JP3831407B2 - メチルホスホン酸エステル、その製造方法およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明はメチルホスホン酸エステル、その製造方法およびその使用に関する。
場合によりリン酸化された活性化合物誘導体が医薬用でも用いられていることは既に知られている。すなわち、例えばJ. Med. Chem. 36, 1048−1052（1993）にはAZTとのホスホアミデートエステルが記載されている。しかし、これらの化合物の抗ウイルス活性はAZTのそれよりもファクター10低いし、記載された化合物の毒性はAZTのそれよりもファクター５高い。J. Med. Chem. 34, 1830−1837（1991）にはAZTとのホスホトリエステル誘導体が記載されており、これらの化合物においてもまたその活性はAZTの場合よりも低いし、その毒性はAZTの場合よりも高い。同様の結果はJ. Org. Chem. 57, 7300−7307（1992）に報告されている関連化合物に関しても得られている。
関連する従来技術の化合物の不利点を有していないリン酸化された活性化合物誘導体を得るための、本発明のメチルホスホン酸エステルが優れた性質を有することが見いだされた。従って、本発明は
１）式Ｉ
〔式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C18）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'はアリール、ヘテロアリールまたはアルキルであり、
Ｗは医薬的に活性な化合物の基であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは場合により置換されたアルキル基であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは下記の式IIの基でありそしてＲは下記の式II'
｛上記式中、Ｘはオキシ、フルファンジイルまたはメチレンであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜50の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C18）−アシルまたは式
（ここでR4はO-、S-、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C18）−アルキル基である）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C18）−アルキル、Ｏ（C1〜C18）−アシル、Ｆ、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C6）−アルキルまたは（C1〜C6）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である〕で表される化合物に関する。
２）前記１）で説明された式Ｉのうち好ましい化合物は式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C8）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C5）−アルキル、ハロゲン、NO2、CN、（C1〜C6）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C4）−アルキルアミノ、（C1〜C8）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C13）−ヘテロアリール；または
（C1〜C16）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、ハロゲン、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗは医薬的に活性な化合物の基であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは〔空隙〕または（C1〜C16）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C1〜C8）−アシルオキシ、（C1〜C18）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシまたはスルファンジイルであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜30の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C12）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C12）−アルキルである）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C12）−アルキル、Ｏ（C1〜C12）−アシル、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C3）−アルキルまたは（C1〜C3）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
３）前記１）または２）で説明された式Ｉのうち特に好ましい化合物は式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C3）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗはステロイド、糖、イノシトールまたはペプチド（少なくとも１個のアミノ酸SerまたはTyrを有しかつ合計20個までの天然アミノ酸を有する）の5'−、3'−または2'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C8）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C3〜C6）−アシルオキシ、（C8〜C18）−アルコキシからなる群より選択される２個までの基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜20の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C8）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C8）−アルキルである）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C8）−アルキル、Ｏ（C1〜C8）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
４）前記１）〜３）で説明された式Ｉのうち極めて好ましい化合物は式中、
ＹはOHであり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C6）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和、好ましくはα−位で不飽和結合を有する共役形態で不飽和であり、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗは5'−または3'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜15の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C4）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C3）−アルキル基である）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C3）−アルキル、Ｏ（C1〜C3）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
５）前記１）〜４）で説明された式Ｉのうちさらに特に重要である化合物は式中、
ＹはOHであり、
Ｗは5'−または3'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり
R'はCl、NO2、CN、（C1〜C3）−アルコキシ、アミノおよび（C1〜C3）−アルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリールである化合物である。
数回現れる置換基（例えば“Ｂ”）に関して前記で使用されている“互いに独立して”の用語は各場合の１つの化合物において個々の置換基が相異なりうることを明確にすることを意図しており、これはまたｎ回繰り返す要素にも適用される。
前記定義で述べたアシル基の例としてはアセチル、ブチリル、ピバロイル、クロトニル、ペンタノイル、ヘキサノイル、オクタデカノイルまたはオレイルを挙げることができる。
適当なアルキル基としては例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはヘキシルを挙げることができる。
アリール基の例はフェニルまたはナフチルである。
適当なヘテロアリール基は例えばピリジル、オキサゾール、フリル、ベンゾフリルまたはフェノチアジニルである。
アルキルアミノ基の例はメチルアミノおよびエチルアミノ基である。
ジアルキルアミノ基の例はジメチルアミノおよびジエチルアミノ基である。
本発明で特に適当なヌクレオシド類似体は塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシン、特に例えば3'−デオキシ−3'−アジドチミジン、2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン、2',3'−ジデオキシチミジン、2',3'−ジデオキシウリジン、2',3'−ジデオキシアデノシン、2',3'−ジデオキシイノシン、3',F,3'−デオキシチミジン、アシクロビルおよびグアシクロビルから誘導される化合物を挙げることができる。
前記の基R5はハロゲン好ましくはCl、CF3、CN、NH2または（C1〜C6）−好ましくは（C1〜C3）−アルコキシで場合により置換されることができる。
本発明はさらに以下の方法を特徴とする化合物の製造方法に関する。
ａ）式IIIの化合物を式IVの化合物と反応させる、
または
ｂ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物と反応させるか、
または
ｃ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物および式VIIの化合物と反応させる、
（式中、SGは保護基であって、場合により式Ｉの化合物を得るために除去される）、または
3'(2')−末端Ｈ−ホスホネート基および保護された5'−ヒドロキシ基を有するヌクレオチド単位を活性化剤の存在下で遊離5'−ヒドロキシ基および保護された3'(2')−ヒドロキシ基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させてＨ−ホスホネートジヌクレオシドを得、これをアルデヒドと縮合してジヌクレオシドα−ヒドロキシアルキル（アリール）ホスホネートを得、それをその活性誘導体を得るための反応後にさらに別の（オリゴ）ヌクレオチド断片と反応させてオリゴヌクレオチドを得、次いで一時的に導入した保護基を除去する、すなわち
ｉ）3'(2')−末端リン（III）またはリン（Ｖ）基を有するヌクレオチド単位を縮合剤の存在下でさらに別のヌクレオチド単位または成長するオリゴヌクレオチド鎖の遊離5'−ヒドロキシ基と反応させるか、または
