CN106620718B - PF-127-miRNA-615 agomir复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

PF-127-miRNA-615 agomir复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物及其制备方法和应用，其中PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物是由Pluronic F‑127水凝胶包裹miRNA‑615 agomir而成。本发明提供了可负载miRNA‑615 agomir并能填充损伤裂隙的运载体，实现miRNA‑615 agomir的精确递送和局部缓释并能够为神经轴突的生长提供三维空间和力学支撑性能。因此，该PF‑127‑miRNA‑615 agomir复合物能够有力促进臂丛神经根性撕脱的神经再生修复，为中枢和外周神经损伤提供治疗新途径。

Description

PF-127-miRNA-615 agomir复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种PF-127-miRNA-615agomir复合物及其制备方法和应用。
背景技术
臂丛神经撕脱(Brachial Plexus Avulsion,BPA)是一种常见的致残性外科创伤，尤其是全臂丛神经根性撕脱，致残率高、疗效不佳、预后差。随着家庭机动车辆和现代交通物流的不断发展，臂丛损伤的发病率逐年增加，其最常见的病因为交通意外和新生儿难产所造成的牵拉性损伤。神经根由中枢部分和外周部分组成，二者的交界部分称为“过渡区”(transitional zone,TZ)。臂丛撕脱是神经根与脊髓在TZ区发生的物理性断离，不仅引起外周神经断裂，还导致相应脊髓节段神经元严重损伤和大量死亡，神经轴突断裂、突触结构破坏、神经网络中断等，造成受损神经对应皮节的感觉丧失及所支配上肢肌肉瘫痪。为了恢复神经通路和运动功能，受损神经元必须存活和再生轴突，并外向延伸穿过TZ瘢痕，重新进入外周神经干并与所支配肌肉重建突触联系。虽然通过神经外科再植术能使部分运动神经元存活并获得一定的轴突再生，但由于局部病理微环境的抑制作用，胶质瘢痕形成，以及轴突再生能力极其有限等原因，神经再生和运动功能恢复的效果并不令人满意。因此，臂丛神经根性撕脱治疗的关键问题在于如何改善损伤局部的抑制性病理微环境，有效促进神经轴突的再生修复与外向延伸，以恢复过渡区神经联系的延续性，重建突触联系，改善肢体的运动功能。
相关研究发现，髓磷脂相关抑制因子是脊髓损伤后局部微环境中的重要抑制因素。该类抑制因子由髓鞘和胶质瘢痕合成释放，主要包括轴突生长抑制因子(neuriteoutgrowth inhibitory A，NogoA)、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelinglycoprotein,OMgp)。这些髓磷脂相关抑制因子可与神经细胞上的共受体成分LINGO-1(LRR and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein)结合而介导抑制效应，抑制中枢神经轴突生长和髓鞘形成。LINGO-1在脑和脊髓的神经元及少突胶质细胞上选择性表达，参与细胞膜上NgR1/p75/LLNGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1信号转导复合物的构成。LINGO-1与抑制因子结合使信号复合物活化，通过RhoA激酶的作用将下游抑制信号转导入神经元和少突胶质细胞，从而阻碍神经轴突的再生修复与髓鞘的形成。研究表明，拮抗LINGO-1对脊髓损伤后的神经再生和功能恢复有明显促进作用。同时，我们的前期研究发现，用慢病毒Lingo-1 RNAi干扰LINGO-1的表达，可影响移植性神经干细胞的发育分化，并能促进脊髓全横断大鼠的神经再生和运动功能恢复。但关于其发挥作用的胞内机制，目前尚未可知。
近年来，miRNA因其功能多样化而在组织工程学领域中的备受关注。miRNA是通过调控靶基因而影响表观遗传的重要分子，主要通过种子序列(seed sequence)与靶mRNA3’-端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)部分或完全互补结合而抑制基因表达或介导靶基因降解，实现转录后水平的广泛基因调控。miRNA介导的基因沉默效应涉及真核生物细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫调节等各种发育和代谢过程。因此，我们推测，miRNA是否也参与LINGO-1基因表达的生物调控过程。通过生物信息学在线软件预测和功能分析，我们初步筛选出可能对LINGO-1基因具有潜在调控作用的miRNA，再经细胞转染后双荧光素酶报告系统和western blotting验证，证实miRNA-615对LINGO-1的表达有负调控作用。
由于miRNA动物实验的体内环境复杂，实验周期长，对miRNA的稳定性要求更高，而人工合成的miRNA-615的拟似物(miRNA-615 mimics)具有较好的分子稳定性和miRNA活性，所以，需要选择合适的miRNA-615拟似物；另一方面，如何准确地将miRNA-615拟似物运输到损伤局部以有效地发挥其基因调控作用成为难题。
