CN111727260A

CN111727260A - 中间型单核细胞在制备诊断和预测ad药物中的应用

Info

Publication number: CN111727260A
Application number: CN201980011391.8A
Authority: CN
Inventors: 戴正乾; 顾柏俊; 黄欣
Original assignee: Hunan Qiankang Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Qiankang Technology Co ltd
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2020-09-29
Also published as: WO2021072650A1

Abstract

一种中间型单核细胞在制备诊断和预测AD药物中的应用。

Description

中间型单核细胞在制备诊断和预测AD药物中的应用

技术领域

本发明涉及中间型单核细胞在制备诊断和预测AD药物中的应用。

背景技术

迟发型阿尔兹海默病的特征是大脑中β淀粉样肽(Aβ)的沉积与积累，而免疫系统的缺陷被认为是导致这种积累的原因，因为人单核细胞已被证实无法有效清除β淀粉样肽Aβ。这其中具体的机制尚未明确，但全基因组关联分析研究强烈表明在神经小胶质细胞通道中这项机制可改变细胞吞噬/内吞作用。中间型单核细胞是指人体中CD14阳性CD16阳性(CD14+CD16+)的一种单核细胞亚型，人体中“中间型单核细胞”是一样的。

发明内容

本发明研究表明，在迟发型老年痴呆病人的单核细胞中可呈现基础细胞的紊乱及受刺激的先天吞噬作用。在血液循环中，单核细胞的一个亚型(CD14+CD16+)携带了大量的β-淀粉样蛋白多肽(Aβ)并表达细胞迁移受体(CX3CR1 and CCR2)。在人脑脊液和大脑中同样也发现这种单核细胞亚型作为主要的渗透细胞类型。在一共165名澳大利亚影像、生物标记与生活方式研究组织机构(AIBL)的志愿者的协助下，通过对单核细胞表面的β-淀粉样肽(Aβ)定量测定，申请人发现在阿尔兹海默患者体内单核细胞对β-淀粉样肽的吞噬作用下降了26％。将为更好地了解阿尔兹海默疾病机制打开新大门，并可能引导全新的治疗方向的发展，以便预防阿尔兹海默症。

Aβ淀粉样肽在大脑中的聚集是老年痴呆病症的一个主要病理特征。而Aβ聚集体具有很强的神经毒性，一般认为是导致老年痴呆的罪魁祸首。而导致Aβ淀粉样肽聚集的一个重要原因就是人体的天然吞噬能力随着老年化逐步降低，不能有效地清除Aβ淀粉样肽和其它的变性蛋白。我们发现外周血中有一类单核细胞的亚群-中间型单核细胞，是人体清除Aβ淀粉样肽的生力军。老年痴呆病人的此类细胞粘附Aβ淀粉样肽的能力比同龄的健康对照下降了近1/4.通过和正常区间值的比对，以及多次随访(2-3次，每次间隔18个月)，我们可以早期诊断老年痴呆并预测疾病的进程。