ii）その活性誘導体またはオリゴヌクレオチド類似体を同じ手法で断片中に作成し、その他の官能基保護のためにｉ）またはii）によって得られたオリゴヌクレオチド中に一時的に導入した保護基を除去し、こうして得られた式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体（ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'の基である）を場合によりそれらの生理学的に許容し得る塩に変換する。
ａ）に記載の反応は下記の条件下で行うのが好ましい。
Ａ）式IIIのホスホネートジエステルを有機溶媒例えば乾燥トリエチルアミン（NEt3）中で高められた温度好ましくは沸騰加熱の下で式IVの適当な置換アルデヒドと反応させる。
Ｂ）式IIIのホスホネートジエステルを乾燥非プロトン性溶媒例えばテトラヒドロフラン（THF）中で、有機塩基例えばNEt3またはキニンを加えて室温±10℃で式IVのアルデヒドと反応させる。
反応の完了後に生成物を知られた方法で例えばクロマトグラフィーにより精製する。
ｂ）およびｃ）に記載の反応は従来技術のエステル化で知られた条件下で進行する。特に良好な結果は、例えばトリアゾール／ジメシチレンスルホニルクロリドを用い、中間体活性エステル形成を介して達成される。
反応後に従来技術の方法によって場合により除去される適当な保護基は例えばアルキルシリル、アルキルアリールシリルおよびアシル特にｔ−ブチルジメチルシリルである。最後の保護基はメタノール中でフッ化アンモニウムを使用して有利に除去されうる。
本発明化合物はまた従来技術の種々の方法により立体選択的に製造され得る。α−炭素原子上のキラリティーの導入に好ましい出発点は、ｔ−ブチルジメチルシリルで保護されたアルコール（式Ｖの化合物）のＣ陰イオンとキラル助剤としての(＋)−エフェドリンから誘導されるオキサザホスホリジンとの反応である。このオキサザホスホリジンは例えばホスホリルクロリドを(＋)−エフェドリンと反応させることにより60％収率およびジアステレオマー比24：１で得られる。キラリティーの導入のさらに別の可能性はエナンチオ選択性オキサザボロリジンの触媒による還元にある（Tetrahedron Lett., 31, 611,（1990）参照）。
前記反応を実施するのに必要な出発物質は商業的に入手しうるか、または一般に知られた方法に従って製造されうる。いくつかの好ましい方法は実施例に記載されている。
出発化合物として使用される式（III）のヌクレオシド Ｈ−ホスホネートジエステルは、例えば、ジイソピロピルアミンジクロロホスフィンを対応するヌクレオシドと反応させてホスホルアミダイトを得、それを“ワンポット反応”でテトラゾール活性化により水を用いて直接加水分解して式IIIの化合物を得ることにより製造されうる。
別法として、この合成は例えば5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルをピバロイルクロリド活性化により第２のヌクレオシド同等物でエステル化することにより実施される。5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルは、三塩化リンをイミダゾールと反応させてリントリイミダゾリドを得、その後対応するヌクレオシドを反応させ次いで加水分解することにより入手することができる。
別法として、式IIIの化合物は5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルをピバロイルクロリド活性化により第２の適当なヌクレオシド同等物でエステル化することにより製造することができる。
式IIおよびII'の基を有する式Ｉの化合物の製造は、原則的には後記式XIの二量体ヌクレオチドを製造し次にそれを慣用法でオリゴヌクレオチド中に混入させるように実施するのが好ましい。例えば（スキーム１）、式VIIIの5'−保護されたヌクレオシド3'−Ｈ−ホスホネートエステルをピリジン中で縮合剤例えばピバロイルクロリドの存在下で式IXの3'−保護された5'−ヒドロキシ成分と反応させて式Ｘのジヌクレオシド Ｈ−ホスホネート エステルを得ることができる。次にこれを適当なアルデヒドと反応させてジヌクレオシドヒドロキシアルキルホスホネートを得る。この遊離のα−ヒドロキシ基は次の各反応のために好ましくはTBDMS（ｔ−ブチルジメチルシリル）保護基を用いて保護されなければならないが、これは合成の終了時にフッ素イオンを用いて除去される。式XIの化合物は、例えば3'−保護基（SG2）の除去後に反応して式XIIのホスホルアミダイトになり、これは知られた手法によってホスホルアミダイトの類似体としてオリゴヌクレオチド中に導入されうる。
しかし、プロドラッグのヌクレオチドもまた、適当に保護されたヌクレオシド−3'（または5'）−ホスホネート エステルを3'（または5'）保護されたヌクレオシドの5'(または3')−ヒドロキシ基と縮合させることにより単量体単位として作製させうる(スキーム２)。式ＸIII（ここで(Ｐ)＝Ｐ−Ｎ（ｉ−プロピル）2である）のヌクレオシド-3'−ほすほンアミデートを使用するのが好ましい。これは慣用法でオリゴヌクレオチド中に混入させることができる。
式IIまたはII'の基を有する式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体は生物学的オリゴヌクレオチドの合成と同様にして溶液中または好ましくは固相上で、適切な場合には自動合成装置を用いて製造される。
本発明の式Ｉの化合物およびその医薬的に許容しうる塩は、それらがベースとする活性化合物の薬学的活性を示す。それらはさらにまた好ましい毒物学的ないし薬物動力学的性質を示すので有用な化学療法剤である。
すなわち、本発明はまた１種以上の本発明化合物を含有することを特徴とする医薬特にウイルス性疾患抑制用医薬に関する。それらは例えば経口的に、筋肉内にまたは静脈内に投与されうる。
１種以上の一般式Ｉの化合物を活性化合物として含有する医薬は、式Ｉの化合物を１種以上の薬理学的に許容しうる賦形剤または希釈剤例えば緩衝剤物質と混合し、それらを適当な製剤形態にすることによって製造されうる。
希釈剤としては例えばポリグリコール、エタノールおよび水がある。緩衝剤物質としては例えば有機化合物例えばN',N'−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは無機化合物例えばホスフェート緩衝剤、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムがある。経口投与用では緩衝物質を含有するかまたは含有しない水中の懸濁液または溶液が適している。賦形剤または希釈剤を用いずに活性化合物をそのままで適当な形態例えばカプセル剤として投与することも可能である。
式Ｉの化合物またはそれらの医薬的に許容しうる塩の適当な投与量は、それらがベースとする各活性化合物に非常に左右される。例えばAZTの場合には体重約75kgの成人について１日当たり約0.4g、好ましくは0.5gないし多くて20gまでである。個別用量または一般には多数回用量を投与することができ、その個別用量は活性化合物を約50〜1000mgの量で含有することができる。
本発明はさらに新規なオリゴヌクレオチド類似体（式IIおよびII'の基を有する式Ｉの化合物）の遺伝子発現阻害剤（アンチセンス オリゴヌクレオチド、リボザイム、センス オリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）としての使用に関する。
オリゴヌクレオチドは遺伝子発現阻害剤としてますます多く使用されている（G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J.S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillon Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochemica and Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E, Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)参照）。アンチセンス オリゴヌクレオチドはその塩基配列が、阻害されるmRNAに対して相補的である核酸断片である。この標的mRNAは細胞、ウイルスまたはその他の病原由来であることができる。可能な細胞標的配列は、例えばレセプター、酵素、免疫調整剤、イオンチャンネルまたは腫瘍遺伝子の配列である。アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いるウイルス複製阻害は、例えばRSV（ラウス肉腫ウイルス）、HSV-1および-2（単純性疱疹ウイルス型ＩおよびII）、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)およびインフルエンザ ウイルスについて記載されている。この場合、ウイルス性核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドが用いられる。他方、センス オリゴヌクレオチドはそれらの配列が、例えば核酸結合タンパク質または核酸プロセシング酵素を結合（“捕獲し”）、それにより生物活性を阻害するように設計されている（Helene、1990）。ここで挙げることができるウイルス性標的は例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼおよびトランスアクチベータータンパク質である。一般に、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは１つの標的としてDNAを有しそしてこれに結合した後に三重のらせん状構造を形成する。一方、アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いるとmRNAのプロセシング（スプライシンク等）またはそれのタンパク質への翻訳は一般に阻害され、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドがDNAの転写または複製を阻害する(Helene et al., 1990, Uhlmann and Peyman, (1990))。しかしまた、１次雑種形成において一本鎖核酸をアンチセンス オリゴヌクレオチドと結合させて二重鎖を形成し、次にそれを２次雑種形成においてトリプレックス形成オリゴヌクレオチドと結合させてトリプレックス構造を形成することも可能である。この場合アンチセンスおよびトリプレックス結合の領域は２個の別々のオリゴヌクレオチドまたは１個のオリゴヌクレオチドのいずれかの中に適応させうる。合成オリゴヌクレオチドのさらに別の適用はいわゆるリボザイムであり、それはそれらのリボヌクレアーゼ活性の結果標的RNAを破壊する（J.J. Rossi and N. Sarver, TIBTECH 8, 179（1990）参照）。
前述の大部分の適用においてオリゴヌクレオチドはそれらの天然産の形態で必ずしも不適当である訳ではない。それらは特異的要件をみたすように化学的に修飾されなければならない。オリゴヌクレオチドが生物系中で例えばウイルス複製阻害のために用いられうるためには、それらは以下の先行必要条件：
１．それらはin vivo状態すなわち血清または細胞内の双方で適当な高い安定性を有していなければならない；
２．それらは細胞および核膜を通過することができるように構成されなければならない；
３．それらは阻害作用を示すために生理学的条件下において塩基−特異的方法でそれらの標的核酸に結合しなければならない；
をみたさなければならない。
ヌクレオチド間のホスフェート基が永久に変わるならば、それらヌクレオチドの性質は徹底的に変化することが多い。例えば、ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドはしばしば配列非特異的方法で作用する。
