JP2004500846A - Myc標的 - Google Patents
Myc標的 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004500846A JP2004500846A JP2001582530A JP2001582530A JP2004500846A JP 2004500846 A JP2004500846 A JP 2004500846A JP 2001582530 A JP2001582530 A JP 2001582530A JP 2001582530 A JP2001582530 A JP 2001582530A JP 2004500846 A JP2004500846 A JP 2004500846A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- myc
- protein
- gene
- cancer
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Superconductor Devices And Manufacturing Methods Thereof (AREA)
- Holo Graphy (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は癌の治療および診断に関し、かつ癌の治療に対する薬剤の開発に関する。本発明はSAGE(Serial analysis of Gene Expression)により識別されるmyc癌遺伝子ファミリーの350より多い標的のカタログを提供する。本発明により遺伝子発現におけるmyc誘導変化の全コンテクストの観点においてmyc下流標的の分析が可能になる。本発明は、成長、浸潤、および拡散をもたらす癌細胞の本質的な腫瘍性特性を支持する現象および本質的に正常な生理学的機構における補充および適用をもたらすのはmyc癌遺伝子ファミリーそれ自体であるという見識を提供する(図1参照)。前記癌の本質的な腫瘍性特性を支持できるmyc依存性下流遺伝子を調節することを含む癌の治療法を提供する。本発明はmyc下流効果に干渉する薬剤を識別するためのスクリーニングアッセイにおける読み取りとしてmyc下流遺伝子の1つまたはそれ以上の遺伝子生成物を使用する方法をも提供する。本発明のこの見識により、mycブースト細胞蛋白質合成機構が組み換え蛋白質合成システムに対する細胞生成システムを最適にするために使用できることが示される。
Description
【0001】
本発明は癌の治療および診断、並びに癌治療のための薬剤開発に関する。
【0002】
正常な健康的な生物は、体の特別な必要性に応答する注意深く調節された均衡を維持する。特に、新しい細胞の創造または増殖と余剰細胞の死との間の均衡は良好に維持される。しかし、細胞増殖を調節する、優れた制御が破壊し、体がこの種の細胞をさらに必要としていないにもかかわらず、細胞が成長および分裂を開始する場合がある。このような細胞は必然的に、体にとって真に必要性のない新生細胞になる。このような細胞の子孫が調節に応答することなく増殖する性質を受け継ぐ場合、結果は無制限に拡がることのできる細胞のクローンとなる。最後には、望まれない細胞のこのクローンにより、腫瘍と呼ばれる塊が形成され得る。すなわち、この冒された個体は癌の開始を発現する。新生細胞または腫瘍は、特に老いた個体では高い頻度で発生する。しかし、局所化しているので殆どの場合はホストに危険をもたらすことは殆どない。局所化した腫瘍は一般に良性と呼ばれ、腫瘍は全身に拡がると命にかかわるようになる。このような腫瘍は悪性と呼ばれ、癌に発展する。
【0003】
悪性腫瘍を良性のものから区別する主な特徴は、その侵襲性と拡がりである。悪性腫瘍は局所に留まらず、カプセル化されない。逆に周囲の組織を侵略し、体の循環系に入り、起源の部位から離れて増殖領域を作り上げる。腫瘍細胞の拡がりと成長の第2領域の確立は転移と呼ばれる。増殖し拡がる悪性細胞は転移の可能性を獲得する。
【0004】
明らかな良性腫瘍が悪性に進行する可能性があり、悪性腫瘍の最も初期段階は確認が困難であるため、病理学は悪性の始まりの程度を確実に捉えることは殆どできない。どんな場合でも、悪性腫瘍の細胞は、分化した特徴を失い、変化した染色体組成を獲得し、必然的に転移するようになる傾向を有しており、侵略的になり、拡がる。
【0005】
正常に調節されている細胞を制御に対して応答することなく成長する細胞に変化する遺伝的現象についての知識が豊富になった。これらの遺伝的現象は一般に配偶子を介して遺伝されず、むしろ体細胞のDNAが変化する。変化の基本形は先に現存する遺伝子が癌遺伝子へ変化することである。その生成により不適切な細胞成長が引き起こされる。したがって、DNAの変化は癌誘発の中心にあり、原因となる遺伝的現象を解明する科学的研究に多くの焦点が注がれた。例えば、myc癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を演じる。ヒト癌におけるmyc遺伝子の遺伝子変化の頻度(Dang and Lee,1995)は、1年あたり米国で約70.000人の癌死がmyc遺伝子またはその発現における変化と関連すると見積もることができる。3つのメンバー、すなわちN−myc、c−myc、およびL−mycが再配列され、増幅され、突然変異を起こし、および/または肺癌、乳癌、および結腸癌、白血病、および脳腫瘍等、多くの癌において過大発現される。
【0006】
c−myc遺伝子は、広範な組織および腫瘍において発現されるが、N−myc発現は胚組織、プレ−B細胞、および神経内分泌腫瘍に非常に限定される。N−mycはヒト神経芽細胞腫および小細胞肺癌において増幅され、ウィルムス腫瘍および網膜芽腫において強く発現される。神経芽細胞腫は予後が非常に変化し得る幼児期癌である。神経芽細胞腫の約20%がN−myc増幅を有しており、これらの腫瘍は非常に活動的な経過をたどる(Schwabら, 1983, Seeger ら, 1985)。神経芽細胞腫細胞株における形質移入されたN−myc遺伝子の過剰発現は増殖速度を非常に高めた(Bernardsら, 1986, Lutz ら, 1996)。神経堤誘導組織における遺伝子組み換えマウス過剰発現N−mycにより神経芽細胞腫が頻繁に成長する(Weisら, 1997)。多くの比較可能な観察により、多くの他の腫瘍型の病原におけるc−mycおよびL−mycを関係付けられた(Cole, 1986, marcu ら, 1992, Henrikson およびLuscher, 1996)。
【0007】
myc−ファミリーメンバーはベーシック/ヘリックス−ループ−ヘリックス/ロイシンジッパー(bHLHzip)ドメインを有する転写因子である。MAX蛋白質とmycのヘテロダイマーは、E−ボックスモーティブCACGTGに結合し、標的遺伝子転写を活性化する(Blackwood ら,1992,Alexら, 1992; Maら, 1993 )。したがって、少数の識別標的遺伝子によりmyc下流パスウェイの識別はかなり不可能になった。しかし、多くの実験により、細胞周期コントロール、転位、分化の遮断、アポトーシス、および増殖速度におけるmyc遺伝子についての役割が示唆された(HenrikssonおよびLuscher,1996, Dang,1999, Schmidt,1999)。正常に機能しないmyc機能を有するショウジョウバエ突然変異体および哺乳類細胞株の表現型分析は細胞成長におけるmyc遺伝子についての役割を示唆した。ラット線維芽細胞におけるc−myc対立遺伝子の両方の不活性化により、2倍から3倍の成長速度の減少となった(Mateyakら, 1997)。ショウジョウバエdmycの正常に機能しないインビボ発現は細胞成長を遅らせ、通常のサイズの半分の大人のハエを結果としてもたらした。さらに、成長調節におけるmyc遺伝子についての役割は細胞周期におけるその効果に合致している。ラット線維芽細胞におけるc−mycの不活性化により細胞周期のG1およびG2期が長くなった。しかし、S期は長くならなかった。ヒト細胞におけるc−mycまたはN−mycの高発現はG1期を通過する移行を加速した(Steinerら,1995; Lutzら,1996)。同様の効果がショウジョウバエで見いだされた。つまり、dmyc活性が減少することにより、G1期の長さが長くなり、一方、dmyc発現が増加することにより、G1を通過する移行が高まった(johnstonら, 1999)。
【0008】
多くの研究により、増殖におけるmycファミリー癌遺伝子の発現が関連付けられた。幾つかの腫瘍系列において、myc遺伝子の発現と増殖の発生との間には関連がある。このことは、例えば乳癌、骨腫瘍および結腸癌におけるc−mycについて観察された(Sierraら,1999, Gamberiら,1998, Kakisakoら,1998)。実験システムにより、myc遺伝子の発現および増殖キャパシティとの間の直接の関連を確認した。例えば、c−myc過剰発現ヒトメラノーマ細胞は、コントロールメラノーマ細胞より転移性であった(Schlagbauer−Wadlら,1999)。しかし、myc遺伝子の発現が癌細胞の転移性の可能性を増加するメカニズムは知られていない。
【0009】
c−mycの直接的な幾つかの標的および間接的に誘導された遺伝子の系列が確認されたが、これらの遺伝子間の明らかな関連は見いだされていない。これらの観察の付随的なおよび独立的な特徴により、癌におけるmyc遺伝子の細胞効果の包括的および統合的な観点の確認を妨げられた。例としては、プロサイモシンα(Eilersら,1991)、オルニチンデカルボキシラーゼ(Bello−Fernandezら,1993)、胚発現ECA39遺伝子(Benvenistyら,1992)、翻訳開始因子elF−4EおよびeIF−2−α(Jonesら,1996; Rosenwaldら,1993)、CAD遺伝子(Boydら,1997)、DEADボックス遺伝子MrDb(Grandoriら,1996)、および近時におけるヌクレオリン(Greasleyら,2000)である。サイクリンおよび他の細胞周期調節因子における効果は細胞の型および条件に依存する。サイクリンD1またはチロシン蛋白質フォスファターゼcdc25Aの誘導は、幾つかのモデル系でのみ見いだされた(Galaktionovら,1996, Amatiら,1998, Philippら,1994; Daksisら,1994; Solomonら,1995)。サイクリンEおよびA発現誘導が報告された(Jansen−Durrら,1993; Hansonら,1994)。c−myc標的プロサイモシンαおよびオルニチンデカルボキシラーゼもN−mycにより誘導されるが、c−mycおよびN−mycがその標的を全て分担するかは知られていない(Lutzら,1996)。したがって、myc遺伝子の変更が中心的であり、その多くが確認されマップ化された。
【0010】
増殖し拡がる癌細胞において裏付ける生理的現象が生じることを明らかにするのに、あまり努力は払われていない。細胞が癌への過程で遺伝的に変化することは充分に理解される。これらの遺伝的に変化した細胞がいかにして通常の生理的メカニズムおよび現象を使って成長、侵略、拡がりに至る本質的な癌特性を立証するかはあまり理解されない。例えば、myc蛋白質は転写因子である。これはMAX蛋白質とダイマーを形成し、DNA配列がCACGTGであると認める。したがって、myc転写因子の極僅かの標的遺伝子が確認された。確認された標的からはmyc蛋白質により活性化された経路の明確な理解はできない。したがって、病原におけるこれらの蛋白質の生化学的役割は推測される。myc遺伝子の正常でない発現を有する突然変異体ショウジョウバエ、哺乳類細胞株、および遺伝子組み換えマウスについての表現型の観察により、細胞周期コントロール、転位、アポトーシス、増殖速度、および細胞成長におけるmyc遺伝子についての役割が示唆された。本発明はmyc調節遺伝子の少なくとも7つのグループを開示する。
【0011】
本発明は、成長、侵略、および拡がりに至る癌細胞の本質的な癌の特徴をサポートする、本質的な通常の生理的メカニズムおよび現象の採用および適用を提供するのはmyc癌遺伝子ファミリーそれ自体であるという見識を提供する。本発明は、成長、侵略、または拡がり等の癌の特徴を本質的に証明できる遺伝子の機能的フラグメントまたはmyc依存下流遺伝子から構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、核酸ライブラリーは、下流myc−依存遺伝子またはその機能性フラクションである、遺伝子またはその機能性フラグメントから構成される核酸配列のコレクションとして規定される。これらの遺伝子の上方または下方制御は、mycファミリーメンバーによりコード化される転写因子の存在に少なくとも依存する。このような核酸配列のコレクションにおいて、配列は、核酸配列のコレクションの容易な取り扱いを提供するベクターにおいて好ましく利用可能である。myc遺伝子の下流遺伝子またはその機能性フラグメントはSAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を適用することにより確認された。初期に、各々はmRNA転写を表す約66,233タグを、N−mycトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株において確認した。したがって、我々は、各々が転写を表し、特に誘導された197タグおよびN−mycにより抑制された85タグを確認した(表1)。79,100転写へのこれらの分析の拡張において、我々はN−mycにより上方または下方制御される転写の付加的な系列を確認した(表2)。
【0012】
機能性フラグメントは、本発明ではSAGE法による確認を提供する、適当なタグ配列を含むmyc依存下流遺伝子の一部として規定される。
特に、本発明はmyc依存下流遺伝子の各々が表1または2に示されたタグ配列に本質的に等価な核酸を含んで構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、本質的な等価物は、類似または関連した遺伝子またはそのフラグメントを識別するタグ配列に関連する。より好ましい態様では、前記myc−依存下流遺伝子がリボソーム蛋白質、蛋白質合成に関する蛋白質、転位に関する蛋白質、解糖酵素またはミトコンドリア機能性蛋白質をコード化する、本発明の核酸ライブラリーを提供する。
【0013】
本発明は、成長、侵略、拡がり等、癌に本質的な特徴を裏付けることのできるmyc依存下流遺伝子をモジュレーションすることを含んでなる、癌の治療法を提供する。本発明は、前記myc依存下流遺伝子が表1または2に示されたタグ配列の一つに本質的に対応する核酸を含む方法を提供する。 本質的な等価物は類似のまたは関連する遺伝子またはそのフラグメントを確認するタグ配列に関連する。
【0014】
例えば、本発明は、ヒト神経芽細胞腫におけるN−mycにより活性化されまたは抑制される下流遺伝子を提供する。66,233転写物より多い発現レベルの分析によりN−myc発現細胞における199の上方調節および85の下方調節転写物を識別した(表1)(Boonら,2001)。79,100転写物へのこれらの分析の拡張によりN−mycにより上方または下方調節される転写物タグの付加的な系列を識別した(表2)。我々の結果は、リボソーム生合成および蛋白質合成における、並びにミトコンドリア電子伝達およびATP合成における遺伝子機能化を刺激することにより、細胞成長、腫瘍形成の容易化のレギュレータとしてN−mycが機能することを示す。さらに、細胞構造および細胞マトリクス相互作用に含まれる多くの遺伝子は下方調節され、腫瘍形成細胞の浸潤または拡散を容易化する。N−myc調節遺伝子の系列はc−myc調節の標的でもある。 ここで、本発明はMYCファミリー標的遺伝子のリストに、myc−ファミリー遺伝子により誘導されまたは阻害される経路を識別できる多数の識別標的を提供する。しかし、個々の遺伝子の識別は幾つかの他の用途にも提供される。この発見は、例えば、新薬の開発、既知の薬剤の改良された使用、および組換え技術に使用可能である。幾つかの例を以下に示す。
【0015】
例えば、本発明は、myc蛋白質またはmyc下流経路蛋白質を特に阻害する薬剤の高い処理能力のスクリーニングのためのアッセイを提供する。個々の癌が幾つかの癌遺伝子および/または腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異により引き起こされることは充分に確立されている。腫瘍や同じ組織は突然変異した癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の異なる組み合わせから起こり得る。遺伝子欠陥の型および組み合わせは腫瘍細胞のバイオロジーをそして腫瘍の臨床的挙動を決定する。将来の腫瘍治療は、個々の患者の腫瘍に対して個別的に行われるであろう。診断に際しては、腫瘍の癌遺伝子活性の型を確立し、治療を選択する指針となる。米国で1年あたり約70,000人が癌で死亡することは、myc遺伝子における欠点またはこれらの遺伝子の過剰発現に関係する(Dang およびLee、1995年; Dang、1999年)。現在のところ、myc蛋白質の活動を特に阻止する薬剤は存在しない。このような薬剤は、現在、高い処理能力システムにおいて、本発明によって供給される標的遺伝子を使用して識別できる。ここでは、何千の化合物がmyc蛋白質の特別な阻害効果に対して試験されうる。これらの試験システムは非常に厳密な読み取りシステムが必要である。TP53腫瘍サプレッサー蛋白質のインヒビタを識別するために使用されるこのようなシステムの例が、最近公開された(Komarov等、1999年)。lacZリポータ構成はTP53により誘導されることが知られている遺伝子のプロモーターのコントロール下にもたらされた。この構成をもつマウス細胞株を使用して10,000の合成化学的化合物を試験した。これらの化合物をこれらの細胞と共に組織培養ウェルに添加し、TP53を不活性にする僅かの化合物が、LacZリポーター遺伝子の発現が低下することから確認された。
【0016】
myc標的遺伝子の系列を我々が識別したことにより、myc抑制性薬剤を識別するための向上したアプローチが可能になる。現在は、このような薬剤を識別する感受性読み取りシステムはない。c−mycおよび/またはN−mycの幾つかの標的遺伝子が識別されたが、これらの発現レベルはほんの数倍調節されたに過ぎず、読み取りシステムとして本質的に役立たない(Cole等により1999年に検討された)。ここに、我々は、N−mycおよび/またはc−mycにより強く誘導または抑制される遺伝子の系列を識別したことを説明する。例えば、我々は、オステオネクチンまたはSPARC遺伝子の発現が、SHEP−2における10,000転写物あたり280転写物から、SHEP−21Nにおける14転写物へN−mycにより下方調節されることを示した。この20倍の減少は、SHEP−2およびSHEP−21NからのmRNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより充分に確認される(データは示さず)。さらに、我々は、蛋白質レベルで、SHEP−2細胞がSHEP−2よりもずっと多くのオステオネクチン蛋白質を有することを確認した(データは示さず)。オステオネクチン蛋白質は分泌蛋白質として知られている(Lane およびSageにより1994年に検討された。)。これにより、N−myc阻害性薬剤の試験が非常に実施し易くなる。試験化合物を、N−myc発現が、例えばテトラサイクリン誘導可能なシステムにより、誘導できるSHEP細胞に添加できる。N−myc発現を誘導する場合、オステオネクチン蛋白質レベルはこれらの細胞において低下するであろう。化合物がN−mycに対して阻害性である場合、これはオステオネクチンmRAN発現の下方モジュレーションを阻止するであろう。これらの細胞は組織培養培地内でオステオネクチン蛋白質の内分泌を継続するであろう。したがって、マルチウェル細胞培養システムにおいて、不活性な化合物を有する全ウェルにおいてオステオネクチンの生成が低いであろう。オステオネクチン濃度が高い稀なウェルは、N−myc機能化を阻害する化合物を示す。イライザまたは他の蛋白質に基づく検出システムはオステオネクチンの高濃度のウェルを自動的に検出できる。オステオネクチンのみならず、IGFBP7、コラーゲン型4a1およびシンデカン(syndecan)2のような多くの他の下方調節遺伝子が、mycにより下方調節されることを識別するので、これらはこのようなアッセイにおいても使用できる。類似のアッセイを、読み取りとしてN−mycまたはc−mycにより誘導される遺伝子を使用して設計できる。このような薬剤試験システムの変形において、強くN−myc調節された遺伝子のプロモーター素子を使用でき、これらをグリーン蛍光性蛋白質(Green Fluorescent Protein)のような容易に検出できる蛋白質のコントロール発現に使用できる。これにより、高い処理能力システムにおけるmyc阻害性薬剤の検出がさらに単純化されるであろう。
N−myc標的の多くはc−mycの標的でもあることを、我々は示したので、我々の発見は、myc癌遺伝子ファミリーの他のメンバーに対して薬剤の識別のためのアッセイに使用できる。誘導性c−myc構成は多くの細胞システムにおいてn−mycと同じ遺伝子を標的にするであろう。したがって、N−mycおよびc−mycについての標的遺伝子の記載されたリストにより、数千の薬剤候補のうち数百について半自動的試験を可能にし、myc蛋白質および/またはそれらの下流経路に対して活性な化合物の選択を可能にする。
【0017】
さらに、本発明は、N−mycまたはc−myc活性化腫瘍を有する患者の特別な治療に対する現在の薬剤の用途およびさらなる開発を、例えばmycが関連する癌の治療法において提供する。説明したように、将来の癌治療は特定の患者の腫瘍において実際に活性化されたこれらの癌遺伝子を特に阻害するように設計されるであろう。我々の発見は、myc遺伝子の活性により引き起こされた腫瘍を有する患者において現在知られた細胞増殖抑制性または細胞障害性薬剤の幾つかの使用の検討を提供する。いくつかの例を挙げる。例えば、本発明はヌクレオホスミンに干渉する薬剤を使用することを含む治療法を提供する。