因此，可将中间型单核细胞用于制备诊断和预测AD药物，且中间型单核细胞是作为β淀粉样肽的清除剂用于制备诊断和预测AD药物。

附图说明

图1：外周血单核细胞表面的β淀粉样肽；

图2：在阿尔兹海默患者中单核细胞吞噬β淀粉样肽功能降低；

图3：在阿尔兹海默症情况下中间单核细胞对β淀粉样肽吞噬能力降低；

图4：在阿尔兹海默症情况下非典型单核细胞对β淀粉样肽吞噬能力降低；

图5：在阿尔兹海默症情况下典型单核细胞对β淀粉样肽吞噬能力降低；

图6：对β淀粉样肽的细胞吞噬能力试验；

图7：渗透入脑脊液的单核细胞；

图8：Aβ⁺⁺单核细胞对YO乳胶微球的吞噬作用；

图9：Aβ⁺⁺单核细胞表型；

图10：神经心理学测试的关联性；

图11：ROC曲线(受试者工作特征曲线)；

图12：外周免疫细胞重组脑β淀粉样肽。

具体实施方式

1外周血单核细胞表面的β淀粉样肽

无论单核细胞浸入中枢神经系统是否是β淀粉样肽(Aβ)清除的普遍机制，这都确保了进一步的研究。即便没有供单核细胞从外周血入脑的通道，单核细胞对β淀粉样肽(Aβ)吞噬作用的改变也可能提供了一个镜像来说明一个人生命周期中脑内源性小神经胶质细胞的变化。在此项研究中，我们通过使用单克隆抗体法和流式细胞仪，在澳大利亚成像、生物标记和生活方式研究组织(ALBL)共165名志愿者(84名认知水平正常CN，41名轻度认知障碍患者MCI和40名老年痴呆症患者AD，均为白种人)的帮助下，量化了单核细胞的β淀粉样肽(Aβ)(图.1a和e)。结果表明，外周单核细胞捕获内源性β淀粉样肽(Aβ)(图.1d)，小部分单核细胞携带大量β淀粉样肽(Aβ)，通过CD14和CD16染色证明这些是中间单核细胞(图.1d和h，包绕)。淋巴细胞和中性粒细胞可携带微量的β淀粉样肽(Aβ)(图.1b和c)。非典型和典型单核细胞携少量β淀粉样肽(Aβ)(图.1f和g)。

2在阿尔兹海默患者中，单核细胞吞噬β淀粉样肽功能降低

我们首先检测了总单核细胞。β淀粉样肽(Aβ)荧光强度试验，Aβ⁺细胞百分比(荧光强度在10²到10^3.6之间)，Aβ⁺⁺细胞百分比(荧光强度在10^3.6到10⁴之间),通过三种方法进行比较。方法1-单纯临床分类，方法2-β淀粉样肽(Aβ)正电子断层扫描小脑标准化摄取率(SUVR)BecKet评分以及方法3，β淀粉样肽(Aβ)脑沉积(摄取率比值SUVR增量/年)。结果发现，阿尔兹海默症患者的Aβ荧光强度降低了26.21％(图.2a方法1平均值认知正常者294.62±16.96，轻度认知障碍者224.31±21.73，以及阿尔兹海默患者217.41±18.87，方差分析P＝0.0049，杜凯式检定Tukey test，阿尔兹海默患者比对认知正常者P＝0.0096，轻度认知障碍者对比认知正常者P＝0.0223；方法2r＝-0.1974,P＝0.0261；方法3r＝-0.2127,P＝0.0430)，同时，阿尔兹海默症患者的Aβ⁺⁺细胞百分含量降低43.15％(图.2g方法1得平均值认知水平正常者1.28±0.12％，轻度认知障碍者0.83±0.14％，而阿尔兹海默患者0.73±0.14％，方差分析P＝0.0068，杜凯式检定Tukey test，阿尔兹海默患者比对认知正常者P＝0.0089，轻度认知障碍者对比认知正常者P＝0.0425；图.2h方法2r＝-0.1793,P＝0.0437；图.2i方法3r＝-0.2392,P＝0.0224)。而Aβ⁺细胞百分比含量则没什么变化(图.2d-f)。

之后我们用CD14和CD16来分类单核细胞集。通过对中间单核细胞群的观测，阿尔兹海默症可使Aβ荧光强度下降(图.3a方法1示方差分析P＝0.0353[轻度认知障碍人群对比认知正常者]；图.3c方法3示r＝-0.2682,P＝0.0336)，Aβ⁺⁺细胞百分含量(图3i方法3示r＝-0.2694,P＝0.0328)。(图.3d-f).在中间单核细胞群中，Aβ⁺细胞百分比含量没有变化(图.3d-f)。非典型单核细胞里，阿尔兹海默症使Aβ荧光强度降低(图.4c方法3示r＝-0.2623,P＝0.0378)，Aβ⁺⁺细胞百分含量(图.4i方法3示r＝-0.2569,P＝0.0421)。而阿尔兹海默症能增加非典型单核细胞的Aβ⁺细胞百分含量(图.4d方法1示方差分析P＝0.0260,杜凯式检定Tukey test阿尔兹海默患者对比认知正常人群P＝0.0146)。典型单核细胞中，阿尔兹海默降低Aβ荧光强度(图.5b方法2示r＝-0.2084P＝0.0427；图5c方法3示r＝-0.315,P＝0.0119)，Aβ⁺⁺细胞百分含量(图.5h方法2示r＝-0.2156,P＝0.0358)。中间单核细胞群中，Aβ⁺细胞百分比含量没有变化(图.5d-f)。

