JP2022515172A - 複数の外来遺伝子を含む組換えトリヘルペスウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、別々の遺伝子間領域に挿入された複数の遺伝子を含む組換えトリヘルペスウイルス、それらの製造、それを含む組成物、およびそれらの使用に関する。
Description
本発明は、少なくとも２つの組換えヌクレオチド配列が挿入された組換えヘルペスウイルス、およびその使用に関する。本発明は、トリ病原体または疾患に対する防御免疫を誘導することができる、ワクチンなどの多価ウイルスまたは組成物を産生するのに特に適している。
家禽の肉および卵は重要な食料源であり、その消費は、人口の増加とその優れた品質－価格比のために絶えず増加している。家禽の健康ならびに食の安全と安心を確保するために、家禽ワクチン技術は世界的な関心事になっている。
病原体タンパク質を発現するウイルスベクターは、標的病原体に対する家禽ワクチンとして一般的に使用されている。このようなウイルスベクターを含むワクチンは、感染した宿主内で外来病原体タンパク質の発現を誘導し、これが防御免疫につながり得る。
アデノウイルス、ＡＡＶ、鶏痘ウイルス、ヘルペスウイルスなど、多くの異なるクラスのウイルスがトリのワクチン接種の候補ベクターとして研究されてきた。
ＭＤＶ１、ＭＤＶ２、ＭＤＶ３（シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）としても知られている）の３種類のヘルペスウイルスが確認されている。これらのウイルスの間には高い類似性が存在し（Ｋｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）８２、１１２３－１１３５を参照）、それらはすべて、トリ、特にニワトリなどの家禽のワクチンとして使用するため、病原体に由来する外来遺伝子が組み込まれた組換えウイルスを調製するために使用されてきた。
このようなワクチン調製物は、多くの疾患に対してトリ種にワクチン接種するための効率的な結果を提供するが、それぞれが異なる抗原をコードする２種以上の組換えヘルペスウイルスをトリに注射すると、病原体間の競合と免疫抑制が発生することがある。
そのような干渉を克服し、複数の疾患に対するワクチン接種を容易にするためにも、いくつかの抗原をコードする多価ヘルペスウイルスを生成するように様々な試みがなされてきた。
最初の研究では、ヘルペスウイルスのゲノムの単一クローニング部位にいくつかの遺伝子が挿入された（例えば、ＥＰ１０２６２４６を参照）。しかし、そのような構築物は、必要なレベルの防御免疫を示さなかったか、または不安定であることが判明し、培養細胞での継代を繰り返す間に外来遺伝子の全部または一部が除去された。
ＷＯ２０１３／１４４３５５は、ウイルスゲノムの非コード領域に位置するクローニング部位の組み合わせを使用して得られた複数の外来抗原をコードする安定なヘルペスウイルスを報告している。
ＷＯ２０１３／０５７２３６、ＷＯ２０１３／０８２３２７、およびＷＯ２０１３／０８２３１７は、多価ＨＶＴの設計において、ヘルペスウイルスのＵＳ２コード配列内に少なくとも１つの遺伝子をクローニングすることによる、別のアプローチを報告している。これらの出願によると、ＵＳ２は、ウイルスの複製に必須ではないが、そのような性質は検証されていない。
病原体および種の数を考慮すると、インビボで複数の遺伝子を安定して発現することができ、トリ、特に家禽のワクチン接種に適した、さらなる組換え多価ヘルペスウイルスが当技術分野で必要とされている。
本発明は、ウイルスゲノムの少なくとも２つの別個の位置に複数の組換えヌクレオチド配列を含む組換えトリヘルペスウイルスを提供する。
より具体的には、本発明は、少なくとも第１および第２の組換えヌクレオチド配列を含む組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を提供し、各組換えヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードし、第１の組換えヌクレオチド配列は、ＨＶＴ０５３（ＵＬ４５）とＨＶＴ０５４（ＵＬ４６）との間に位置するウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入され、第２の組換えヌクレオチド配列は、ＨＶＴ０６４（ＬＯＲＦ３）とＨＶＴ０７０との間、特にＨＶＴ０６４（ＬＯＲＦ３）とＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）との間、ＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）とＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）との間、ＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）とＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）との間、ＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）とＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）との間、またはＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）とＨＶＴ０７０との間、さらに具体的にはＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）とＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）との間に位置するウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される。
各組換えヌクレオチドは、同じまたは異なるポリペプチド、特に抗原、サイトカイン、アジュバント、ホルモンなどをコードし得る。特定の実施形態において、各組換えヌクレオチドは、同じか、または異なり得る（または同じ抗原の同一部分または異なる部分）、および同じ病原体または異なる病原体に由来し得る、抗原をコードする。抗原は、例えば、該病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質もしくは構造タンパク質、またはそれらの免疫原性断片から選択または誘導され得る。
本発明はまた、上記で定義された組換えＨＶＴのゲノムを含む核酸、およびそのような核酸を含むベクター（プラスミドなど）に関する。
本発明はさらに、上記で定義された組換えＨＶＴまたは核酸またはベクターを含む細胞に関する。
本発明のさらなる目的は、上記で定義された組換えＨＶＴおよび適切な賦形剤または希釈剤を含む組成物である。
本発明のさらなる目的は、上記で定義された核酸または細胞、および適切な賦形剤または希釈剤を含む組成物である。
本発明の別の目的は、上記で定義された、有効な免疫量の組換えＨＶＴ、核酸および／または細胞を含むワクチンにある。
本発明のさらなる目的は、病原体に対して家禽などのトリを免疫するために使用するための、上記で定義された組換えＨＶＴ、核酸または細胞にある。
本発明のさらなる目的は、病原体によって引き起こされる疾患から家禽などのトリを保護するために使用するための、上記で定義された組換えＨＶＴ、核酸または細胞にある。
本発明のさらなる目的は、１種または複数種の病原体に対して家禽などのトリにワクチン接種するために使用するための、上記で定義されたワクチンにある。
本発明のさらなる目的は、上記で定義された組成物またはワクチンまたはウイルスをトリに投与することを含む、トリにワクチン接種するための方法にある。
本発明のさらなる目的は、上記で定義された組成物またはワクチンまたはウイルスをトリに投与することを含む、トリに抗原に対する免疫応答を誘導する方法にある。
本発明はまた、以下の成分：
ａ．有効量の上記で定義された組成物またはワクチン、および
ｂ．該組成物またはワクチンを該トリに投与するための手段、を含む、トリを免疫するためのワクチン接種キットを提供する。
ａ．有効量の上記で定義された組成物またはワクチン、および
ｂ．該組成物またはワクチンを該トリに投与するための手段、を含む、トリを免疫するためのワクチン接種キットを提供する。
本発明は、任意のトリ病原体に対するワクチン接種のために、任意のトリに使用することができる。ニワトリなどの家禽へのワクチン接種に特に適している。
ｒＨＶＴ／４５－４６ＢａｃＶＰ２（ＦＷ１８１）のレーンにはバンドが無かった。図３Ｂに示すように、ｇＢタンパク質は、各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴのレーンで、５４キロダルトン（ｋｄ）で観察された
反対に、ｒＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ（ＦＷ１６８）のレーンにはバンドが無かった。本発明の二重ｒＨＶＴは、ＮＤＶ－ＦおよびＩＬＴＶ－ｇＢの両方を発現した。
本発明は、一般に、複数の組換えヌクレオチド配列を含む組換えトリヘルペスウイルス、それらの製造、それを含む組成物、およびそれらの使用に関する。
定義
本開示は、以下の定義を参照することによって最もよく理解されるであろう。
ヘルペスウイルスに関して「組換え」という用語は、ヘルペスウイルスのゲノムにおいて自然には見られない、または該ゲノムにおいて自然に見られるが、異なる形態もしくは異なる位置で見られる、少なくとも１つのヌクレオチド配列（例えば、遺伝子などのＤＮＡ）の挿入によって改変されたヘルペスウイルスを指す。組換えヘルペスウイルスは、それに記載されている組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって製造することができ、一旦製造されると、組換えＤＮＡ技術をさらに使用することなく複製することができることが理解されよう。したがって、「組換えヘルペスウイルス」の構造は、ＤＮＡ挿入の観点から説明される。
本開示は、以下の定義を参照することによって最もよく理解されるであろう。
ヘルペスウイルスに関して「組換え」という用語は、ヘルペスウイルスのゲノムにおいて自然には見られない、または該ゲノムにおいて自然に見られるが、異なる形態もしくは異なる位置で見られる、少なくとも１つのヌクレオチド配列（例えば、遺伝子などのＤＮＡ）の挿入によって改変されたヘルペスウイルスを指す。組換えヘルペスウイルスは、それに記載されている組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって製造することができ、一旦製造されると、組換えＤＮＡ技術をさらに使用することなく複製することができることが理解されよう。したがって、「組換えヘルペスウイルス」の構造は、ＤＮＡ挿入の観点から説明される。
本明細書において、「核酸」、「核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドであり得る決定された配列を有する核酸分子を指す。ヌクレオチド配列は、例えば組換え技術、酵素技術および／または化学技術によって最初に調製され、続いて宿主細胞またはインビトロ系で複製され得る。ヌクレオチド配列は、優先的に、分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）をコードする翻訳領域を含む。ヌクレオチド配列は、プロモーター、転写ターミネーター、シグナルペプチド、ＩＲＥＳなどのような追加の配列を含み得る。好ましくは、組換え核酸の翻訳領域は、イントロンを含まない。
「組換えヌクレオチド配列」は、ヘルペスウイルスのゲノムにおいて自然には見られない配列、または該ゲノムにおいて自然に見られるが、異なる形態もしくは異なる位置にある配列を示す。一般的な「組換えヌクレオチド配列」は、好ましくは、異なるウイルスまたは細胞からの分子など、トリヘルペスウイルスによって自然に産生されない分子をコードする遺伝子である。そのような「組換えヌクレオチド配列」と関連して「遺伝子」は、翻訳領域からなるかまたは本質的に翻訳領域からなる核酸などの、翻訳領域を含む任意の核酸分子を示す。遺伝子は、例えば、プロモーターまたはターミネーターなどの調節エレメントをさらに含み得る。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも２つの連続したアミノ酸のポリマーを含む任意の分子を指す。