我々は、N−mycおよびc−myc誘導の主な標的としてヌクレオホスミン(B23)を識別した。ヒト腫瘍および細胞株の大きな系列の分析は、インビボでヌクレオホスミンmRNAレベルがN−mycまたはc−myc発現に関連することを示した。ヌクレオホスミンはリボソーム生合成およびプレリボソーム粒子の核小体の細胞質内輸送において機能する。前記蛋白質は、アクチノマイシンD、ドキソルビシン、マイトマイシン、トヨカマイシン(toyocamycin)、ツベルシジン(tubercidin)、サンギバマイシン(sangivamycin)、およびマイコフェノール酸(mycophenolic acid)のような幾つかの細胞障害性薬剤により核小体から核質に転位することが知られている(Yung等、1995年、1990年; Chan等、1987年;Chan,1988年、1992年; Cohen およびGlazer、1985年、Perlaky等、1997年)。これらの薬剤を用いた細胞の処理はリボソームRNAのプロセッシングおよび蛋白質合成を阻害し、細胞死に至る。これらの薬剤の幾つかは、癌患者の治療に臨床的に試験および/または適用される。
【0018】
myc癌遺伝子ファミリーのメンバーがヌクレオホスミンmRNAおよび蛋白質発現を誘導するという我々の発見により、mycファミリーメンバーの過剰発現を有する腫瘍に対する治療における関心のある標的としてこの蛋白質は注目される。このことから、上記薬剤およびこれらの類似物に対する基本的な新規な機会が開かれる。これらの薬剤は、myc活性化腫瘍について特別の効果の可能性の知識を持たずに、非選択的な患者系列に対して臨床的に試験されまたは使用された。この患者系列は、おそらく腫瘍にmyc遺伝子を有する患者持たない患者からなると考えられる。アクチノマイシンDは例えばウィルム(Wilm)の腫瘍および横紋筋肉腫の治療に使用される。幾人かの患者は他の患者より良好な治療反応を示す。ウィルムの腫瘍および横紋筋肉腫の患者は高いN−mycまたはc−myc発現を有する(Nisen等、1986年)。アクチノマイシンDが腫瘍を発現するN−mycまたはc−mycに対して特に効果的であるかどうかを今や試験でき、この場合、アクチノマイシンDはmyc活性を持たない腫瘍に対して非効果的である。これらの発見により、アクチノマイシンDのより特別な使用がもたらされる。幾つかの他の薬剤がヌクレオホスミンに対して効果的である(上記参照)。より特別な抗ヌクレオホスミン効果を有する低毒性類似物の開発によるこれらの薬剤の改良は、特別の抗myc薬剤を設計するために提供される興味ある戦略である。例えば、トヨカマイシンは高毒性であるが(Wilson1968年)、類似物は試験されてさらにmyc活性化腫瘍を有する患者に対する特別な使用について開発できる。
【0019】
本発明は細胞外および膜貫通型蛋白質のインヒビタの使用をもたらす。N−mycおよび/またはc−mycにより誘導される遺伝子のリストは分泌性または細胞表面蛋白質に対してコード化する多くの遺伝子を含む。このような蛋白質は、容易に受け入れられるので、薬剤に対する優れた標的である。これらにより、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍細胞の成長および転移を特別に阻害するための標的がもたらされる。標的の可能性のある例としては、バシジン(basigin)およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI)である(表1、No.112)。バシジン(またはEMMPRIN、細胞外マトリクスメタロプロテイナーゼインデューサ)(表1,No.97)は腫瘍細胞の表面に存在し、側の線維芽細胞を刺激するイムノグロブリンファミリーのメンバーである(Guo等1998年)。メタロプロテイナーゼはマトリックスの分解および転移を促進することが知られているので、バシジンを阻害する薬剤は、mycファミリー遺伝子の高発現を有する腫瘍の転移を防止可能であるであろう。メタロプロテイナーゼを阻害する薬剤は既知であり、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍の特別な治療に対して適用できるであろう。
【0020】
プラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI−1)は、線維素溶解およびマトリックス代謝回転の主な生理学的インヒビタである。ここに記載の、N−mycによるPAI−1の下方調節はマトリックス代謝回転を増加させ、細胞運動性および転移を促進する。多くの化合物をPAIの調節に対して臨床的に実験的に試験する。例えば、15−デオキシ−デルタ12,14−プロスタグランジンJ2(15d−PGJ2)、転写因子PPARgに対する活性化リガンドはPAI−1mRNAおよび蛋白質発現を強化した(Marx等、1999年)。したがって、これらの薬剤は腫瘍を発現するN−mycまたはc−mycの転移を防止するために特に使用されるということがもたらされる。さらに、N−mycまたはc−myc蛋白質により誘導される膜貫通型蛋白質は、細胞障害性薬剤に結合できる抗体のような治療薬剤の標的として使用できる。
【0021】
さらに、本発明は腫瘍の分子診断をさらに提供する。mycファミリー癌遺伝子の標的遺伝子について第1の完全な記述を提供する。幾つかの基本的なカテゴリが提供される。しかし、N−myc活性を有するフレッシュな腫瘍の分析において、我々は、これらの全てではない遺伝子または全てのカテゴリが全腫瘍において上方調節されることを観察した。これにより、付加的な欠点または要因が個々の腫瘍においてmyc癌遺伝子により誘導または抑制される遺伝子の範囲に影響することが示唆される。このことは、腫瘍の生態に対して重要であると考えられる。したがって、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍における上方調節/抑制される遺伝子の詳細な分析が臨床的に関連する。蛋白質合成に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍は、酸化的リン酸に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍とは異なるかもしれない。この情報は腫瘍に対する適当な治療法を選択するのに重要である。したがって、N−mycおよび/またはc−myc下流標的の完全なリストにより、最適な治療に対する腫瘍を分類するための重要な手段をもたらす。ここに記載の発見は、mycファミリー癌遺伝子のキー下流標的の活性化または不活性化を測定する診断キットを開発するのに適用される。このような診断ツールは、最適な治療をガイドするために提供される。
【0022】
さらに、本発明は腫瘍の非侵略的な診断を提供する。特別な癌遺伝子の活性は現在では外科的に除去した腫瘍試験片の分析により確立されるのみである。外科手術は患者に負担であるので、腫瘍の癌遺伝子状態を監視するための高価で危険がなく、非浸潤的な方法が望まれる。N−mycにより誘導または抑制される分泌性蛋白質に対する遺伝子のインベントリが血清マーカーの分析によりmyc発現の状態を決定するのに使用できる。さらに、これらの遺伝子の血清レベルは、腫瘍成長、治療に対する反応および再発の発生を監視するのに使用できる。我々の結果は、例えば、オステオネクチン(10,000タグあたり280から14タグに減少される)、マクロファージ移行阻害因子(表1、No.92)(10,000タグあたり1.1から14.4タグに誘導される)、およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI−1)等多くの候補蛋白質が腫瘍マーカーとして腫瘍の生物学的分類に役立つことを示す。最近、PAI−1の血清レベルを一連の頭頚部腫瘍において分析し、腫瘍ステージに関連することがわたかった(Stroan等1998年)。したがって、我々の発見は、PAI−1およびmycファミリーメンバーにより影響される他の分泌性蛋白質を、腫瘍におけるmyc遺伝子の状態を監視しかつmyc誘導性腫瘍の治療に対する成長および応答を追跡する良好な候補として識別する。
【0023】
さらに、本発明は生成目的のための細胞蛋白質合成機構の強化を提供する。真核生物の細胞を使用して、例えば薬剤の組換え蛋白質を生成する。N−mycおよびc−mycが蛋白質合成機構の本質的な成分を誘導するという発見は、細胞システムの組換え蛋白質のブースト生成に適用され得る。本発明は、治療または市販価値を有する抗体、ホルモン、または他の蛋白質のような組換え蛋白質の生成を最適にする内因性または形質移入性myc遺伝子の高発現を有する細胞の使用を提供する。
さらに、本発明は、転写物および/または蛋白質のn−mycまたはn−myc誘導調節に干渉できる物質を識別する方法であって、n−myc活性を有する細胞を提供し、前記物質の存在下で前記転写物および/または蛋白質のモジュレーションを決定することを含む方法を提供する。本発明で記載したように、n−mycによる転写物および/または蛋白質のモジュレーションは上方または下方調節できる。
【0024】
myc癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を担う。ヒト癌のmyc遺伝子の遺伝的変化の頻発(Dang およびLee、1995)により、1年あたり米国で約70,000人が癌で死亡することがmyc遺伝子におけるまたはその発現における変化に関連するという予想が可能になった。3つのメンバー、すなわちN−myc、c−mycおよびL−mycが、例えば肺、乳房および大腸の多くの癌においておよび白血病および脳腫瘍において、再配列され、増幅され、突然変異し、および/または過剰発現する。myc蛋白質は転写因子である。これらはMAX蛋白質とダイマーを形成し、DNA配列CACGTGを認識する。myc転写因子の標的遺伝子は殆ど識別されていない。識別された標的によっては、myc蛋白質により活性化されるパスウェイの理解を明確にすることができない。したがって、これらの蛋白質の病因論における生物化学的な役割は推論の域をでない。myc遺伝子の異常発現を有する、哺乳類の細胞株、遺伝子組換えマウスおよび突然変異ドロゾフィラについての表現型の観察により、細胞サイクル制御、転移、アポトーシス、増殖速度および細胞成長におけるmyc遺伝子に対する役割を提案した。
【0025】
myc遺伝子の下流パスウェイを識別するために、我々はSAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を利用した。初期に、我々は約66,233タグを識別した。これらの各々は、1対の、N−mycトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株における、mRNA転写物を表す。このようにして、我々は、各々が転写物を表し、特に誘導される197タグおよびN−mycにより抑圧される85タグを識別した(表1)。79,100転写物に対するこれらの解析の拡張において、N−mycにより上方制御または下方制御された転写物の付加的なシリーズを識別した(表2)。N−mycは多くのリボソーム蛋白質遺伝子、リボソームRNA合成およびリボソーム生合成に伴われる遺伝子、および翻訳および蛋白質成熟に伴われる遺伝子の発現を誘導することが明らかである。このことは、N−mycの主な機能が細胞の蛋白質合成機構の増強であることを示している。さらに、ミトコンドリア内における電子伝達およびATP合成、および解糖に伴われる遺伝子の著しい誘導がもたらされる。このことは、細胞エネルギー生成機構が高い容量を有していることを示している。N−myc標的の別のセットは細胞粘着、マトリクス形成、侵略的キャパシティおよび細胞骨格構築に伴われる。これらのデータによりmyc発現腫瘍細胞に関連する転移可能性が高いことが説明される。さらに、遺伝子のセットは、転写、染色体縮合および情報伝達における役割について誘導されまたは抑制される。最終的に、短いcDNA配列のみが既知である(Ests)一連の遺伝子が識別され、幾つかのSAGE転写物タグを、遺伝子を遺伝子割り当てすることなく識別した。これらの遺伝子はN−myc下流パスウェイの重要な成分であり得る。N−mycのこれらの下流標的の多くはc−myc癌遺伝子の標的でもあることが明らかである。したがって、これらのデータはmyc癌遺伝子ファミリーの標的遺伝子のインベントリを示す。これらの遺伝子はmycファミリー癌遺伝子の腫瘍形成効果を仲介するので、これらはmyc蛋白質またはmyc下流パスウェイを阻害する新薬を識別する機会を提供する。さらに、癌遺伝子のmycファミリーのメンバーを発現する腫瘍細胞を阻害または殺す潜在的な標的遺伝子の範囲を示す。
【0026】
結果
N−mycでトランスフェクトされた神経芽細胞腫細胞株のSAGEライブラリ N−mycの下流標的遺伝子を識別するために、我々はN−mycトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株についてSAGE法を適用した。SHEP細胞株はN−myc増幅および発現がなく、さらにc−myc発現もない。テトラサイクリン依存N−myc発現ベクターはこれらの細胞中に誘導され、SHEP−21Nクローンをもたらす(Lutz等、1996年)。SHEP−21N細胞はテトラサイクリンによってスイッチオフされ得る構成性外因性N−myc発現を有する。SHEP−21N細胞におけるN−myc発現は細胞分裂の速度を高め、細胞周期のG1期を短くし、細胞にアポトーシスのトリガに対する感受性をより高めることを示した(Lutz等、1996年;Fulda等1999年)。2つのSAGEライブラリを構成した。N−mycを発現するSHEP−21N細胞からのものと、SHEP−2コントロール細胞からのものである。SHEP−2クローンをエンプティ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。SHEP−2から我々は約44,674の転写物タグを配列決定し、SHEP−21Nからは21,559転写物タグを配列決定した。2つのSAGEライブラリーを比較することにより、N−myc発現細胞において199の有意に(p<0.01)上方制御されたタグを47倍までの誘導レベルで得た(表1、セクション1)。別の85タグは有意に下方制御された。さらに、21,559タグから34,426タグまでのSHEP−21Nライブラリーの配列決定により、N−myc(p<0.01)により上方または下方制御された転写物タグの別のシリーズを得た(表2)。我々はこれらのタグと現在作ることのできる最も可能性のある遺伝子割当を本明細書に記載する。これらのタグに相当する転写物を我々が開発したコンピュータープログラムおよびCGAP/NCBI(Lal等、1999年)からのSAGEマップデータベースを使用して識別した。N−myc制御遺伝子の7つのグループを記載する。
【0027】
N−myc標的1:リボソーム蛋白質遺伝子
第1の機能的グループは61のリボソーム蛋白質遺伝子からなり、それらは47倍まで誘導される(p<0.01、表1、セクション1)。これらの61の蛋白質はヒトのリボソーム蛋白質の約75%を表す(Wool等、1996年)。誘導された遺伝子の幾つかをさらに解析するために選択した。SHEP−2およびSHEP−21N細胞からの全RNAの等量を用いたノーザンブロッティングを、リボソーム蛋白質S12、S27、Fau−S30、L8、S6、S19およびリボソームリン蛋白質P0(PPARP0)に対するプローブを用いてハイブリッドした(図1)。7つの遺伝子全てをN−mycにより誘導した。リボソーム蛋白質mRNAに対して発見されたタグの残量は、SHEP−2において全タグの約4%を構成する。このフラクションはSHEP−21Nにおいて10%に増加した。個々のリボソーム蛋白質遺伝子のレベルはSHEP−2における基礎発現レベルのフラクションである。高発現遺伝子は、SHEP−2において低基礎発現を有する遺伝子より低く誘導される(図2)。これらの結果より、N−mycが、直接的にまたは間接的に、大多数のリボソーム蛋白質のmRNA発現レベルを誘導することを示している。
【0028】
N−myc標的2:リボソーム生合成および蛋白質合成における遺伝子機能化
26タグの第2の機能的グループは蛋白質合成および代謝回転、特別なリボソームバイオジェネシス、mRNA翻訳、蛋白質成熟および分解における明確な役割を有する遺伝子に相当する。
【0029】
ヌクレオホスミン(B23)(表1、No.67および83)の誘導に高い関心がある。ノーザンブロット解析により、この誘導が、タグ頻度により推定されるよりもかなり強いレベルであることを確認した(図1)。ヌクレオホスミンは、5.8Sのプレ−rRNAの5’末端の切断によるリボソームRNAをプロセスする、非常に豊富な核小体蛋白質である(Savkur等、1998年)。さらに、これはプレリボソーム粒子の核−細胞シャトリングおよび集合において機能する(Borer等、1989年;Olson等、1991年;Szebeni等、1999年)。ヌクレオホスミンはリンパ腫および白血病における再発性染色体転座の標的である(Morris等、1994年、Redner等、1996年、Pandolfi、1996年)。リボソームバイオジェネシスにおけるヌクレオホスフィンの主要な役割のために、我々はこのプロセスに関連した他の遺伝子に対するSAGEライブラリーを解析することを急いだ。第二の転写物のために2つのタグを有するヌクレオリン(表1、No.87および88)は、合計で10,000あたり2.5から5.6タグを誘導する(p=0.044)。この誘導はノーザンブロット解析により確認された(図1)。また、ヌクレオリンは非常に豊富な核小体蛋白質であり、ヌクレオホスミンに結合する(修正TujetaおよびTujeta、1998年;Ginisty等、1999年)。18SrRNAを成熟させることは恐らくプレリボソームRNAのプロセシングにおける第1段階に対する律速酵素である(Gistiny等、1998年)。さらに、ヌクレオリンはプレリボソーム粒子の集合およびそれらの核−細胞輸送に伴われる。それは18リボソーム蛋白質と相互作用し(Bouvet等、1998年)、それの16はN−mycにより誘導される。N−mycによるヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの誘導は、さらにリボソーム蛋白質、リボソームRNAおよびリボソーム生合成はN−myc刺激の標的であることを示唆する。
【0030】
3つの翻訳開始因子および5つの翻訳延長因子に相当するタグが誘導された。開始因子は、真核生物翻訳開始因子3サブユニト8(eIF3s8)(表1、No.81)およびサブユニット3(表1、No.78)、真核生物翻訳開始因子4B(表1、No.72)である。延長因子1(EEF1)は、リボソームへのアミノアシル−tRNAのデリバリに起因し、サブユニットα/β/γまたはα/β/γからなるヘテロトリマーである。サブユニットα、βおよびγに対するタグは、SHEP−21Nにおいて9〜11.4倍に誘導される(表1、No.69、66および70)。延長因子2はリボソームのAからP部位に新生ポリペプチド鎖の転座を促進し、誘導もされる(表1、No.79)。ミトコンドリアの延長因子Tu(tuFM)はアミノアシルtRNAをミトコンドリアリボソームにデリバリし、12.4倍上方制御される(表1、No.64)。SHEP−21NおよびSHEP−2のノーザンブロット解析はeIF3s8、EEF1a1およびtuFMの誘導を確認した(図1)。さらに、これらのデータは蛋白質合成のレギュレータとしてのN−mycに対する役割を支持する。
【0031】
蛋白質合成の次の段階は成熟およびルーティングである。新生ポリペプチド結合錯体(NAC)αmRNAをN−myc発現細胞において誘導した(表1、No.77)。NACは細胞基質蛋白質の新生ポリペプチド鎖を不適当な転座から小胞体(endoplasmatic reticulum)へ保護する(Wiedmann等、1994年)。シャペロンHSP60およびHSP90の誘導は蛋白質フォールディングおよび成熟についての細胞能力が高まることを示唆した(表1、No.65、68、80および82)。HSP60はミトコンドリアの蛋白質取り込みおよび高分子集合に関連する。HSP90は、ステロイドホルモン受容体を含むシグナル分子のフォールディングおよびミスフォールディング蛋白質の再フォールディングに関連する。ノーザンブロット解析はHSP60の誘導を確認した(図1)。蛋白質分解に対する細胞能力も誘導できた。このことは、3つのユビキチンパスウェイ蛋白質(表1、No.62、73および76)および5つのプロテアソームサブユニット(表1、No.63、71、74、75および84)に対するタグ頻度が増加することにより示唆された。ノーザンブロット解析はSHEP−21N細胞におけるプロテアソームサブユニットbタイプ6の発現レベルがより高いことを確認した(図1)。
【0032】
N−myc標的3:解糖遺伝子
N−myc誘導遺伝子の第3グループは解糖経路における鍵酵素をコード化した(表1、セクション4)。アルドラーゼAフルクトースビホスフェート(ALDOA)、トリオースホスフェートイソメラーゼ1(TPI1)、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびピルベートキナーゼに対するタグは全て増加した(表1、No.133,135および132)。他の誘導mRNAは、セリンの合成に関連する代謝酵素3−ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼおよびソルビトールをフルクトースに酸化するソルビトールデヒドロゲナーゼに対してコード化する。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1はメタノール代謝において機能する。ノーザンブロット解析はALDOA、ぴるべートキナゼ、TPI1およびGAPDHのmRNA誘導を確認した(図1)。これらのデータはN−myc刺激の標的として解糖に関連している。
