CN118126141A - 一种表达猪瘟病毒突变的全长e2蛋白的重组伪狂犬病毒株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株及应用，涉及生物技术领域。本发明提供的重组全长E2蛋白，疏水性评分低于3.25，蛋白表达水平较高，同时，E2蛋白表达的跨膜区疏水性阈值为3.25～3.51。该发现对于E2蛋白或其他跨膜蛋白在真核细胞中表达E2蛋白有指导意义。本发明构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组PRV，小鼠免疫后可诱导高水平的E2抗体和细胞免疫。免疫后的家兔可同时抵抗PRV ZJ2013的致死攻击和猪瘟引起的发热反应。本发明提供的重组伪狂犬病毒株可以作为预防CSFV和PRV感染的二联疫苗。

Description

一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株及 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株及应用。

背景技术

E2蛋白位于猪瘟病毒(CSFV)囊膜表面，参与病毒感染，负责与细胞上的受体结合，是CSFV的主要保护抗原，并能诱导产生中和抗体。

伪狂犬病毒(PRV)具有150kb的基因组，可以利用细菌人工染色体(BAC)技术进行反向遗传操作。将毒力基因(TK、gE和gI)敲除，成为免疫原性较好的弱毒株。此外，PRV基因组中含有许多非必需基因，如US4、US7、US8、US9，外源基因可以插入到这些基因中而不影响病毒的体外和/或体内复制潜力，使其成为表达其他猪病外源抗原的合适载体([1]Cong X，Lei JL，Xia SL，et al.2016.Pathogenicity and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant in susceptible animals.Vet Microbiol，182：170-177.[2]Qiu HJ，Tian ZJ，Tong GZ，et al.2005.Protective immunity induced by arecombinant pseudorabies virus expressing the GP5 of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus in piglets.Vet Immunol Immunopathol，106：309-319.)。免疫后可感染宿主细胞，PRV的基因组可在细胞内表达外源蛋白，然后将外源蛋白分泌出细胞，诱导体液免疫，产生针对外源蛋白的抗体。

现有的PRV疫苗，即Bartha-K61疫苗，对PRV变异株仅提供50％的保护作用。目前用于预防猪瘟的C-Strain对流行的2.1d亚基因型效果欠佳。因此，有必要研制针对伪狂犬病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)流行株的疫苗。已有许多PRV表达猪瘟E2基因疫苗的研究报道，但目前尚无商品化广泛应用于畜牧业的PRV和猪瘟双价二联基因工程载体疫苗。gE/gI/TK基因缺失的疫苗是安全的，并且能够完全预防PRV。猪瘟病毒E2糖蛋白主要用于开发猪瘟疫苗。多价联疫苗，尤其是表达外源蛋白的病毒载体疫苗，是对抗各种猪疾病合并感染的有效策略。

发明内容

基于现有技术中的不足，本发明提供了一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株及应用。

对E2跨膜区的分析发现，E2跨膜区的高疏水性是其无法表达的主要原因。通过突变一个氨基酸来降低其跨膜区的疏水性，发现E2的全长突变体(E2FL-muta3或E2FL-muta4)可以实现高表达，同时表达的全长突变体E2可定位于细胞膜上。构建表达E2FL-muta3或E2FL-muta4的PRV载体疫苗，将其免疫小鼠后，可产生针对E2蛋白的特异性细胞免疫的体液免疫，产生的E2抗体水平明显高于表达截短E2的PRV载体疫苗。构建的载体疫苗免疫家兔后可同时防止强毒PRV ZJ2013的致死攻击和猪瘟病毒引起的发热反应。

