根据制造商的说明来测量。将1nM、2nM和10nM DAS181作为对照添加到VV-细胞裂解物中，并生成标准曲线。1×10^6个感染有唾液酸酶-VV的细胞在1ml培养基中表达的DAS181相当于0.78nM-1.21nM的DAS181。如图20所示，DAS181在体外具有唾液酸酶活性。
实施例9：痘苗病毒-唾液酸酶促进树突状细胞成熟
为了确定唾液酸酶-VV是否可以促进DC活化和成熟，将贴壁人PBMC以5×106个细胞重悬于补充有100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的3ml培养基中，然后在6孔板中培养，每孔具有补充有相同浓度的GM-CSF和IL-4的2ml的新鲜培养基。在48hr之后，在唾液酸酶-VV感染的肿瘤细胞裂解物、VV感染的肿瘤细胞裂解物、VV感染的肿瘤细胞裂解物加合成的DAS181蛋白或LPS(阳性对照)的存在下培养细胞。在另外的24hr之后，通过流式细胞术确定CD86、CD80、MHC-II、MHC-I的表达。如图21所示，唾液酸酶-VV促进指示树突状细胞活化和成熟的标志物的表达。
实施例10：唾液酸酶-VV增强T淋巴细胞介导的细胞因子产生和溶瘤活性
为了评估DAS181是否可以通过诱导IFN-γ(IFNr)和IL-2表达来活化人类T细胞，通过添加10ug/ml的CD3抗体来活化人PBMC，通过每48hr添加IL-2来进一步刺激增殖。在第15天，将肿瘤细胞(A549)在2.5％FBS培养基中以MOI 0.5、1或2用VV感染持续2小时。在1ug/ml的CD3抗体的存在下，将活化的T细胞以5:1或10:1的效应物:靶的比添加到培养物中。在另外的24hr之后，测量肿瘤细胞毒性，并且收集细胞培养基用于细胞因子测定。如图22中可以看到的，唾液酸酶-VV比VV诱导由CD3活化的T细胞表达的显著更高的IL2和IFN-γ表达。另外，如图23中可以看到的，以5:1的E:T，唾液酸酶-VV比VV引发更强的抗肿瘤反应。
某些唾液酸酶的序列
SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：5
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：15
SEQ ID NO：16
SEQ ID NO：17
SEQ ID NO：18
SEQ ID NO：19
SEQ ID NO：20
SEQ ID NO：21
SEQ ID NO：22
SEQ ID NO：23
SEQ ID NO：24
SEQ ID NO：25
尽管本文已经示出和描述了某些实施方案，但对于本领域技术人员来说将明显的是，这样的实施方案仅通过实例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解，在实践本公开内容时可以采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。意图以下权利要求限定本公开内容的范围，并且从而涵盖在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (16)
1.一种重组溶瘤病毒，包含编码包含唾液酸酶结构域的多肽的核苷酸序列，其中编码所述唾液酸酶的所述核苷酸序列可操作地连接至启动子。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：痘苗病毒、呼肠孤病毒、塞内加谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒属病毒、逆转录病毒、流感病毒、辛德比斯病毒、痘病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、慢病毒和腺病毒。
3.根据权利要求2所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且所述痘病毒是痘苗病毒。
4.根据权利要求3所述的溶瘤病毒，其中所述痘苗病毒选自Dryvax；Lister；M63；LIVP；Tian Tan；修饰的安卡拉痘苗；New York City Board of Health，Dairen，Ikeda，LC16M8，Tashkent，IHD-J，Brighton，Dairen I，Connaught，Elstree，Wyeth，Copenhagen和WesternReserve毒株；痘苗病毒Elstree毒株、痘苗病毒CL毒株、痘苗病毒Lederle-Chorioallantoic毒株、痘苗病毒AS毒株。
5.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述唾液酸酶是人类唾液酸酶或细菌唾液酸酶。
6.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述唾液酸酶是Neu5Acα(2,6)-Gal唾液酸酶或Neu5Acα(2,3)-Gal唾液酸酶。
7.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述人类唾液酸酶或所述细菌唾液酸酶选自由以下组成的组：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)唾液酸酶、粘放线菌(Actinomyces viscosus)唾液酸酶、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶、NEU2和NEU4。
8.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述启动子是病毒早期启动子。
9.根据权利要求2所述的重组溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是痘病毒，并且所述启动子是痘病毒早期启动子。
10.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是TalimogeneLaherparepvec。
11.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述病毒是呼肠孤病毒。
12.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述病毒是具有E1ACR2缺失的腺病毒。
13.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述唾液酸酶是DAS181。
14.根据权利要求1所述的重组溶瘤病毒，其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的重组溶瘤病毒，其中所述病毒是痘苗病毒Western Reserve。
16.一种治疗实体瘤的方法，包括向有相应需要的患者施用权利要求1-15中任一项所述的重组病毒。
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