因此，亟待有可负载miRNA-615拟似物并能填充损伤裂隙的运载体，该运载体应具备高效、无毒、较好的生物相容性、生物降解性等特点，同时还应为神经轴突外向延伸生长提供必要的条件支持。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种所述能负载miRNA-615agomir、并能促进臂丛撕脱神经再生修复的水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物及其制备方法以及该复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
提供PF-127-miRNA-615 agomir复合物，所述复合物由以下组份制成：
Pluronic F-127水凝胶、去离子水和miRNA-615 agomir，所述miRNA-615 agomir包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
优选的，Pluronic F-127水凝胶与去离子水的用量比为每100ml去离子水中加入20g～25g的Pluronic F-127水凝胶。
优选的，miRNA-615 agomir在Pluronic F-127水凝胶与去离子水充分混合后得到的混合液中的浓度为18～23nmol/ml。
优选的，miRNA-615 agomir是经特殊化学修饰合成的miRNA-615拟似物，是由广州锐博生物科技有限公司合成的。
本发明还提供上述PF-127-miRNA-615 agomir复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)miRNA-615 agomir的合成；
(2)水凝胶原液的制备：
称取一定量的水凝胶，将其与去离子水在无菌条件下配制成混悬液，将混悬液置于一定温度条件下，使水凝胶充分溶解，然后过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)水凝胶与miRNA-615 agomir混合液的制备：
在一定温度条件下，将步骤(1)的miRNA-615 agomir与步骤(2)制备的水凝胶原液搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615 agomir的混合液，备用；
(4)水凝胶包裹miRNA-615 agomir：
取步骤(3)制备的混合液加入至24孔板，使混合液平铺孔底，然后放入培养箱在一定温度下温一段时间后，使孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615 agomir复合物。
优选的，所述步骤(1)，miRNA-615 agomir是由广州锐博生物科技有限公司合成的。
优选的，所述步骤(2)，水凝胶和去离子水在无菌条件下配制成质量体积比浓度为0.20～0.25g/ml的混悬液，将混悬液置于0～4℃，使水凝胶充分溶解，然后采用0.20μm孔径的滤膜除菌，得水凝胶原液。
优选的，所述步骤(3)，在0～4℃条件下，以每毫升水凝胶原液中含20nmol miRNA-615 agomir的浓度搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615 agomir的混合液。
优选的，所述步骤(4)，取步骤(3)制备的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平铺孔底，然后放置于25℃～37℃培养箱温育3～5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615 agomir复合物。
本发明还提供PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
与现有的技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的PF-127-miRNA-615 agomir复合物，由于含有温敏型水凝胶Pluronic F-127，不仅能够负载miRNA-615 agomir，实现miRNA-615 agomir的精确递送和局部缓释，起到药物递送缓释的作用，还兼具生物支架的性能，通过体内胶化形成具有生物支架功能的三维孔隙结构，为神经轴突的生长提供三维空间和力学支撑，同时还可有效填补脊髓损伤裂隙，促进轴突的生长和外向延伸，起到在形态和功能上双重修复的作用；
(2)本发明提供的PF-127-miRNA-615 agomir复合物，由于含有miRNA-615拟似物miRNA-615 agomir，与一般的miRNA-615拟似物相比，miRNA-615 agomir有更高的稳定性和miRNA活性，在生物体内不易被降解，且更易穿透细胞膜和组织间隙而富集于靶细胞，并能通过全身或局部注射的方式等进行给药，有效作用时间长，可操作性更强，特别适用于动物实验观察和分析。因此，含有miRNA-615 agomir的PF-127-miRNA-615 agomir复合物能够特异性抑制神经细胞中LINGO-1基因和蛋白的表达，减少其与髓磷脂抑制因子的结合，促进神经轴突的生长；