本发明的具体的技术方案如下：

本发明提供了一种猪瘟病毒突变的全长E2蛋白，所述猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

所述猪瘟病毒突变的全长E2蛋白，包括信号肽、E2蛋白胞质外区、E2蛋白跨膜区、E2蛋白的胞质尾区。更具体的，而突变部分是E2蛋白的跨膜区。

本发明还提供了编码所述猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的核酸分子。

本发明还提供了与所述核酸分子相关的生物材料，包括如下任一项：

(a)表达盒，含有所述的核酸分子；

(b)重组载体，含有所述的核酸分子或(a)中表达盒。

本发明还提供了一种细菌人工染色体，包含所述的核酸分子。

本发明还提供了一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株，在伪狂犬病毒基因组中插入有所述的核酸分子；所述伪狂犬病毒为伪狂犬病毒株PRV ZJ2013株。

优选的，所述伪狂犬病毒株PRV ZJ2013毒株敲除了TK基因、gE基因和11K基因；所述TK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，gE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，11K基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了所述重组伪狂犬病毒株的制备方法，包括以下步骤：

(1)将含有所述核酸分子序列的表达盒替换pPRV-HA2-dTK的gE基因和11K基因，获得pPRV-dTK/gE-E2；

(2)将步骤(1)获得的pPRV-dTK/gE-E2转染到BHK-21细胞，得到所述重组伪狂犬病毒株。

具体的，表达盒还包括启动子CMV；BGH-pA人β球蛋白基因-多聚腺苷酸尾。

本发明还提供了所述的重组伪狂犬病毒株在制备预防或治疗伪狂犬病及猪瘟的疫苗中的应用。

本发明还提供了一种预防猪瘟和伪狂犬病的二联疫苗，包含所述重组伪狂犬病毒株活病毒或者灭活后的病毒。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的重组全长E2蛋白，疏水性评分低于3.25，蛋白表达水平较高，同时，E2蛋白表达的跨膜区疏水性阈值为3.25～3.51。该发现不仅对于在真核细胞中表达E2蛋白有指导意义，而且对于其他跨膜蛋白在真核细胞中的高效表达也具有重要意义。

(2)本发明构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组PRV，小鼠免疫后可诱导产生针对E2蛋白的E2抗体和特异性细胞免疫。免疫后的家兔可同时防止PRV ZJ2013的致死攻击和猪瘟引起的发热反应。

(3)本发明提供的重组伪狂犬病毒株可以作为预防CSFV和PRV感染的二联疫苗。

附图说明

图1为E2蛋白质空间结构建模图；其中，A为由全长E2蛋白形成的同源二聚体的空间结构，用膜的结构注释。绿色和红色表示组成E2二聚体的两股。B为E2蛋白的疏水和亲水区域。利用Discovery Studio软件对E2蛋白空间结构中的疏水区进行了分析和注释，计算了疏水区的面积，并对参与疏水区形成的氨基酸进行了标记。方框表示E2蛋白跨膜区的氨基酸。

图2为突变E2跨膜区图，其中，A为以CSFV E2蛋白、SARS-CoV-2(新型冠状病毒)S蛋白、AIV(禽流感病毒)HA蛋白、PRV跨膜区gG蛋白、MDV(马立克氏病病毒)gB蛋白为例，总结了病毒包膜蛋白的各种特征。椭圆圈出的表示特殊值。B为以2.1d亚型的KT953607和QEP54409的339～366aa氨基酸作为E2跨膜区突变的参考。以KT953607为参照，得到E2FL-muta1和E2FL-muta2。以QEP54409为参照，经诱变得到E2FL-muta3、E2FL-muta4、E2FL-muta5、E2FL-muta6和E2FL-muta7。突变的甘氨酸是阴影绿色，突变的丙氨酸是阴影灰色。两个蓝色方框表明KT953607与QEP54409在348AA处不同。在每个序列的上面是预测的二级结构(红色柱子代表α-螺旋，蓝色箭头代表β-转角，黄色箭头代表β-折叠)。每个氨基酸的疏水性可以用红柱的高度来表示。柱越高，颜色越鲜艳，氨基酸越疏水。柱越低，颜色越深，氨基酸疏水性越差。柱为灰色或没有柱表示氨基酸是亲水性的)。每个序列的突变氨基酸数、疏水性评分(HYB评分)以及与原序列的二级结构(SS)相似度显示在后面。红框表示二级结构与原始序列一致的突变序列。