综上所述，我们发现相较总单核细胞，单核细胞子集的参数与患病情况的相关性更弱，可能是由于小细胞数量中间与非典型细胞的偏差所导致的。在此，我们选择了总单核细胞的两个参数，即Aβ荧光强度和Aβ⁺⁺细胞百分含量，通过使用多种神经心理学估量测试，即MMSE评分，CDR评分和临床前阿尔兹海默症复合认知(PACC)来进行额外辅助分析。(Suppl.Fig.1d r＝-0.2482,P＝0.0035).研究发现，Aβ荧光强度与PACC结果呈正相关(补充，图.1m r＝0.3200,P＝0.0005)，但其又与CDR评分结果负相关(图.10n r＝0.3412,P＝0.0002)。Aβ⁺⁺细胞百分含量与MMSE评分正相关(图.10br＝0.1858,P＝0.0297)，也与PACC结果正相关(＝图.10n r＝0.3412,P＝0.0002)，而与CDR评分结果负相关(图.10d r＝-0.2482,P＝0.0035)。

3淀粉样肽细胞表面结合测试

我们用免疫氟化化学和流式细胞术(CN n＝6)做了两个体外β淀粉样肽细胞吞噬试验。首先，比较淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞对β淀粉样肽的细胞吞噬作用(图.6a)。从中发现，单核细胞吸收了大量的外源性β淀粉样肽(比较经二甲基亚砜DMSO处理的假模组与调控组，杜凯式检定Tukey test示P<0.0001)，而单核细胞是人体白细胞中负责对β淀粉样肽起作用的主要吞噬细胞(相较淋巴细胞与中性粒细胞，方差分析P<0.0001)。其次，我们将单核细胞分成三个子集，即典型单核细胞(CD14+CD16-)，中间型单核细胞(CD14+CD16+)，以及非典型单核细胞(CD14-CD16+)，并对它们对β淀粉样肽的吞噬作用进行比较(图.6b)。结果可见中间单核细胞与非典型单核细胞均可吸收外源β淀粉样肽(比较假模组与调控组，杜凯式检定Tukey test分别示P<0.0001和P＝0.0033)，其中中间单核细胞在三个子集中吞噬能力最强(方差分析P<0.0001)。

4脑脊液中细胞特性

外周免疫细胞在多大程度上参与了阿尔兹海默症核心病理改变尚未被完全了解，但积累的数据表明我们可能低估了它们的重要性。在这项研究中，我们做了一个试点研究来显示人脑脊液中渗透的外周免疫细胞(n＝8)。浓缩10ml脑脊液样本，通过单克隆抗体法和流式细胞术来检测细胞类型和细胞表面的β淀粉样肽。在三份人脑脊液样本中我们都发现了少量的渗透的外周免疫细胞(CD45+)，即每毫升脑脊液中含317.00±84.30的淋巴细胞和74.30±19.60的单核细胞(图.7a和b)。并未在脑脊液中发现中性粒细胞(CD45+CD15+细胞计数为1.67±1.53)。单核细胞是由CD14及CD16来分类子集的，令人惊讶的是中间型单核细胞是存在于脑脊液的主要单核细胞子集，多达70.2±11.8％，而非典型和典型单核细胞仅分别有7.78±6.14％和1.41±0.37％(图.7c)。在外周静脉血中我们发现，中间单核细胞和典型单核细胞占总单核细胞的比例分别为6.30±3.87％和49.60±15.26％(n＝165)。换言之，中间型单核细胞和典型单核细胞在外周血及脑脊液中的比例是相反的。我们进一步研究了脑脊液中单核细胞趋化受体CX3CR1和CCR2的表达水平。研究发现，脑脊液单核细胞表达CX3CR1+(92.23.61％)而54.85.53％的细胞也表达了CCR2(图.7d)。这表示CX3CE1可能在帮助外周单核细胞进入脑脊液中发挥作用。此外，Lin-1、HLA-DR(MHC-II细胞表面标记)、CD11B和CD11C用来描述单核细胞的特征，研究发现77.207.94％的脑脊液单核细胞表现为HLA-DR和Lin-1双阳性(图.7e)而88.60±6.53％的脑脊液单核细胞表现为CD11B和CD11C双阳性(图.7f)。最后我们研究了脑脊液单核细胞的内源性β淀粉样肽。技术上来说，收集这许多细胞是非常困难的，但看起来单核细胞携带着大量的β淀粉样肽(图.7g)。