すなわち、本発明のさらに別の目的は、特異活性を有しかつ血清安定性の増大されたオリゴヌクレオチド類似体を入手し、それを再び生物系（血清、器官、細胞）中のそれらのもとの天然ホスホジエステル オリゴヌクレオチドに戻すことである。
オリゴヌクレオチドの１種以上のヌクレオチド間のホスフェート基はプロドラッグとして修飾されうる。本発明によれば3'および／または5'−末端プロドラッグ修飾を有するオリゴヌクレオチドは血清中でさえ天然産のホスホジエステル オリゴヌクレオチドよりも安定であるということが見出された。
本発明はα−およびβ−Ｄ−またはＬ−リボフラノシド、α−およびβ−Ｄ−またはＬ−デスオキシリボフラノシドおよび対応する炭素環式５員環類似体に制限されるのではなく、さらにまたその他の糖単位例えば環拡張ないし環縮小された糖、種々の非環式、環−架橋されたまたは異なった種類の適当な糖誘導体から作製されるオリゴヌクレオチド類似体にも適用される。本発明はさらに式Ｉで例示されているホエフェート基の誘導体に制限されるのではなくて、さらにまた知られたデホスホ誘導体にも関する。
すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは種々の方法で天然構造から修飾されうる。それ自体知られた方法により導入されるこのような修飾は例えば下記のとおりである。
ａ）ホスフェート架橋の修飾
その例としてはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、ホスフェートメチルエステル、ホスフェートエチルエステル、フェニルホスホネートを挙げることができる。このホスフェート架橋の好ましい修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートである。
ｂ）ホスフェート架橋の置換
その例としてはホルムアセタール、3'−チオホルムアセタール、メチル−ヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン、シリル基による置換がある。好ましいのはホルムアセタールおよび3'−チオホルムアセタールによる置換である。
ｃ）糖の修飾
その例としてはα−アノマー糖、2'−Ｏ−メチルリボース、2'−Ｏ−ブチルリボース、2'−Ｏ−アリルリボース、2'−フルオロ−2'−デオキシリボース、2'−アミノ−2'−デオキシリボース、α−アラビノフラノース、炭素環式糖類似体がある。好ましい修飾は2'−Ｏ−メチルリボースおよび2'−Ｏ−ｎ−ブチルリボースによるものである。
ｄ）ワトソン−クリック塩基対合の特異性を変化させない塩基の修飾
その例としては５−プロピニル−2'−デオキシウリジン、５−プロピニル−2'−デオキシシチジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシシチジン、５−フルオロ−2'−デオキシシチジン、５−フルオロ−2'−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−2'−デオキシウリジン、５−メチル−2'−デオキシシチジン、５−ブロモ−2'−デオキシシチジンがある。好ましい修飾は５−プロピニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシシチジンおよび５−プロピニル−2'−デオキシシチジンである。
ｅ）3'−3'−および5'−5'−逆位〔例えばM. Koga et al., J. Org. Chem. 56（1991）3757〕。
ｆ）5'−および3'−ホスフェートおよびまた5'−および3'−チオホスフェート
細胞内吸収に好都合な基の例としては種々の親油性基例えば-O-(CH2)x-CH3（ここでｘは６〜18の整数である）、-O-(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3（ここでｎおよびｍは互いに独立していて６〜12の整数である）、-O-(CH2CH2O)4-(CH2)9-CH3、-O-(CH2CH2O)8-(CH2)13-CH3および-O-(CH2CH2O)7-(CH2)15-CH3があるが、さらにまたステロイド基例えばコレステリルまたはビタミン基例えばビタミンＥ、ビタミンＡもしくはビタミンＤおよび天然担体系を使用するその他の抱合体例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アルコキシ）アミノアントラキノンおよびマンノースのコンジュゲート並びにレセプターを介してのオリゴヌクレオチドのエンドサイト−シスをもたらす対応するレセプターのペプチド例えばEGF（上皮成長因子）、ブラジキニンおよびPDGF（血小板由来成長因子）を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は当業者に知られた手法例えばトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはホスホルアミダイト法により、好ましくはCaruthers（M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185（1981）参照）による標準的なホスホルアミダイト化学により実施される。
さらに本発明によれば動物モデルでの細胞培養中および選ばれた例において、Ｗが式IIでありそしてＲが式II'である式Ｉの化合物はDNA部分の塩基配列によるが、例えば酵素、レセプターまたは成長因子の特定の遺伝子の発現を阻害するということが見出された。
極めて一般的には、本発明は医薬の治療活性成分としての式Ｉの化合物の使用にまで及ぶ。治療活性オリゴヌクレオチド誘導体は一般的意味ではアンチセンス オリゴヌクレオチド、トリプル ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、アプタマー（aptamer）またはリボザイム特にアンチセンス オリゴヌクレオチドとして理解される。
本発明の医薬は例えばウイルス例えばHIV、HSV-1、HSV-2、インフルエンザ、VSV、Ｂ型肝炎ウイルスまたは乳糖腫ウイルスによって惹起される疾患の治療に使用することができる。
このような目標に対して活性である本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）HIVに対して、例えば
ｂ）HSV-1に対して、例えば
また本発明の医薬は例えば癌の治療に適している。例えば、この場合には発癌または癌成長の原因となる標的に向けられるオリゴヌクレオチド配列が使用されうる。このような標的は例えば下記のとおりである。
１）核の癌タンパク質例えばc-myc、N-myc、c-myb、c-fos、c-fos／jun、PCNA、p120
２）細胞質／膜に結合した癌タンパク質例えばEJ-ras、c-Ha-ras、N-ras、rrg、bcl-2、cdc-2、c-raf-1、c-mos、c-src、c-abl
３）細胞レセプター例えばEGFレセプター、c-erbA、レチノイド レセプター、タンパク質キナーゼ調節サブユニット、c-fms
４）サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス例えばCSF-1、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、bFGF、ミエロブラスチン、フィブロネクチン。
前記標的に対して活性である本発明の式Ｉで表されるアンチセンス オリゴヌクレオチドは例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）c-Ha-rasに対して、例えば
ｃ）c-mycに対して、例えば
ｄ）c-mybに対して、例えば
ｅ）c-fosに対して、例えば
ｆ）p120に対して、例えば
ｇ）EGFレセプターに対して、例えば
ｈ）p53腫瘍サプレッサーに対して、例えば
本発明の医薬はさらに、例えばインテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター例えばVLA-4、VLA-2、ICAM、VCAMまたはELAMにより冒される疾患の治療に適している。
前記標的に対して活性である本発明のアンチセンス オリゴヌクレオチド誘導体は例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）VLA-4、例えば
ｂ）ICAM、例えば
ｃ）ELAM-1、例えば
また本発明の医薬は例えば再発狭窄症予防用にも適している。例えばこの場合には、増殖または移動の原因である標的に向けられるオリゴヌクレオチド配列を使用することができる。このような標的は例えば下記のとおりである。
１）核トランスアクチベータータンパク質およびサイクリン例えばc-myc、c-myb、c-fos、c-fos／junおよびcdc−２−キナーゼ；
２）有糸分裂促進または成長因子例えばPDGF、bFGF、EGF、HB-EGFおよびTGF-β；
３）細胞レセプター例えばbFGFレセプター、EGFレセプターおよびPDGFレセプター。
このような標的に対して活性である本発明の式Ｉのアンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）c-myb
ｂ）c-myc
ｃ）cdc2−キナーゼ
ｄ）PCNA（ラットの増殖しつつある細胞核抗原）
式ＩにおいてＷおよびＲがそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成する化合物に適した剤形は、局所適用例えばカテーテルを用いるような局部適用あるいはまた注射である。注射ではアンチセンス オリゴヌクレオチド誘導体は液体溶液好ましくは生理学的に許容しうる緩衝液例えばハンクス液またはリンガー溶液中で処方される。しかし、アンチセンス オリゴヌクレオチドはまた固形形態で処方され、使用の前に溶解または懸濁されうる。全身投与に好適な投与量は１日当たり体重１kgにつき約0.01mg〜約50mgである。
またこれらの医薬は例えば経口投与用製剤の形態例えば錠剤、被覆錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤、溶液、乳液または懸濁液の形態で使用することもできる。場合によりさらに別の成分例えばタンパク質を含有するリポソームに医薬を含有させるのもまた適当な剤形である。それらはまた、例えば坐薬の形態で直腸投与されうるかまたは例えば注射液の形態で非経口投与されうる。製剤を製造するにはこれらの化合物を治療的に不活性な有機または無機の賦形剤に加工することができる。錠剤、被覆錠剤および硬質ゼラチンカプセル剤用の賦形剤の例としてはラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、タロウ酸およびステアリン酸またはそれらの塩がある。溶液製剤に適当な賦形剤は水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適当な賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐薬用の適当な賦形剤は植物油および硬化油、ワックス、脂肪および半液状ポリオールである。製剤はまた保存剤、溶剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧調整用塩、緩衝剤、被覆剤、抗酸化剤およびまた、所望によりその他の治療活性化合物を含有することもできる。
ジヌクレオシド、α−ヒドロキシメチルアリールホスホネート１〜３のin vitro抗HIV試験
in vitro HIV試験をジヌクレオシドα−ヒドロキシアリールホスホネート１〜３を用いて実施した。１つの試験系としてヒトＴリンパ球（CEM／Ｏ）を使用した。これらの化合物はさらにチミジンキナーゼ欠損Ｔリンパ球菌株（CEM／TK-）中で試験された。CEM／Ｏ細胞をHIV-1およびHIV-2の両方に感染させた。試験の前に供試化合物は遊離ヌクレオシドを含んでいないことを確かめた（最大、0.5％HPLC）。試験アッセイの結果を表１に示す。