【0033】
N−myc標的4:ミトコンドリア電子運搬およびATP合成
SHEP−21Nは、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化における役割を有する遺伝子に相当する一連のタグの誘導を示す(表1、セクション5)。17のタグを有意に誘導する。誘導した遺伝子の5つがミトコンドリアについてコード化される(参照:ミトコンドリアタグ解析Welle等、1999年)。
O2への電子移動によるNADHおよびFADH2の酸化は、呼吸鎖、NADHデヒドロゲナーゼ、ユビキノールシトクロームcレダクターゼおよびシトクロームcオキシダーゼにより行われる。これらの大きい錯体はミトコンドリア内膜を横切ってプロトン勾配を確立する。このプロトン勾配はFタイプATPシンターゼ錯体によるATPの合成を駆動する。N−mycは、4つの酵素錯体全ての一連のサブユニットを増加する。
【0034】
4つのNADHデヒドロゲナーゼサブユニット、サブコンプレックス4(表1、No.136、NDUFB4)、サブコンプレックス7(表1、No.138)、およびミトコンドリアについてコード化したサブユニット4/41および3(表1、No.150および151)を誘導する。NDUFB4の誘導をノーザンブロット解析により確認した(図1)。
ユビキノール−シトクロームcレダクターゼ複合体のサブユニットを誘導した(表1、No.136)。さらに、シトクロームcオキシダーゼのサブユニットII、 IIIおよび VIIIをN−myc発現細胞において誘導した。サブユニットVIII(COXVIII、表1、No.149)の誘導をノーザンブロット解析により確認した。
最終的に、N−mycはF0セグメントのサブユニット6/8およびFタイプATPシンターゼのストークのF0セグメントのサブユニット9(またはc)の2つのイソ型の転写を誘導する(表1、No.137、148および152)。ATPアーゼサブユニット6および8を、オーバーラップミトコンドリア転写についてコード化する。
【0035】
さらに、ミトコンドリア機能における役割を有する幾つかの他の蛋白質は上方制御される(表1、セクション5)。電圧依存性陰イオンチャンネル(VDAC、表1、No.143)を5倍誘導し、ノーザンブロット解析で確認した(図1)。VDACは親水性分子が拡散できるミトコンドリア外膜チャンネルを形成する。これは、シトクロームcを細胞質に伝達できるので、アポトーシスにおいて主な役割を果たし、カスパーゼ(caspase)9活性をもたらす。
さらに、グルタチオンペルオキシダーゼ4およびグルタチオンSトランスフェラーゼpは強く誘導される(表1、No.139および144)。グルタチオンは容易に電子を受容し、過酸化水素および有機過酸化物に対するスッキャベンジャとして作用し得る。ミトコンドリアの電子伝達系により不可避のアーチファクトが生じる。この反応はグルタチオンペルオキシダーゼにより触媒される。
【0036】
N−myc標的5:細胞運動および転移における役割を有する遺伝子:
N−mycによって誘導または抑制される、大きいグループのタグは、細胞運動および細胞マトリックス相互作用における役割を有する遺伝子に属する(表1、セクション3)。これらの遺伝子は細胞骨格蛋白質、細胞表面蛋白質、接着分子、および細胞マトリックス構築および代謝回転における役割を有する細胞外保護蛋白質に対してコード化する。この範疇における遺伝子に対するタグを有意に誘導した。この範疇における別の29のタグを有意に下方制御する。下方制御の例としては、コラーゲンタイプIa1(表1、No.100、108、および109)、タイプIVa1(表1、No.115)およびタイプXVIIIa1(表1、No.116)、フィブリリン(表1、No.121)、シンデカン2(表1、No.126)、フィブロネクチン(表1、No.122)およびオステオネクチン(SPARC)(表1、No.118、123および125)である。後者は興味のある遺伝子であり、10,000タグあたり280から14タグに下方制御される。我々はノーザンブロット解析により、オステオネクチン、シンデカン2およびコラーゲンIVa1およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタタイプ1を確認した(表1、No.112)(データは示さず)。これらの遺伝子の下方制御は、N−mycが細胞マトリックスに対する細胞粘着を下げることができ、したがって、細胞運動性を誘導することを示唆する。これは、myc発現腫瘍細胞の転移可能性が高められた株である。
【0037】
N−myc標的6:他の遺伝子
N−mycによって影響される遺伝子の別のグループは、情報伝達蛋白質、転写因子、クロマチン因子、サイクリンおよび他の調節蛋白質によって形成される。このグループは66の有意に誘導された転写を数える(表1、セクション6)。例としてはNM23A,NM23B,HMGI−Y,ジンクフィンガー蛋白質6および(表1、No.171、214、162、218)である。HMGI−Y,NM23A,およびNM23Bの誘導をノーザンブロット解析により確認した(データは示さず)。調節蛋白質または酵素に対する遺伝子の別のグループをN−mycにより下方制御した(表1、セクション6)。例としては、インスリン様成長因子結合蛋白質7(IGFBP7)(表1、No.252)およびジンクフィンガー蛋白質216(表1、No.248)である。ノーザンブロット解析はSHEP−21N細胞に比較したSHEP−2細胞におけるIGFBP7の下方制御を確認した(データは示さず)。
【0038】
N−myc標的7:アノニマス遺伝子(Ests)
部分的cDNA配列のみが知られている(発現配列タグまたはEsts)一連のアノニマス遺伝子はN−mycにより誘導または下方制御される(表1、セクション7)。これらの遺伝子の機能は未だ知られていないが、癌における役割を有する可能性のある重要な遺伝子として、myc制御マークの標的であることはわかった。
N−mycの未識別標的のタグ
SHEP−2bおよびSHEP−21Nライブラリーにおいて別々に表示された幾つかのタグに対して、我々は対応する遺伝子を未だ識別していない(表1、セクション8)。これらは両方ともN−mycにより誘導または抑制される遺伝子である。
【0039】
N−mycは4時間以内に下流標的を活性化する
経時的実験において、我々は推定N−myc標的がSHEP−21N系におけるN−調節の後誘導されるかどうかを解析した。N−myc発現はテトラサイクリンによりSHEP−21N細胞において可逆的にスイッチオフできる。SHEP−21N細胞をテトラサイクリンで24時間処理し、充分に洗浄し、テトラサイクリンなしでさらに2〜36時間成長させた。ノーザンブロット解析は、N−mycmRNAの発現がテトラサイクリン処理の8時間以内にスイッチオフされることを示した(図3A,レーン1−2)。テトラサイクリン除去後、N−mycmRNA発現は2〜4時間回復される(図3A、レーン5−6)。N−myc蛋白質発現は並列的な経時的実験においてウェスタンブロッティングおよび直後のN−mycmRNA発現により解析した(図3B)。ノーザンブロットフィルタを、N−myc下流タグヌクレオリン、ヌクレオホスミンおよびリボソーム蛋白質遺伝子RPS6およびRPS12に対するプローブでハイブリッドした(図3A)。テトラサイクリンによるN−mycの抑圧後、これらの遺伝子のmRNAレベルは0および8時間にて影響がないが、それらの発現は24時間で低い基本的なレベルに下がった。重要なことは、N−mycmRNAおよび蛋白質の再発現の後2〜4時間の間、4つの遺伝子全ての発現が強く再誘導されることである(図3B、レーン6〜7)。類似の結果が、EEF1A1,TPI1,eIF3s8,およびVDACに対して得られた(データを示さず)。我々がコントロールとして使用したコフィリン(cofilin)の発現レベルは時間経過の間有意には変化しない。ヌクレオリンまたはヌクレオホスミン発現におけるテトラサイクリンの直接の効果を排除するために、我々はSHEP−2細胞を使用した同じ実験を行ったが、遺伝子発現について影響は観察されなかった(データは示さず)。これらの結果により、ここで識別された遺伝子はN−mycにより誘導されることが先ず確認される。第2に、必ずしもN−mycの直接の標的ではないが、N−myc下流パスウェイにおける早期の標的であることを示す。したがって、これらは、N−mycパスウェイの本質的な成分を表す。さらに、データは、N−mycによる誘導が多方面にわたることを示している。つまり、N−myc除去後発現が低下し、N−myc再発現後素早く回復する。
【0040】
N−mycはリボソームRNA合成を誘導する
rRNAプロセシングおよびリボソーム生合成における重量な役割を有する2つの遺伝子の誘導により、我々はそれらの蛋白質発現およびそれらの潜在的な機能活性を解析した。ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの蛋白質発現を、N−myc増幅のあるおよびこれの無い2つのコントロール細胞株およびSHEP−2およびSHEP−21N細胞において解析した。ウェスタンブロット解析により、SHEP−2に比較してSHEP−21Nにおいて(図4、レーン3および4)、およびN−mycシングルコピー細胞株SK−N−FIに比較してN−myc増幅IMR32細胞株において(図4、レーン1および2)、より高いヌクレオリンおよびヌクレオホスミン発現が示された。リボソームRNAプロセシングにおけるこれらの蛋白質機能として、我々はSHEP−21NがSHEP−2細胞より高いrRNA含量を有するかどうかを解析した。我々は各細胞株の106の指数関数的に成長する10のサンプルから全RNAを単離した。分光光度解析により、SHEP−21N細胞はSHEP−2細胞より全RNAについて平均で45%高い収率であることがわかった(p<0.001、独立したサンプルに対してスチューデントのt検定)(図4B)。独立的に培養した細胞についての重複した実験からは同じ結果が得られた。アガロースゲル電気泳動により分画した18Sおよび24SrRNAバンドの濃度測定定量化により、この増加がリボソームRNAにより引き起こされることが確認された(データ示さず)。
【0041】
rRNAにおけるこの強い増加により、全体的な蛋白質合成およびリボソーム機能の増加がもたらされることを解析するために、我々はSHEP−2およびSHEP−21N細胞における蛋白質合成の速度および蛋白質量を測定した。106SHEP−2およびSHEP−21N細胞のライセートは等量の蛋白質を含有した(データは示さず)。蛋白質合成速度を35Sメチオニンインコーポレーションにより解析した。SHEP−2およびN−myc発現SHEP−21N細胞間で差異は観察されなかった。また、経時的実験におけるSHEP−21NについてのN−myc発現操作によって、蛋白質合成速度の違いは明らかにならなかった(データは示さず)。このことから、SHEP−21Nにおける蛋白質合成速度がN−mycにより誘導されない因子によって制限されるか、または蛋白質合成がSHEP神経芽細胞腫細胞株において既に最大値であり、N−mycによりブーストされ得るレベルを超えていることを示唆する。
【0042】
内因性N−mycの増幅を有するまたは有しない神経芽細胞腫のSAGEライブラリー
SHEP神経芽細胞腫細胞株は内因性N−myc発現がなく、したがって、N−mycトランスフェクト細胞は必ずしもN−myc増幅神経芽細胞腫に対する遺伝的バックグラウンドを代表するものではない。例えば、90%のN−myc増幅神経芽細胞腫は染色体領域1p35−36の欠損が見られず(Caron等、1993年)、SHEP−2およびSHEP−21N細胞は染色体1の2つの明らかなインタクトpアームを有する(データは示さず)。N−mycの識別下流パスウェイがインビボで活性化されるかという問いに取り組むために、我々は2つの神経芽細胞腫のSAGEライブラリーを生成した。神経芽細胞腫腫瘍N159はN−myc増幅および発現があり、神経芽細胞腫N52はN−myc発現のないN−mycシングルコピー腫瘍である(図5B,レーン9および10)。我々は2つのライブラリーの39.598タグを配列決定した。タグ頻度を20,000タグにつき標準化し、比較した。N−mycをN159における16タグおよびN52における0タグにより表した。ライブラリーに差異を付けて発現された(p<0.01)52のタグがある。2つの腫瘍がより多くの観点において恐らく異なっているので、これらの差異はN−mycによりおそらく単に部分的に引き起こされる。我々は、SHEP細胞において識別されたN−myc標的遺伝子について2つの腫瘍におけるN−mycとの関連を解析した。
【0043】
SHEP−21Nにおいて検出された56の有意に(p<0.01)誘導されたリボソーム蛋白質遺伝子が(20,000タグについて)N52における988タグおよびN159における1600タグの合計を生成する。したがって、N−myc増幅N159腫瘍は62%高いリボソーム蛋白質遺伝子発現を有する。N52と比較してN159において少なくとも50%の増加を有する36のタグおよび少なくとも100%の増加を有する22タグがある(図2B)。これらの増加はSHEP−21N細胞におけるよりもより穏やかである(図2Aおよび2Bを比較)が、N−mycがインビボでのリボソーム蛋白質遺伝子発現を誘導することを強く示唆する。蛋白質合成において機能する他の遺伝子はN159において情報制御される。N52と比べてN159において発現が増加することは、ヌクレオホスミン(4〜19.2タグ)、ヌクレオリン(3〜9タグ)、真核生物の翻訳開始因子4A、イソ型1(4〜9タグ)、および翻訳延長因子EEF1a1(50〜96タグ)およびEEF1g(18.4〜32.8タグ)について見られる。解糖および酸化的リン酸化に伴われる遺伝子の誘導は殆どない。5つの代表的な遺伝子の発現レベルを、N159およびN59からの合計RNAを使用したノーザンブロットのハイブリダイゼーションにより確認した(図5Bおよびデータは示さず)。これらの結果から、SHEP−21N細胞において識別したN−myc標的遺伝子の多くの発現レベルがインビボにおけるN−myc増幅および過剰発現に関連することが示される。しかし、このことは全遺伝子については当てはまらず、他の因子がN−myc標的遺伝子の活性を調節することを示唆する。
【0044】
神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおいて解析されるN−myc標的遺伝子発現
神経芽細胞腫のN−myc下流遺伝子の誘導をさらに解析するために、我々は神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおける発現を調べた。21の神経芽細胞腫細胞株からの全RNAのノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、N−myc、ヌクレオリン、ヌクレオホスミン、およびリボソーム蛋白質PPARP0の発現間の不完全ながらもはっきりとした関係を示した(図5A)。細胞株SJNB12はN−myc発現がないが、N−myc標的遺伝子の非常に高い発現を有する。しかし、この細胞株はc−myc増幅および過剰発現を有し(図5A、レーン7およびCheng等1995年)、c−mycがN−mycと同じ標的遺伝子を誘導し得ることを示唆する(以下参照)。
【0045】
細胞株がインビボで神経芽細胞腫腫瘍について完全には代表的ではないので、我々は、アグレシブステージ3および4、およびより弱いアグレシブステージ1、2および4sを有する16の新鮮な神経芽細胞腫を解析した。ノーザンブロット解析により、N−myc、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの発現間の公正な総合的な関連が示された(図5B)。幾つかの例外はあるが、総合的な結果は、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンがN−myc誘導のインビボにおける標的であることを示唆している。リボソーム蛋白質S6(RPS6)発現は、N−mycとの一貫した関連性が少なく、N−mycおよび他の因子がその発現を調節することを示した。
【0046】
幾つかのN−myc標的遺伝子はc−mycにより誘導されるかまたは抑圧され、さらにN−mycはc−mycと同じプロト−癌遺伝子のファミリーに属する。両方の癌遺伝子は類似の表現型効果を誘導し、幾つかの標的遺伝子を共有するので、我々は、この研究で識別されたN−myc下流標的がc−mycの標的でもあることを解析する。したがって、我々はメラノーマ細胞株IGR39Dおよびこの細胞株のc−mycトランスフェクトクローンを解析した(クローン3、Versteeg等、1988年)。これらの細胞株の全RNAを有するノーザンブロットをSHEP−2およびSHEP−21N細胞について試験した26のプローブをハイブリッドした。さらに、9つの23N−myc誘導標的は、c−mycにより誘導されることがわかる(図6)。これらは、リボゾーム蛋白質遺伝子S12、S27、S19、S6およびヌクレオリン、ヌクレオホスミン、ユビキチン、GAPDHおよびNDUFB4である。N−myc抑制標的の3つについて試験し、c−mycにより抑制されることを見いだした。これらは、オステオネクチン(表1、No.118/123/125)、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター型1(表1、No.112)、および結合組織成長因子(表1、No.127)であった。したがって、c−mycおよびN−mycはここで試験した細胞系においてそれらの標的遺伝子の約46%を共有する。ヌクレオホスミン、ヌクレオリンおよび殆どのリボソーム蛋白質遺伝子がそれらに含まれる。
【0047】
我々は、リボソーム生合成、mRNA翻訳、蛋白質成熟、および蛋白質代謝回転に寄与する86の転写の誘導を発見し、蛋白質合成の増強がN−mycの主な機能であることを示した。我々は、SHEP−2におけるよりもSHEP−21Nにおいて著しく45%高いrRNA含量を見いだした。SHEP−21Nにおいて蛋白質合成の速度の総合的な増加はない。蛋白質合成の仕組みの幾つかの律速成分がSHEP−21N細胞においては誘導されないという1つの解釈がある。N−mycシングルコピー神経芽差異簿腫N52およびN−myc増幅腫瘍N159のSAGEライブラリーは、リボソーム蛋白質遺伝子、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンおよび5つの翻訳開始および延長因子がインビボでN−myc増幅神経芽細胞腫において過剰発現される。37の神経芽細胞腫および神経芽細胞腫細胞株のノーザンブロット解析は、N−myc増幅神経芽細胞腫におけるこれらの遺伝子の誘導をさらに確認した。これらの結果から、myc遺伝子が蛋白質合成の主なレギュレータとして機能することがわかる。このことは、c−mycのホモ接合性不活性化線維芽細胞における蛋白質合成の速度の低下(Mateyak等、1997年)、およびc−mycの活性化の後の線維芽細胞における蛋白質合成の増加(Scmidt等、1999年)と合致する。
【0048】
エネルギー生成、ミトコンドリアおよびアポトーシス
N−myc下流標的遺伝子の2つの他の包括的なセットは、解糖およびミトコンドリア電子伝達およびATP合成経路において関連する。N−myc誘導の主な標的として電子伝達およびATP合成経路の識別は、ミトコンドリア膜貫通型ポテンシャルおよびアポトーシス間の関係に関係する。ミトコンドリアは2つの面を有する:すなわち、これらはファーストサイクリング細胞に対してエネルギーを与え、かつ細胞をアポトーシスに駆り立てることである。同様に、myc癌遺伝子は活発な細胞増殖および大規模なアポトーシスを誘導できる。N−myc発現によりSHEP−21N細胞はアポトーシストリガーに対して感受性となる(Fulda等,1999年;Lutz等、1998年)。アポトーシスにおける多くの重要な出来事はミトコンドリアの膜ポテンシャルに重点をおいている(参照:GreenおよびReed、1998年)。例としては、シトクロームc放出、内膜の過分極、透過性遷移ポアの開口、および反応性酸素種(ROS)の生成である。ミトコンドリア膜における通常の電子伝達の間、1〜5%の電子はさまよって、ROSを生成する。電子伝達経路の中断により、細胞に有害なROSの生成は非常に高められる(Kroemer等、1997年)。N−mycによる電子流れの増強により、電子伝達鎖ブーストROS生成の中断は高まるであろう。さらに、VDACの適度な上方制御(図1)はシトクロームc放出およびアポトーシスを刺激した。したがって、電子伝達遺伝子のN−myc誘導は細胞増殖に対して必要なエネルギーを必然的に供給する。また、これは、ミトコンドリアの死の可能性を増加し、アポトーシスの実行に向かうスケールを起動する。
【0049】
酸化的リン酸化経路に対するタグはN−myc増幅N159腫瘍において過剰発現される。この腫瘍は、N−myc下流経路の一部を妨げる付加的な欠点に対してインビボで選択される。N−mycを発現するSHEP−21N細胞はアポトーシストリガに感受性であり(Lutz等、1998年)、内因性N−mycの過剰発現を有する神経芽細胞腫細胞株はこのようなトリガに不応性である。このことは、これらの細胞株がN−myc下流経路のプロアポトーシスアームに欠点を有することを示す。これがミトコンドリア蛋白質遺伝子の誘導の欠損に関連するかどうかを解析することは興味深い。
【0050】
N−mycおよびc−mycが標的遺伝子を共有する