图3为表达猪瘟病毒E2的重组PRV的构建图，其中，A为pPRV-HA2-dTK、pPRV-dTK/gE-E2构建示意图。将TK基因从PRV基因组中删除，插入pHA2质粒，获得pPRV-HA2-dTK。在pPRV-HA2-dTK中缺失gE和11K基因，插入E2表达盒，得到pPRV-dTK/gE-E2。B为构建的E2的不同表达形式。胞外表示E2蛋白的胞外结构域1-338AA，SP表示E2蛋白自身18aa的信号肽序列，TM表示E2蛋白的跨膜结构域(339-366aa)，*表示突变的氨基酸。短划线表示与其参考序列相同的氨基酸。尾部代表E2蛋白的胞质结构域(367-373aa)。E2全长(E2FL)包含信号肽E2胞外区、E2跨膜区和尾部。

图4为表达猪瘟病毒E2的重组PRV的RFLP鉴定图，用BamHI消化不同重组毒株的基因组，箭头表示GroupA～GroupD均成功插入E2基因，对照组为pPRV-dTK/gE。

图5为参照Materials and Methods中的WB法测定E2蛋白表达图，GFP作为E2蛋白的内参。(pHA2质粒上的绿色荧光蛋白和pHA2插入PRV基因组)，图中Marker为60kD。

图6为采用IFA法测定E2蛋白表达图。

图7为IFA检测E2蛋白在ST细胞膜的表面定位图(IFA对照组：表达去跨膜区E2的重组PRV毒株)。

图8为小鼠体内CSFV E2蛋白特异性抗体检测图。

图9为免疫小鼠PRV gB、gE抗体检测图。

图10为小鼠CSFV E2蛋白特异性细胞免疫ELISPOT统计图。

图11为小鼠CSFV E2蛋白特异性细胞免疫ELISPOT斑点图(PMA、E2、DMEM)。

图12为家兔攻毒试验图；其中，A为免疫时间和家兔试验的挑战时间线；B、C组分别用DMEM、对照组(rPRV-dTK/gE)和GroupA～GroupD免疫，分别于第0天初免和第7天二免。各组用猪瘟病毒C-Strain 10⁶ TCID₅₀在35dPV下攻毒，攻毒后0～96h每隔6h测定直肠温度(B图)。第42天，用PRV ZJ2013的10⁶ TCID₅₀攻击家兔，观察14天绘制生存曲线(C图)。

具体实施方式

实施例1重组全长E2蛋白的构建

2013年从中国浙江一个猪群中分离的PRV ZJ2013毒株，于2023年1月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：V202307。将PRV ZJ2013 TK基因(基因序列如SEQ ID NO.3所示)和gE基因(基因序列如SEQ ID NO.4所示)敲除获得rPRV-dTK/gE，在BHK-21细胞系中传代。CSFV C-Strain在ST细胞(ATCC CRL-1746)中增殖。BHK-21细胞和ST细胞在添加10％胎牛血清(ZETA)的Dulbecco改良Eagle′s培养基(DMEM；GIBCO)中生长，在37℃含5％CO₂的条件下培养。另外，含pPRV-HA2-dTK的感受态细胞和pEP-kan-S质粒在本实验室保存，具体构建过程参见申请号为ZL201210100785.0的专利和文献“尹文玲，尹龙勃，叶伟成，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4)：330-335.”。

抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体9011购自北京金诺白泰生物技术有限公司。2B6单克隆抗体为方维焕教授赠送，用C-Strain多次免疫兔后获得CSFV C-Strain兔多克隆抗体(pAb)。CSFV C-Strain株在浙江省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室保存。