5与Aβ^+/-,Aβ⁺和Aβ⁺⁺单核细胞相关的吞噬功能

我们首先通过实时流式细胞法检测了Aβ⁺⁺单核细胞吞噬YO乳胶微球的能力。研究表明Aβ⁺⁺单核细胞对微珠具有最强的吞噬能力(图.8)。

Aβ⁺⁺单核细胞特征

随之我们运用单克隆抗体检测了Aβ⁺⁺单核细胞。研究发现Aβ⁺⁺单核细胞组成有Lin-1⁺(因此并不是树状细胞)和HLA-DR⁺(MHC-II)(图.9a和b)。它们表达趋化受体,CX3CR1和CCR2(图.9c和d)，少部分表达CD68(图.9e)。它们可表达多种β受体蛋白，例如CD85A及D受体(图.9f和g)还有低密度脂蛋白受体CD91(图.9h)。可以表达多种补体受体，比如CD11B(图.9i)，CD11C(图.9j)和CD35(CR1图.9k)。同时还能表达多种清除剂受体例如酪氨酸蛋白激酶Mer受体(MerTK图.13l)，P2X7(图.9m)和CD163(图.9n)。

6单核细胞上的β淀粉样肽可能具有作为生物标记的诊断价值

我们预设用阿尔兹海默症含的血浆β淀粉样肽(Aβ)作为生物标记。然而，这与已发表过的阿尔兹海默症与血浆β淀粉样肽(Aβ)相关性结果相矛盾，并且血浆β淀粉样肽(Aβ)的测量比脑脊液血浆β淀粉样肽(Aβ)变量影响更多更大。从技术上来说，用流式细胞术(FACS)测量白细胞中的β淀粉样肽(Aβ)会更简单，重复性也更好。我们试图研究β淀粉样肽(Aβ)是否具有预警脑β淀粉样肽(Aβ)负荷状况的诊断价值。大脑β淀粉样肽(Aβ)负荷状况被用二进制表示，0代表AβPET评分<1.4而1代表AβPET评分>1.4。第一项预计变量是参与者的人口资料比如年龄，性别，载脂蛋白E基因型和受教育年限，并导致曲线下面积(AUC)为0.706和95％置信区间为0.574-0.837(图.11)。随年龄和载脂蛋白E被确认是致阿尔兹海默症的危险因素，受教育年限是阿尔兹海默症的预防因素，这项变量考评比随机几率0.5(图.11)要好。第二项测试的预计变量为人口统计数据与MMSE评分和CDR评分的合并考虑(图.11)，其使AUC值增加到0.767(95％置信区间0.654-0.880)。第三项预测变量为人口统计资料，MMSE评分，CDR评分及2个生物标记即β淀粉样肽(Aβ)荧光强度和Aβ⁺⁺细胞占总单核细胞的百分比(图.11)，其使AUC值小幅增加到0.783(95％置信区间0.675-0.892)。最终的预测变量是人口统计资料，MMSE评分，CDR评分及4个生物标记,即进一步增加了典型单核细胞及中间单核细胞分别占总单核细胞的百分比(图.11)，其使AUC值增加到0.824(95％置信区间为0.725-0.924)，而最优阈值为0.585，灵敏度是0.744，特异性为0.852。