「遺伝子間領域」という用語は、当技術分野で周知であり、２つの特定のウイルスＯＲＦの間に位置するウイルスゲノムの任意の領域を指す。したがって、ＵＬ４５（ＨＶＴ０５３）とＵＬ４６（ＨＶＴ０５４）との間の遺伝子間領域は、ＵＬ４５の終止コドンの３’で直ちに始まり、ＵＬ４６の終止コドンの５’で直ちに終わる領域を示す（両方のＯＲＦが反対方向にあるため）。ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０６５との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴ０６４の開始コドンの３’で直ちに始まり、ＨＶＴ０６５の開始コドンの５’で直ちに終わる領域を示す（両方のＯＲＦが逆方向にあるため）。同様に、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴ０６５の終止コドンの３’で直ちに始まり、ＨＶＴ０６６の終止コドンの５’で直ちに終わる領域を示す（両方のＯＲＦが反対方向にあるため）。遺伝子間領域は、ターミネーターまたはプロモーターなどの調節領域を含み得る。
「トリ種」という用語は、鳥綱の鳥、すなわち、羽が生えた、翼のある、二足歩行の、吸熱および産卵する脊椎動物など、あらゆる種類のトリを包含することを意図している。本発明と関連して、トリまたはトリ種は、より具体的には、家禽（ニワトリおよびシチメンチョウなど）、水鳥家禽（アヒルおよびガチョウなど）および観賞用鳥（例えば、ハクチョウやオウム類）などの経済的および／または農業的利益を有する鳥を指す。
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、生物において免疫応答を引き起こし、刺激し、または増幅するために使用され得る薬剤を示す。
本発明の組換えヘルペスウイルス、ベクター、またはワクチンに関連して本明細書で使用される「多価」という用語は、上記で定義した少なくとも２つの組換えヌクレオチド配列を含む組換えヘルペスウイルスまたはワクチンを指し、該配列は同じかまたは異なっており、同じまたは異なる病原体に由来する。
多価組換えＨＶＴ
本発明は、特定の位置に複数の外来遺伝子を含む組換えＨＶＴに関する。より具体的には、本発明は、以下の場合に、安定で効果的な多価組換えＨＶＴが得られ得ることを示している。
・少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされている場合、および
・少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０７０との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされている場合。
本発明は、特定の位置に複数の外来遺伝子を含む組換えＨＶＴに関する。より具体的には、本発明は、以下の場合に、安定で効果的な多価組換えＨＶＴが得られ得ることを示している。
・少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされている場合、および
・少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０７０との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされている場合。
実施例に示すように、そのような部位の組み合わせが使用される場合、組換えＨＶＴは、ＣＥＦ細胞において少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０継代にわたって安定である。さらに、そのような部位の組み合わせを使用して、遺伝子の強力で長期的な発現がインビボで得られ、高い防御免疫を獲得するのに十分である。
組換えヘルペスウイルスには、多くの潜在的なクローニング部位が存在する。特に、ヘルペスウイルスゲノムには３９７近くのＯＲＦがあり、そのうち９９は、機能性タンパク質産物をコードすると推定されている（Ａｆｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（２），２００１，９７１を参照）。さらに、一価ウイルスとの関連で使用に適したいくつかのクローニング部位は、特に２つの異なるクローニング部位が、同じウイルスで使用される場合、多価ウイルスと関連して使用されると不安定性を示した。本発明は、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域と、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０７０との間の遺伝子間領域との組み合わせにより、インビトロでの両方のクローニング組換えヌクレオチド配列の安定性および適切なレベルの発現が可能になることを示す。したがって、そのような特定の組換えウイルスは、インビボで強力な防御免疫を誘導するための新規の効果的な薬剤を表す。
特定の実施形態において、本発明は、複数の組換え核酸（例えば、外来遺伝子）を含む組換えＨＶＴに関し、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０６５との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０６５との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
さらなる特定の実施形態において、本発明は、複数の組換え核酸（例えば、外来遺伝子）を含む組換えＨＶＴに関し、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
さらなる特定の実施形態において、本発明は、複数の組換え核酸（例えば、外来遺伝子）を含む組換えＨＶＴに関し、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６６とＨＶＴ０６７との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６６とＨＶＴ０６７との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
別の特定の実施形態において、本発明は、複数の組換え核酸（例えば、外来遺伝子）を含む組換えＨＶＴに関し、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸がＨＶＴ０６７とＨＶＴ０６９との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。このような遺伝子間領域は、ＨＶＴ０６８ ＯＲＦと限られた範囲内で重複し得るが、しかし、これは相補鎖上に位置する。したがって、そのような遺伝子間領域でのクローニングは、ＨＶＴ０６８コード配列を変化させ得る。
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸がＨＶＴ０６７とＨＶＴ０６９との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。このような遺伝子間領域は、ＨＶＴ０６８ ＯＲＦと限られた範囲内で重複し得るが、しかし、これは相補鎖上に位置する。したがって、そのような遺伝子間領域でのクローニングは、ＨＶＴ０６８コード配列を変化させ得る。
さらなる特定の実施形態において、本発明は、複数の組換え核酸（例えば、外来遺伝子）を含む組換えトリＨＶＴに関し、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６９とＨＶＴ０７０との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされ、
・少なくとも１つの組換え核酸が、ＨＶＴ０６９とＨＶＴ０７０との間に位置するゲノムの遺伝子間領域にクローニングされる。
本発明の組換えＨＶＴは、任意のＨＶＴ、好ましくは非病原性ＨＶＴから調製することができる。本発明での使用に適したＨＶＴの非病原性株（ＭＤＶ３）の例は、ＦＣ１２６株である。
ＦＣ１２６株のゲノム配列は、当技術分野で入手可能である（Ａｆｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，前出、Ｋｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，前出）。引用された遺伝子間領域の位置は、本出願の教示、一般的な知識、および文献で利用可能な配列情報を使用して、当業者が容易に特定することができる。例えば、Ｋｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（前出）は、ＦＣ１２６参考株のヌクレオチド配列、ならびに該ゲノム内のほとんどのＯＲＦの位置を報告している。
ＦＣ１２６完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２９１８６６．１）を参照すると、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド９５３２３～９５４４３に対応し、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０６５との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１１１３０４～１１１４９９に対応し、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１１２０１０～１１２２０７に対応し、ＨＶＴ０６６とＨＶＴ０６７との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１１２７６６～１１３１０７に対応し、ＨＶＴ０６７とＨＶＴ０６９との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１１３９０６～１１４０７８に対応し、およびＨＶＴ０６９とＨＶＴ０７０との間の遺伝子間領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１１６７３１～１１６８３１に対応する。
本出願において、株ＦＣ１２６の完全なゲノムへの参照は、本出願の出願日に受入番号ＡＦ２９１８６６．１でＧｅｎｂａｎｋに記載されている該株への参照である。
ゲノムに挿入された組換えヌクレオチド配列は、任意の方向にあってもよい。
好ましい実施形態において、本発明の組換えＨＶＴは、以下を含む：
・ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間のゲノムの遺伝子間領域にクローニングされた少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列、および
・ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間のゲノムの遺伝子間領域にクローニングされた少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列。
・ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間のゲノムの遺伝子間領域にクローニングされた少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列、および
・ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間のゲノムの遺伝子間領域にクローニングされた少なくとも１つの組換えヌクレオチド配列。
特定の実施形態において、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入された核酸は、ＨＶＴ０５４と同じ方向にある。