本发明选择2.1d亚型的KT953607的E2蛋白进行研究。并进行E2蛋白质空间结构的建模。

CSFV成熟的E2蛋白含有一个N端胞外区、一个跨膜区和一个C端胞质区。以牛病毒性腹泻病毒1型E2包膜蛋白(PDB ID：4JNT)为模板，用Swiss model对CSFV E2蛋白的胞外区进行同源模型构建，用RoseTTAFold工具模拟E2蛋白的跨膜区，用Discovery Studio软件对跨膜区的细胞膜进行标记。利用Discovery Studio软件对E2蛋白空间结构的疏水区和疏水得分进行分析和注释，计算疏水区面积，并标记参与疏水区域形成的氨基酸。利用Discovery Studio软件预测突变后的蛋白序列二级结构(SS)。

E2蛋白可形成同源二聚体，且具有跨膜结构域。由于4JNT与E2蛋白的氨基酸序列相似性达到80％，因此以4JNT为模板，使用Swiss model进行同源建模，并通过Rosettafold工具从头预测E2蛋白跨膜区的空间结构。膜结构在Discovery Studio软件中进行标记，最终外观显示如图1A所示。E2的跨膜区由嵌入膜结构中的β-转角连接的两段α-螺旋和位于质膜内侧的β-转角组成(图1A)。其跨膜区对应的氨基酸为339-366aa。利用Discovery Studio软件对E2蛋白表面的疏水区进行分析，发现E2蛋白有两个主要的疏水区域。其中一个疏水区域(疏水区域1)与跨膜区域重叠，表面积为另一个疏水区域(疏水区域2)在294～329aa之间，表面积为/>(图1B)。

已知具有跨膜区的E2在体外不能表达，而不具有跨膜区的E2在体外可以表达。E2属于包膜蛋白，对体外表达的病毒包膜蛋白进行比较，如SARS-CoV-2 S蛋白、AIV HA蛋白、PRV gG蛋白、MDV gB蛋白，分析其跨膜结构域长度、连续疏水氨基酸数量、疏水评分、跨膜区域的带电氨基酸，其跨膜结构域二级结构如图2A所示，E2蛋白的疏水评分明显高于其他蛋白。因此，跨膜区是限制E2表达的关键因素。根据E2蛋白的跨膜区序列，进行了氨基酸突变。从对137条E2序列的比对可知，E2的跨膜区除了348aa处的两个氨基酸V和A外，是相对保守的(图2B)。以KT953607为模板得到E2FL-muta1和E2FL-muta2，以QEP54409为模板得到E2FL-muta3、E2FL-muta4、E2FL-muta5、E2FL-muta6和E2FL-muta7。突变序列(图2B)的疏水性评分显示，突变氨基酸的疏水性降低，突变跨膜序列的疏水性评分也相应有不同程度的降低。E2FL-muta3和E2FL-muta4的二级结构与原序列一致，其余序列的二级结构与原序列相似(图2B)。选择E2FL-muta1和E2FL-muta2、E2FL-muta3和E2FL-muta4进行后续测试。

实施例2插入全长E2基因的重组PRV的构建

1、重组全长E2表达盒的构建

E2核苷酸序列(GenBank登录号：KT953607)由Genescript进行密码子优化。在优化序列的两端添加PstI和NotI酶切位点。将pEP-kan-S质粒和优化后的全长E2片段(基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示)经PstI和NotI酶切后连接得到质粒pEP-E2-kan(E2基因位于人巨细胞病毒启动子下方，BGH polyA终止子前，I-SecI归巢内切酶位点和kan抗性基因位于BGH polyA基因后方)，经测序确认质粒。