今日までに、N−mycの2つの標的遺伝子のみが公表され、これらはc−mycの標的でもある(Lutz等、1996年;Eilers等、1991年;Bello−fernadez等、1993年)。我々がノーザンブロットについて試験したN−mycの23の上方制御標的のうち、9つがトランスフェクトメラノーマ細胞でc−mycにより誘導される。我々が試験した下方制御N−myc標的の両方がc−mycによっても下方制御される。N−myc誘導下方制御経路遺伝子は遺伝子の非常に簡単な機能的グループを形成するので、我々はN−mycが蛋白質合成の一般的なスティミュレーターとして機能すると仮定した。c−mycはN−mycのように等しく強力な成長誘導およびトランスフォーミング効果を有するので、c−mycが蛋白質およびATP合成の仕組みをブーストするのに必要な遺伝子のサブセットを単に誘導することを認識するのは困難である。N−mycおよびc−mycが同じ基本的な細胞機能を活性化することはあり得ることである。c−mycは線維芽細胞株の蛋白質合成の誘導に関連する(上記参照)。我々はN−mycによる遺伝子の誘導がその基本的な発現レベルに強く依存することを観察した(図2)。したがって、オリジナルのメラノーマ細胞株における潜在的な標的遺伝子の高発現がc−mycによる誘導を防止したことは可能性がある。
【0051】
これまでに識別された標的遺伝子は非常に少ないので、myc遺伝子の生理学的な役割は謎である。我々は、N−mycまたはN−mycの潜在的な標的(その幾つかはc−mycの標的でもある)である単一遺伝子(unigene)により規定された335遺伝子を識別する351転写タグを説明する。これらの結果から、myc遺伝子は蛋白質合成および細胞エネルギー生成の主なレギュレターとして機能する。この誘導は、正常な増殖細胞においておよび生理学的刺激物より増殖を誘導された細胞において、細胞サイクルのG1期からの遷移強化を媒介することは可能性がある。蛋白質合成についての効果は限定されたセットの標的遺伝子の識別に基づいて先の仮定を確認する(Schmidt,1999年、Mateyak等、1997年、Johnston等、1999年)。電子伝達およびATP合成経路における遺伝子についての刺激性効果は期待されず、強化された蛋白質生成およびG1遷移に対するエネルギー要求に非常に適合し、myc遺伝子の充分に確立されたアポトーシス効果に関係し得る。
【0052】
N−mycにより誘導されまたは抑制されたタグおよび遺伝子のリスト
表1は、我々が、SHEP−2およびSHEP−21N SAGEライブラリーの比較においてN−mycにより有意に(p<0.01)誘導または抑制されたことを発見したタグの全てである。この比較は、SHEP−244,674タグおよびSHEP−21Nの21,559タグに基づく。示されたタグ頻度は10,000タグについて標準化される(コラムSHEP−2およびSHEP−21N)。「オン:オフ比」の欄は、N−mycによるフォールド誘導(正の値)または抑制(負の値)を示す。タグがライブラリーのうち1つにおいてゼロ発現を有する場合は、我々は、タグが完全なライブラリーにおいて一時期存在したことを比の計算に対して仮定する。バイオテクノロジーインフォメーションに対するナショナルセンターの単一遺伝子数(NCBI:USA、ベテスダ)を、「単一遺伝子」の欄に示す。この数は29−3−2000による、NCBI単一遺伝子データベースに基づく。次の欄は、単一遺伝子の記載を示す。さらに、各単一遺伝子クラスターについて、1つまたは2つの遺伝子バンク受入れ番号を示す。幾つかのタグに対して、我々は、2つの可能性のある対応遺伝子を識別した。このことはタグの次の欄におけるアスタリクスにより示す。
【0053】
表2:この表は21,559タグから34,426タグのSHEP−21Nライブラリーの配列を延長した後、SHEP−2およびSHEP−21NのSAGEライブラリー間で有意に(p<0.01)異なることを識別したタグを示す。表は20,000の転写タグについて発現された両方のライブラリーにおける発現レベル(「SHEP−2」および「SHEP−21N」の欄)、Caron等(2001年)により記載されたコンピュータープログラムにより識別された単一遺伝子数、および幾つかの場合には単一遺伝子クラスターに相当するクローンの遺伝子バンク受入れ番号を示す
【0054】
実験手順
細胞株
神経芽細胞腫細胞株および培養条件は前述の通りである(Cheng等、1995年)。メラノーマ細胞株IGR39Dおよびクローン3はVersteeg等(1988年)により記載されている。SHEP細胞株を、10%ウシ胎児血清、4mMLのグルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地中に保存した(Lutz等、1996年)。テトラサイクリン(シグマ)を10ng/mlの培地濃度で使用し、N−myc発現を阻害した。
【0055】
SAGEライブラリーの生成
SAGEを、Velculescu等(1995年)の記載に若干の変更を加えて実施した。全RNAをグアニジンチオシアネートにより抽出した(ChromczynskiおよびSacchi,1987年)。ポリ(A)+RNAを、製造者の指示書にしたがって、メッセージメーカー(MessageMaker)キット(Gibco/BRL)を使用して単離した。SAGEライブラリーを、最小限4μgポリ(A)+RNAを使用して生成した。cDNAをスーパースクリプトチョイスシステム(Gibco/BRL)に準じて合成し、NlaIIIで消化し、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynal)に結合した。BsmFIに対する認識部位を含有するリンカーをcDNAに結合した。cDNAタグを含むリンカータグをBsmFI消化により遊離し、互いに結合し、増幅した。PCR生成物を5分65℃で加熱した後、ポリアクリルアミドゲルで調製的分析(preparative analysis)をした。コンカテマーへの結合の後、第2加熱段階を含み(15分で65℃)、800bp〜1500bpのフラグメントを精製し、pZero−1(インビトロゲン)でクローン化した。コロニーをPCRでM13フォワードアンドリバースプライマーを使用してスクリーニングした。300bpより大きいインサートをBigDyeターミネイターキットで配列決定し、377ABI自動化シーケンサーで解析した(Perkin Elmer)。
【0056】
解析SAGEデータベース
SAGEライブラリーを、SAGE300プログラムソフトウェアパッケージを使用して解析した(Velsculescu等、1997年)。P値をモンテカルロシミュレーションを使用して計算した。転写を、NCBIでキャンサーゲノムアナトミープロジェクトからの「遺伝子マップへのタグ」(SAGEマップ)を有するデータベースにおいてタグの比較により識別した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE)。このデータベースは単一遺伝子クラスターとSAGEタグを繋ぐ(Lal等、1999年)。次に、遺伝子のアサインメントを人手によって不正なタグを生じる配列エラーについておよびハイブリッド単一遺伝子クラスターに基づいて誤った遺伝子アサインメントについてチェックした。他のデータベース解析および特定のプライマー生成については、ウィスコンシンGCGパッケージソフトウェアを使用した。
【0057】
ノーザンブロット解析
全RNA(レーン当たり20μg)を6.7%のホルムアルデヒドの存在下で0.8%のアガロースゲルにより電気泳動し、10×SSC中で(Hybond)N膜においてブロットした。ハイブリダイゼーションを一晩0.5MのNaHPO4、pH7.0、7%SDS、1mMのEDTA中で、65℃にて行った。フィルタを40mMのNaHPO4、1%SDS、65℃で洗浄した。プローブを配列証明されたPCR生成物のランダムプライミングによりラベル化した。RT−PCR反応において使用された全プライマーの完全なリストは請求することにより利用可能である。
【0058】
全蛋白質含量
指数関数的に成長する細胞をハーベストし、細胞数をクールターカウンターを使用して決定した。細胞(1×106)を20mMのトリスHCl(pH8.0)、137mMのNaCl、10%のグリセロール、1%のNP40およびプロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼカクテル、ロシュ)溶解した。サンプルをバイオラド蛋白質アッセイで検定した。アッセイを少なくとも2回行った。
【0059】
ウェスタンブロット
細胞溶解物をSDSポリアクリルアミドで分離し、イモビロン−Pトランスファ膜でエレクトロブロットした(Millipore)。膜のブロッキングおよび抗体とのインキュベーションは標準的な手順を伴った。蛋白質を、ECL検出シツテムを使用して可視化した(Amersham)。抗−ヌクレオホスミンモノクローナル抗体はP.K.Chan博士から贈呈を受けた(ベイラー医科大学)。ヌクレオリンに抗する抗体はP.Bouvet博士から贈呈された(フランス、ツールーズ、CNRS,IPBS)。抗−N−mycをPharmIngenから得た(クローンB8.4.B)。
【0060】
全rRNA含量
1×106の指数関数的に成長する細胞の全rRNAをグアニジンイソチオシアネート(ChromczynskiおよびSacchi,1987年)により抽出し、分光光度計で定量した。細胞株SHEP−2およびSHEP−21Nのそれぞれの10の単離の結果は、スチューデントt検定で独立したサンプルについて統計的に解析した。パーセルベースについてのアリコートをアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色した。rRNAバンドの関連する蛍光をコダックデジタルサイエンス1Dイメージ解析ソフトウェアパッケージを使用して定量した(EDAS120)。
【0061】
リファレンス
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1】N−myc下流標的遺伝子のノーザンブロット分析。指数関数的に成長するSHEP−2およびSHEP−21N細胞からの全RNAの等量をロードした。ノーザンブロットを23の指示N−myc標的についてのプローブと共にハイブリッドした。
【図2】SHEP−21N細胞におけるN−myc標的(p<0.01)として指示された56のリボソーム蛋白質遺伝子の誘導レベル。A.SHEP−2における基本発現レベルのファンクションとしてのSHEP−21NにおけるN−mycによるフォールド誘導。X−座標:10,000タグあたり標準化されたSHEP−2における基本発現レベル。Y−座標:SHEP−21Nにおけるフォールド誘導。B.N−mycシングルコピー神経芽線維細胞腫N52における基本発現レベルのファンクションと同じN−myc増幅神経芽細胞腫N159における56のリボゾーム蛋白質遺伝子の増加。X座標:10,000タグあたり標準化されたN52における発現レベル。Y座標:N52に対比したN159におけるフォールド増加。
【図3】SHEP−21N細胞におけるN−mycおよび下流標的遺伝子誘導の経時的解析。SHEP−21N細胞を24時間10ng/mlのテトラサイクリンで処理し、洗浄し、テトラサイクリンの不存在下でさらに36時間成長させた。細胞を、テトラサイクリン処理の0時間、8時間、24時間にてハーベストした。次のサンプルを前記抗生物質除去後、1時間、2時間、4時間、8時間、10時間、12時間、24時間、36時間にて採取した。A:示された時間ポイントにおける全RNAのノーザンブロット解析。B:示された時間ポイントにおけるN−myc蛋白質のウェスタンブロット解析。経時的実験の全蛋白質サンプルのうち10mgを10%のSDS−PAGEゲルで分画し、イモビロン膜でブロットし、モノクローナル抗−N−myc抗体でプローブした。
【図4】ヌクレオリンおよびヌクレオホスミン蛋白質発現並びにSHEP−2およびSHEP−21Nの全RNA量。A:ヌクレオリン、N−MYCおよびヌクレオホスミン蛋白質発現のウェスタンブロット解析。全細胞抽出物(10μg)をアクリルアミドゲルで分画し、ブロットし、ヌクレオリンに対するポリクローナル抗体(上方のパネル)およびN−mycに対するモノクローナル抗体(中間のパネル)およびヌクレオホスミン(下方パネル)でプローブした。コントロール細胞株IMR32およびSK−N−FIはN−myc、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンのそれぞれ高い発現と低い発現を有する。B:SHEP−2およびSHEP−21Nの全RNA量。RANを、各細胞株106細胞の10のサンプルから単離し、分光写真で分析した。エラーバーはS.D.を示す。
【図5】神経芽細胞腫細胞株および腫瘍からの全RNAのノーザンブロット解析。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。RNA定量化を臭化エチジウム染色により確認した。28Sバンドを示した。A:21の神経芽細胞腫細胞株のパネル。B:フレッシュな腫瘍のパネル。レーン1−9における腫瘍は増幅されたN−mycである。
【図6】c−myc形質移入メラノーマ細胞株におけるN−myc標的遺伝子の誘導のノーザンブロット解析。クローン3はIGR39Dメラノーマ細胞株のc−myc形質移入クローンである。IGR39Dおよびクローン3の全RNAの等量をロードした。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。
本発明は癌の治療および診断、並びに癌治療のための薬剤開発に関する。
【0002】
正常な健康的な生物は、体の特別な必要性に応答する注意深く調節された均衡を維持する。特に、新しい細胞の創造または増殖と余剰細胞の死との間の均衡は良好に維持される。しかし、細胞増殖を調節する、優れた制御が破壊し、体がこの種の細胞をさらに必要としていないにもかかわらず、細胞が成長および分裂を開始する場合がある。このような細胞は必然的に、体にとって真に必要性のない新生細胞になる。このような細胞の子孫が調節に応答することなく増殖する性質を受け継ぐ場合、結果は無制限に拡がることのできる細胞のクローンとなる。最後には、望まれない細胞のこのクローンにより、腫瘍と呼ばれる塊が形成され得る。すなわち、この冒された個体は癌の開始を発現する。新生細胞または腫瘍は、特に老いた個体では高い頻度で発生する。しかし、局所化しているので殆どの場合はホストに危険をもたらすことは殆どない。局所化した腫瘍は一般に良性と呼ばれ、腫瘍は全身に拡がると命にかかわるようになる。このような腫瘍は悪性と呼ばれ、癌に発展する。
【0003】
悪性腫瘍を良性のものから区別する主な特徴は、その侵襲性と拡がりである。悪性腫瘍は局所に留まらず、カプセル化されない。逆に周囲の組織を侵略し、体の循環系に入り、起源の部位から離れて増殖領域を作り上げる。腫瘍細胞の拡がりと成長の第2領域の確立は転移と呼ばれる。増殖し拡がる悪性細胞は転移の可能性を獲得する。
【0004】
明らかな良性腫瘍が悪性に進行する可能性があり、悪性腫瘍の最も初期段階は確認が困難であるため、病理学は悪性の始まりの程度を確実に捉えることは殆どできない。どんな場合でも、悪性腫瘍の細胞は、分化した特徴を失い、変化した染色体組成を獲得し、必然的に転移するようになる傾向を有しており、侵略的になり、拡がる。
【0005】
正常に調節されている細胞を制御に対して応答することなく成長する細胞に変化する遺伝的現象についての知識が豊富になった。これらの遺伝的現象は一般に配偶子を介して遺伝されず、むしろ体細胞のDNAが変化する。変化の基本形は先に現存する遺伝子が癌遺伝子へ変化することである。その生成により不適切な細胞成長が引き起こされる。したがって、DNAの変化は癌誘発の中心にあり、原因となる遺伝的現象を解明する科学的研究に多くの焦点が注がれた。例えば、myc癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を演じる。ヒト癌におけるmyc遺伝子の遺伝子変化の頻度(Dang and Lee,1995)は、1年あたり米国で約70.000人の癌死がmyc遺伝子またはその発現における変化と関連すると見積もることができる。3つのメンバー、すなわちN−myc、c−myc、およびL−mycが再配列され、増幅され、突然変異を起こし、および/または肺癌、乳癌、および結腸癌、白血病、および脳腫瘍等、多くの癌において過大発現される。
【0006】
c−myc遺伝子は、広範な組織および腫瘍において発現されるが、N−myc発現は胚組織、プレ−B細胞、および神経内分泌腫瘍に非常に限定される。N−mycはヒト神経芽細胞腫および小細胞肺癌において増幅され、ウィルムス腫瘍および網膜芽腫において強く発現される。神経芽細胞腫は予後が非常に変化し得る幼児期癌である。神経芽細胞腫の約20%がN−myc増幅を有しており、これらの腫瘍は非常に活動的な経過をたどる(Schwabら, 1983, Seeger ら, 1985)。神経芽細胞腫細胞株における形質移入されたN−myc遺伝子の過剰発現は増殖速度を非常に高めた(Bernardsら, 1986, Lutz ら, 1996)。神経堤誘導組織における遺伝子組み換えマウス過剰発現N−mycにより神経芽細胞腫が頻繁に成長する(Weisら, 1997)。多くの比較可能な観察により、多くの他の腫瘍型の病原におけるc−mycおよびL−mycを関係付けられた(Cole, 1986, marcu ら, 1992, Henrikson およびLuscher, 1996)。
【0007】
myc−ファミリーメンバーはベーシック/ヘリックス−ループ−ヘリックス/ロイシンジッパー(bHLHzip)ドメインを有する転写因子である。MAX蛋白質とmycのヘテロダイマーは、E−ボックスモーティブCACGTGに結合し、標的遺伝子転写を活性化する(Blackwood ら,1992,Alexら, 1992; Maら, 1993 )。したがって、少数の識別標的遺伝子によりmyc下流パスウェイの識別はかなり不可能になった。しかし、多くの実験により、細胞周期コントロール、転位、分化の遮断、アポトーシス、および増殖速度におけるmyc遺伝子についての役割が示唆された(HenrikssonおよびLuscher,1996, Dang,1999, Schmidt,1999)。正常に機能しないmyc機能を有するショウジョウバエ突然変異体および哺乳類細胞株の表現型分析は細胞成長におけるmyc遺伝子についての役割を示唆した。ラット線維芽細胞におけるc−myc対立遺伝子の両方の不活性化により、2倍から3倍の成長速度の減少となった(Mateyakら, 1997)。ショウジョウバエdmycの正常に機能しないインビボ発現は細胞成長を遅らせ、通常のサイズの半分の大人のハエを結果としてもたらした。さらに、成長調節におけるmyc遺伝子についての役割は細胞周期におけるその効果に合致している。ラット線維芽細胞におけるc−mycの不活性化により細胞周期のG1およびG2期が長くなった。しかし、S期は長くならなかった。ヒト細胞におけるc−mycまたはN−mycの高発現はG1期を通過する移行を加速した(Steinerら,1995; Lutzら,1996)。同様の効果がショウジョウバエで見いだされた。つまり、dmyc活性が減少することにより、G1期の長さが長くなり、一方、dmyc発現が増加することにより、G1を通過する移行が高まった(johnstonら, 1999)。
【0008】
多くの研究により、増殖におけるmycファミリー癌遺伝子の発現が関連付けられた。幾つかの腫瘍系列において、myc遺伝子の発現と増殖の発生との間には関連がある。このことは、例えば乳癌、骨腫瘍および結腸癌におけるc−mycについて観察された(Sierraら,1999, Gamberiら,1998, Kakisakoら,1998)。実験システムにより、myc遺伝子の発現および増殖キャパシティとの間の直接の関連を確認した。例えば、c−myc過剰発現ヒトメラノーマ細胞は、コントロールメラノーマ細胞より転移性であった(Schlagbauer−Wadlら,1999)。しかし、myc遺伝子の発現が癌細胞の転移性の可能性を増加するメカニズムは知られていない。
【0009】
c−mycの直接的な幾つかの標的および間接的に誘導された遺伝子の系列が確認されたが、これらの遺伝子間の明らかな関連は見いだされていない。これらの観察の付随的なおよび独立的な特徴により、癌におけるmyc遺伝子の細胞効果の包括的および統合的な観点の確認を妨げられた。例としては、プロサイモシンα(Eilersら,1991)、オルニチンデカルボキシラーゼ(Bello−Fernandezら,1993)、胚発現ECA39遺伝子(Benvenistyら,1992)、翻訳開始因子elF−4EおよびeIF−2−α(Jonesら,1996; Rosenwaldら,1993)、CAD遺伝子(Boydら,1997)、DEADボックス遺伝子MrDb(Grandoriら,1996)、および近時におけるヌクレオリン(Greasleyら,2000)である。サイクリンおよび他の細胞周期調節因子における効果は細胞の型および条件に依存する。サイクリンD1またはチロシン蛋白質フォスファターゼcdc25Aの誘導は、幾つかのモデル系でのみ見いだされた(Galaktionovら,1996, Amatiら,1998, Philippら,1994; Daksisら,1994; Solomonら,1995)。サイクリンEおよびA発現誘導が報告された(Jansen−Durrら,1993; Hansonら,1994)。c−myc標的プロサイモシンαおよびオルニチンデカルボキシラーゼもN−mycにより誘導されるが、c−mycおよびN−mycがその標的を全て分担するかは知られていない(Lutzら,1996)。したがって、myc遺伝子の変更が中心的であり、その多くが確認されマップ化された。
【0010】