別の特定の実施形態において、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入された組換えヌクレオチド配列は、ＨＶＴ０６６と同じ方向にある。
組換えヌクレオチド配列または挿入された核酸配列は、プロモーターおよび／またはターミネーターなどの調節配列を含み得る（または作動可能に連結され得る）。使用されるプロモーターは、合成または天然、内因性または異種のプロモーターのいずれかであり得る。標的細胞または宿主において効果的に機能することができる限り、原則として任意のプロモーターを使用することができる。この点に関して、プロモーターは真核生物、原核生物、ウイルスまたは合成のプロモーターであり得、多価ベクターと関連してトリ細胞における遺伝子転写を指示することができる。また、各組換えヌクレオチド配列は、互いに同じであっても異なっていてもよいプロモーターを含み得る。
優先的に、各組換えヌクレオチド配列に使用されるプロモーターは、ニワトリベータアクチン（Ｂａｃ）プロモーター、Ｐｅｃプロモーター、マウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、およびラウス肉腫（ＲＳＶ）プロモーター、またはプロモーター活性を保持するそれらの任意の断片）から選択される。
ニワトリＢａｃプロモーターの核酸配列を配列番号１に、Ｐｅｃプロモーターの配列を配列番号２に、Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの配列を配列番号３に示す。機能性プロモーターをコードするそのような配列の変異体は、既知であり、および／または本発明で使用するために、当業者により設計／試験され得ることに留意されたい。
好ましい実施形態において、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置する遺伝子間領域に挿入された組換えヌクレオチド配列は、ＰｅｃプロモーターまたはＢａｃプロモーターを含む。本発明者らによって得られた結果は、そのようなプロモーターが、本発明の多価ベクターと関連して、該クローニング部位に配置された場合に効率的であることを示している。
別の好ましい実施形態において、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間に位置する遺伝子間領域に挿入された外来遺伝子は、ＰｅｃまたはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターを含む。本発明者らによって得られた結果は、そのようなプロモーターが、本発明の多価ベクターと関連して、該クローニング部位に配置された場合に特に効率的であることを示している。
本発明の特に好ましい組換えＨＶＴは、（ｉ）ＰｅｃまたはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下でＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入された組換え核酸、および（ｉｉ）Ｐｅｃプロモーターの制御下でＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入された組換え核酸を含む。
組換えヌクレオチド配列
組換えヌクレオチド配列は、目的の任意のポリペプチドをコードし得る。組換えヌクレオチド配列は、例えば、抗原、サイトカイン、ホルモン、またはアジュバントなどのポリペプチドをコードし得る。
組換えヌクレオチド配列は、目的の任意のポリペプチドをコードし得る。組換えヌクレオチド配列は、例えば、抗原、サイトカイン、ホルモン、またはアジュバントなどのポリペプチドをコードし得る。
特定の実施形態において、該少なくとも２つの組換えヌクレオチド配列の１つまたはそれぞれは、病原体またはその免疫原性断片からの抗原をコードする。
それらは、トリ種に感染を引き起こす可能性のあるいずれの病原性生物に由来し得るか、またはそれから得られ得る。トリにおいて感染を引き起こす病原体の例としては、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物が挙げられる。
抗原は、該病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質もしくは構造タンパク質、またはそれらの断片から選択されるかまたはそれらに由来するペプチドまたはタンパク質などの、病原体の任意の免疫原性のペプチドまたはタンパク質であり得る。
本発明で使用するための好ましい組換えヌクレオチド配列は、トリインフルエンザウイルス、トリパラミクソウイルス１型（ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）とも呼ばれる）、トリメタニューモウイルス、マレック病ウイルス、ガンボロ病ウイルス（伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）とも呼ばれる）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶＴ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ、Ｏｒｎｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、トリ種に感染するＭｙｃｏｐｌａｓｍａ微生物、および／または球虫類由来の抗原をコードする。
優先的に、ウイルスゲノムに挿入された組換えヌクレオチド配列の少なくとも１つは、ＮＤＶのＦタンパク質、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍの４０Ｋタンパク質、およびトリインフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）、またはそれらの免疫原性断片から選択される抗原をコードする。優先的に、両方の組換えヌクレオチド配列は、同じであろうとなかろうと、そのような抗原をコードする。
抗原の免疫原性断片は、インビボで該抗原に対する免疫応答を誘発することができる任意の断片、好ましくはエピトープを含む任意の断片を示す。免疫原性断片は、一般に、抗原の５～５０個の連続したアミノ酸残基、例えば５～４０個、または１０～４０個のアミノ酸残基を含む。
抗原ペプチドの様々な組み合わせを検討することができる。
一実施形態において、本発明の組換えＨＶＴは、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列、およびＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態において、本発明の組換えＨＶＴは、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列、およびＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態において、本発明の組換えＨＶＴは、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列、およびＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
別の変異体において、本発明の組換えＨＶＴは、同じ病原体からの２つ以上の抗原を発現する。該抗原は、同じであっても異なっていてもよい。
さらなる変異体において、組換えヌクレオチド配列の少なくとも１つは、サイトカインまたは免疫調節剤、アジュバント、ホルモン、駆虫剤、抗菌剤などの活性分子をコードし、もの一方は、例えば、抗原をコードする。
さらなる実施形態によれば、３つ以上の組換えヌクレオチド配列が、ウイルスゲノムに挿入される。
構築方法
本発明の組換えＨＶＴは、組換え技術、相同組換え、部位特異的挿入、突然変異誘発など、当技術分野でそれ自体が公知の技術を使用して調製することができる。
本発明の組換えＨＶＴは、組換え技術、相同組換え、部位特異的挿入、突然変異誘発など、当技術分野でそれ自体が公知の技術を使用して調製することができる。
遺伝子クローニングおよびプラスミド構築は、当業者によく知られており、基本的に標準的な分子生物学技術によって実施することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．２０１２）。
ヘルペスウイルスは、任意の適切な宿主細胞および培地で増殖し得る。ヘルペスウイルスを増させるための殖宿主および条件としては、例えば、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）などのニワトリ由来の細胞、ニワトリ腎細胞などが挙げられる。このような細胞は、イーグルＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ－Ｌ－１５／ＭｃＣｏｙ ５Ａ（１：１混合）培地などの培地で、約３７℃で３～４日間培養することができる。
ゲノムＤＮＡは、任意の従来の方法に従ってウイルス感染細胞から抽出することができる。特に、タンパク質を溶解緩衝液で変性させて除去した後、フェノールとエタノールでＤＮＡを抽出することができる。
一般的には、組換えウイルスは、ウイルスゲノムと、組換えを可能にする挿入部位からのヌクレオチドに隣接する、挿入される組換えヌクレオチド配列または核酸を含む構築物（例えば、プラスミド）との間の相同組換えによって調製され得る。簡単に言えば、標的遺伝子間領域を含む配列は、最初にプラスミドまたは他の適切なベクターにクローニングされる。プラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、およびｐＵＣ９が挙げられ、ファージの例としては、ラムダファージおよびＭ１３ファージを含み、コスミドの例としては、ｐＨＣ７９を含む。クローニングされた領域は、外来遺伝子の挿入時に、外来遺伝子に隣接する配列が、ウイルスゲノムとのインビトロ相同組換えを可能にするために適切な長さであるように、好ましくは十分な長さでなければならない。好ましくは、各隣接配列は、少なくとも約５０ヌクレオチド長を有する。
１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を遺伝子間領域に挿入するために、遺伝子間領域の特定の部位で変異を行って、制限酵素の切断部位を作成することができる。変異を行う方法は、従来の方法であってよく、インビトロ突然変異誘発およびＰＣＲなどの当業者により一般的に用いられる方法を使用することができる。したがって、ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマー中の１～２ヌクレオチドの欠失、置換、または付加などの変異が行われ、次いで、そのプライマーを使用して変異が作成される。あるいは、天然に存在する制限部位を使用してもよい。次いで、外来遺伝子（およびプロモーター）が、プラスミド内のウイルスゲノムの挿入部位に挿入される。
得られたプラスミドは、任意の適切な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、リポフェクチンベースの方法など）を使用して、ＨＶ感染細胞またはＨＶゲノムトランスフェクト細胞に導入することができる。導入するプラスミドの量が０．１～１０００μｇの範囲である場合、ＨＶゲノムの相同領域とプラスミドとの間の組換えによる組換えウイルスの生成効率は細胞内で高くなる。これにより、プラスミドとウイルスゲノム間の組換えイベントが発生し、組換えヌクレオチド配列がウイルスに挿入される。
得られた組換えウイルスは、既知の選択技術を使用して、例えば、ハイブリダイゼーション、組換え核酸配列とともに共挿入された遺伝子によってコードされる酵素活性の検出、または組換えヘルペスウイルスによって免疫学的に発現される抗原ペプチドの検出により遺伝子型または表現型で選択することができる。
選択した組換えヘルペスウイルスは、細胞培養で大規模に培養することができる。作成されると、ウイルスは、適切な細胞内で増殖し得る。
好ましい実施形態
以下の組換えＨＶＴは、本発明の好ましい特定の実施形態である。実施例に示すように、それらは、各組換えヌクレオチド配列によってコードされる抗原に対してインビボで強い免疫応答を可能にする。