2、插入全长E2基因重组PRV的构建

在PRV的gE和11K基因位置插入E2表达盒。插入E2的详细过程见图3A-B。简单地说，扩增的E2表达盒的两端含有50bp左右同源臂，并通过两步RED介导的重组插入pPRV-HA2-dTK的gE基因(基因序列如SEQ ID NO.4所示)和11K基因(基因序列如SEQ ID NO.5所示)处，具体过程参照文献(YinW，Yin L，YeW，et al.2010.Construction of an InfectiousClone of Pseudorabies Virus Strain ZJ Genome Maintained as a BacterialArtificial Chromosome.Chinese Journal of Virology，26：330-335.)。

以pEP-E2-kan为模板，用引物PRV-dgE-E2-in-F和PRV-dgE-E2-in-R扩增出长度约为3305bp的片段(表1)，电转化至含pPRV-HA2-dTK的感受态细胞，获得GroupA-GroupD的pPRV-dTK/gE-E2突变体。以pEP-E2-kan为模板，分别用引物PRV-dgE-F和PRV-dgE-R扩增出长度约1144bp的片段(表1)，电转化至含pPRV-HA2-dTK的感受态细胞，获得pPRV-dTK/gE突变体(图3A)。

表1 PCR引物

用碱裂解法提取pPRV-dTK/gE和pPRV-dTK/gE-E2的BAC质粒，按Morgan′s磷酸钙转染法转染BHK-21细胞。细胞在37℃和5％CO₂下进一步培养。然后拯救病毒并命名为对照：rPRV-dTK/gE，GroupA：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta1，GroupB：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta2，GroupC：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta3，GroupD：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta4(图3B)。

用BamHI酶切重组病毒rPRV-dTK/gE-E2的基因组，经限制性片段长度多态性(RFLP)鉴定E2基因的插入，并用引物PRV-E2-identify-2F和PRV-E2-identify-2R进行PCR鉴定和测序(表1)，结果表明，成功构建了4株重组病毒(图4)。将4株重组病毒与对照rPRV-dTK/gE在MOI为0.02的条件下分别感染BHK-21细胞，在72小时后从感染细胞和细胞培养上清中收集病毒液，获得总病毒，并在BHK-21细胞上用标准TCID₅₀试验测定病毒滴度。结果表明，所有重组菌株均具有相似的效价。

用rPRV-dTK/gE或rPRV-dTK/gE-E2(MOI＝1)感染ST细胞。24h后，用预冷PBS洗涤单层细胞3次。然后在SDS样品缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 6.8，1％SDS、1％β-巯基乙醇、5％甘油、溴酚蓝)中裂解5min。细胞裂解液在12000rpm离心10min，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳，电转到硝酸纤维素(NC)膜上。10％脱脂奶粉封闭膜后，以抗E2单克隆抗体9011作为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG抗体(联科生物，杭州，中国)作为二抗。最后，用底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(宝生物，大连，中国)显色。以GFP作为内参。结果显示，在感染GroupC和GroupD的ST细胞中出现E2单克隆抗体9011特异性条带，而对照组(rPRV-dTK/gE)以及GroupA和GroupB中则没有出现特异性条带(见图5)。

间接免疫荧光法(IFA)：用rPRV-dTK/gE-E2(MOI＝1)感染在爬片上生长的ST细胞。24h后，用4％多聚甲醛(PFA)固定单层细胞，用0.1％Triton渗透单层细胞。用抗E2单克隆抗体9011和Cy3抗小鼠二抗(碧云天，上海，中国)孵育后，经共聚焦显微镜直接观察。结果表明，感染GroupC和GroupD后，ST细胞E2蛋白免疫荧光呈阳性，而GroupA和GroupB以及对照组细胞呈阴性(见图6)。

另外，IFA观察ST细胞表面的E2蛋白，发现GroupC、GroupD表达的突变全长E2定位于ST细胞表面，而IFA对照组(表达去跨膜区E2的重组PRV毒株)表达的E2蛋白(编码基因序列如SEQ ID NO.6所示)不能定位在细胞膜上(图7)。