増殖し拡がる癌細胞において裏付ける生理的現象が生じることを明らかにするのに、あまり努力は払われていない。細胞が癌への過程で遺伝的に変化することは充分に理解される。これらの遺伝的に変化した細胞がいかにして通常の生理的メカニズムおよび現象を使って成長、侵略、拡がりに至る本質的な癌特性を立証するかはあまり理解されない。例えば、myc蛋白質は転写因子である。これはMAX蛋白質とダイマーを形成し、DNA配列がCACGTGであると認める。したがって、myc転写因子の極僅かの標的遺伝子が確認された。確認された標的からはmyc蛋白質により活性化された経路の明確な理解はできない。したがって、病原におけるこれらの蛋白質の生化学的役割は推測される。myc遺伝子の正常でない発現を有する突然変異体ショウジョウバエ、哺乳類細胞株、および遺伝子組み換えマウスについての表現型の観察により、細胞周期コントロール、転位、アポトーシス、増殖速度、および細胞成長におけるmyc遺伝子についての役割が示唆された。本発明はmyc調節遺伝子の少なくとも7つのグループを開示する。
【0011】
本発明は、成長、侵略、および拡がりに至る癌細胞の本質的な癌の特徴をサポートする、本質的な通常の生理的メカニズムおよび現象の採用および適用を提供するのはmyc癌遺伝子ファミリーそれ自体であるという見識を提供する。本発明は、成長、侵略、または拡がり等の癌の特徴を本質的に証明できる遺伝子の機能的フラグメントまたはmyc依存下流遺伝子から構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、核酸ライブラリーは、下流myc−依存遺伝子またはその機能性フラクションである、遺伝子またはその機能性フラグメントから構成される核酸配列のコレクションとして規定される。これらの遺伝子の上方または下方制御は、mycファミリーメンバーによりコード化される転写因子の存在に少なくとも依存する。このような核酸配列のコレクションにおいて、配列は、核酸配列のコレクションの容易な取り扱いを提供するベクターにおいて好ましく利用可能である。myc遺伝子の下流遺伝子またはその機能性フラグメントはSAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を適用することにより確認された。初期に、各々はmRNA転写を表す約66,233タグを、N−mycトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株において確認した。したがって、我々は、各々が転写を表し、特に誘導された197タグおよびN−mycにより抑制された85タグを確認した(表1)。79,100転写へのこれらの分析の拡張において、我々はN−mycにより上方または下方制御される転写の付加的な系列を確認した(表2)。
【0012】
機能性フラグメントは、本発明ではSAGE法による確認を提供する、適当なタグ配列を含むmyc依存下流遺伝子の一部として規定される。
特に、本発明はmyc依存下流遺伝子の各々が表1または2に示されたタグ配列に本質的に等価な核酸を含んで構成される核酸ライブラリーを提供する。本発明では、本質的な等価物は、類似または関連した遺伝子またはそのフラグメントを識別するタグ配列に関連する。より好ましい態様では、前記myc−依存下流遺伝子がリボソーム蛋白質、蛋白質合成に関する蛋白質、転位に関する蛋白質、解糖酵素またはミトコンドリア機能性蛋白質をコード化する、本発明の核酸ライブラリーを提供する。
【0013】
本発明は、成長、侵略、拡がり等、癌に本質的な特徴を裏付けることのできるmyc依存下流遺伝子をモジュレーションすることを含んでなる、癌の治療法を提供する。本発明は、前記myc依存下流遺伝子が表1または2に示されたタグ配列の一つに本質的に対応する核酸を含む方法を提供する。 本質的な等価物は類似のまたは関連する遺伝子またはそのフラグメントを確認するタグ配列に関連する。
【0014】
例えば、本発明は、ヒト神経芽細胞腫におけるN−mycにより活性化されまたは抑制される下流遺伝子を提供する。66,233転写物より多い発現レベルの分析によりN−myc発現細胞における199の上方調節および85の下方調節転写物を識別した(表1)(Boonら,2001)。79,100転写物へのこれらの分析の拡張によりN−mycにより上方または下方調節される転写物タグの付加的な系列を識別した(表2)。我々の結果は、リボソーム生合成および蛋白質合成における、並びにミトコンドリア電子伝達およびATP合成における遺伝子機能化を刺激することにより、細胞成長、腫瘍形成の容易化のレギュレータとしてN−mycが機能することを示す。さらに、細胞構造および細胞マトリクス相互作用に含まれる多くの遺伝子は下方調節され、腫瘍形成細胞の浸潤または拡散を容易化する。N−myc調節遺伝子の系列はc−myc調節の標的でもある。 ここで、本発明はMYCファミリー標的遺伝子のリストに、myc−ファミリー遺伝子により誘導されまたは阻害される経路を識別できる多数の識別標的を提供する。しかし、個々の遺伝子の識別は幾つかの他の用途にも提供される。この発見は、例えば、新薬の開発、既知の薬剤の改良された使用、および組換え技術に使用可能である。幾つかの例を以下に示す。
【0015】
例えば、本発明は、myc蛋白質またはmyc下流経路蛋白質を特に阻害する薬剤の高い処理能力のスクリーニングのためのアッセイを提供する。個々の癌が幾つかの癌遺伝子および/または腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異により引き起こされることは充分に確立されている。腫瘍や同じ組織は突然変異した癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の異なる組み合わせから起こり得る。遺伝子欠陥の型および組み合わせは腫瘍細胞のバイオロジーをそして腫瘍の臨床的挙動を決定する。将来の腫瘍治療は、個々の患者の腫瘍に対して個別的に行われるであろう。診断に際しては、腫瘍の癌遺伝子活性の型を確立し、治療を選択する指針となる。米国で1年あたり約70,000人が癌で死亡することは、myc遺伝子における欠点またはこれらの遺伝子の過剰発現に関係する(Dang およびLee、1995年; Dang、1999年)。現在のところ、myc蛋白質の活動を特に阻止する薬剤は存在しない。このような薬剤は、現在、高い処理能力システムにおいて、本発明によって供給される標的遺伝子を使用して識別できる。ここでは、何千の化合物がmyc蛋白質の特別な阻害効果に対して試験されうる。これらの試験システムは非常に厳密な読み取りシステムが必要である。TP53腫瘍サプレッサー蛋白質のインヒビタを識別するために使用されるこのようなシステムの例が、最近公開された(Komarov等、1999年)。lacZリポータ構成はTP53により誘導されることが知られている遺伝子のプロモーターのコントロール下にもたらされた。この構成をもつマウス細胞株を使用して10,000の合成化学的化合物を試験した。これらの化合物をこれらの細胞と共に組織培養ウェルに添加し、TP53を不活性にする僅かの化合物が、LacZリポーター遺伝子の発現が低下することから確認された。
【0016】
myc標的遺伝子の系列を我々が識別したことにより、myc抑制性薬剤を識別するための向上したアプローチが可能になる。現在は、このような薬剤を識別する感受性読み取りシステムはない。c−mycおよび/またはN−mycの幾つかの標的遺伝子が識別されたが、これらの発現レベルはほんの数倍調節されたに過ぎず、読み取りシステムとして本質的に役立たない(Cole等により1999年に検討された)。ここに、我々は、N−mycおよび/またはc−mycにより強く誘導または抑制される遺伝子の系列を識別したことを説明する。例えば、我々は、オステオネクチンまたはSPARC遺伝子の発現が、SHEP−2における10,000転写物あたり280転写物から、SHEP−21Nにおける14転写物へN−mycにより下方調節されることを示した。この20倍の減少は、SHEP−2およびSHEP−21NからのmRNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより充分に確認される(データは示さず)。さらに、我々は、蛋白質レベルで、SHEP−2細胞がSHEP−2よりもずっと多くのオステオネクチン蛋白質を有することを確認した(データは示さず)。オステオネクチン蛋白質は分泌蛋白質として知られている(Lane およびSageにより1994年に検討された。)。これにより、N−myc阻害性薬剤の試験が非常に実施し易くなる。試験化合物を、N−myc発現が、例えばテトラサイクリン誘導可能なシステムにより、誘導できるSHEP細胞に添加できる。N−myc発現を誘導する場合、オステオネクチン蛋白質レベルはこれらの細胞において低下するであろう。化合物がN−mycに対して阻害性である場合、これはオステオネクチンmRAN発現の下方モジュレーションを阻止するであろう。これらの細胞は組織培養培地内でオステオネクチン蛋白質の内分泌を継続するであろう。したがって、マルチウェル細胞培養システムにおいて、不活性な化合物を有する全ウェルにおいてオステオネクチンの生成が低いであろう。オステオネクチン濃度が高い稀なウェルは、N−myc機能化を阻害する化合物を示す。イライザまたは他の蛋白質に基づく検出システムはオステオネクチンの高濃度のウェルを自動的に検出できる。オステオネクチンのみならず、IGFBP7、コラーゲン型4a1およびシンデカン(syndecan)2のような多くの他の下方調節遺伝子が、mycにより下方調節されることを識別するので、これらはこのようなアッセイにおいても使用できる。類似のアッセイを、読み取りとしてN−mycまたはc−mycにより誘導される遺伝子を使用して設計できる。このような薬剤試験システムの変形において、強くN−myc調節された遺伝子のプロモーター素子を使用でき、これらをグリーン蛍光性蛋白質(Green Fluorescent Protein)のような容易に検出できる蛋白質のコントロール発現に使用できる。これにより、高い処理能力システムにおけるmyc阻害性薬剤の検出がさらに単純化されるであろう。
N−myc標的の多くはc−mycの標的でもあることを、我々は示したので、我々の発見は、myc癌遺伝子ファミリーの他のメンバーに対して薬剤の識別のためのアッセイに使用できる。誘導性c−myc構成は多くの細胞システムにおいてn−mycと同じ遺伝子を標的にするであろう。したがって、N−mycおよびc−mycについての標的遺伝子の記載されたリストにより、数千の薬剤候補のうち数百について半自動的試験を可能にし、myc蛋白質および/またはそれらの下流経路に対して活性な化合物の選択を可能にする。
【0017】
さらに、本発明は、N−mycまたはc−myc活性化腫瘍を有する患者の特別な治療に対する現在の薬剤の用途およびさらなる開発を、例えばmycが関連する癌の治療法において提供する。説明したように、将来の癌治療は特定の患者の腫瘍において実際に活性化されたこれらの癌遺伝子を特に阻害するように設計されるであろう。我々の発見は、myc遺伝子の活性により引き起こされた腫瘍を有する患者において現在知られた細胞増殖抑制性または細胞障害性薬剤の幾つかの使用の検討を提供する。いくつかの例を挙げる。例えば、本発明はヌクレオホスミンに干渉する薬剤を使用することを含む治療法を提供する。
我々は、N−mycおよびc−myc誘導の主な標的としてヌクレオホスミン(B23)を識別した。ヒト腫瘍および細胞株の大きな系列の分析は、インビボでヌクレオホスミンmRNAレベルがN−mycまたはc−myc発現に関連することを示した。ヌクレオホスミンはリボソーム生合成およびプレリボソーム粒子の核小体の細胞質内輸送において機能する。前記蛋白質は、アクチノマイシンD、ドキソルビシン、マイトマイシン、トヨカマイシン(toyocamycin)、ツベルシジン(tubercidin)、サンギバマイシン(sangivamycin)、およびマイコフェノール酸(mycophenolic acid)のような幾つかの細胞障害性薬剤により核小体から核質に転位することが知られている(Yung等、1995年、1990年; Chan等、1987年;Chan,1988年、1992年; Cohen およびGlazer、1985年、Perlaky等、1997年)。これらの薬剤を用いた細胞の処理はリボソームRNAのプロセッシングおよび蛋白質合成を阻害し、細胞死に至る。これらの薬剤の幾つかは、癌患者の治療に臨床的に試験および/または適用される。
【0018】
myc癌遺伝子ファミリーのメンバーがヌクレオホスミンmRNAおよび蛋白質発現を誘導するという我々の発見により、mycファミリーメンバーの過剰発現を有する腫瘍に対する治療における関心のある標的としてこの蛋白質は注目される。このことから、上記薬剤およびこれらの類似物に対する基本的な新規な機会が開かれる。これらの薬剤は、myc活性化腫瘍について特別の効果の可能性の知識を持たずに、非選択的な患者系列に対して臨床的に試験されまたは使用された。この患者系列は、おそらく腫瘍にmyc遺伝子を有する患者持たない患者からなると考えられる。アクチノマイシンDは例えばウィルム(Wilm)の腫瘍および横紋筋肉腫の治療に使用される。幾人かの患者は他の患者より良好な治療反応を示す。ウィルムの腫瘍および横紋筋肉腫の患者は高いN−mycまたはc−myc発現を有する(Nisen等、1986年)。アクチノマイシンDが腫瘍を発現するN−mycまたはc−mycに対して特に効果的であるかどうかを今や試験でき、この場合、アクチノマイシンDはmyc活性を持たない腫瘍に対して非効果的である。これらの発見により、アクチノマイシンDのより特別な使用がもたらされる。幾つかの他の薬剤がヌクレオホスミンに対して効果的である(上記参照)。より特別な抗ヌクレオホスミン効果を有する低毒性類似物の開発によるこれらの薬剤の改良は、特別の抗myc薬剤を設計するために提供される興味ある戦略である。例えば、トヨカマイシンは高毒性であるが(Wilson1968年)、類似物は試験されてさらにmyc活性化腫瘍を有する患者に対する特別な使用について開発できる。
【0019】
本発明は細胞外および膜貫通型蛋白質のインヒビタの使用をもたらす。N−mycおよび/またはc−mycにより誘導される遺伝子のリストは分泌性または細胞表面蛋白質に対してコード化する多くの遺伝子を含む。このような蛋白質は、容易に受け入れられるので、薬剤に対する優れた標的である。これらにより、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍細胞の成長および転移を特別に阻害するための標的がもたらされる。標的の可能性のある例としては、バシジン(basigin)およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI)である(表1、No.112)。バシジン(またはEMMPRIN、細胞外マトリクスメタロプロテイナーゼインデューサ)(表1,No.97)は腫瘍細胞の表面に存在し、側の線維芽細胞を刺激するイムノグロブリンファミリーのメンバーである(Guo等1998年)。メタロプロテイナーゼはマトリックスの分解および転移を促進することが知られているので、バシジンを阻害する薬剤は、mycファミリー遺伝子の高発現を有する腫瘍の転移を防止可能であるであろう。メタロプロテイナーゼを阻害する薬剤は既知であり、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍の特別な治療に対して適用できるであろう。
【0020】
プラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI−1)は、線維素溶解およびマトリックス代謝回転の主な生理学的インヒビタである。ここに記載の、N−mycによるPAI−1の下方調節はマトリックス代謝回転を増加させ、細胞運動性および転移を促進する。多くの化合物をPAIの調節に対して臨床的に実験的に試験する。例えば、15−デオキシ−デルタ12,14−プロスタグランジンJ2(15d−PGJ2)、転写因子PPARgに対する活性化リガンドはPAI−1mRNAおよび蛋白質発現を強化した(Marx等、1999年)。したがって、これらの薬剤は腫瘍を発現するN−mycまたはc−mycの転移を防止するために特に使用されるということがもたらされる。さらに、N−mycまたはc−myc蛋白質により誘導される膜貫通型蛋白質は、細胞障害性薬剤に結合できる抗体のような治療薬剤の標的として使用できる。
【0021】
さらに、本発明は腫瘍の分子診断をさらに提供する。mycファミリー癌遺伝子の標的遺伝子について第1の完全な記述を提供する。幾つかの基本的なカテゴリが提供される。しかし、N−myc活性を有するフレッシュな腫瘍の分析において、我々は、これらの全てではない遺伝子または全てのカテゴリが全腫瘍において上方調節されることを観察した。これにより、付加的な欠点または要因が個々の腫瘍においてmyc癌遺伝子により誘導または抑制される遺伝子の範囲に影響することが示唆される。このことは、腫瘍の生態に対して重要であると考えられる。したがって、mycファミリーメンバーの活性を有する腫瘍における上方調節/抑制される遺伝子の詳細な分析が臨床的に関連する。蛋白質合成に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍は、酸化的リン酸に伴われる遺伝子の上方調節を有する腫瘍とは異なるかもしれない。この情報は腫瘍に対する適当な治療法を選択するのに重要である。したがって、N−mycおよび/またはc−myc下流標的の完全なリストにより、最適な治療に対する腫瘍を分類するための重要な手段をもたらす。ここに記載の発見は、mycファミリー癌遺伝子のキー下流標的の活性化または不活性化を測定する診断キットを開発するのに適用される。このような診断ツールは、最適な治療をガイドするために提供される。
【0022】
さらに、本発明は腫瘍の非侵略的な診断を提供する。特別な癌遺伝子の活性は現在では外科的に除去した腫瘍試験片の分析により確立されるのみである。外科手術は患者に負担であるので、腫瘍の癌遺伝子状態を監視するための高価で危険がなく、非浸潤的な方法が望まれる。N−mycにより誘導または抑制される分泌性蛋白質に対する遺伝子のインベントリが血清マーカーの分析によりmyc発現の状態を決定するのに使用できる。さらに、これらの遺伝子の血清レベルは、腫瘍成長、治療に対する反応および再発の発生を監視するのに使用できる。我々の結果は、例えば、オステオネクチン(10,000タグあたり280から14タグに減少される)、マクロファージ移行阻害因子(表1、No.92)(10,000タグあたり1.1から14.4タグに誘導される)、およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタ型1(PAI−1)等多くの候補蛋白質が腫瘍マーカーとして腫瘍の生物学的分類に役立つことを示す。最近、PAI−1の血清レベルを一連の頭頚部腫瘍において分析し、腫瘍ステージに関連することがわたかった(Stroan等1998年)。したがって、我々の発見は、PAI−1およびmycファミリーメンバーにより影響される他の分泌性蛋白質を、腫瘍におけるmyc遺伝子の状態を監視しかつmyc誘導性腫瘍の治療に対する成長および応答を追跡する良好な候補として識別する。
【0023】
さらに、本発明は生成目的のための細胞蛋白質合成機構の強化を提供する。真核生物の細胞を使用して、例えば薬剤の組換え蛋白質を生成する。N−mycおよびc−mycが蛋白質合成機構の本質的な成分を誘導するという発見は、細胞システムの組換え蛋白質のブースト生成に適用され得る。本発明は、治療または市販価値を有する抗体、ホルモン、または他の蛋白質のような組換え蛋白質の生成を最適にする内因性または形質移入性myc遺伝子の高発現を有する細胞の使用を提供する。
さらに、本発明は、転写物および/または蛋白質のn−mycまたはn−myc誘導調節に干渉できる物質を識別する方法であって、n−myc活性を有する細胞を提供し、前記物質の存在下で前記転写物および/または蛋白質のモジュレーションを決定することを含む方法を提供する。本発明で記載したように、n−mycによる転写物および/または蛋白質のモジュレーションは上方または下方調節できる。
【0024】
myc癌遺伝子ファミリーのメンバーは癌において重要な役割を担う。ヒト癌のmyc遺伝子の遺伝的変化の頻発(Dang およびLee、1995)により、1年あたり米国で約70,000人が癌で死亡することがmyc遺伝子におけるまたはその発現における変化に関連するという予想が可能になった。3つのメンバー、すなわちN−myc、c−mycおよびL−mycが、例えば肺、乳房および大腸の多くの癌においておよび白血病および脳腫瘍において、再配列され、増幅され、突然変異し、および/または過剰発現する。myc蛋白質は転写因子である。これらはMAX蛋白質とダイマーを形成し、DNA配列CACGTGを認識する。myc転写因子の標的遺伝子は殆ど識別されていない。識別された標的によっては、myc蛋白質により活性化されるパスウェイの理解を明確にすることができない。したがって、これらの蛋白質の病因論における生物化学的な役割は推論の域をでない。myc遺伝子の異常発現を有する、哺乳類の細胞株、遺伝子組換えマウスおよび突然変異ドロゾフィラについての表現型の観察により、細胞サイクル制御、転移、アポトーシス、増殖速度および細胞成長におけるmyc遺伝子に対する役割を提案した。
【0025】