以下の組換えＨＶＴは、本発明の好ましい特定の実施形態である。実施例に示すように、それらは、各組換えヌクレオチド配列によってコードされる抗原に対してインビボで強い免疫応答を可能にする。
本発明の特に好ましい組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーター（ＦＷ２４３）の制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む。
本発明の別の特に好ましい組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片コードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーター（ＦＷ２４２）の制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む組換えトリヘルペスウイルスである。
本発明の別の特に好ましい組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーター（ＦＷ２４４）の制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む組換えトリヘルペスウイルスである。
本発明の別の特に好ましい組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーター（ＦＷ２４１）の制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む。
本発明の別の組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターまたはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む。
本発明のさらなる組換えＨＶＴは、（ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターまたはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーター（ＦＷ２５９）の制御下の、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む。
本発明の組換えＨＶＴは、細胞培養物中で増殖させることができる。好ましい実施形態において、ＣＥＦ、発育卵、ニワトリ腎臓細胞などが、組換えＨＶＴの増殖のための宿主細胞として使用される。本発明の多価組換えＨＶＴは、イーグル最小必須培地、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ－Ｌ－１５／ＭｃＣｏｙ ５Ａ（１：１混合）培地などの培地中で、約３７℃で３～４日間培養することができる。このようにして得られた感染細胞を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地に懸濁し、液体窒素下で凍結保存する。
有利なことに、本発明の組換え多価ＨＶＴは、１０回以上の継代後、好ましくは１５回の継代後、さらにより好ましくは、２０継代後も、継代を通して高レベルの安定性を示し、トリ種の細胞、好ましくはＣＥＦ細胞における組換えヌクレオチド配列の同時発現に対応する。本発明と関連して、「継代」または「細胞継代」とは、細胞が９０％～１００％コンフルエントになるまで、それらの増殖を可能にし、それらを生存させるための適切な条件における細胞の培養を意味する。継代ステップは、以前のコンフルエントな培養から少数の細胞を新しい培養培地に移すことで構成されている。少数の細胞を含む以前のコンフルエントな培養物のアリコートを、大量の新鮮な培地で希釈することができる。
ウイルスは、従来の技術を使用して収集または精製し得る。それらは、任意の適切な培地に保存され、凍結および／または凍結乾燥され得る。
核酸および細胞
本発明のさらなる目的は、上記で定義されたウイルスに含まれる任意の核酸に関する。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの変異体であり得る。
本発明のさらなる目的は、上記で定義されたウイルスに含まれる任意の核酸に関する。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの変異体であり得る。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター（例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体など）に関する。
本発明はまた、本発明の組換えＨＶＴ、核酸またはベクターを含む細胞に関する。細胞は、一般的には、トリ細胞などの真核細胞、または原核細胞（ベクターがそのような細胞型での複製または維持に適している場合）である。
ワクチン組成物
本発明はまた、本発明の多価組換えＨＶＴ、本発明の核酸、または本発明の細胞を含むワクチンなどの組成物に関する。
本発明はまた、本発明の多価組換えＨＶＴ、本発明の核酸、または本発明の細胞を含むワクチンなどの組成物に関する。
本発明のワクチンは、一般的には、薬学的に許容されるビヒクル中に、上記のように免疫学的に有効量の組換えＨＶＴを含む。
本発明による組成物およびワクチンは、一般的には、適切な溶媒もしくは希釈剤もしくは賦形剤、例えば水性緩衝液またはリン酸緩衝液を含む。組成物はまた、免疫応答を高めるように十分な量のワクチンで投与される、動物に由来するタンパク質またはペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、共刺激因子）、ウイルスおよび他の供給源に由来する核酸（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）などの添加物を含み得る。さらに、前述の物質の任意の数の組み合わせにより、免疫増強効果がもたらされ得、したがって、本発明の免疫増強剤が形成され得る。
本発明のワクチンは、さらに、等張性、生理的ｐＨおよび安定性を維持するように１種または複数種のさらなる添加剤、例えば、生理食塩水（０．８５％）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、トリス緩衝生理食塩水など、または抗生物質、例えば、ネオマイシンまたはストレプトマイシンなどで調合され得る。
投与経路は、経口、眼球（例えば、点眼薬による）、エアロゾルを使用する眼鼻投与、鼻腔内、飼料中、水中、またはスプレーによる、卵内、局所、または注射による（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、皮内、および／または腹腔内）ワクチン接種を含む任意の経路であり得る。当業者は、各種類の投与経路にワクチン組成物の調合を容易に適合させるであろう。
各ワクチン用量は、トリ種において防御免疫応答を誘発するのに十分な適切な用量を含み得る。そのような用量の最適化は、当技術分野でよく知られている。投与量あたりの抗原の量は、抗原／抗体反応を使用する既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ法によって決定され得る。
本発明のワクチンは、ワクチン接種プロトコルに応じて、単回投与としてまたは反復投与で投与することができる。
本発明のワクチンはさらに、それらが３週間のワクチン接種後に標的とされたトリ病原体に対して最大８０％の保護を鳥種に与えるという点で有利である。
本発明はさらに、病原体に対して家禽などのトリ種を免疫化するための上記のワクチンの使用に関する。
本発明はさらに、本発明による免疫学的に有効量のワクチンを投与することによってトリ種を免疫化する方法に関する。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、経口、卵内、粘膜投与、または眼鼻投与によって有利に投与することができる。
本発明はさらに、上記の有効量の多価ワクチンと、該成分をトリ種に投与するための手段とを含む、トリ種を免疫するためのワクチン接種キットに関する。例えば、そのようなキットは、本発明による多価ワクチンで満たされた注射装置と、皮膚内、皮下、筋肉内、または卵内注射のための説明書とを含む。あるいは、キットは、本発明による多価ワクチンで満たされたスプレー／エアロゾルまたは点眼装置と、眼鼻投与、経口または粘膜投与のための説明書とを含む。
本出願のさらなる態様および利点は、ここで、本発明を例示する以下の実施例に開示される。
実験セクションでは、いくつかの組換えＨＶＴ（本発明による一価または多価）を、以下のように生成し、名付けた（ＨＶＴ／第１の挿入部位－第１の外来遺伝子／第２の挿入部位－第２の外来遺伝子）。
一価：
ＦＷ２００：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２１９：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ１６８：ＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ１６９：ＨＶＴ／４５－４６ Ｂａｃ ＶＰ２
ＦＷ１８１：ＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
多価：
ＦＷ２４１：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ２４２：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２４３：ＨＶＴ／６５－６６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ２４４：ＨＶＴ／６５－６６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ｇＢ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２５９：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ／４５－４６ Ｂａｃ ＶＰ２
一価：
ＦＷ２００：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２１９：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ１６８：ＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ１６９：ＨＶＴ／４５－４６ Ｂａｃ ＶＰ２
ＦＷ１８１：ＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
多価：
ＦＷ２４１：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ２４２：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２４３：ＨＶＴ／６５－６６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｆ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ
ＦＷ２４４：ＨＶＴ／６５－６６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ｇＢ／４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ
ＦＷ２５９：ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ／４５－４６ Ｂａｃ ＶＰ２
実施例１：相同性ベクターの構築
プラスミドの構築は、基本的に標準的な分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０１２）によって行った。ＤＮＡ制限断片をアガロースゲル上で電気泳動し、Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）で精製した。