实施例3性能测定

1、免疫小鼠体内CSFV E2特异性抗体检测

动物实验按照浙江省农业科学院畜牧兽医科学研究所(ZAAS)《实验动物护理与使用指南》进行。动物实验获得了ZAAS动物实验伦理委员会的批准。

将24只6周龄雌性Balb/c小鼠随机分为3组，每组8只。对照组、GroupC和GroupD分别接种10⁷TCID₅₀。所有小鼠均经肌注，1周后以相同剂量和途径加强免疫。免疫后第0、1、2、3、4、5周，每组5只小鼠经尾静脉采血检测抗体。每组在首免后2周取3只小鼠脾脏进行细胞免疫检测。

使用间接ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性E2抗体。结果表明：对照组小鼠免疫后未检测到E2抗体。GroupC和GroupD免疫小鼠在首免后7d，可在血清中检测到E2特异性抗体，随着免疫时间延长，抗体水平进一步升高(图8)，到28d时可达0.5以上。免疫后不同时间点，GroupC和GroupD的抗体水平无显著差异。

采用PRV gB/gE抗体检测试剂盒(IDEXX Laboratories，Inc，Westbrook，ME，USA)进行检测，结果显示，所有组均产生了针对PRV gB的抗体，但未产生针对gE的抗体(图9)。

2、表达E2蛋白的重组PRV毒株免疫小鼠的细胞免疫检测

用137个E2蛋白的序列进行比对。利用Gblock软件对E2蛋白的保守区进行分析，并从保守区合成多肽。多肽的合成和纯化由生工生物技术有限公司(中国上海)完成。多肽纯度超过95％，冻干后保存于-80℃。表2显示了多肽的序列。

表2 E2重叠肽库

多肽序列(N′toC′)	氨基酸个数
		CTAVSPTTLRTEVVK	15
TFKREKPFPHRVDCATTIVEKED	23
		SCKEDYRYAISSTNEIGPLGAEG	23
LTTTWREYSHSLQLDDGTVRAICTAG	26
		VSRRYLASL	9
YAISSTNEI	9
		SAFYLVCPI	9
CTFNYTKTL	9
		TSVTFELLF	9
TWREYSHSL	9
		DSYFQQYML	9
KTFKREKPF	9
		LPTSVTFEL	9
GEYQYWFDL	9
		RYAISSTNE	9
KPFPHRVDC	9
		SPTTLRTEV	9
CTAVSPTTL	9
		AGPVRKTSC	9

首免后14d，每组取3只小鼠脾脏进行细胞免疫检测。用小鼠淋巴细胞分离培养基(达科为，广州，中国)分离脾脏，脾细胞在添加10％FBS的RPMI-1640中培养。

ELISpot法：采用小鼠IFN-γ预包被ELISpot试剂盒(达科为，广州，中国)检测各组脾细胞分泌频率。每只小鼠的脾细胞被逐份添加到每个孔中，大约每孔10⁵个细胞，一式六份。用RPMI 1640培养基、PMA、E2重叠肽库(10μg/ml)、37℃、5％CO₂孵育脾细胞20h。进行ELISpot试验。最后，使用自动ELISpot阅读器(Mabtech，USA)对平板进行定量。肽特异性T细胞频率表示为每10⁵个斑点形成单位(SFU)的数量脾细胞。

结果显示GroupC和GroupD能够诱导IFN-γ反应，对照组(rPRV-dTK/gE)中，未检测到E2特异性T细胞(图10)。此外，各组脾细胞经DMEM刺激的结果均为阴性，而经PMA刺激的结果均为阳性(图11)。综上所述，免疫GroupC和GroupD的小鼠均能诱导出E2特异性细胞免疫。