myc遺伝子の下流パスウェイを識別するために、我々はSAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を利用した。初期に、我々は約66,233タグを識別した。これらの各々は、1対の、N−mycトランスフェクトおよびコントロールトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株における、mRNA転写物を表す。このようにして、我々は、各々が転写物を表し、特に誘導される197タグおよびN−mycにより抑圧される85タグを識別した(表1)。79,100転写物に対するこれらの解析の拡張において、N−mycにより上方制御または下方制御された転写物の付加的なシリーズを識別した(表2)。N−mycは多くのリボソーム蛋白質遺伝子、リボソームRNA合成およびリボソーム生合成に伴われる遺伝子、および翻訳および蛋白質成熟に伴われる遺伝子の発現を誘導することが明らかである。このことは、N−mycの主な機能が細胞の蛋白質合成機構の増強であることを示している。さらに、ミトコンドリア内における電子伝達およびATP合成、および解糖に伴われる遺伝子の著しい誘導がもたらされる。このことは、細胞エネルギー生成機構が高い容量を有していることを示している。N−myc標的の別のセットは細胞粘着、マトリクス形成、侵略的キャパシティおよび細胞骨格構築に伴われる。これらのデータによりmyc発現腫瘍細胞に関連する転移可能性が高いことが説明される。さらに、遺伝子のセットは、転写、染色体縮合および情報伝達における役割について誘導されまたは抑制される。最終的に、短いcDNA配列のみが既知である(Ests)一連の遺伝子が識別され、幾つかのSAGE転写物タグを、遺伝子を遺伝子割り当てすることなく識別した。これらの遺伝子はN−myc下流パスウェイの重要な成分であり得る。N−mycのこれらの下流標的の多くはc−myc癌遺伝子の標的でもあることが明らかである。したがって、これらのデータはmyc癌遺伝子ファミリーの標的遺伝子のインベントリを示す。これらの遺伝子はmycファミリー癌遺伝子の腫瘍形成効果を仲介するので、これらはmyc蛋白質またはmyc下流パスウェイを阻害する新薬を識別する機会を提供する。さらに、癌遺伝子のmycファミリーのメンバーを発現する腫瘍細胞を阻害または殺す潜在的な標的遺伝子の範囲を示す。
【0026】
結果
N−mycでトランスフェクトされた神経芽細胞腫細胞株のSAGEライブラリ N−mycの下流標的遺伝子を識別するために、我々はN−mycトランスフェクト神経芽細胞腫細胞株についてSAGE法を適用した。SHEP細胞株はN−myc増幅および発現がなく、さらにc−myc発現もない。テトラサイクリン依存N−myc発現ベクターはこれらの細胞中に誘導され、SHEP−21Nクローンをもたらす(Lutz等、1996年)。SHEP−21N細胞はテトラサイクリンによってスイッチオフされ得る構成性外因性N−myc発現を有する。SHEP−21N細胞におけるN−myc発現は細胞分裂の速度を高め、細胞周期のG1期を短くし、細胞にアポトーシスのトリガに対する感受性をより高めることを示した(Lutz等、1996年;Fulda等1999年)。2つのSAGEライブラリを構成した。N−mycを発現するSHEP−21N細胞からのものと、SHEP−2コントロール細胞からのものである。SHEP−2クローンをエンプティ発現ベクターを用いてトランスフェクトした。SHEP−2から我々は約44,674の転写物タグを配列決定し、SHEP−21Nからは21,559転写物タグを配列決定した。2つのSAGEライブラリーを比較することにより、N−myc発現細胞において199の有意に(p<0.01)上方制御されたタグを47倍までの誘導レベルで得た(表1、セクション1)。別の85タグは有意に下方制御された。さらに、21,559タグから34,426タグまでのSHEP−21Nライブラリーの配列決定により、N−myc(p<0.01)により上方または下方制御された転写物タグの別のシリーズを得た(表2)。我々はこれらのタグと現在作ることのできる最も可能性のある遺伝子割当を本明細書に記載する。これらのタグに相当する転写物を我々が開発したコンピュータープログラムおよびCGAP/NCBI(Lal等、1999年)からのSAGEマップデータベースを使用して識別した。N−myc制御遺伝子の7つのグループを記載する。
【0027】
N−myc標的1:リボソーム蛋白質遺伝子
第1の機能的グループは61のリボソーム蛋白質遺伝子からなり、それらは47倍まで誘導される(p<0.01、表1、セクション1)。これらの61の蛋白質はヒトのリボソーム蛋白質の約75%を表す(Wool等、1996年)。誘導された遺伝子の幾つかをさらに解析するために選択した。SHEP−2およびSHEP−21N細胞からの全RNAの等量を用いたノーザンブロッティングを、リボソーム蛋白質S12、S27、Fau−S30、L8、S6、S19およびリボソームリン蛋白質P0(PPARP0)に対するプローブを用いてハイブリッドした(図1)。7つの遺伝子全てをN−mycにより誘導した。リボソーム蛋白質mRNAに対して発見されたタグの残量は、SHEP−2において全タグの約4%を構成する。このフラクションはSHEP−21Nにおいて10%に増加した。個々のリボソーム蛋白質遺伝子のレベルはSHEP−2における基礎発現レベルのフラクションである。高発現遺伝子は、SHEP−2において低基礎発現を有する遺伝子より低く誘導される(図2)。これらの結果より、N−mycが、直接的にまたは間接的に、大多数のリボソーム蛋白質のmRNA発現レベルを誘導することを示している。
【0028】
N−myc標的2:リボソーム生合成および蛋白質合成における遺伝子機能化
26タグの第2の機能的グループは蛋白質合成および代謝回転、特別なリボソームバイオジェネシス、mRNA翻訳、蛋白質成熟および分解における明確な役割を有する遺伝子に相当する。
【0029】
ヌクレオホスミン(B23)(表1、No.67および83)の誘導に高い関心がある。ノーザンブロット解析により、この誘導が、タグ頻度により推定されるよりもかなり強いレベルであることを確認した(図1)。ヌクレオホスミンは、5.8Sのプレ−rRNAの5’末端の切断によるリボソームRNAをプロセスする、非常に豊富な核小体蛋白質である(Savkur等、1998年)。さらに、これはプレリボソーム粒子の核−細胞シャトリングおよび集合において機能する(Borer等、1989年;Olson等、1991年;Szebeni等、1999年)。ヌクレオホスミンはリンパ腫および白血病における再発性染色体転座の標的である(Morris等、1994年、Redner等、1996年、Pandolfi、1996年)。リボソームバイオジェネシスにおけるヌクレオホスフィンの主要な役割のために、我々はこのプロセスに関連した他の遺伝子に対するSAGEライブラリーを解析することを急いだ。第二の転写物のために2つのタグを有するヌクレオリン(表1、No.87および88)は、合計で10,000あたり2.5から5.6タグを誘導する(p=0.044)。この誘導はノーザンブロット解析により確認された(図1)。また、ヌクレオリンは非常に豊富な核小体蛋白質であり、ヌクレオホスミンに結合する(修正TujetaおよびTujeta、1998年;Ginisty等、1999年)。18SrRNAを成熟させることは恐らくプレリボソームRNAのプロセシングにおける第1段階に対する律速酵素である(Gistiny等、1998年)。さらに、ヌクレオリンはプレリボソーム粒子の集合およびそれらの核−細胞輸送に伴われる。それは18リボソーム蛋白質と相互作用し(Bouvet等、1998年)、それの16はN−mycにより誘導される。N−mycによるヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの誘導は、さらにリボソーム蛋白質、リボソームRNAおよびリボソーム生合成はN−myc刺激の標的であることを示唆する。
【0030】
3つの翻訳開始因子および5つの翻訳延長因子に相当するタグが誘導された。開始因子は、真核生物翻訳開始因子3サブユニト8(eIF3s8)(表1、No.81)およびサブユニット3(表1、No.78)、真核生物翻訳開始因子4B(表1、No.72)である。延長因子1(EEF1)は、リボソームへのアミノアシル−tRNAのデリバリに起因し、サブユニットα/β/γまたはα/β/γからなるヘテロトリマーである。サブユニットα、βおよびγに対するタグは、SHEP−21Nにおいて9〜11.4倍に誘導される(表1、No.69、66および70)。延長因子2はリボソームのAからP部位に新生ポリペプチド鎖の転座を促進し、誘導もされる(表1、No.79)。ミトコンドリアの延長因子Tu(tuFM)はアミノアシルtRNAをミトコンドリアリボソームにデリバリし、12.4倍上方制御される(表1、No.64)。SHEP−21NおよびSHEP−2のノーザンブロット解析はeIF3s8、EEF1a1およびtuFMの誘導を確認した(図1)。さらに、これらのデータは蛋白質合成のレギュレータとしてのN−mycに対する役割を支持する。
【0031】
蛋白質合成の次の段階は成熟およびルーティングである。新生ポリペプチド結合錯体(NAC)αmRNAをN−myc発現細胞において誘導した(表1、No.77)。NACは細胞基質蛋白質の新生ポリペプチド鎖を不適当な転座から小胞体(endoplasmatic reticulum)へ保護する(Wiedmann等、1994年)。シャペロンHSP60およびHSP90の誘導は蛋白質フォールディングおよび成熟についての細胞能力が高まることを示唆した(表1、No.65、68、80および82)。HSP60はミトコンドリアの蛋白質取り込みおよび高分子集合に関連する。HSP90は、ステロイドホルモン受容体を含むシグナル分子のフォールディングおよびミスフォールディング蛋白質の再フォールディングに関連する。ノーザンブロット解析はHSP60の誘導を確認した(図1)。蛋白質分解に対する細胞能力も誘導できた。このことは、3つのユビキチンパスウェイ蛋白質(表1、No.62、73および76)および5つのプロテアソームサブユニット(表1、No.63、71、74、75および84)に対するタグ頻度が増加することにより示唆された。ノーザンブロット解析はSHEP−21N細胞におけるプロテアソームサブユニットbタイプ6の発現レベルがより高いことを確認した(図1)。
【0032】
N−myc標的3:解糖遺伝子
N−myc誘導遺伝子の第3グループは解糖経路における鍵酵素をコード化した(表1、セクション4)。アルドラーゼAフルクトースビホスフェート(ALDOA)、トリオースホスフェートイソメラーゼ1(TPI1)、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびピルベートキナーゼに対するタグは全て増加した(表1、No.133,135および132)。他の誘導mRNAは、セリンの合成に関連する代謝酵素3−ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼおよびソルビトールをフルクトースに酸化するソルビトールデヒドロゲナーゼに対してコード化する。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1はメタノール代謝において機能する。ノーザンブロット解析はALDOA、ぴるべートキナゼ、TPI1およびGAPDHのmRNA誘導を確認した(図1)。これらのデータはN−myc刺激の標的として解糖に関連している。
【0033】
N−myc標的4:ミトコンドリア電子運搬およびATP合成
SHEP−21Nは、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化における役割を有する遺伝子に相当する一連のタグの誘導を示す(表1、セクション5)。17のタグを有意に誘導する。誘導した遺伝子の5つがミトコンドリアについてコード化される(参照:ミトコンドリアタグ解析Welle等、1999年)。
O2への電子移動によるNADHおよびFADH2の酸化は、呼吸鎖、NADHデヒドロゲナーゼ、ユビキノールシトクロームcレダクターゼおよびシトクロームcオキシダーゼにより行われる。これらの大きい錯体はミトコンドリア内膜を横切ってプロトン勾配を確立する。このプロトン勾配はFタイプATPシンターゼ錯体によるATPの合成を駆動する。N−mycは、4つの酵素錯体全ての一連のサブユニットを増加する。
【0034】
4つのNADHデヒドロゲナーゼサブユニット、サブコンプレックス4(表1、No.136、NDUFB4)、サブコンプレックス7(表1、No.138)、およびミトコンドリアについてコード化したサブユニット4/41および3(表1、No.150および151)を誘導する。NDUFB4の誘導をノーザンブロット解析により確認した(図1)。
ユビキノール−シトクロームcレダクターゼ複合体のサブユニットを誘導した(表1、No.136)。さらに、シトクロームcオキシダーゼのサブユニットII、 IIIおよび VIIIをN−myc発現細胞において誘導した。サブユニットVIII(COXVIII、表1、No.149)の誘導をノーザンブロット解析により確認した。
最終的に、N−mycはF0セグメントのサブユニット6/8およびFタイプATPシンターゼのストークのF0セグメントのサブユニット9(またはc)の2つのイソ型の転写を誘導する(表1、No.137、148および152)。ATPアーゼサブユニット6および8を、オーバーラップミトコンドリア転写についてコード化する。
【0035】
さらに、ミトコンドリア機能における役割を有する幾つかの他の蛋白質は上方制御される(表1、セクション5)。電圧依存性陰イオンチャンネル(VDAC、表1、No.143)を5倍誘導し、ノーザンブロット解析で確認した(図1)。VDACは親水性分子が拡散できるミトコンドリア外膜チャンネルを形成する。これは、シトクロームcを細胞質に伝達できるので、アポトーシスにおいて主な役割を果たし、カスパーゼ(caspase)9活性をもたらす。
さらに、グルタチオンペルオキシダーゼ4およびグルタチオンSトランスフェラーゼpは強く誘導される(表1、No.139および144)。グルタチオンは容易に電子を受容し、過酸化水素および有機過酸化物に対するスッキャベンジャとして作用し得る。ミトコンドリアの電子伝達系により不可避のアーチファクトが生じる。この反応はグルタチオンペルオキシダーゼにより触媒される。
【0036】
N−myc標的5:細胞運動および転移における役割を有する遺伝子:
N−mycによって誘導または抑制される、大きいグループのタグは、細胞運動および細胞マトリックス相互作用における役割を有する遺伝子に属する(表1、セクション3)。これらの遺伝子は細胞骨格蛋白質、細胞表面蛋白質、接着分子、および細胞マトリックス構築および代謝回転における役割を有する細胞外保護蛋白質に対してコード化する。この範疇における遺伝子に対するタグを有意に誘導した。この範疇における別の29のタグを有意に下方制御する。下方制御の例としては、コラーゲンタイプIa1(表1、No.100、108、および109)、タイプIVa1(表1、No.115)およびタイプXVIIIa1(表1、No.116)、フィブリリン(表1、No.121)、シンデカン2(表1、No.126)、フィブロネクチン(表1、No.122)およびオステオネクチン(SPARC)(表1、No.118、123および125)である。後者は興味のある遺伝子であり、10,000タグあたり280から14タグに下方制御される。我々はノーザンブロット解析により、オステオネクチン、シンデカン2およびコラーゲンIVa1およびプラスミノーゲンアクチベータインヒビタタイプ1を確認した(表1、No.112)(データは示さず)。これらの遺伝子の下方制御は、N−mycが細胞マトリックスに対する細胞粘着を下げることができ、したがって、細胞運動性を誘導することを示唆する。これは、myc発現腫瘍細胞の転移可能性が高められた株である。
【0037】
N−myc標的6:他の遺伝子
N−mycによって影響される遺伝子の別のグループは、情報伝達蛋白質、転写因子、クロマチン因子、サイクリンおよび他の調節蛋白質によって形成される。このグループは66の有意に誘導された転写を数える(表1、セクション6)。例としてはNM23A,NM23B,HMGI−Y,ジンクフィンガー蛋白質6および(表1、No.171、214、162、218)である。HMGI−Y,NM23A,およびNM23Bの誘導をノーザンブロット解析により確認した(データは示さず)。調節蛋白質または酵素に対する遺伝子の別のグループをN−mycにより下方制御した(表1、セクション6)。例としては、インスリン様成長因子結合蛋白質7(IGFBP7)(表1、No.252)およびジンクフィンガー蛋白質216(表1、No.248)である。ノーザンブロット解析はSHEP−21N細胞に比較したSHEP−2細胞におけるIGFBP7の下方制御を確認した(データは示さず)。
【0038】
N−myc標的7:アノニマス遺伝子(Ests)
部分的cDNA配列のみが知られている(発現配列タグまたはEsts)一連のアノニマス遺伝子はN−mycにより誘導または下方制御される(表1、セクション7)。これらの遺伝子の機能は未だ知られていないが、癌における役割を有する可能性のある重要な遺伝子として、myc制御マークの標的であることはわかった。
N−mycの未識別標的のタグ
SHEP−2bおよびSHEP−21Nライブラリーにおいて別々に表示された幾つかのタグに対して、我々は対応する遺伝子を未だ識別していない(表1、セクション8)。これらは両方ともN−mycにより誘導または抑制される遺伝子である。
【0039】
N−mycは4時間以内に下流標的を活性化する
経時的実験において、我々は推定N−myc標的がSHEP−21N系におけるN−調節の後誘導されるかどうかを解析した。N−myc発現はテトラサイクリンによりSHEP−21N細胞において可逆的にスイッチオフできる。SHEP−21N細胞をテトラサイクリンで24時間処理し、充分に洗浄し、テトラサイクリンなしでさらに2〜36時間成長させた。ノーザンブロット解析は、N−mycmRNAの発現がテトラサイクリン処理の8時間以内にスイッチオフされることを示した(図3A,レーン1−2)。テトラサイクリン除去後、N−mycmRNA発現は2〜4時間回復される(図3A、レーン5−6)。N−myc蛋白質発現は並列的な経時的実験においてウェスタンブロッティングおよび直後のN−mycmRNA発現により解析した(図3B)。ノーザンブロットフィルタを、N−myc下流タグヌクレオリン、ヌクレオホスミンおよびリボソーム蛋白質遺伝子RPS6およびRPS12に対するプローブでハイブリッドした(図3A)。テトラサイクリンによるN−mycの抑圧後、これらの遺伝子のmRNAレベルは0および8時間にて影響がないが、それらの発現は24時間で低い基本的なレベルに下がった。重要なことは、N−mycmRNAおよび蛋白質の再発現の後2〜4時間の間、4つの遺伝子全ての発現が強く再誘導されることである(図3B、レーン6〜7)。類似の結果が、EEF1A1,TPI1,eIF3s8,およびVDACに対して得られた(データを示さず)。我々がコントロールとして使用したコフィリン(cofilin)の発現レベルは時間経過の間有意には変化しない。ヌクレオリンまたはヌクレオホスミン発現におけるテトラサイクリンの直接の効果を排除するために、我々はSHEP−2細胞を使用した同じ実験を行ったが、遺伝子発現について影響は観察されなかった(データは示さず)。これらの結果により、ここで識別された遺伝子はN−mycにより誘導されることが先ず確認される。第2に、必ずしもN−mycの直接の標的ではないが、N−myc下流パスウェイにおける早期の標的であることを示す。したがって、これらは、N−mycパスウェイの本質的な成分を表す。さらに、データは、N−mycによる誘導が多方面にわたることを示している。つまり、N−myc除去後発現が低下し、N−myc再発現後素早く回復する。
【0040】
N−mycはリボソームRNA合成を誘導する
rRNAプロセシングおよびリボソーム生合成における重量な役割を有する2つの遺伝子の誘導により、我々はそれらの蛋白質発現およびそれらの潜在的な機能活性を解析した。ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの蛋白質発現を、N−myc増幅のあるおよびこれの無い2つのコントロール細胞株およびSHEP−2およびSHEP−21N細胞において解析した。ウェスタンブロット解析により、SHEP−2に比較してSHEP−21Nにおいて(図4、レーン3および4)、およびN−mycシングルコピー細胞株SK−N−FIに比較してN−myc増幅IMR32細胞株において(図4、レーン1および2)、より高いヌクレオリンおよびヌクレオホスミン発現が示された。リボソームRNAプロセシングにおけるこれらの蛋白質機能として、我々はSHEP−21NがSHEP−2細胞より高いrRNA含量を有するかどうかを解析した。我々は各細胞株の106の指数関数的に成長する10のサンプルから全RNAを単離した。分光光度解析により、SHEP−21N細胞はSHEP−2細胞より全RNAについて平均で45%高い収率であることがわかった(p<0.001、独立したサンプルに対してスチューデントのt検定)(図4B)。独立的に培養した細胞についての重複した実験からは同じ結果が得られた。アガロースゲル電気泳動により分画した18Sおよび24SrRNAバンドの濃度測定定量化により、この増加がリボソームRNAにより引き起こされることが確認された(データ示さず)。
【0041】
rRNAにおけるこの強い増加により、全体的な蛋白質合成およびリボソーム機能の増加がもたらされることを解析するために、我々はSHEP−2およびSHEP−21N細胞における蛋白質合成の速度および蛋白質量を測定した。106SHEP−2およびSHEP−21N細胞のライセートは等量の蛋白質を含有した(データは示さず)。蛋白質合成速度を35Sメチオニンインコーポレーションにより解析した。SHEP−2およびN−myc発現SHEP−21N細胞間で差異は観察されなかった。また、経時的実験におけるSHEP−21NについてのN−myc発現操作によって、蛋白質合成速度の違いは明らかにならなかった(データは示さず)。このことから、SHEP−21Nにおける蛋白質合成速度がN−mycにより誘導されない因子によって制限されるか、または蛋白質合成がSHEP神経芽細胞腫細胞株において既に最大値であり、N−mycによりブーストされ得るレベルを超えていることを示唆する。
【0042】
内因性N−mycの増幅を有するまたは有しない神経芽細胞腫のSAGEライブラリー