プラスミドの構築は、基本的に標準的な分子生物学技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０１２）によって行った。ＤＮＡ制限断片をアガロースゲル上で電気泳動し、Ｐｌａｓｍｉｄ ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）で精製した。
ＨＶＴ ＤＮＡは、Ｌｅｅらの方法に従って、ＨＶＴ ＦＣ１２６株に感染したＣＥＦ細胞から調製した。（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５１：２４５－２５３， １９８０）。得られたＨＶＴ ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲによりＨＶＴ０６４－０７１を増幅した。２つのプライマーを使用した。１つは配列番号４（５’－ＧＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＣＧＣＡＣＡＴＧ－３’）で、もう１つは配列番号５（５－ＧＣＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＧ－３’）であった。各プライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２９１８６６．１の情報に基づいて設計した。
ｐＨＶＴ６４－６５の構築
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６４（ＬＯＲＦ３）とＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６４（ＬＯＲＦ３）とＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
第１の対は、配列番号６（５’－ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡ－３’）と、配列番号７（５’－ＧＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＣ－３’）であった。
第２の対は、配列番号８（５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＴＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣ－３’）と、配列番号９（５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡＧＴＴＧ－３’）であった。
得られた第１の断片をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩとで消化した。得られた第２の断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。これらの切断した断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１８に組み込み、プラスミドｐＨＶＴ ６４－６５を得た。
ｐＨＶＴ６５－６６の構築
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）とＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６５（ＵＬ５５）とＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
第１の対は、配列番号：１０（５’－ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＣ－３’）と、配列番号：１１（５’－ＧＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡＴ－３’）であった。
第２の対は、配列番号１２（５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴ ＧＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡ－３’）と、配列番号１３（５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＡＡ－３’）であった。
得られた第１の断片をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩとで消化した。得られた第２の断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。これらの切断した断片は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１８に組み込み、プラスミドｐＨＶＴ ６５－６６を得た。
ｐＨＶＴ６６－６７の構築
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）とＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６６（ＬＯＲＦ４）とＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
第１の対は、配列番号１４（５’－ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧ－３’）と、配列番号１５（５’－ＧＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧ－３’）であった。
第の２の対は、配列番号１６（５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＣＣＧ－３’）と、配列番号１７（５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＡＣＧＧＡＡ－３’）であった。
得られた第１の断片をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩとで消化した。得られた第２の断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。これらの切断した断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１８に組み込み、プラスミドｐＨＶＴ ６６－６７を得た。
ｐＨＶＴ６７－６９の構築
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）とＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６７（ＬＯＲＦ５）とＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
第１の対は、配列番号：１８（５’－ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＧＡＣＧ－３’）と、配列番号：１９（５’－ＧＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＣＧ－３’）であった。
第２の対は、配列番号２０（５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＣ－３’）と、配列番号２１（５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＴＣＧＧ－３’）であった。
得られた第１の断片をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩとで消化した。得られた第２の断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。これらの切断した断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１８に組み込み、プラスミドｐＨＶＴ ６７－６９を得た。
ｐＨＶＴ６９－７０の構築
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）とＨＶＴ０７０との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
ＨＶＴ０６４－０７１をテンプレートとして使用し、２対のプライマーを使用してＰＣＲを行った。２つのＯＲＦ、ＨＶＴ０６９（ＬＯＲＦ６）とＨＶＴ０７０との間にＳｆｉＩ部位を有するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって調製し、ｐＵＣ１８にクローニングした。
第１の対は、配列番号２２（５’－ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＧ－３’）と、配列番号２３（５’－ＧＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＴＧＣＣＧＡＡＡＡＧ－３’）であった。
第２の対は、配列番号２４（５’－ＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＣＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧ－３’）と、配列番号２５（５’－ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＡＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣ－３’）であった。
得られた第１の断片をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩとで消化した。得られた第２の断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化した。これらの切断した断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１８に組み込み、プラスミドｐＨＶＴ ６９－７０を得た。
相同性ベクター、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆの構築
ＳｆｉＩで切断したｐＨＶＴ６５－６６を、アルカリホスファターゼＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｓ１Ｂ１組換え（ＰＡＰ）（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ＃ＤＥ１１０）を使用して脱リン酸化させた。断片をＢｇｌＩ切断ｐ４５／４６Ｐｅｃ Ｆ（ＷＯ２００３／００１０６６）とライゲーションさせ、プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆを得た。合成された短いポリＡシグナル（ＳＰＡ：配列番号２６ ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣ）を、ＳａｌＩおよびＳｆｉＩで切断したｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆに組み込み、相同プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ ＳＰＡを得た。
ＳｆｉＩで切断したｐＨＶＴ６５－６６を、アルカリホスファターゼＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｓ１Ｂ１組換え（ＰＡＰ）（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ＃ＤＥ１１０）を使用して脱リン酸化させた。断片をＢｇｌＩ切断ｐ４５／４６Ｐｅｃ Ｆ（ＷＯ２００３／００１０６６）とライゲーションさせ、プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆを得た。合成された短いポリＡシグナル（ＳＰＡ：配列番号２６ ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣ）を、ＳａｌＩおよびＳｆｉＩで切断したｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆに組み込み、相同プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ ＳＰＡを得た。