7为解决阿尔兹海默症问题寻求新方法

人类大脑被认为具有“免役特权”，即由于血脑屏障，外周免疫细胞禁止进入大脑，也因此，外周免疫细胞脱离了免疫监控。我们知道这样的说法并不完全正确，因为小胶质细胞作为大脑中的主要免疫细胞便能一致作用于中枢免疫防御。然而，我们并不知道在神经退行性病变疾病如阿尔兹海默症中，外周免疫细胞在多大程度上参与了中枢免疫防御。这项研究首先探查了人白细胞对β淀粉样肽(Aβ)的吞噬能力并确定了中间单核细胞起吞噬外周β淀粉样肽(Aβ)的主要作用。其次，研究发现中间单核细胞是存在于脑脊液中的主要子集，其渗透脑实质并携带大量β淀粉样肽(Aβ)。最后，通过对165名志愿者单核细胞β淀粉样肽(Aβ)的研究，我们发现在阿尔兹海默症中单核细胞吞噬β淀粉样肽(Aβ)能力下降。通过这项新方法显示，我们对阿尔兹海默症背后的致病机理有了更好的了解，并可能由此引导出新型治疗方法与目标来预防阿尔兹海默症。

8在阿尔兹海默症中β淀粉样肽(Aβ)吞噬效果下降。

阿尔兹海默症状态下β淀粉样肽(Aβ)荧光强度降低要归咎于总单核细胞中Aβ⁺⁺细胞百分含量减少。无论Aβ⁺⁺细胞百分含量的减少是由于β淀粉样肽(Aβ)吞噬能力的衰弱还是因为中间单核细胞占总单核细胞的比例减少或是两者兼有，这都值得质疑。不管哪一种假象是正确的，都表明了阿尔兹海默症中外周β淀粉样肽(Aβ)被吞噬能力受损的状况，这可能反映了在衰老过程中脑内内源性小胶质细胞的变化。有趣的是，在阿尔兹海默症患者体内中间型单核细胞占总单核细胞的比例下降了。对此有个恰当的解释是，中间型单核细胞具有高度流动性，它们由于阿尔兹海默症病理改变带来的化学趋化因子作用下进入到中枢神经系统中。但我们仍不知道这样的解释是否正确。事实上，阿尔兹海默症受试者的单核细胞可能比健康受试者的单核细胞更易受到细胞凋亡的影响，这一点很明显由我们之前的研究发现表明，人单核细胞中β淀粉样肽(Aβ)的合成可以诱导不可逆的细胞毒性产生。迁移率或死亡率的增加要求更快的周转率，这与发现老年人骨髓造血偏差的结果是一致的，骨髓PU.1靶位基因网受抑与阿尔兹海默症的迟发有关。

9细胞通过血脑屏障

在阿尔兹海默症情况下，外周白细胞是否能渗透入脑是存在争议的。然而，根据最新的老鼠嵌合体试验研究，阿尔兹海默症发病机理中外周固有免疫系统的重要性已经更新。目前研究表明，Aβ⁺⁺单核细胞拥有趋化受体CX3CR1和CCR2，还拥有淀粉纤维化受体CD85A/D及低密度脂蛋白受体CD91,这可能对交叉血脑屏障运输和含神经毒性的β淀粉样肽(Aβ)沉积在患阿尔兹海默症的大脑中有针对性的转移很重要。由研究结果可得，假设外周单核细胞尤其是中间单核细胞，可能渗透进入阿尔兹海默患者的中枢神经系统，这些外周免疫细胞发挥对β淀粉样肽(Aβ)的吞噬作用。尤其在我们的脑脊液捐献者平均年龄在77岁时，这假设可能是正确的。不能确定的是这些负载β淀粉样肽(Aβ)的单核细胞是留在中枢神经系统或是回到外周血中。但我们有一个来自于APP/PS1小鼠(20月龄)实验研究的证据表明有一部分负载β淀粉样肽(Aβ)的单核细胞会回到外周循环中去(图.12)。

Claims

1.中间型单核细胞在制备诊断和预测AD药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中间型单核细胞是作为β淀粉样肽的清除剂用于诊断和预测AD药物的制备中。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述中间型单核细胞为中间型单核细胞亚型CD14和/或中间型单核细胞亚型CD16。