SHEP神経芽細胞腫細胞株は内因性N−myc発現がなく、したがって、N−mycトランスフェクト細胞は必ずしもN−myc増幅神経芽細胞腫に対する遺伝的バックグラウンドを代表するものではない。例えば、90%のN−myc増幅神経芽細胞腫は染色体領域1p35−36の欠損が見られず(Caron等、1993年)、SHEP−2およびSHEP−21N細胞は染色体1の2つの明らかなインタクトpアームを有する(データは示さず)。N−mycの識別下流パスウェイがインビボで活性化されるかという問いに取り組むために、我々は2つの神経芽細胞腫のSAGEライブラリーを生成した。神経芽細胞腫腫瘍N159はN−myc増幅および発現があり、神経芽細胞腫N52はN−myc発現のないN−mycシングルコピー腫瘍である(図5B,レーン9および10)。我々は2つのライブラリーの39.598タグを配列決定した。タグ頻度を20,000タグにつき標準化し、比較した。N−mycをN159における16タグおよびN52における0タグにより表した。ライブラリーに差異を付けて発現された(p<0.01)52のタグがある。2つの腫瘍がより多くの観点において恐らく異なっているので、これらの差異はN−mycによりおそらく単に部分的に引き起こされる。我々は、SHEP細胞において識別されたN−myc標的遺伝子について2つの腫瘍におけるN−mycとの関連を解析した。
【0043】
SHEP−21Nにおいて検出された56の有意に(p<0.01)誘導されたリボソーム蛋白質遺伝子が(20,000タグについて)N52における988タグおよびN159における1600タグの合計を生成する。したがって、N−myc増幅N159腫瘍は62%高いリボソーム蛋白質遺伝子発現を有する。N52と比較してN159において少なくとも50%の増加を有する36のタグおよび少なくとも100%の増加を有する22タグがある(図2B)。これらの増加はSHEP−21N細胞におけるよりもより穏やかである(図2Aおよび2Bを比較)が、N−mycがインビボでのリボソーム蛋白質遺伝子発現を誘導することを強く示唆する。蛋白質合成において機能する他の遺伝子はN159において情報制御される。N52と比べてN159において発現が増加することは、ヌクレオホスミン(4〜19.2タグ)、ヌクレオリン(3〜9タグ)、真核生物の翻訳開始因子4A、イソ型1(4〜9タグ)、および翻訳延長因子EEF1a1(50〜96タグ)およびEEF1g(18.4〜32.8タグ)について見られる。解糖および酸化的リン酸化に伴われる遺伝子の誘導は殆どない。5つの代表的な遺伝子の発現レベルを、N159およびN59からの合計RNAを使用したノーザンブロットのハイブリダイゼーションにより確認した(図5Bおよびデータは示さず)。これらの結果から、SHEP−21N細胞において識別したN−myc標的遺伝子の多くの発現レベルがインビボにおけるN−myc増幅および過剰発現に関連することが示される。しかし、このことは全遺伝子については当てはまらず、他の因子がN−myc標的遺伝子の活性を調節することを示唆する。
【0044】
神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおいて解析されるN−myc標的遺伝子発現
神経芽細胞腫のN−myc下流遺伝子の誘導をさらに解析するために、我々は神経芽細胞腫細胞株および腫瘍のパネルにおける発現を調べた。21の神経芽細胞腫細胞株からの全RNAのノーザンブロットのハイブリダイゼーションは、N−myc、ヌクレオリン、ヌクレオホスミン、およびリボソーム蛋白質PPARP0の発現間の不完全ながらもはっきりとした関係を示した(図5A)。細胞株SJNB12はN−myc発現がないが、N−myc標的遺伝子の非常に高い発現を有する。しかし、この細胞株はc−myc増幅および過剰発現を有し(図5A、レーン7およびCheng等1995年)、c−mycがN−mycと同じ標的遺伝子を誘導し得ることを示唆する(以下参照)。
【0045】
細胞株がインビボで神経芽細胞腫腫瘍について完全には代表的ではないので、我々は、アグレシブステージ3および4、およびより弱いアグレシブステージ1、2および4sを有する16の新鮮な神経芽細胞腫を解析した。ノーザンブロット解析により、N−myc、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンの発現間の公正な総合的な関連が示された(図5B)。幾つかの例外はあるが、総合的な結果は、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンがN−myc誘導のインビボにおける標的であることを示唆している。リボソーム蛋白質S6(RPS6)発現は、N−mycとの一貫した関連性が少なく、N−mycおよび他の因子がその発現を調節することを示した。
【0046】
幾つかのN−myc標的遺伝子はc−mycにより誘導されるかまたは抑圧され、さらにN−mycはc−mycと同じプロト−癌遺伝子のファミリーに属する。両方の癌遺伝子は類似の表現型効果を誘導し、幾つかの標的遺伝子を共有するので、我々は、この研究で識別されたN−myc下流標的がc−mycの標的でもあることを解析する。したがって、我々はメラノーマ細胞株IGR39Dおよびこの細胞株のc−mycトランスフェクトクローンを解析した(クローン3、Versteeg等、1988年)。これらの細胞株の全RNAを有するノーザンブロットをSHEP−2およびSHEP−21N細胞について試験した26のプローブをハイブリッドした。さらに、9つの23N−myc誘導標的は、c−mycにより誘導されることがわかる(図6)。これらは、リボゾーム蛋白質遺伝子S12、S27、S19、S6およびヌクレオリン、ヌクレオホスミン、ユビキチン、GAPDHおよびNDUFB4である。N−myc抑制標的の3つについて試験し、c−mycにより抑制されることを見いだした。これらは、オステオネクチン(表1、No.118/123/125)、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター型1(表1、No.112)、および結合組織成長因子(表1、No.127)であった。したがって、c−mycおよびN−mycはここで試験した細胞系においてそれらの標的遺伝子の約46%を共有する。ヌクレオホスミン、ヌクレオリンおよび殆どのリボソーム蛋白質遺伝子がそれらに含まれる。
【0047】
我々は、リボソーム生合成、mRNA翻訳、蛋白質成熟、および蛋白質代謝回転に寄与する86の転写の誘導を発見し、蛋白質合成の増強がN−mycの主な機能であることを示した。我々は、SHEP−2におけるよりもSHEP−21Nにおいて著しく45%高いrRNA含量を見いだした。SHEP−21Nにおいて蛋白質合成の速度の総合的な増加はない。蛋白質合成の仕組みの幾つかの律速成分がSHEP−21N細胞においては誘導されないという1つの解釈がある。N−mycシングルコピー神経芽差異簿腫N52およびN−myc増幅腫瘍N159のSAGEライブラリーは、リボソーム蛋白質遺伝子、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンおよび5つの翻訳開始および延長因子がインビボでN−myc増幅神経芽細胞腫において過剰発現される。37の神経芽細胞腫および神経芽細胞腫細胞株のノーザンブロット解析は、N−myc増幅神経芽細胞腫におけるこれらの遺伝子の誘導をさらに確認した。これらの結果から、myc遺伝子が蛋白質合成の主なレギュレータとして機能することがわかる。このことは、c−mycのホモ接合性不活性化線維芽細胞における蛋白質合成の速度の低下(Mateyak等、1997年)、およびc−mycの活性化の後の線維芽細胞における蛋白質合成の増加(Scmidt等、1999年)と合致する。
【0048】
エネルギー生成、ミトコンドリアおよびアポトーシス
N−myc下流標的遺伝子の2つの他の包括的なセットは、解糖およびミトコンドリア電子伝達およびATP合成経路において関連する。N−myc誘導の主な標的として電子伝達およびATP合成経路の識別は、ミトコンドリア膜貫通型ポテンシャルおよびアポトーシス間の関係に関係する。ミトコンドリアは2つの面を有する:すなわち、これらはファーストサイクリング細胞に対してエネルギーを与え、かつ細胞をアポトーシスに駆り立てることである。同様に、myc癌遺伝子は活発な細胞増殖および大規模なアポトーシスを誘導できる。N−myc発現によりSHEP−21N細胞はアポトーシストリガーに対して感受性となる(Fulda等,1999年;Lutz等、1998年)。アポトーシスにおける多くの重要な出来事はミトコンドリアの膜ポテンシャルに重点をおいている(参照:GreenおよびReed、1998年)。例としては、シトクロームc放出、内膜の過分極、透過性遷移ポアの開口、および反応性酸素種(ROS)の生成である。ミトコンドリア膜における通常の電子伝達の間、1〜5%の電子はさまよって、ROSを生成する。電子伝達経路の中断により、細胞に有害なROSの生成は非常に高められる(Kroemer等、1997年)。N−mycによる電子流れの増強により、電子伝達鎖ブーストROS生成の中断は高まるであろう。さらに、VDACの適度な上方制御(図1)はシトクロームc放出およびアポトーシスを刺激した。したがって、電子伝達遺伝子のN−myc誘導は細胞増殖に対して必要なエネルギーを必然的に供給する。また、これは、ミトコンドリアの死の可能性を増加し、アポトーシスの実行に向かうスケールを起動する。
【0049】
酸化的リン酸化経路に対するタグはN−myc増幅N159腫瘍において過剰発現される。この腫瘍は、N−myc下流経路の一部を妨げる付加的な欠点に対してインビボで選択される。N−mycを発現するSHEP−21N細胞はアポトーシストリガに感受性であり(Lutz等、1998年)、内因性N−mycの過剰発現を有する神経芽細胞腫細胞株はこのようなトリガに不応性である。このことは、これらの細胞株がN−myc下流経路のプロアポトーシスアームに欠点を有することを示す。これがミトコンドリア蛋白質遺伝子の誘導の欠損に関連するかどうかを解析することは興味深い。
【0050】
N−mycおよびc−mycが標的遺伝子を共有する
今日までに、N−mycの2つの標的遺伝子のみが公表され、これらはc−mycの標的でもある(Lutz等、1996年;Eilers等、1991年;Bello−fernadez等、1993年)。我々がノーザンブロットについて試験したN−mycの23の上方制御標的のうち、9つがトランスフェクトメラノーマ細胞でc−mycにより誘導される。我々が試験した下方制御N−myc標的の両方がc−mycによっても下方制御される。N−myc誘導下方制御経路遺伝子は遺伝子の非常に簡単な機能的グループを形成するので、我々はN−mycが蛋白質合成の一般的なスティミュレーターとして機能すると仮定した。c−mycはN−mycのように等しく強力な成長誘導およびトランスフォーミング効果を有するので、c−mycが蛋白質およびATP合成の仕組みをブーストするのに必要な遺伝子のサブセットを単に誘導することを認識するのは困難である。N−mycおよびc−mycが同じ基本的な細胞機能を活性化することはあり得ることである。c−mycは線維芽細胞株の蛋白質合成の誘導に関連する(上記参照)。我々はN−mycによる遺伝子の誘導がその基本的な発現レベルに強く依存することを観察した(図2)。したがって、オリジナルのメラノーマ細胞株における潜在的な標的遺伝子の高発現がc−mycによる誘導を防止したことは可能性がある。
【0051】
これまでに識別された標的遺伝子は非常に少ないので、myc遺伝子の生理学的な役割は謎である。我々は、N−mycまたはN−mycの潜在的な標的(その幾つかはc−mycの標的でもある)である単一遺伝子(unigene)により規定された335遺伝子を識別する351転写タグを説明する。これらの結果から、myc遺伝子は蛋白質合成および細胞エネルギー生成の主なレギュレターとして機能する。この誘導は、正常な増殖細胞においておよび生理学的刺激物より増殖を誘導された細胞において、細胞サイクルのG1期からの遷移強化を媒介することは可能性がある。蛋白質合成についての効果は限定されたセットの標的遺伝子の識別に基づいて先の仮定を確認する(Schmidt,1999年、Mateyak等、1997年、Johnston等、1999年)。電子伝達およびATP合成経路における遺伝子についての刺激性効果は期待されず、強化された蛋白質生成およびG1遷移に対するエネルギー要求に非常に適合し、myc遺伝子の充分に確立されたアポトーシス効果に関係し得る。
【0052】
N−mycにより誘導されまたは抑制されたタグおよび遺伝子のリスト
表1は、我々が、SHEP−2およびSHEP−21N SAGEライブラリーの比較においてN−mycにより有意に(p<0.01)誘導または抑制されたことを発見したタグの全てである。この比較は、SHEP−244,674タグおよびSHEP−21Nの21,559タグに基づく。示されたタグ頻度は10,000タグについて標準化される(コラムSHEP−2およびSHEP−21N)。「オン:オフ比」の欄は、N−mycによるフォールド誘導(正の値)または抑制(負の値)を示す。タグがライブラリーのうち1つにおいてゼロ発現を有する場合は、我々は、タグが完全なライブラリーにおいて一時期存在したことを比の計算に対して仮定する。バイオテクノロジーインフォメーションに対するナショナルセンターの単一遺伝子数(NCBI:USA、ベテスダ)を、「単一遺伝子」の欄に示す。この数は29−3−2000による、NCBI単一遺伝子データベースに基づく。次の欄は、単一遺伝子の記載を示す。さらに、各単一遺伝子クラスターについて、1つまたは2つの遺伝子バンク受入れ番号を示す。幾つかのタグに対して、我々は、2つの可能性のある対応遺伝子を識別した。このことはタグの次の欄におけるアスタリクスにより示す。
【0053】
表2:この表は21,559タグから34,426タグのSHEP−21Nライブラリーの配列を延長した後、SHEP−2およびSHEP−21NのSAGEライブラリー間で有意に(p<0.01)異なることを識別したタグを示す。表は20,000の転写タグについて発現された両方のライブラリーにおける発現レベル(「SHEP−2」および「SHEP−21N」の欄)、Caron等(2001年)により記載されたコンピュータープログラムにより識別された単一遺伝子数、および幾つかの場合には単一遺伝子クラスターに相当するクローンの遺伝子バンク受入れ番号を示す
【0054】
実験手順
細胞株
神経芽細胞腫細胞株および培養条件は前述の通りである(Cheng等、1995年)。メラノーマ細胞株IGR39Dおよびクローン3はVersteeg等(1988年)により記載されている。SHEP細胞株を、10%ウシ胎児血清、4mMLのグルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したRPMI1640培地中に保存した(Lutz等、1996年)。テトラサイクリン(シグマ)を10ng/mlの培地濃度で使用し、N−myc発現を阻害した。
【0055】
SAGEライブラリーの生成
SAGEを、Velculescu等(1995年)の記載に若干の変更を加えて実施した。全RNAをグアニジンチオシアネートにより抽出した(ChromczynskiおよびSacchi,1987年)。ポリ(A)+RNAを、製造者の指示書にしたがって、メッセージメーカー(MessageMaker)キット(Gibco/BRL)を使用して単離した。SAGEライブラリーを、最小限4μgポリ(A)+RNAを使用して生成した。cDNAをスーパースクリプトチョイスシステム(Gibco/BRL)に準じて合成し、NlaIIIで消化し、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ(Dynal)に結合した。BsmFIに対する認識部位を含有するリンカーをcDNAに結合した。cDNAタグを含むリンカータグをBsmFI消化により遊離し、互いに結合し、増幅した。PCR生成物を5分65℃で加熱した後、ポリアクリルアミドゲルで調製的分析(preparative analysis)をした。コンカテマーへの結合の後、第2加熱段階を含み(15分で65℃)、800bp〜1500bpのフラグメントを精製し、pZero−1(インビトロゲン)でクローン化した。コロニーをPCRでM13フォワードアンドリバースプライマーを使用してスクリーニングした。300bpより大きいインサートをBigDyeターミネイターキットで配列決定し、377ABI自動化シーケンサーで解析した(Perkin Elmer)。
【0056】
解析SAGEデータベース
SAGEライブラリーを、SAGE300プログラムソフトウェアパッケージを使用して解析した(Velsculescu等、1997年)。P値をモンテカルロシミュレーションを使用して計算した。転写を、NCBIでキャンサーゲノムアナトミープロジェクトからの「遺伝子マップへのタグ」(SAGEマップ)を有するデータベースにおいてタグの比較により識別した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE)。このデータベースは単一遺伝子クラスターとSAGEタグを繋ぐ(Lal等、1999年)。次に、遺伝子のアサインメントを人手によって不正なタグを生じる配列エラーについておよびハイブリッド単一遺伝子クラスターに基づいて誤った遺伝子アサインメントについてチェックした。他のデータベース解析および特定のプライマー生成については、ウィスコンシンGCGパッケージソフトウェアを使用した。
【0057】
ノーザンブロット解析
全RNA(レーン当たり20μg)を6.7%のホルムアルデヒドの存在下で0.8%のアガロースゲルにより電気泳動し、10×SSC中で(Hybond)N膜においてブロットした。ハイブリダイゼーションを一晩0.5MのNaHPO4、pH7.0、7%SDS、1mMのEDTA中で、65℃にて行った。フィルタを40mMのNaHPO4、1%SDS、65℃で洗浄した。プローブを配列証明されたPCR生成物のランダムプライミングによりラベル化した。RT−PCR反応において使用された全プライマーの完全なリストは請求することにより利用可能である。
【0058】
全蛋白質含量
指数関数的に成長する細胞をハーベストし、細胞数をクールターカウンターを使用して決定した。細胞(1×106)を20mMのトリスHCl(pH8.0)、137mMのNaCl、10%のグリセロール、1%のNP40およびプロテアーゼ阻害剤(プロテアーゼカクテル、ロシュ)溶解した。サンプルをバイオラド蛋白質アッセイで検定した。アッセイを少なくとも2回行った。
【0059】
ウェスタンブロット
細胞溶解物をSDSポリアクリルアミドで分離し、イモビロン−Pトランスファ膜でエレクトロブロットした(Millipore)。膜のブロッキングおよび抗体とのインキュベーションは標準的な手順を伴った。蛋白質を、ECL検出シツテムを使用して可視化した(Amersham)。抗−ヌクレオホスミンモノクローナル抗体はP.K.Chan博士から贈呈を受けた(ベイラー医科大学)。ヌクレオリンに抗する抗体はP.Bouvet博士から贈呈された(フランス、ツールーズ、CNRS,IPBS)。抗−N−mycをPharmIngenから得た(クローンB8.4.B)。
【0060】
全rRNA含量
1×106の指数関数的に成長する細胞の全rRNAをグアニジンイソチオシアネート(ChromczynskiおよびSacchi,1987年)により抽出し、分光光度計で定量した。細胞株SHEP−2およびSHEP−21Nのそれぞれの10の単離の結果は、スチューデントt検定で独立したサンプルについて統計的に解析した。パーセルベースについてのアリコートをアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色した。rRNAバンドの関連する蛍光をコダックデジタルサイエンス1Dイメージ解析ソフトウェアパッケージを使用して定量した(EDAS120)。
【0061】
リファレンス
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1】N−myc下流標的遺伝子のノーザンブロット分析。指数関数的に成長するSHEP−2およびSHEP−21N細胞からの全RNAの等量をロードした。ノーザンブロットを23の指示N−myc標的についてのプローブと共にハイブリッドした。
【図2】SHEP−21N細胞におけるN−myc標的(p<0.01)として指示された56のリボソーム蛋白質遺伝子の誘導レベル。A.SHEP−2における基本発現レベルのファンクションとしてのSHEP−21NにおけるN−mycによるフォールド誘導。X−座標:10,000タグあたり標準化されたSHEP−2における基本発現レベル。Y−座標:SHEP−21Nにおけるフォールド誘導。B.N−mycシングルコピー神経芽線維細胞腫N52における基本発現レベルのファンクションと同じN−myc増幅神経芽細胞腫N159における56のリボゾーム蛋白質遺伝子の増加。X座標:10,000タグあたり標準化されたN52における発現レベル。Y座標:N52に対比したN159におけるフォールド増加。
【図3】SHEP−21N細胞におけるN−mycおよび下流標的遺伝子誘導の経時的解析。SHEP−21N細胞を24時間10ng/mlのテトラサイクリンで処理し、洗浄し、テトラサイクリンの不存在下でさらに36時間成長させた。細胞を、テトラサイクリン処理の0時間、8時間、24時間にてハーベストした。次のサンプルを前記抗生物質除去後、1時間、2時間、4時間、8時間、10時間、12時間、24時間、36時間にて採取した。A:示された時間ポイントにおける全RNAのノーザンブロット解析。B:示された時間ポイントにおけるN−myc蛋白質のウェスタンブロット解析。経時的実験の全蛋白質サンプルのうち10mgを10%のSDS−PAGEゲルで分画し、イモビロン膜でブロットし、モノクローナル抗−N−myc抗体でプローブした。
【図4】ヌクレオリンおよびヌクレオホスミン蛋白質発現並びにSHEP−2およびSHEP−21Nの全RNA量。A:ヌクレオリン、N−MYCおよびヌクレオホスミン蛋白質発現のウェスタンブロット解析。全細胞抽出物(10μg)をアクリルアミドゲルで分画し、ブロットし、ヌクレオリンに対するポリクローナル抗体(上方のパネル)およびN−mycに対するモノクローナル抗体(中間のパネル)およびヌクレオホスミン(下方パネル)でプローブした。コントロール細胞株IMR32およびSK−N−FIはN−myc、ヌクレオリンおよびヌクレオホスミンのそれぞれ高い発現と低い発現を有する。B:SHEP−2およびSHEP−21Nの全RNA量。RANを、各細胞株106細胞の10のサンプルから単離し、分光写真で分析した。エラーバーはS.D.を示す。