(3)本发明提供的PF-127-miRNA-615 agomir复合物的制备方法，具有生产成本低、操作简便、耗时短、实验设备要求低，且能用于大规模生产的特点；
(4)本发明提供的PF-127-miRNA-615 agomir复合物，既能利用Pluronic F-127水凝胶的分子运载系统实现miRNA-615 agomir的精确递送和局部缓释，通过抑制LINGO-1基因和蛋白的表达，减少其与髓磷脂抑制因子的结合，改善损伤局部的抑制性病理微环境，促进神经轴突的再生修复；又能借助Pluronic F-127的智能温敏性能，通过体内胶化形成具有生物支架功能的三维孔隙结构，为神经轴突的生长提供三维空间和力学支撑，同时还可有效填补脊髓损伤裂隙，起到在形态和功能上双重修复的作用。因此，该PF-127-miRNA-615agomir复合物可用于制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物，能够有力促进臂丛神经根性撕脱的神经再生修复，为中枢和外周神经损伤患者的治疗和康复提供新的治疗途径。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：PF-127-miRNA-615 agomir复合物的制备
PF-127-miRNA-615 agomir复合物由Pluronic F-127水凝胶、去离子水和miRNA-615 agomir采用以下步骤制备而成：
(1)miRNA-615 agomir的合成：
本实施例中，miRNA-615 agomir是经特殊化学修饰合成的miRNA-615拟似物，是由广州锐博生物科技有限公司合成的；
miRNA-615的基本信息如表1所示：
表1 miRNA-615的基本信息
miRNA-615与LINGO-1的反应机制：成熟miRNA主要通过与特定靶基因的3’-UTR结合而影响基因的转录后翻译效率和稳定性。成熟miRNA-615通过其种子序列(seedsequence)─GGGGGUCCCC(表1单下划线部分)与LINGO-1 mRNA的3’-UTR的部分序列(表1双下划线部分)特异性结合，介导基因沉默效应阻遏LINGO-1 mRNA的翻译过程，进而引起LINGO-1蛋白含量下降。LINGO-1表达减少，其与髓磷脂相关抑制因子的结合就减少，信号复合物的活化及神经元和少突胶质细胞中抑制信号的转入则相应减弱，在一定程度上起到促进神经轴突再生、髓鞘形成并进而改善运动功能恢复的效应。
(2)水凝胶原液的制备：
超净台酒精擦拭消毒，将电子天平、称量纸、称量药勺、50ml离心管等称量物品放入并紫外照射消毒约30分钟；于超净台内称取适量水凝胶，并在无菌条件下，将水凝胶与去离子水配置成质量体积比浓度为0.20～0.25g/ml的混悬液，然后将混悬液置于0～4℃的水平摇床以60-70转/分钟的速度振摇过夜10-24小时，至水凝胶充分溶解后，取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器覆盖于50ml离心管管口，连接上50ml注射器，将上述混合液倒入注射器后，缓慢推出通过滤膜以过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)水凝胶与miRNA-615 agomir混合液的制备：
将步骤(1)合成的miRNA-615 agomir与步骤(2)制备的水凝胶原液在0～4℃以每毫升水凝胶原液中含20nmol的miRNA-615 agomir的浓度混合，搅拌使其充分混合，得混合液；
(4)水凝胶包裹miRNA-615 agomir：
取步骤(3)制备的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平铺孔底，然后放置于25℃～37℃培养箱温育3～5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615agomir复合物。
以上步骤的所有操作均在无菌条件下进行。
本实施例中，水凝胶原液一般在2～8℃的医用冰箱或冷藏柜中储存，miRNA-615agomir储存于-80℃的液氮或者其他环境保存。
实施例2：PF-127包裹miRNA-615 agomir复合物修复臂丛神经根性撕脱的应用
1.臂丛神经根性撕脱大鼠模型制备
成年雌性SD大鼠用10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，在体视显微镜下，暴露右侧C4-T2脊髓节段，行C4-C7椎板切除，分离出右侧臂丛神经的C5～C7脊神经根，用精细玻璃挂钩轻轻撕脱C5～C7神经根，并切除与C5和C7神经根相连的一段脊神经，使神经与脊髓间留下大概5mm的间隙，随后将C6前根重置回原位，充分止血，逐层间断缝合肌肉和皮肤。术后保暖，待动物苏醒后送至清洁级动物饲养房进行常规护理。术后每只大鼠给予青霉素16万单位(1ml/d)和硫酸庆大霉素25万单位(0.5ml/d)肌内注射预防感染，每日2次，连续注射3天。
2.水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物局部注射
