ES2535101T3 - Mejoras en la preparación de antígenos en vacuna de virus de la gripe - Google Patents
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Abstract
Un proceso para interrumpir viriones de la gripe, que comprende las etapas de: (i) obtención de una composición que comprende viriones de la gripe en presencia de un tampón de fosfato; (ii) inactivar los viriones de la gripe en presencia de un tampón de fosfato; y (iii) la división de los viriones inactivados en presencia de un tampón de fosfato.
Description
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adecuados son, por ejemplo células de mono verde africano, como las células renales como en la línea celular Vero [43-45]. Células perro adecuados son, por ejemplo, células de riñón, como en las líneas celulares CLDK y MDCK.
[0059] Por lo tanto líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a: MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6 [46]; FRhL2; WI-38; etc. líneas celulares adecuadas están ampliamente disponibles por ejemplo, de la American Type Culture celular (ATCC) de recogida [47], a partir de los Coriell Cell Repositories [48], o de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Por ejemplo, el ATCC suministra varias células Vero diferentes con los números de catálogo CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 y CRL-1587, y suministra células MDCK con el número de catálogo CCL-34. PER.C6 está disponible en la ECACC bajo el número de depósito 96022940.
[0060] Las líneas celulares más preferidas son aquellas con tipo de mamífero glicosilación. Como una alternativa menos preferida a las líneas celulares de mamífero, el virus se puede cultivar en líneas celulares aviares [por ejemplo, refs. 49-51], incluidas las líneas celulares derivadas de patos (por ejemplo, la retina de pato) o gallinas. Ejemplos de líneas celulares aviares incluyen células de aves madre embrionarias [49,52] y células de la retina pato [50]. Las células madre embrionarias aviares adecuados, incluyen la línea celular EBx derivado de células madre embrionarias de pollo, EB45, EB14 y EB14-074 [53]. Fibroblastos de embrión de pollo (CEF) también se pueden utilizar. En lugar de utilizar células de aves, sin embargo, el uso de células de mamíferos significa que las vacunas pueden estar libres de ADN y proteínas de huevo aviar (tales como ovoalbúmina y ovomucoide), reduciendo así la alergenicidad.
[0061] Las líneas celulares más preferidos para los virus de influenza en crecimiento son líneas de células MDCK [54-57], derivados de Madin Darby de riñón canino. La línea original de células MDCK está disponible en la ATCC como CCL-34, pero los derivados de esta línea celular también se pueden utilizar. Por ejemplo, la referencia 54 desvela una línea celular MDCK que fue adaptada para el crecimiento en cultivo en suspensión ('MDCK 33016', depositado como DSM ACC 2219). Del mismo modo, la referencia 58 describe una línea celular MDCK-derivada que crece en suspensión en cultivo libre de suero ("B-702 ', depositado como FERM BP-7449). La referencia 59 divulga células MDCK no tumorigénicas, incluyendo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) y 'MDCK-SF103 '(PTA-6503). Referencia 60 da a conocer líneas celulares MDCK con alta susceptibilidad a la infección, incluyendo células MDCK.5F1 '(ATCC CRL-12042). Cualquiera de estas líneas de células MDCK se puede utilizar.
[0062] El virus puede obtenerse en células en cultivo adherente o en suspensión. Culturas microportadores también se pueden utilizar. En algunas realizaciones, las células así se pueden adaptar para el crecimiento en suspensión.
[0063] Las líneas celulares se cultivan preferentemente en medio de cultivo libre de suero y / o proteína de medios libres. Un medio se conoce como un medio libre de suero en el contexto de la presente invención en la que no hay aditivos de suero de origen humano o animal. Las células que crecen en tales cultivos contienen proteínas naturales sí mismos, sino un medio libre de proteínas, se entiende uno en el que la multiplicación de las células se produce con exclusión de proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos de proteínas y proteínas no séricas, pero pueden incluir opcionalmente proteínas tales como tripsina u otras proteasas que puedan ser necesarias para el crecimiento viral.
[0064] Las líneas celulares que soportan la replicación del virus de la gripe se cultivan preferentemente por debajo de 37 °C [61] (por ejemplo, 30 a 36 °C, o en alrededor de 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C) durante la replicación viral.