3、GroupD重组病毒对家兔的攻毒保护实验

表达全长E2的重组PRV毒株免疫家兔。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)证实无CSFV、PRV的15只2月龄家兔进行疫苗评价实验。将家兔随机分为3组，每组5只。GroupD肌注1毫升不同剂量(10⁷TCID₅₀)的rPRV-dTK/gE-E2，以DMEM和rPRV-dTK/gE作为对照。首疫后7d，加强免疫1次；首免35d后，各组均以10⁶TCID₅₀ CSFV C-Strain攻毒。首免42d后，各组均以10⁶TCID₅₀ PRV ZJ2013攻毒，并观察14d。

结果表明，CSFV攻毒后，GroupD的家兔在接种病毒后体温未升高，表明GroupD可以保护其免受C-Strain攻击引起的发热反应(图12A)。DMEM和rPRV-dTK/gE组的兔子直肠温度在48h开始升高，急剧上升至41℃左右，并维持高温至少16h，表明猪瘟C-Strain引起家兔典型的发热反应(图12B)。96h后，所有家兔均恢复到正常体温，可正常采食。

第42天，用10⁶TCID₅₀ PRV ZJ2013株攻击家兔，观察14天(图12A)。攻毒后第3天，DMEM免疫组所有兔子均出现瘙痒症状，死亡1只。在攻毒后的5天内，DMEM免疫组所有兔子全部死亡。而rPRV-dTK/gE组和GroupD组免疫兔无临床症状，均健康存活(图12C)。因此，GroupD候选疫苗株可以保护家兔免受PRV ZJ2013毒株的攻击。证明GroupD能同时保护家兔免受PRV的致死性攻击以及猪瘟C-Strain引起的发热反应。

本研究首次成功构建了表达猪瘟病毒2.1d亚型的突变全长E2蛋白重组PRV毒株。表达全长E2的PRV(GroupC：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta3，GroupD：rPRV-dTK/gE-18sig/E2FL/muta4)，可诱导免疫小鼠产生高水平的E2抗体和细胞免疫。其优势在于：重组PRV表达E2的二联活载体疫苗缺失了gE基因，可通过检测gE抗体来区分野毒感染和疫苗免疫。与猪瘟弱毒疫苗相比，重组PRV-CSFV活载体疫苗免疫后只检测到CSFV的E2抗体，通过检测猪瘟病毒其他结构蛋白的抗体，还可以区分针对疫苗和野毒的抗体。

Claims (10)

1.一种猪瘟病毒突变的全长E2蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的核酸分子。

3.与权利要求2所述核酸分子相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一项：

(a)表达盒，含有权利要求2所述的核酸分子；

(b)重组载体，含有权利要求2所述的核酸分子或(a)中表达盒。

4.一种细菌人工染色体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸分子。

5.一种表达猪瘟病毒突变的全长E2蛋白的重组伪狂犬病毒株，其特征在于，在伪狂犬病毒基因组中插入有权利要求2所述的核酸分子；所述伪狂犬病毒为伪狂犬病毒株PRVZJ2013株。

6.如权利要求5所述的重组伪狂犬病毒株，其特征在于，所述伪狂犬病毒株PRV ZJ2013毒株敲除了TK基因、gE基因和11K基因；所述TK基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，gE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，11K基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求5所述重组伪狂犬病毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将含有权利要求2所述核酸分子序列的表达盒替换pPRV-HA2-dTK的gE基因和11K基因，获得pPRV-dTK/gE-E2；

(2)将步骤(1)获得的pPRV-dTK/gE-E2转染到BHK-21细胞，得到所述重组伪狂犬病毒株。

8.如权利要求7所述伪狂犬病毒株的制备方法，其特征在于，表达盒还包括启动子CMV；BGH-pA人β球蛋白基因-多聚腺苷酸尾。

9.权利要求5所述的重组伪狂犬病毒株在制备预防或治疗伪狂犬病及猪瘟的疫苗中的应用。

10.一种预防猪瘟和伪狂犬病的二联疫苗，其特征在于，包含权利要求5所述重组伪狂犬病毒株活病毒或者灭活后的病毒。