表１から分かるように、全ての化合物はHIV-1およびHIV-2複製の両方に対して高活性を示す。
文献に既述されたプロドラッグ形態とは対照的に、本発明の式Ｉの化合物は細胞毒性作用を全く示さなかった。
１：ヌクレオシド＝2',3'−ジデオキシチミジン(ddT)；２：ヌクレオシド＝2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン(d4T)；３：ヌクレオシド＝3'−デオキシ−3'−アゾドチミジン(AZT)
本発明化合物はヌクレオシド類似体の場合よりもオクタノール／水の混合物中で分配係数が高い。すなわち、それらは生体膜を介する受動輸送性が良好である。
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例
実施例１
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−メチルフェニル）メチルホスホネートの製造
904mg（4.0ミリモル）の2',3'−ジデオキシチミジンを高真空下で乾燥し、60mlの乾燥アセトニトリル中に溶解した。この溶液を774mg（6.0ミリモル；1.07ml）のジイソプロピルエチルアミンで処理し、氷浴中で０℃まで冷却した。次に、404mg（2.0ミリモル）のジイソプロピルアミンジクロロホスフィンを15分かけて少しずつ加えた。添加の終了後、混合物を室温まで加温しながら15分間撹拌した。室温で254mg（4.0ミリモル）のテトラゾールおよび80mlの水を加えた。30分間撹拌した後、溶媒を高真空装置で濃縮した。残留物をクロマトトロン（Chromatotoron）において酢酸エチル／メタノール（０％〜30％メタノール）の勾配を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を無色の固体として単離した（797mg〔1.6ミリモル〕；80％収率）。
797mg（1.6ミリモル）の2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルを40mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、518mg（4.8ミリモル）の４−メチルベンズアルデヒドで処理した。20mlの予め蒸留した乾燥トリエチルアミンをこの溶液に撹拌しながら加えた。室温で４時間後、出発物質は反応した。逆相HPLCクロマトグラフィーを用いて最終のチエックを行なった。反応混合物を20mlの酢酸の添加により中和し、回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を塩化メチレン／メタノール（０％〜15％メタノール）の勾配を用いてクロマトトロンで精製した。凍結乾燥後、生成物を無色の固体として単離した（921mg〔1.52ミリモル〕；95％収率）。生体外での抗HIV試験のための化合物を精製するため、さらに半−分取（semi-preparative）HPLC精製を溶離剤混合物（アセトニトリル中の30％メタノール）を用いて行なった。
実施例２
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ジメチルアミノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ジメチルアミノベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例３
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例４
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（フェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを使用した（収率93％）。
実施例５
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例６
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−シアノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−シアノベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例７
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例８
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例９
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例10
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（９−フルオレニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに９−フルオレノンを使用した（収率91％）。
実施例11
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジルアルデヒドを使用した（収率82％）。
実施例12
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジクロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジクロロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例13
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例14
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−メチルフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用した（収率83％）。
実施例15
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（フェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例16
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例17
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−シアノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−シアノベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例18
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率81％）。
実施例19
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例20
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例21
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジンアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例22
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジクロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジクロロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例23
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシヘプチルメチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにオクタナールを使用した（収率75％）。
実施例24
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例25
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率92％）。
実施例26
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率88％）。
実施例27
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例28
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジンアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例29
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシヘプチルメチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにオクタナールを使用した（収率96％）。
実施例30
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにddT／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率88％）。
実施例31
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例32
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例40
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率91％）。
実施例41
（5'−Ｏ−チミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／Ｔ−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例42
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ）−レブリニルチミジンヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−レブリニルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率93％）。
実施例43
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−レブリニルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例44
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−アセチルチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−アセチルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率75％）。
実施例45
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−アセチルチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−アセチルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率70％）。