[0065] Los métodos para la propagación de virus de la gripe en células cultivadas generalmente incluye las etapas de inocular un cultivo de células con un inóculo de la cepa para ser cultivadas, el cultivo de las células infectadas durante un período de tiempo deseado para la propagación de virus, tales como, por ejemplo, como se determina por el título de virus o la expresión de antígenos (por ejemplo, entre 24 y 168 horas después de la inoculación) y recogiendo el virus propagado. Las células cultivadas se inoculan con un virus (medido por PFU o TCID 50) a la celda proporción de 1: 500 a 1: 1, preferiblemente de 1: 100 a 1: 5, más preferiblemente 01:50-01:10. El virus se añade a una suspensión de las células o se aplica a una monocapa de las células, y el virus se absorbe en las células durante al menos 60 minutos pero normalmente menos de 300 minutos, preferiblemente entre 90 y 240 minutos a 25 °C a 40 °C, preferiblemente de 28 °C a 37 °C. El cultivo celular infectado (por ejemplo, monocapas) puede ser removido ya sea por congelación-descongelación o por acción enzimática para aumentar el contenido viral de los sobrenadantes de cultivo cosechados. Los fluidos son cosechados a continuación, ya sea inactivado o almacenado congelado. Las células cultivadas pueden ser infectadas a una multiplicidad de infección ("moi") de aproximadamente 0,0001 a 10, preferiblemente de 0,002 a 5, más preferiblemente de 0,001 a 2. Aún más preferiblemente, las células se infectaron a una MOI de aproximadamente 0,01. Las células infectadas se pueden cosechar de 30 a 60 horas después de la infección. Preferiblemente, las células se recogen 34-48 horas después de la infección. Aún más preferiblemente, las células se recogen de 38 a 40 horas después de la infección. Las proteasas (típicamente de tripsina) se añaden generalmente durante el cultivo celular para permitir la liberación viral, y las proteasas se pueden añadir en cualquier etapa adecuada durante el cultivo por ejemplo, antes de la inoculación, al mismo tiempo que la inoculación, o después de la inoculación [61].
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[0089] Un adyuvante particularmente útil en torno a los oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC31 ™ [120]. Así, un adyuvante utilizado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) incluye al menos una (y preferiblemente múltiple) motivos IPC, y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferiblemente múltiple) secuencia de tripéptido Lys-Arg-Lys (s). El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26-mer 5 '-(IC) 13 -3 '.El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende 11-mer secuencia de aminoácidos KLKLLLLLKLK.
- •
- 3-O-desacilado monofosforil lípido A ('3dMPL', también conocido como 'MPL ™') [121-124]. En condiciones acuosas, 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo con un diámetro de <150 nm o> 500 nm. Uno o ambos de estos pueden ser utilizados con la invención, y las mejores partículas se pueden seleccionar mediante ensayo de rutina. Las partículas más pequeñas (por ejemplo, suficientemente pequeño para dar una suspensión acuosa clara de 3dMPL) se prefieren para uso de acuerdo con la invención debido a su actividad superior [125]. Las partículas preferidas tienen un diámetro medio inferior a 220 nm, más preferiblemente menos de 200 nm o menor que 150 nm o menor que 120 nm, e incluso pueden tener un diámetro medio inferior a 100 nm. En la mayoría de casos, sin embargo, el diámetro medio no será menor que 50 nm.
- •
- Un compuesto de imidazoquinolina, tales como Imiquimod ("R-837") [126127], Resiquimod ("R-848") [128], y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato). Más detalles sobre imidazoquinolinas inmunoestimulantes se pueden encontrar en las referencias 129-133.
- •
- Un compuesto tiosemicarbazona, tales como los descritos en la referencia 134. Los métodos de formulación, fabricación, y la detección de compuestos activos también se describen en la referencia 134. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citoquinas, tales como TNF-α.
- •
- Un compuesto tryptanthrin, tales como los descritos en la referencia 135. Los métodos de formulación, fabricación, y la detección de compuestos activos también se describen en la referencia 135. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citoquinas, tales como TNF-α.
- •
- Un análogo de nucleósido, tales como: (a) Isatorabine (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):
y profármacos de los mismos; (B) ANA975;(C) ANA-025-1; (D) ANA380; (E) los compuestos descritos en las referencias 136 a 138Compounds que contienen lípidos ligados a un esqueleto acíclico que contiene fosfato, como el antagonista de TLR4 E5564 [139,140]:
• Un urea sustituida o compuesto de fórmula I, II o III, o una sal del mismo:
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