相同性ベクター、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢの構築
相同性ベクター、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ ＳＰＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断した。５２１０－ｂｐ断片をＸｂａｌ／Ｎｏｔｌ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｐｅｃ ＩＬｇＢ ｄｅｌ（ＷＯ２０１３ １４４３５５）（１５０６ｂｐ）とライゲーションさせ、相同プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ ＳＰＡを得た。
相同性ベクター、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ ＳＰＡをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断した。５２１０－ｂｐ断片をＸｂａｌ／Ｎｏｔｌ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｐｅｃ ＩＬｇＢ ｄｅｌ（ＷＯ２０１３ １４４３５５）（１５０６ｂｐ）とライゲーションさせ、相同プラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ ＳＰＡを得た。
化学合成されたＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーター
Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーター（配列番号３）を、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．によって報告されたＧｅｎｅ Ｂａｎｋ Ｌ０６８１６．１の４１９１－４７３１ｂｐの情報に基づいて合成し、合成Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーターを、ＢｇｌＩ－ＰｓｔＩ部位をその前に追加し、最後にＸｂａＩ－ＮｏｔＩ部位を追加するようにデザインした。
Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーター（配列番号３）を、Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ、Ｕ．Ｈ．によって報告されたＧｅｎｅ Ｂａｎｋ Ｌ０６８１６．１の４１９１－４７３１ｂｐの情報に基づいて合成し、合成Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモーターを、ＢｇｌＩ－ＰｓｔＩ部位をその前に追加し、最後にＸｂａＩ－ＮｏｔＩ部位を追加するようにデザインした。
実施例２：各トランスファーベクターでトランスフェクトしたＣＥＦにおける組換えＨＶＴの精製
ＨＶＴ野生型ＦＣ１２６株（ｗｔ－ＨＶＴ）のウイルスＤＮＡを、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３４：３４５－３５１， １９９０）による記載のように、調製した。ＦＷ１６８（ｒＨＶＴ／４５－４６ＰｅｃＦ）、ＦＷ１６９（ｒＨＶＴ／４５－４６ＢａｃＶＰ２）およびＦＷ１８１（ｒＨＶＴ／４５－４６ＰｅｃｇＢｄｅｌ）（ＷＯ２００５ ０９３０７０）のウイルスＤＮＡを同様の方法で調製した。第１の二重ｒＨＶＴパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したｗｔ－ＨＶＴ ＤＮＡとｐＨＶＴ６５－６６Ｐｅｃ Ｆ（例えばＦＷ２００）とをトランスフェクトしたものであった。第２のパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したＦＷ１６８ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ（例えばＦＷ２４２）とをトランスフェクトしたものであった。第３のパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したＦＷ１８１ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ（例えばＦＷ２４１）とをトランスフェクトしたものであった。第４のパターンは、ＣＥＦに、調製したＦＷ１６９ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ（例えばＦＷ２５９）とをトランスフェクトしたものであったこれらの得られた組換えウイルスを、プラークを抗ＩＬＴＶ ｇＢ抗体、抗ＮＤＶ－Ｆ抗体、または抗ＩＢＤＶ－ＶＰ２抗体で染色することによってプラーク精製した。
ＨＶＴ野生型ＦＣ１２６株（ｗｔ－ＨＶＴ）のウイルスＤＮＡを、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３４：３４５－３５１， １９９０）による記載のように、調製した。ＦＷ１６８（ｒＨＶＴ／４５－４６ＰｅｃＦ）、ＦＷ１６９（ｒＨＶＴ／４５－４６ＢａｃＶＰ２）およびＦＷ１８１（ｒＨＶＴ／４５－４６ＰｅｃｇＢｄｅｌ）（ＷＯ２００５ ０９３０７０）のウイルスＤＮＡを同様の方法で調製した。第１の二重ｒＨＶＴパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したｗｔ－ＨＶＴ ＤＮＡとｐＨＶＴ６５－６６Ｐｅｃ Ｆ（例えばＦＷ２００）とをトランスフェクトしたものであった。第２のパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したＦＷ１６８ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ（例えばＦＷ２４２）とをトランスフェクトしたものであった。第３のパターンは、ＣＥＦ細胞に、調製したＦＷ１８１ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ Ｆ（例えばＦＷ２４１）とをトランスフェクトしたものであった。第４のパターンは、ＣＥＦに、調製したＦＷ１６９ ＤＮＡと、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢ（例えばＦＷ２５９）とをトランスフェクトしたものであったこれらの得られた組換えウイルスを、プラークを抗ＩＬＴＶ ｇＢ抗体、抗ＮＤＶ－Ｆ抗体、または抗ＩＢＤＶ－ＶＰ２抗体で染色することによってプラーク精製した。
手短に言うと、１０７の初代ＣＥＦ細胞を１００μＬのＭＥＦ－１（Ｌｏｎｚａ ＬＮＪＶＤ－１００４）に懸濁し、１μｇの相同性ベクター（例えば、ｐＨＶＴ６５－６６ ＰｅｃＦ、ｐＨＶＴ６５－６６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ｇＢ）と、２μｇのＨＶＴ ＤＮＡ（例えば、ＦＣ１２６、ＦＷ１８１、ＦＷ１６８）とをエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩでエレクトロポレーションを行った。トランスフェクトした細胞を、２０ｍＬのＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ－１５（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｃａｔ．＃４１３００－３９）、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｃａｔ．＃２１５００－０６１）（１：１）、および４％子ウシ血清（溶液ＬＭ（＋）培地と名付けられる）に希釈し、９６ウェルプレートにウェルあたり１００ｕＬを分配する。
プラークが見えるようになるまで３７℃で、５％ＣＯ２でインキュベートし、細胞をトリプシン処理によってプレートから剥がし、新たに調製した二次ＣＥＦ細胞で希釈し、２枚の９６ウェルプレートに均等に移し、３日間インキュベートしてプラークを可視化した。次いで、２枚のプレートのうちの１枚を抗体で染色し、各トランスファーベクターに保持された挿入遺伝子を一次抗体として検出した。ＮＤＶ－Ｆを抗Ｆｃウサギ血清またはＭａｂ７７－２により検出した。ＩＬＴＶ－ｇＢを抗ＩＬＴＶ ｇＢＮ４ウサギ血清またはＭａｂ＃１＿Ｂ４＿７により検出した。ＩＢＤＶ－ＶＰ２を抗ＶＰ２モノクローナル抗体Ｒ６３（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ－９４９０）により検出した。染色された組換えプラークを含むウェルを検出した後、他のプレートの対応するウェルから細胞を回収し、新たな二次ＣＥＦ細胞で希釈し、２枚の９６ウェルプレートに均等に移して、精製の最初のラウンドを完了した。得られたすべてのプラークが各ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体で陽性に染色されるまで、精製手順を繰り返した。その後、ダブルｒＨＶＴ候補を別の抗体で染色した。最終的に、候補ｒＨＶＴのすべてのプラークによるタンパク質の発現を、二重ＩＦＡ染色により確認した。各ｒＨＶＴに感染したＣＥＦを冷アセトン－メタノール（２：１）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、抗体混合物（１：１０００希釈の抗ｇＢＮ４ウサギ血清（またはＭａｂ＃１＿Ｂ４＿１）および抗Ｆｃウサギ血清（Ｍａｂ７７－２）または抗ＶＰ２マウスＭａｂ Ｒ６３）を３７Ｃで６０分、反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を蛍光抗体混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供された１：１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ウサギおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６抗マウス）と３７Ｃで６０分間、反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、４０倍または１００倍の倍率で、蛍光顕微鏡で観察した。
タンパク質ｇＢの発現を、抗ｇＢＮ４ウサギ血清およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６により検出した。タンパク質Ｆの発現を、抗Ｆ Ｍａｂ ７７－２およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８により検出した。タンパク質ＶＰ２の発現を、抗ＶＰ２ Ｍａｂ（Ｒ６３）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５４６により検出した。すべてのプラークがＦとｇＢの両方（ｇＢとＶＰ２の両方）を発現したとき、精製が完了したと結論づけた。図２ＡおよびＢは、デュアルＩＦＡのいくつかの例を示す。
精製された組換えＨＶＴを、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴまたはｒＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤＶと名付けた。
以下の表１は、さまざまなｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴから得られたｇＢおよびタンパク質Ｆの発現を示す。