実施例46
ビス（5'−Ｏ−チミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例５ａ）に記載の3'−Ｏ−レブリニル保護誘導体から標準条件下、４：１のピリジン／酢酸中、５当量のヒドラジン水和物を用いて室温で１５分かけて製造を行なった。
実施例47
ジ（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジンを使用した（収率75％）。
実施例48
ジ（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジンを使用した（収率85％）。
実施例49
ジ（5'−Ｏ−3'−レブリニルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−レブリニルチミジンを使用した（収率65％）。
実施例50
ジ（5'−Ｏ−3'−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンを使用した（収率65％）。
実施例51
ジ（5'−Ｏ−3'−アセチルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−アセチルチミジンを使用した（収率86％）。
強力な受容体で置換されたベンズアルデヒド（４−ニトロ−、２−ニトロ−および2,4−ジニトロベンズアルデヒド）との反応もまた、キラルなキニンを塩基として使用して行なうことができた。上記の実験の代わりに、供与体で置換されたベンズアルデヒド（４−ジメチルアミノ−、４−メトキシ−および４−メチルベンズアルデヒド）との反応もまた、純粋なトリエチルアミン中で加熱しながら行なった。
実施例52
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−チミジン−3'−（（Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−OHホスホネート ダイマーＤ）の製造
ａ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−Ｈ−ホスホネート（Ｈ−ホスホネート ダイマーＡ）の製造：
1.9g（2.7ミリモル；1.1当量）の5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−3'−Ｈ−ホスホネートを高真空下で乾燥し、30mlの乾燥ピリジン中に溶解した。828mg（2.4ミリモル；1.0当量）の予備乾燥した3'−Ｏ−レブリニルチミジンをこの溶液に加えた。次に、899mlの蒸留したばかりの塩化ピバロイルを滴加し、撹拌を室温で継続した。８分後、混合物を150mlの塩化メチレンで希釈し、150mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液を使用して分液ロートで抽出した。それぞれ150mlの塩化メチレンを使用してさらに２回抽出した後、その抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥剤を濾去し、そして回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール（＋0.1％酢酸の添加）溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物を黄色の固体として単離した（1.972g；2.12ミリモル；78％）。
ｂ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−（（−ヒドロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（α−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢ）の製造
予備乾燥した1.5g（1.6ミリモル；１当量）のＨ−ホスホネートダイマーＡを20mlの乾燥塩化メチレン中に溶解した。この溶液を725mg（4.8ミリモル；３当量）の予備乾燥した２−ニトロベンズアルデヒド、次に40mlのトリエチルアミンで処理した。室温で８時間撹拌した後、それを酢酸で中和し、溶液を直接フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール（＋0.1％酢酸の添加）溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物は無色の固体であった（1.374g；1.27ミリモル；79％）。
ｃ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＣ）の製造
予備乾燥した1.1g（1.01ミリモル；１当量）の−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢを20mlの乾燥ピリジン中に溶解した。914mg（6.07ミリモル；1.02ml；６当量）の塩化トリエチルシリルをこの溶液に滴加し、それを室温で撹拌した。７時間撹拌した後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから４％メタノールまで増加した。生成物は淡黄色の固体であった（1.13g；0.95ミリモル；93％）。
ｄ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−チミジン−3'−（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（Ｄ）の製造
1,1g（0.92ミリモル）のTES−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＣを10mlのピリジン中に溶解し、３mlのヒドラジン水和物（水中、24％）、6.92mlのピリジンおよび4.61mlの酢酸の溶液10mlで処理した。室温で３分間撹拌した後、溶液を０℃まで冷却し、100mlの水および100mlの酢酸エチルで希釈した。分液ロートで相を分離した後、有機相を25mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を分離した後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから７％メタノールまで増加した。生成物を淡黄色の固体として単離した（858mg；0.78ミリモル；85％）。
実施例53
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）チミジン−3'−Ｏ−（β−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホラミジット）−（（Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−ホスホラミジット ホスホネート ダイマーＥ）の製造
予備乾燥した230mg（0.21ミリモル；１当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−OHホスホネート ダイマーＤを15mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、撹拌しながら177ml（1.05ミリモル；135mg；５当量）のジイソプロピルエチルアミン、次に70ml（0.31ミリモル；74.2mg；1.5当量）のβ−シアノエチルジイソプロピルクロロホスフィンで処理した。混合物を室温で５時間撹拌し、20mlの酢酸エチルを加え、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。次にそれをそれぞれ20mlの２％炭酸水素ナトリウム溶液で２回、次に飽和塩化ナトリウム溶液で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、残留物を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶離剤として、１：１の塩化メチレン／アセトニトリル（＋１％トリエチルアミンの添加）を使用した。生成物は淡黄色の固体であった（123mg；0.095ミリモル；45％）。
実施例54
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'→5'）チミジン−3'−Ｏ−スクシニル（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＦ）の製造
予備乾燥した200mg（0.18ミリモル；1.4当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＤを２mlの乾燥ピリジン中に溶解した。次に、24.4mg（0.2ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジンおよび20.0mg（0.2ミリモル）の無水コハク酸を連続的に加え、混合物を撹拌しながら室温で４時間反応させた。45mlの水を加え、10分間撹拌した後、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を15mlの塩化メチレンに溶解し、８mlの冷10％クエン酸で１回、それぞれ８mlの冷水で２回抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物を３mlの塩化メチレンに溶解し、25mlの氷冷ｎ−ヘキサンに滴加した。生成物は無色の沈殿物として沈殿した。沈殿を終了させるために母液を−20℃で数時間保存し、固体を濾過し、乾燥した。生成物は無色の固体であった（167mg；0.14ミリモル；78％）。
実施例55
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'→5'）チミジン−3'−Ｏ−スクシニル−CPG（（α−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（CPG−結合TES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＧ）の製造
50mg（0.042ミリモル；1.5当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネートダイマーＦをピアスフラスコ中における1.5mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、13.41mg（0.042ミリモル；1.5当量）のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート(TBTU)および4.2ml（0.033ミリモル；3.84mg；1.2当量）のＮ−エチルモルホリンで処理した。次に、370mgのCPG支持体を加え、混合物を室温で４時間振とうした。それをフリットに移し、メタノールおよび塩化メチレンで洗浄し、再びピアスフラスコに移し、そして1.5mlのキャッピング試薬で処理した。それをさらに１時間振とうし、再びフリットに移し、濾過し、メタノール、塩化メチレン、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルで洗浄し、そして油ポンプ真空装置において40℃で乾燥した。支持体の負荷量：47.12ミリモル／g
実施例56
式TTTTTTTTT(pp)T（ppはα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである）のオリゴヌクレオチドの製造