【図5】神経芽細胞腫細胞株および腫瘍からの全RNAのノーザンブロット解析。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。RNA定量化を臭化エチジウム染色により確認した。28Sバンドを示した。A:21の神経芽細胞腫細胞株のパネル。B:フレッシュな腫瘍のパネル。レーン1−9における腫瘍は増幅されたN−mycである。
【図6】c−myc形質移入メラノーマ細胞株におけるN−myc標的遺伝子の誘導のノーザンブロット解析。クローン3はIGR39Dメラノーマ細胞株のc−myc形質移入クローンである。IGR39Dおよびクローン3の全RNAの等量をロードした。フィルタを示されたプローブでハイブリッドした。
Claims (15)
- 成長、浸潤、拡散のような癌の腫瘍特性を本質的にサポートできるmyc依存性下流遺伝子またはその機能的フラグメントを含んで構成される核酸ライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子は、表1または表2に示すタグ配列に本質的に等価な核酸をそれぞれ含んで構成される、請求項1記載のライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子がリボソーム蛋白質をコード化する、請求項1または2記載のライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子が蛋白質合成に関連する蛋白質をコード化する、請求項1または2記載のライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子が転移に関連する蛋白質をコード化する、請求項1または2記載のライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子が解糖酵素をコード化する、請求項1または2記載のライブラリー。
- 前記myc依存性下流遺伝子がミトコンドリア機能性蛋白質をコード化する、請求項1または2記載のライブラリー。
- 前記癌の本質的な腫瘍特性をサポートできるmyc依存性下流遺伝子を調節することを含んで構成される癌の治療法。
- 前記myc依存性下流遺伝子が表1または表2に示されるようなタグ配列に機能的に等価な核酸を含んで構成される、請求項8記載の方法。
- 前記癌がmyc発現腫瘍細胞を含んで構成される、請求項8または9記載の方法。
- mycがN−mycである、請求項8〜10のうちいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が神経芽細胞腫を含んで構成される、請求項11記載の方法。
- 前記癌の本質的な腫瘍特性をサポートできるmyc依存性下流遺伝子またはそれに由来する遺伝子生成物の相対的な有無を検出することを含んで構成される癌の診断法。
- 内因性または形質移入されたmyc遺伝子の、高発現性を有する蛋白質生成系を含んで構成される組換え蛋白質の生成を強化する方法。
- 転写物および/または蛋白質のn−mycまたはn−myc誘導モジュレーションに干渉できる物質を識別する方法であって、n−myc活性を有する細胞またはn−myc活性をコード化する核酸を供給すること、および前記物質の存在下で前記転写物および/または蛋白質のモジュレーションを決定すること、を含んで構成される方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00201698A EP1156109A1 (en) | 2000-05-11 | 2000-05-11 | MYC targets |
EP00202284 | 2000-06-29 | ||
PCT/NL2001/000361 WO2001085941A2 (en) | 2000-05-11 | 2001-05-11 | Myc targets |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004500846A true JP2004500846A (ja) | 2004-01-15 |
Family
ID=26072227
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001582530A Pending JP2004500846A (ja) | 2000-05-11 | 2001-05-11 | Myc標的 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040033932A1 (ja) |
EP (1) | EP1287128A2 (ja) |
JP (1) | JP2004500846A (ja) |
AU (1) | AU2001256865A1 (ja) |
CA (1) | CA2408840A1 (ja) |
WO (1) | WO2001085941A2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9080171B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-07-14 | RXi Parmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering RNAi compounds |
US9095504B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-08-04 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in ocular indications |
US9340786B2 (en) | 2010-03-24 | 2016-05-17 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in dermal and fibrotic indications |
US10934550B2 (en) | 2013-12-02 | 2021-03-02 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Immunotherapy of cancer |
US11279934B2 (en) | 2014-04-28 | 2022-03-22 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6965025B2 (en) | 2001-12-10 | 2005-11-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of connective tissue growth factor expression |
JP5283265B2 (ja) | 2005-09-30 | 2013-09-04 | アンチキャンサー インコーポレーテッド | ヒトの早期癌、癌の進行および再発のマーカーの同定方法 |
US8946172B2 (en) | 2008-08-25 | 2015-02-03 | Excaliard Pharmaceuticals, Inc. | Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF |
MX2011002143A (es) | 2008-08-25 | 2011-07-20 | Excaliard Pharmaceuticals Inc | Oligonucleotidos antisentido dirigidos contra el factor de crecimiento del tejido conectivo y usos de los mismos. |
MX365647B (es) | 2011-02-02 | 2019-06-10 | Excaliard Pharmaceuticals Inc | El uso de compuestos antisentido dirigidos al factor de crecimiento del tejido conectivo (ctgf) para tratar queloides o cicatrices hipertroficas. |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5840484A (en) * | 1992-07-17 | 1998-11-24 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
US6303297B1 (en) * | 1992-07-17 | 2001-10-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Database for storage and analysis of full-length sequences |
US6114114A (en) * | 1992-07-17 | 2000-09-05 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
-
2001
- 2001-05-11 JP JP2001582530A patent/JP2004500846A/ja active Pending
- 2001-05-11 EP EP01930324A patent/EP1287128A2/en not_active Withdrawn
- 2001-05-11 CA CA002408840A patent/CA2408840A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-11 AU AU2001256865A patent/AU2001256865A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-11 WO PCT/NL2001/000361 patent/WO2001085941A2/en not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-11-12 US US10/293,222 patent/US20040033932A1/en not_active Abandoned
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9080171B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-07-14 | RXi Parmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering RNAi compounds |
US9095504B2 (en) | 2010-03-24 | 2015-08-04 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in ocular indications |
US9340786B2 (en) | 2010-03-24 | 2016-05-17 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in dermal and fibrotic indications |
US9963702B2 (en) | 2010-03-24 | 2018-05-08 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | RNA interference in dermal and fibrotic indications |
US10184124B2 (en) | 2010-03-24 | 2019-01-22 | Phio Pharmaceuticals Corp. | RNA interference in ocular indications |
US10240149B2 (en) | 2010-03-24 | 2019-03-26 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Reduced size self-delivering RNAi compounds |
US10662430B2 (en) | 2010-03-24 | 2020-05-26 | Phio Pharmaceuticals Corp. | RNA interference in ocular indications |
US10913948B2 (en) | 2010-03-24 | 2021-02-09 | Phio Pharmaceuticals Corp. | RNA interference in dermal and fibrotic indications |
US11118178B2 (en) | 2010-03-24 | 2021-09-14 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Reduced size self-delivering RNAI compounds |
US11584933B2 (en) | 2010-03-24 | 2023-02-21 | Phio Pharmaceuticals Corp. | RNA interference in ocular indications |
US10934550B2 (en) | 2013-12-02 | 2021-03-02 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Immunotherapy of cancer |
US11279934B2 (en) | 2014-04-28 | 2022-03-22 | Phio Pharmaceuticals Corp. | Methods for treating cancer using nucleic acids targeting MDM2 or MYCN |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2408840A1 (en) | 2001-11-15 |
EP1287128A2 (en) | 2003-03-05 |
WO2001085941A2 (en) | 2001-11-15 |
WO2001085941A3 (en) | 2002-06-20 |
AU2001256865A1 (en) | 2001-11-20 |
WO2001085941A9 (en) | 2003-01-16 |
US20040033932A1 (en) | 2004-02-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fèvre-Montange et al. | Microarray analysis reveals differential gene expression patterns in tumors of the pineal region | |
Jing et al. | Tazarotene-induced gene 1 (TIG1) expression in prostate carcinomas and its relationship to tumorigenicity | |
Ngan et al. | A germline mutation (A339V) in thyroid transcription factor-1 (TITF-1/NKX2. 1) in patients with multinodular goiter and papillary thyroid carcinoma | |
Wolvetang et al. | ETS2 overexpression in transgenic models and in Down syndrome predisposes to apoptosis via the p53 pathway | |
Guerrini-Rousseau et al. | Germline SUFU mutation carriers and medulloblastoma: clinical characteristics, cancer risk, and prognosis | |
Soucek et al. | Role of the tuberous sclerosis gene-2 product in cell cycle control: loss of the tuberous sclerosis gene-2 induces quiescent cells to enter S phase | |
Gutmann et al. | Loss of DAL-1, a protein 4.1-related tumor suppressor, is an important early event in the pathogenesis of meningiomas | |
Wu et al. | Transforming activity of MECT1‐MAML2 fusion oncoprotein is mediated by constitutive CREB activation | |
Papin et al. | Alternative splicing at the MEFV locus involved in familial Mediterranean fever regulates translocation of the marenostrin/pyrin protein to the nucleus | |
CA2500470A1 (en) | Method for diagnosing chronic myeloid leukemia | |
US8236772B2 (en) | Methods of modulating angiogenesis and screening compounds for activity in modulating angiogenesis | |
Miettinen et al. | CDKN2/p16 predicts survival in oligodendrogliomas: comparison with astrocytomas | |
JP2004500846A (ja) | Myc標的 | |
Mourtada-Maarabouni et al. | Functional expression cloning reveals a central role for the receptor for activated protein kinase C 1 (RACK1) in T cell apoptosis | |
Ren et al. | The p44S10 locus, encoding a subunit of the proteasome regulatory particle, is amplified during progression of cutaneous malignant melanoma | |
US7776519B2 (en) | Use of the slug gene, or of the transcription or expression products thereof in the detection and/or treatment of cancerous cells | |
Wang et al. | Expression of the apoptosis-suppressing gene BCL-2 in pheochromocytoma is associated with the expression of C-MYC | |
WO2001002828A2 (en) | Diagnosis of cancer by detecting ash2 polypeptides or polynucleotides | |
JP3507512B2 (ja) | 熱ショック蛋白質の発現誘導制御物質のスクリーニング方法 | |
Carrington et al. | Overexpression of murine WT1+/+ and−/− isoforms has no effect on chemoresistance but delays differentiation in the K562 leukemia cell line | |
EP1156109A1 (en) | MYC targets | |
Yang et al. | Leukocyte common-antigen-related tyrosine phosphatase receptor: altered expression of mRNA and protein in the New England Deaconess Hospital rat line exhibiting spontaneous pheochromocytoma | |
Galmarini et al. | A p21/WAF1 mutation favors the appearance of drug resistance to paclitaxel in human noncancerous epithelial mammary cells | |
JP2004057003A (ja) | Rb1遺伝子誘導蛋白質(rb1cc1)及び遺伝子 | |
JP5209699B2 (ja) | 胃癌遺伝子ZNF312b、該遺伝子から翻訳されるタンパク質、ならびに診断キット及び該タンパク質を使用する抗癌剤スクリーニング方法 |