菌株ＦＷ１６８（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ）およびＦＷ２００（ＨＶＴ／６５－６６ ＰｅｃＦ）は、タンパク質Ｆ発現の対照として使用される一価組換えヘルペスウイルスに対応し、ＦＷ１８１（ＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢｄｅｌ）およびＦＷ２１９（ＨＶＴ／６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢｄｅｌ）は、タンパク質ｇＢ発現の対照として使用される一価組換えヘルペスウイルスに対応し、ＦＷ１６９（ＨＶＴ／４５－４６ Ｂａｃ ＶＰ２）は、ＶＰ２発現の対照として使用される一価組換えヘルペスウイルスに対応する。
結果は、本発明の二価構築物が両抗原を発現することを示している。
実施例３：二重組換えＨＶＴに感染したＣＥＦにおける２つのタンパク質の同時発現
２×１０５のＣＥＦ細胞を含有する２ｍＬを組換えＨＶＴに感染させ、３７℃で、５％ＣＯ２中３日間、インキュベートした。
２×１０５のＣＥＦ細胞を含有する２ｍＬを組換えＨＶＴに感染させ、３７℃で、５％ＣＯ２中３日間、インキュベートした。
次いで、培養物を３００ｇで３分間遠心分離し、沈殿した細胞を１００ｕＬに再懸濁した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００ｕＬ）を細胞懸濁液に加えた。次いで、得られた混合物を５分間煮沸し、それらのうちの５ｕｌを１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動したタンパク質をＳＤＳ－ＧＥＬからＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、ＰＢＳに溶解した１％ｗ／ｖ脱脂粉乳中、室温で１時間ブロックした。
次いで、Ｆ検出（図３Ａ）のために、処理した膜を５００倍希釈の抗Ｆｃウサギ抗血清と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗ウサギヤギ抗血清とともに１時間インキュベートした。
ｇＢ検出（図３Ｂ）のために、処理した膜を５００倍希釈の抗ｇＢＮ４ウサギ血清と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗ウサギヤギ抗血清とともに１時間インキュベートした。
ＰＢＳで３回洗浄した後、膜をアビジン－アルカリホスファターゼ複合体とともに１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で１回洗浄し、次いでＢＣＩＰ－ＮＢＴ（アルカリホスファターゼの基質）と反応させた。図３Ａに示すように、６０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質バンドは、Ｆタンパク質の予想サイズ（ ）であるｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴ感染細胞のレーンでのみ観察された。ｒＨＶＴ／４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢ（ＦＷ１８１）のレーンにはバンドがなかった。
図３Ｂは、各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴのレーンで、５４キロダルトン（ｋｄ）でｇＢタンパク質が観察されたことを示している
。
それどころか、ｒＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ（ＦＷ１６８）のレーンにはバンドがなかった。５４－ｋｄは、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴまたはｒＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤに挿入されるｇＢ短縮タンパク質（４６９ａａ；ＷＯ２００５／０９３０７０）である。
。
それどころか、ｒＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ（ＦＷ１６８）のレーンにはバンドがなかった。５４－ｋｄは、ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴまたはｒＨＶＴ／ＩＬＴ／ＩＢＤに挿入されるｇＢ短縮タンパク質（４６９ａａ；ＷＯ２００５／０９３０７０）である。
本発明による二重組換えＨＶＴは、ＮＤＶ－ＦおよびＩＬＴＶ－ｇＢの両方を発現した。
実施例４：ゲノム構造の検証
ＰＣＲ分析
精製したｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴを１枚の６ウェルプレートのＣＥＦ細胞に増殖させ、コンフルエントなプラークを得た。細胞をこすることにより皿から回収し、Ｆａｌｃｏｎチューブに移して、３００ｘｇで５分間遠心分離した。（１つのウェルから）採取した細胞の１０分の１を０．１ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に懸濁し、１分間ボルテックスして溶解させた。溶解物を、２μＬのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ）とともに６０℃で１０分間インキュベートした。得られた混合物をフェノール－クロロホルムで２回処理した。水相（ウイルスＤＮＡ）をテンプレートとして使用した。
ＰＣＲ分析
精製したｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴを１枚の６ウェルプレートのＣＥＦ細胞に増殖させ、コンフルエントなプラークを得た。細胞をこすることにより皿から回収し、Ｆａｌｃｏｎチューブに移して、３００ｘｇで５分間遠心分離した。（１つのウェルから）採取した細胞の１０分の１を０．１ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に懸濁し、１分間ボルテックスして溶解させた。溶解物を、２μＬのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍＬ）とともに６０℃で１０分間インキュベートした。得られた混合物をフェノール－クロロホルムで２回処理した。水相（ウイルスＤＮＡ）をテンプレートとして使用した。
プライマーセットを、挿入部位ごとに設計した。
ＨＶＴ６５／６６周辺の分析用
６５Ｒ（配列番号２７）：５’－ＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧ－３’
６６Ｆ（配列番号２８）：５’－ＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＴ－３’
ＵＬ４５／４６周辺の分析用
４５－４６Ｆ－Ｋ（配列番号：２９）：５’－ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣ－３’
４５－４６Ｒ（配列番号３０）：５’－ＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’
ＰＣＲを、メーカーのマニュアルに従ってＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．＃Ｒ０６０）を使用して行った。
６５Ｒ（配列番号２７）：５’－ＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧ－３’
６６Ｆ（配列番号２８）：５’－ＧＣＣＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＡＣＴＣＣＴ－３’
ＵＬ４５／４６周辺の分析用
４５－４６Ｆ－Ｋ（配列番号：２９）：５’－ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣ－３’
４５－４６Ｒ（配列番号３０）：５’－ＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’
ＰＣＲを、メーカーのマニュアルに従ってＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．＃Ｒ０６０）を使用して行った。
図４ＣのＰＣＲの結果は、２５５０－ｂｐの断片が、精製されたＦＷ２４３（ｐ＋１）由来のＤＮＡでのプライマーセット６６Ｆ／６５Ｒで増幅されたことを示している。トランスファープラスミドｐＨＶＴ６５－６６ ｉｅ１ ＮＤＶ－Ｆにおいて増幅された断片は同じサイズであった。さらに、２２８１－ｂｐの断片は、精製されたＦＷ２４３（ｐ＋１）由来のＤＮＡでの別のプライマーセット４５－４６－Ｋ／４５－４６Ｒで増幅された（図４Ｄ）。同じバンドがｐ４５－４６ Ｐｅｃ ｇＢｄｅｌで検出された。下の断片（５４６ｂｐ）はｐＮＺ４５－４６ Ｓｆｉ－Ｔで増幅された。
図４Ｃ～Ｄ（ｐ＋１）は、得られた二重組換えＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴが予想されたゲノム構造を有することを示す。親株に対応するバンドが増幅されなかったため、組換えウイルスは純粋であることが確認された。
実施例５：継代中の組換えＨＶＴの安定性
ＰＣＲ分析
各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴをＣＥＦ細胞で２０回継代し、実験４で説明したようにＰＣＲ分析を行った。結果は実験４で得られた結果と同じであり、組換えウイルスは２０継代後も安定であることが示された。
ＰＣＲ分析
各ｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴをＣＥＦ細胞で２０回継代し、実験４で説明したようにＰＣＲ分析を行った。結果は実験４で得られた結果と同じであり、組換えウイルスは２０継代後も安定であることが示された。
図４ＡのＰＣＲの結果は、ＦＷ２４２（ｐ＋５、＋１０、＋１５、＋２０）およびトランスファープラスミドｐＨＶＴ６５－６６ Ｐｅｃ ｇＢｄｅｌ由来のＤＮＡでのプライマーセット６６Ｆ／６５Ｒで２１１８－ｂｐの断片が増幅されたことを示す。対照的に、下の断片（２５２ｂｐ）は、未精製のクローンで増幅された。
図４Ｂは、ＦＷ２４２（ｐ＋５、＋１０、＋１５、＋２０）およびｐ４５－４６ Ｐｅｃ Ｆ ２ｎｄで別のプライマーセット４５－４６－Ｋ／４５－４６Ｒを使用して３０８３－ｂｐ断片が増幅されたことを示す。下のバンド（５４７ｂｐ）は、ｐＮＺ４５－４６ Ｓｆｉ－Ｔ（ＵＳ ７５６９３６５）で増幅された。
図４Ｃは、２５５０－ｂｐの断片が継代されたＦＷ２４３（ｐ＋５、＋１０、＋１５、＋２０）で増幅されたことを示す。図４Ｄは、２２８１－ｂｐの断片が継代されたＦＷ２４３（ｐ＋５、＋１０、＋１５、＋２０）で増幅されたことを示す。
６５Ｒ／６６Ｆおよび４５－４６－Ｋ／４５－４６ＲによるＰＣＲ分析は、ＦＷ２４２およびＦＷ２４３の挿入部位ＨＶＴ６５／６６またはＵＬ４５／４６でそれぞれＦ遺伝子またはｇＢ遺伝子が安定して維持されていることを示した。
ウエスタンブロッティング分析
二重組換えＨＶＴは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上で連続的に（最大２０回）継代された。次いで、細胞溶解物をウエスタンブロット分析に適用した。第１のパネル（図５Ａ）において、ブロットは、抗Ｆｃウサギ血清（１：５００）での反応であった。第２のパネル（図５Ｂ）において、ブロットは、抗ｇＢＮ４ウサギ血清（１：５００）での反応であった。
二重組換えＨＶＴは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）上で連続的に（最大２０回）継代された。次いで、細胞溶解物をウエスタンブロット分析に適用した。第１のパネル（図５Ａ）において、ブロットは、抗Ｆｃウサギ血清（１：５００）での反応であった。第２のパネル（図５Ｂ）において、ブロットは、抗ｇＢＮ４ウサギ血清（１：５００）での反応であった。
偽：非感染ＣＥＦ
Ｍ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｂｉｏ Ｒａｄ＃１６１－０３７４