１μモルの3'−末端を介して結合したジヌクレオチドを含有する実施例55のCPG支持体を次の試薬を用いて連続的に処理する：
１．無水アセトニトリル
２．ジクロロメタン中、２％ジクロロ酢酸
３．無水アセトニトリル
４．無水アセトニトリル中、10μモルのβ−シアノエチル5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3'−ホスフェートジイソプロピルアミジットおよび40μモルのテトラゾール
５．アセトニトリル
６．40％ルチジンおよび10％ジメチルアミノピリジンを含有するTHF中の20％無水酢酸
７．アセトニトリル
８．ヨウ素（1.3g，THF／水／ピリジン中；70：20：5＝v：v：v）
工程１〜８（以後、反応サイクルと称する）を７回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、3'−末端に（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例57
式T(pp)TTTTTTTTTのオリゴヌクレオチドの製造
１μモルの3'−末端を介して結合した5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを含有する商業的に入手可能なCPG支持体を次の試薬を用いて連続的に処理する：
１．無水アセトニトリル
２．ジクロロメタン中、２％ジクロロ酢酸
３．無水アセトニトリル
４．無水アセトニトリル中、10μモルのβ−シアノエチル5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3'−ホスフィット ジイソプロピルアミジットおよび40μモルのテトラゾール
５．アセトニトリル
６．40％ルチジンおよび10％ジメチルアミノピリジンを含有するTHF中の20％無水酢酸
７．アセトニトリル
８．ヨウ素（1.3g，THF／水／ピリジン中；70：20：5＝v：v：v）
工程１〜８（以後、反応サイクルと称する）を７回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。最後のサイクルにおいて、工程４のモノマーの代わりに実施例53のようにして製造した対応するジヌクレオチドを使用する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、5'−末端に（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例58
式T(pp)TTTTTTTT(pp)T（ppはそれぞれのα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネートブリッジである）のオリゴヌクレオチドの製造
合成は実施例56に記載の方法と同様にして、１μモルのの3'−末端を介して結合したジヌクレオチドを含有する実施例55のT(pp)T-CPG支持体から開始して行なわれる。最後のサイクルにおいて、工程４のモノマーの代わりに実施例53のようにして製造した対応するジヌクレオチドを使用する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、3'−末端および5'−末端のそれぞれに（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例59
GCAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C（HSVターゲット）の製造
製造は実施例56に記載の方法と同様にして、T(pp)T-CPGの代わりに対応するG(pp)C-CPG支持体から開始して行なわれる。縮合反応において、工程４でそれぞれその配列に対応するデオキシアデノシン、デオキシグアノシンまたはデオキシシチジンのモノマー構成単位を使用する。すぐに除去できる保護基を有する商業的に入手可能な構成単位（RExpedite Fast Deprotecting Amidites; Millipore社製）が好ましい。
実施例60
G(pp)CAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)Cの製造
製造は実施例５に記載の方法と同様にして行なわれる。最後の縮合工程において、T(p)Tホスホラミジットの代わりに対応するG(pp)Cホスホラミジットを使用する。
実施例61
G(pp)CAGGAGGATG(pp)CTGAGGAGG(pp)Cの製造
製造は実施例５に記載の方法と同様にして行なわれる。第８工程および最後の縮合工程のそれぞれにおいて、対応するG(pp)Cホスホラミジットを使用する。
実施例62
G(pp)CGGGGCTCCATGGGGGTC(pp)Gの製造
製造は実施例60に記載の方法と同様にして、G(pp)C-CPGの代わりに対応するC(pp)G-CPG支持体から開始して行なわれる。
実施例63
C(pp)GAGAACATCATGGTC(pp)G（c-fosターゲット）の製造
製造は実施例62に記載の方法と同様にして行なわれる。最後のサイクルにおいて、対応するC(pp)Gホスホラミジットを使用する。
実施例64
オリゴヌクレオチドの特性決定
特性決定はHPLC、ポリアクリルアミドゲル特定泳動（PAGE）および陰イオンエレクトロスプレー質量分析法（ES-MS）を用いて行なわれる。生成物は上記のようにして精製され、PAGE（20％アクリルアミド、２％ビスアクリルアミドおよび７Ｍ尿素）で均質のバンドを示す。HPLCはMerck社製の逆相カラムRP-18またはDionex社製のPA-100カラムを用いて行なわれる。
ES-MS-のため、オリゴヌクレオチドは酢酸アンモニウム沈殿または他の塩交換によりアンモニウム塩に変換される。試料は５ OD260／mlのオリゴマーを含有するアセトニトリル／水（１：１）中の溶液として使用される。本法の精度は約±1.5ダルトンである。
実施例65
放射性標識後の安定性および細胞吸収の測定
放射性標識：
一般に応用できる35Sでの標識はオリゴヌクレオチドの合成で35S原子を使用するDNA合成サイクル（実施例11の工程20）において酸化を少なくとも１回行なうことからなる。遊離の5'−ヒドキシ基を有するオリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを用いて知られている方法により32Pまたは35Sで標識することができる。遊離の3'−ヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチドは3'−末端トランスフェラーゼを用いて知られている方法により標識することができる。例として、DNA部分の5'−標識をここで示す：遊離の5'−ヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチド（500ピコモル）を420μｌの水に溶解し、この溶液を90℃まで加熱し、冷却した。次に、50μｌの10×キナーゼ緩衝液および50μｌの32P-γ-ATP（6000Ci／ミリモル）または35S-γ-ATPを加え、混合物を37℃で１時間インキュベートする。0.5Ｍ EDTA溶液を加えて反応を終了させる。Pharmacia社製のNAPRカラムを用いて脱塩を行なう。
細胞を含有する培地中のオリゴマーの安定性の調査：
上澄み１（10μｌ）を５μｌの80％ホルムアミド（XCおよびBBを含む）と混合し、95℃で（５分間）加熱し、そしてポリアクリルアミドゲル（20％アクリルアミド、７Ｍ尿素）に負荷する。ゲルを電場で展開した後、ゲル上のバンドをオートラジオグラフィーにより“安定なオリゴマー”に、または欠けているバンドを“分解したオリゴマー”に割り当てる。24時間のインキュベーション後の結果：非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、式Ｉ（Ｗ＝式II、Ｒ＝式II'）の化合物はすべて大きく増大した寿命を有する。
細胞吸収量の測定：
Vero細胞をDMEM、５％FCS中、96−ウエルマイクロタイタープレートにおいて37℃で74時間インキュベートする。培地を取り除いた後、細胞を無血清DMEMで２回洗浄する。放射性標識オリゴマー（106cpm）を非標識オリゴマーを使用して血清中、10μｍの濃度まで希釈し、細胞をそれと一緒に37℃でインキュベートする。１、７および24時間後、それぞれ150μｌを採取（表示：“上澄み１”）する。マイクロタイタープレートのウエル中の細胞を300μｌの新鮮な培地で７回洗浄し、そして合一した洗浄培地（表示：“上澄み２”）をシンチレーションカウンターで測定する。次に、100μｌのトリプシン溶液を加え、30秒間待ち、上澄みを取り除く。細胞をプレートから取り出し、それを37℃で３分間インキュベートする。取り出した細胞を1.5mlのEppendorf容器に移し、2000rpmで６分間遠心分離する（“上澄み３”）。上澄み１（５μｌ）、２および３（0.5ml）をそれぞれ別々にシンチレーションカウンターで測定する。この結果からオリゴマーの吸収量（ピコモル／100,000個の細胞）を計算する。上澄み３は細胞に結合したオリゴマーフラクションであり、そして上澄み１および２は細胞に結合していないオリゴマーフラクションである。
実施例66
蛍光標識後の細胞吸収の測定
COS細胞を５cmのペトリ皿において、10％FCSを追加したダルベッコ（Dulbecco）MEM中で全面成長させる。細胞を無血清DMEMで２回洗浄する。無菌の針を用いて、ペトリ皿の中心の約１cm2領域をかき取る。調査対象のDNAオリゴマー溶液（0.1mM）をこの領域に加える。それをCO2雰囲気下、37℃でインキュベートする。２、４および16時間後、細胞を蛍光顕微鏡検査法により調査する。この目的のため、細胞を無血清DMEMで４回洗浄し、ガラス支持体でカバーし、そして蛍光顕微鏡または位相差顕微鏡で評価する。
実施例67
融解温度の測定
融解温度をHP 8452Ａダイオードアレー分光光度計、HP 89090Ａペルチエ素子およびHP温度制御ソフトウエアRev. B5.1（Hewlett Packard社製）を用いて測定する。それを緩衝剤として10mMのHEPESおよび140mMのNaCl（pH6.5）中、0.5℃／分で測定する。オリゴマー濃度は0.5〜1.5OD260／mlである。
実施例68
細胞培養における抗ウイルス活性試験
試験物質の様々なヒト病原性ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性を細胞培養試験法で調査する。本試験では、サルの腎臓細胞（Vero、２×105／ml）を96−ウエル マイクロタイタープレートにおいて、血清を含有するダルベッコMEM（５％ウシ胎児血清FCS）中に接種し、そして５％CO2下、37℃で24時間インキュベートする。次に、血清を含有する培地を吸引し、細胞を無血清ダルベッコMEM（-FCS）で２回洗浄する。試験物質は予め水で600μＭの濃度まで希釈し、−18℃で保存する。本試験のため、ダルベッコ最少必須培地（MEM）の希釈工程をさらに行なう。それぞれ100μｌの各試験物質希釈液を100μｌの無血清ダルベッコMEM（-FCS）と共に、洗浄した細胞に加える。５％CO2下、37℃で３時間インキュベートした後、細胞に単純ヘルペスウイルス１型（ATCC VR733、HSV-1 Ｆ株）または単純ヘルペスウイルス２型（ATCC VR734、HSV-2 Ｇ株）を細胞層が３日以内で完全に崩壊する濃度で用いて感染させる。HSV-1の場合、感染能力は500プラーク形成単位（PFU）／ウエルであり、HSV-2の場合は350 PFU／ウエルである。実験バッチは100Ｕ／mlのペニシリンＧおよび100mg／ｌのストレプトマイシンを追加したMEM中、80μM〜0.04μMの濃度で試験物質を含有する。対照を除いてすべての実験を二重測定により行ない、１個のプレートにつき８回行なう。実験バッチを５％CO2下、37℃で17時間インキュベートする。試験物質の細胞毒性を20時間の全インキュベーション時間後、細胞培養物の顕微鏡検査により測定する。最大許容用量（MTD）を前記条件下で顕微鏡で検査可能な細胞の損傷をもたらさない最高調製濃度として表わす。この後、FCSを最終濃度が４％となるまで加え、さらに５％CO2下、37℃で55時間インキュベートする。未処置の感染対照は完全細胞変性効果（CPE）を示す。細胞培養物の顕微鏡検査後、これらをFinterの生体染色法（1966年）に従ってニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性はウイルスによる細胞変性効果から30〜60％の細胞を保護するのに必要な最小阻止濃度（MIC）として定義される。種々のオリゴヌクレオチドのMIC値は0.1〜80μモル／ｌの範囲である。