采用本发明实施例1制备所得水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物，在臂丛神经撕脱大鼠模型C6神经根撕脱原位空隙缓慢注射。注射时注意谨防微泵针尖伤及周围脊髓组织。注射完毕后，静置大鼠约5分钟，依次逐层缝合肌肉和皮肤，标准条件下常规饲养。
3.水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物修复大鼠臂丛撕脱试验
实验组：采用本发明实施例1制备所得水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物，37℃水浴温育3-5min至形成不透明胶冻物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝胶包裹miRNA-615agomir复合物，在臂丛神经撕脱大鼠模型C6神经根撕脱原位空隙缓慢注射。注射完毕后，静置大鼠约5分钟，依次逐层缝合肌肉和皮肤，标准条件下常规饲养。
对照组：给予同等剂量的PBS。
(1)免疫荧光染色检测神经丝蛋白NF-200的表达
各组动物模型10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，用生理盐水和4℃多聚甲醛进行左心室灌注，取C5-C7脊髓节段，4℃多聚甲醛后固定6-8小时，30％蔗糖溶液脱水，OCT包埋并切成20um厚的冰冻纵切片，Hoechst33342染核，于荧光显微镜下观察。
(2)甲苯胺蓝染色观察髓鞘形成
10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪开胸腔行心脏灌流固定，取脊髓标本用4％戊二醛溶液和1％锇酸溶液进行再固定,逐级酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切成0.5μm厚的半薄切片，甲苯胺蓝染色,封片后镜下观察并比较有髓神经轴突的数量及直径大小。
(3)行为学测试
参照Bertelli JA等人提出的Terzis grooming test对臂丛撕脱模型大鼠进行右前肢的运动功能评估。在安静环境中，用10ml注射器往大鼠头颈部喷射约10ml左右的水以引出其前肢的理毛行为，观察并依据该评定标准对其右前肢的运动功能进行等级评分。该评定标准分为0-5级：右前肢无反应为0分，右前肢可弯曲并能到达耳部及耳后为5分。术前对动物检查为5级，术后第二天对动物右上肢功能评定为功能丧失，评分0级，纳入评分标准。术后第二周开始对不同处理组动物进行运动功能等级评分，每周一次，连续4周。测试结果(见表2)显示，实验组动物右前肢的运动功能评分明显高于对照组，有统计学差异(P＜0.05)。
表2 臂丛神经根撕脱运动功能评分(x±s)
实验组与对照组(单纯脊髓损伤)相比，P＜0.05。
如表2所示，实验组大鼠在2、3、4、5W的运动功能评分均明显优于对照组(P＜0.05)，提示水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物能明显促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。
(4)荧光金逆行标记
取材前3-4天，麻醉动物后暴露右侧肌皮神经，于肌皮神经入肱二头肌肌点近端5mm处进针，缓慢注射1.0ul荧光金。标记后4天7％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛(加PBS磷酸盐缓冲液稀释)心脏灌注固定，取出C5-C7脊髓节段，放入30％蔗糖脱水48h后切成20um薄片。于荧光显微镜下观察C5-C7脊髓内荧光金标记的神经细胞数(见表3)，以观察C6回植后神经轴突的修复再生情况。
表3 荧光金标记的神经细胞计数(x±s)
实验组与对照组(单纯脊髓损伤)相比，P＜0.05。
如表3所示，实验组荧光金标记的神经元细胞数明显多于对照组，有明显差异(P<0.01)。由此可见，水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物对神经轴突的再生有明显改善作用。
(5)运动终板检测
取材固定后肱二头肌切成14um厚的纵切片，0.2mg/L的α-环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTX)染色30min。于荧光显微镜下计数运动终板的数目，并利用Image J图像软件计算其面积大小(见表4)。
表4 运动终板检测
实验组与对照组(单纯脊髓损伤)相比，P＜0.05。
如表4所示，实验组大鼠肱二头肌运动终板的数量明显多于对照组(P＜0.05)，由此说明水凝胶包裹miRNA-615 agomir复合物对受损神经的再生及与其所支配肌肉重建突触联系有保护作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
核苷酸和/ 或氨基酸序列表
<110> 广东医科大学
<120> PF-127-miRNA-615 agomir复合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