２０継代後、ＮＤＶ－Ｆタンパク質
およびＩＬＴＶ－ｇＢ
は二重組換えＨＶＴに感染したＣＥＦで安定して発現した。
実施例６：二重組換えＨＶＴを接種したニワトリにおける抗ＮＤＶ抗体の誘導
２０ゲージ注射器を使用して、１日齢のＳＰＦニワトリ（ＬｉｎｅＭ、ＮＩＳＳＥＩＫＥＮ）１０羽の背中に二重組換えＨＶＴを皮下接種した。接種用量を表２に示す。ワクチン接種したニワトリから血清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶＥＴ、ニューカッスル病を診断するためのＩＤスクリーンニューカッスル Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔキット）によって抗ＮＤＶ抗体価を測定した。陰性対照群（非免疫化）のニワトリにはワクチンを投与しなかった。
２０ゲージ注射器を使用して、１日齢のＳＰＦニワトリ（ＬｉｎｅＭ、ＮＩＳＳＥＩＫＥＮ）１０羽の背中に二重組換えＨＶＴを皮下接種した。接種用量を表２に示す。ワクチン接種したニワトリから血清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶＥＴ、ニューカッスル病を診断するためのＩＤスクリーンニューカッスル Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔキット）によって抗ＮＤＶ抗体価を測定した。陰性対照群（非免疫化）のニワトリにはワクチンを投与しなかった。
表２は、Ｓ／Ｐ値による抗ＮＤＶ力価を示す。結果は、本発明による二重組換えＨＶＴが、接種後早くも３週間で抗ＮＤＶ抗体を誘導し、その後抗ＮＤＶ抗体を増加させたことを明確に示している。
実施例７：ＩＬＴＶに対するＳＰＦニワトリのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴの有効性
ＩＬＴワクチンとしてのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴ（ＦＷ２４１、ＦＷ２４２、ＦＷ２４３、ＦＷ２４４）の有効性は、ＩＬＴＶ ＵＳＤＡ株によるチャレンジにより評価された。
ＩＬＴワクチンとしてのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴ（ＦＷ２４１、ＦＷ２４２、ＦＷ２４３、ＦＷ２４４）の有効性は、ＩＬＴＶ ＵＳＤＡ株によるチャレンジにより評価された。
二重組換えＨＶＴを１日齢のＳＰＦニワトリの背中に皮下接種した。接種から４週間後、ワクチン接種したニワトリに、気管内（ＩＴ）にＩＬＴＶ ＵＳＤＡ株の１０３ ＥＩＤ５０／鳥をチャレンジした。チャレンジしたニワトリを毎日観察して、死亡数を調べ、衰弱、努力性呼吸、ラ音、血痰、くしゃみ、あえぎ、頭振り、首を伸ばす、または羽を逆立てるなどの伝染性喉頭気管炎の症状を検出した。チャレンジ後１０日目の結果を表３にまとめた。
表３に示すように、本発明による二重組換えＨＶＴのすべては、ニワトリにおいて毒性のあるＩＬＴＶによるチャレンジに対して防御免疫を誘導した。
実施例８：ＳＰＦニワトリにおいてＮＤＶに対するｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴの有効性
ＮＤワクチンとしてのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴ（ＦＷ２４１、ＦＷ２４２、ＦＷ２４３、ＦＷ２４４）の有効性を評価した。
ＮＤワクチンとしてのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴ（ＦＷ２４１、ＦＷ２４２、ＦＷ２４３、ＦＷ２４４）の有効性を評価した。
２，０００ＰＦＵ／２００μＬ／ニワトリのｒＨＶＴ／ＮＤ／ＩＬＴを、２０ゲージの注射器を使用して１５羽の１日齢のＳＰＦニワトリ（ＬｉｎｅＭ，Ｊａｐａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の背中に皮下接種した。ワクチン接種後３週間以降、ワクチン接種した鳥から血清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶＥＴ、ニューカッスル病を診断するためのＩＤスクリーンニューカッスル病間接キット）で抗ＮＤＶ抗体価を測定した。
陰性対照群のニワトリにはワクチンを投与しなかった（ＮＩ：非免疫化）。
４９日齢（ワクチン接種後４８日目）に、５群すべてのニワトリに、有効性研究でチャレンジ株として頻繁に使用される株であるＮＤＶ－ＴｅｘａｓＧＢの１０３ ＥＩＤ５０を、大腿部への筋肉内注射によってチャレンジした。チャレンジしたニワトリを毎日観察して、死亡数を調べ、衰弱、あえぎ、神経症状、瀕死などのニューカッスル病のあらゆる症状を検出した。チャレンジ後１０日目の結果を表４に示す。
表４に示すように、本発明による二重組換えＨＶＴのすべては、ＮＤＶによるチャレンジに対してニワトリにおいて防御免疫を誘導した。
Claims (24)
- 少なくとも第１および第２の組換えヌクレオチド配列を含み、各組換えヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（「ＨＶＴ」）であって、前記第１の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間に位置するウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入され、前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０７０との間に位置するウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、組換えＨＶＴ。
- 前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６４とＨＶＴ０６５との間に位置する前記ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１に記載の組換えＨＶＴ。
- 前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間に位置する前記ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１に記載の組換えＨＶＴ。
- 前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６６とＨＶＴ０６７との間に位置する前記ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１に記載の組換えＨＶＴ。
- 前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６７とＨＶＴ０６９との間に位置する前記ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１に記載の組換えＨＶＴ。
- 前記第２の組換えヌクレオチド配列が、ＨＶＴ０６９とＨＶＴ０７０との間に位置する前記ウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１に記載の組換えＨＶＴ。
- 各組換えヌクレオチド配列が、トリ病原体由来の抗原またはその免疫原性断片をコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- 各抗原が、前記トリ病原体またはその免疫原性断片の表面タンパク質、分泌タンパク質および構造タンパク質から選択される、請求項７に記載の組換えＨＶＴ。
- 各組換えヌクレオチド配列が、トリパラミクソウイルス１型の抗原、好ましくはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦタンパク質またはその免疫原性断片、ガンボロ病ウイルスの抗原、好ましくは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質またはその免疫原性断片、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の抗原、好ましくはｇＢタンパク質またはその免疫原性断片、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍの抗原、好ましくは４０Ｋタンパク質またはその免疫原性断片、およびトリインフルエンザウイルスの抗原、優先的には表面タンパク質血球凝集素（ＨＡ）またはその免疫原性断片の中から選択される抗原をコードする、請求項７または８に記載の組換えＨＶＴ。
- 前記第１および第２の組換えヌクレオチド配列が、同じ病原体もしくは異なる病原体由来の異なる抗原、またはその免疫原性断片をコードする、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- 各組換えヌクレオチド配列が、プロモーターの制御下にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- 組換えヌクレオチド配列の発現を制御する各プロモーターが、ニワトリベータアクチン（Ｂａｃ）プロモーター、Ｐｅｃプロモーター、マウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）前初期（ｉｅ）１プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｈｃｍｖ）、サルウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはプロモーター活性を保持するそれらのいずれかの断片から選択される、請求項１１に記載の組換えＨＶＴ。
- （ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- （ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- （ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- （ｉ）ＨＶＴ０６５とＨＶＴ０６６との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモーターの制御下の、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＨＶＴ０５３とＨＶＴ０５４との間の前記遺伝子間領域に挿入される、優先的にはＰｅｃプロモーターの制御下の、ＮＤＶのＦタンパク質またはその免疫原性断片をコードする組換えヌクレオチド配列とを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴの前記ゲノムを含む核酸。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ、または請求項１７に記載の核酸を含む細胞。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えトリヘルペスウイルスおよび適切な賦形剤または希釈剤を含む組成物。
- 請求項１７に記載の核酸または請求項１８に記載の細胞および適切な賦形剤もしくは希釈剤を含む組成物。
- 有効免疫量の請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えトリヘルペスウイルス、請求項１７に記載の核酸および／または請求項１８に記載の細胞を含む多価ワクチン。
- 病原体に対して家禽などのトリを免疫するために使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えＨＶＴ。
- 少なくとも２つの病原体に対して同時に、トリにワクチン接種する方法で使用するための、請求項２１に記載の多価ワクチン。
- トリを免疫するためのワクチン接種キットであって、以下の成分：
ｃ．有効量の請求項２１に記載の多価ワクチン、および
ｄ．前記ワクチンを前記トリに投与するための手段を含む、ワクチン接種キット。
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