実施例69
生体内の抗ウイルス活性の測定
生体内で本化合物を試験するため、体重が約16〜18gの５週齢のNMRIマウスを使用する。マウスを通常の条件下、５匹以下のグループに分けて飼育し、食料および水を自由に与える。マウスに約10〜50 LD50単位のHSV株（HSV“角膜”）を腹腔内に感染させる。本化合物を１日に２回、１、10または50mg／kgの用量で腹腔内に投与する。対照動物には１％塩化ナトリウム溶液を与える。動物の生存率を２週間にわたって監視する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合１〜５匹が生き残るが、プラシーボ投与後はすべての動物が死亡する。
実施例70
生体内活性の測定；ラットにおけるc-Fosタンパク質発現の阻害
測定は
らの「痛みに関する第VI回世界会議の議事録（Proceedings of the Vith World Congress on Pain）」、CharltonおよびWoolf編、第313〜318頁（1991年）に記載のようにして脊髄の過融解により行なう。バルビタール酸塩で麻酔をかけたSprague-Dawleyラットの椎弓を切除した後、アンチセンスオリゴマーを含有させるためのシリコーン製の二室容器を作る。一方の室をアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体で満たし、他方の室を対照オリゴマーで満たす（濃度はそれぞれ75μｍ）。それぞれの場合において、過融解物を１時間後に交換する。６時間の過融解後、後足の熱処理（52℃）によりc-fos発現を刺激する。c-fos発現の阻害は適当な組織片試料を用いて免疫組織化学的に検出することができる。
実施例71
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−デオキシチミジリル−（3'→5'）−3'−Ｏ−レブリニル−2'−デオキシチミジン3'−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS（トリブチルシロキシ）−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＨ）の製造
予備乾燥した1.77g（1.636ミリモル；１当量）のα−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢを30mlの乾燥ピリジン中に溶解した。2.62ml（9.816ミリモル；2.306g；６当量）のクロロトリブチルシランをこの溶液に滴加した。室温で８時間撹拌した後、メタノールを加えて反応を停止させ、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから２％メタノールまで増加した。生成物は淡黄色の固体であった（1.78g；1.39ミリモル；85％）。
実施例72
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＩ）の製造
1.2g（0.94ミリモル）のTBS−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＨを10mlのピリジン中に溶解し、そして３mlのヒドラジン水和物（水中、24％）、6.92mlのピリジンおよび4.61mlの酢酸の溶液10mlで処理した。室温で３分間撹拌した後、溶液を０℃まで冷却し、100mlの水および100mlの酢酸エチルで希釈した。分液ロードで相を分離した後、有機相を25mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾過し、濾液を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物を淡黄色の固体として単離した（910mg；0.77ミリモル；82％）。
実施例73
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−Ｏ−スクシニル−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＪ）の製造
予備乾燥した120mg（0.10ミリモル；１当量）のTBS−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＩを１mlの乾燥ピリジン中に溶解した。次に、14.8mg（0.12ミリモル；1.2当量）の４−ジメチルアミノピリジンおよび12.1mg（0.12ミリモル；1.2当量）の無水コハク酸を連続的に加え、混合物を室温で４時間撹拌した。40mlの水を加え、10分間撹拌した後、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を10mlの塩化メチレンに溶解し、５mlの冷10％クエン酸で１回、それぞれ５mlの冷水で２回抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、濾液を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物を３mlの塩化メチレンに溶解し、25mlの氷冷ｎ−ヘキサンに滴加した。生成物は無色の沈殿物として沈殿した。沈殿を終了させるために母液を−20℃で数時間保存し、固体を濾過し、乾燥した。生成物は無色の固体であった（115mg；0.09ミリモル；90％）。
実施例74
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−Ｏ−スクシニル−CPG（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（CPG−結合TBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＫ）の製造
26.5mg（0.021ミリモル；1.5当量）のTBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーJをPierceフラスコ中における0.7mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、6.74mg（0.021ミリモル；1.5当量）のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）および2.1ml（0.017ミリモル；1.96mg；1.2当量）のＮ−エチルモルホリンで処理した。次に、183mgのCPG支持体を加え、混合物を室温で４時間振とうした。それをフリットに移し、メタノールおよび塩化メチレンで洗浄し、再びピアスフラスコに移し、そして0.7mlのキャッピング試薬で処理した。それをさらに１時間振とうし、再びフリットに移し、濾過し、メタノール、塩化メチレン、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルで洗浄し、そして油ポンプ真空装置で乾燥した。支持体の負荷量：33.15ミリモル／g
実施例75
CGTCCATGTCGGCAAACAGCT(pp)C（HSVターゲット）の製造
製造は実施例56に記載の方法と同様にして、T(pp)T-CPGの代わりに実施例４の対応するT(pp)T-CPG支持体から開始して行なわれる。縮合反応において、工程４でそれぞれその配列に対応するデオキシアデノシン、デオキシグアノシンまたはデオキシシチジンのモノマー構成単位を使用する。すぐに除去できる保護基を有する商業的に入手可能な構成単位（RExpedite Fast Deprotecting Amidites；Millipore社製）が好ましい。
【配列表】
配列番号：１
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：１：
配列番号：２
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：２：
配列番号：３
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..28
（xi）配列：配列番号：３：
配列番号：４
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..25
（xi）配列：配列番号：４：
配列番号：５
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..31
（xi）配列：配列番号：５：
配列番号：６
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＳＶ−１
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：６：
配列番号：７
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：シトプラスミック／膜−結合オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-Ha-ras”
（xi）配列：配列番号：７：
配列番号：８
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：８：
配列番号：９
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：９：
配列番号：１０
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“c-myb”
（xi）配列：配列番号：１０：
配列番号：１１
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１１：
配列番号：１２
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１２：
配列番号：１３
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１３：
配列番号：１４
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“p120”
（xi）配列：配列番号：１４：
配列番号：１５
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：細胞レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“EGFレセプター”
（xi）配列：配列番号：１５：
配列番号：１６
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：細胞レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“EGFレセプター”
（xi）配列：配列番号：１６：
配列番号：１７
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：p53腫瘍サプレッサー
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..19