gggggucccc ggugcucgga uc 22
<210> 2
<211> 414
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggatggggca gggtgggggc gcagggaccc cccacttccg ggggaacact gggcagggaa 60
ggtgcctggc tgctgcccac tcacccccag gccttcccac ctttccctgc cctcctcaca 120
cactctcccc tccccccacg cgcccccgct gccacgccag cctcgccctc accgcctgcc 180
ctccttctac caggatttca gaaggccagg cctgaggacc ccgcctacat aggggccaga 240
gttgacagac gaatccaaag ccgacgaacc acgcggcaga gtcaataatt caattaaaaa 300
aaaagttaca aacttcctct gtaacttggg tttcaataat taatggattt ttatgaaaac 360
ttgaaataat aaaaaaagaa aaaaactaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 414

Claims (6)

1.PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，所述复合物由以下组份制成：Pluronic F-127水凝胶、去离子水和miRNA-615 agomir，所述miRNA-615 agomir为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
Pluronic F-127水凝胶与去离子水的用量比为每100ml去离子水中加入20g～25g的Pluronic F-127水凝胶；
miRNA-615 agomir在Pluronic F-127水凝胶与去离子水充分混合后得到的混合液中的浓度为18～23nmol/ml。
2.根据权利要求1所述的PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，其特征在于：PF-127-miRNA-615 agomir复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)miRNA-615 agomir的合成;
(2)水凝胶原液的制备：
称取一定量的水凝胶，将其与去离子水在无菌条件下配制成混悬液，将混悬液置于一定温度条件下，使水凝胶充分溶解，然后过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)水凝胶与miRNA-615 agomir混合液的制备：
在一定温度条件下，将步骤(1)的miRNA-615 agomir与步骤(2)制备的水凝胶原液搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615 agomir的混合液，备用；
(4)水凝胶包裹miRNA-615 agomir：
取步骤(3)制备的混合液加入至24孔板，使混合液平铺孔底，然后放入培养箱在一定温度下温育一段时间后，使孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615 agomir复合物。
3.根据权利要求2所述的PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，其特征在于：所述步骤(1)，miRNA-615 agomir是由广州锐博生物科技有限公司合成的。
4.根据权利要求2所述的PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，所述步骤(2)，水凝胶和去离子水在无菌条件下配制成质量体积比浓度为0.20～0.25g/ml的混悬液，将混悬液置于0～4℃，使水凝胶充分溶解，然后采用0.20μm孔径的滤膜除菌，得水凝胶原液。
5.根据权利要求2所述的PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，其特征在于：所述步骤(3)，在0～4℃条件下，以每毫升水凝胶原液中含20nmol miRNA-615 agomir的浓度搅拌使其充分混合，得水凝胶与miRNA-615 agomir的混合液。
6.根据权利要求2所述的PF-127-miRNA-615 agomir复合物在制备治疗臂丛神经根性撕脱的药物中的应用，其特征在于：所述步骤(4)，取步骤(3)制备的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平铺孔底，然后放置于25℃～37℃培养箱温育3～5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得PF-127-miRNA-615 agomir复合物。
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