（xi）配列：配列番号：１７：
配列番号：１８
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：p53腫瘍サプレッサー
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
（xi）配列：配列番号：１８：
配列番号：１９
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“VLA-4”
（xi）配列：配列番号：１９：
配列番号：２０
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２０：
配列番号：２１
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２１：
配列番号：２２
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..19
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２２：
配列番号：２３
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“ELAM-1”
（xi）配列：配列番号：２３：
配列番号：２４
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“ELAM-1”
（xi）配列：配列番号：２４：
配列番号：２５
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“c-myb”
（xi）配列：配列番号：２５：
配列番号：２６
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：２６：
配列番号：２７
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核トランスアクティベータープロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“cdc2キナーゼ”
（xi）配列：配列番号：２７：
配列番号：２８
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“PCNA”
（xi）配列：配列番号：２８：
配列番号：２９
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：２９：
配列番号：３０
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“5'−末端における最初のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３０：
配列番号：３１
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：HSV標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３１：
配列番号：３２
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３２：
配列番号：３３
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３３：
配列番号：３４
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“5'−末端から数えた第１、第11および第22番目のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３４：
配列番号：３５
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３５：
配列番号：３６
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：c-fos標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..17
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３６：
配列番号：３７
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：HSV標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３７：
場合によりリン酸化された活性化合物誘導体が医薬用でも用いられていることは既に知られている。すなわち、例えばJ. Med. Chem. 36, 1048−1052（1993）にはAZTとのホスホアミデートエステルが記載されている。しかし、これらの化合物の抗ウイルス活性はAZTのそれよりもファクター10低いし、記載された化合物の毒性はAZTのそれよりもファクター５高い。J. Med. Chem. 34, 1830−1837（1991）にはAZTとのホスホトリエステル誘導体が記載されており、これらの化合物においてもまたその活性はAZTの場合よりも低いし、その毒性はAZTの場合よりも高い。同様の結果はJ. Org. Chem. 57, 7300−7307（1992）に報告されている関連化合物に関しても得られている。
関連する従来技術の化合物の不利点を有していないリン酸化された活性化合物誘導体を得るための、本発明のメチルホスホン酸エステルが優れた性質を有することが見いだされた。従って、本発明は
１）式Ｉ
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C18）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'はアリール、ヘテロアリールまたはアルキルであり、
Ｗは医薬的に活性な化合物の基であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは場合により置換されたアルキル基であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは下記の式IIの基でありそしてＲは下記の式II'
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜50の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C18）−アシルまたは式
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C18）−アルキル、Ｏ（C1〜C18）−アシル、Ｆ、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C6）−アルキルまたは（C1〜C6）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である〕で表される化合物に関する。
２）前記１）で説明された式Ｉのうち好ましい化合物は式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C8）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C5）−アルキル、ハロゲン、NO2、CN、（C1〜C6）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C4）−アルキルアミノ、（C1〜C8）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C13）−ヘテロアリール；または
（C1〜C16）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、ハロゲン、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗは医薬的に活性な化合物の基であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは〔空隙〕または（C1〜C16）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C1〜C8）−アシルオキシ、（C1〜C18）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシまたはスルファンジイルであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜30の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C12）−アシルまたは式
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C12）−アルキル、Ｏ（C1〜C12）−アシル、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C3）−アルキルまたは（C1〜C3）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
３）前記１）または２）で説明された式Ｉのうち特に好ましい化合物は式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C3）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗはステロイド、糖、イノシトールまたはペプチド（少なくとも１個のアミノ酸SerまたはTyrを有しかつ合計20個までの天然アミノ酸を有する）の5'−、3'−または2'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C8）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C3〜C6）−アシルオキシ、（C8〜C18）−アルコキシからなる群より選択される２個までの基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜20の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C8）−アシルまたは式
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C8）−アルキル、Ｏ（C1〜C8）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
４）前記１）〜３）で説明された式Ｉのうち極めて好ましい化合物は式中、
ＹはOHであり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C6）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和、好ましくはα−位で不飽和結合を有する共役形態で不飽和であり、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗは5'−または3'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜15の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C4）−アシルまたは式
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C3）−アルキル、Ｏ（C1〜C3）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である化合物である。
５）前記１）〜４）で説明された式Ｉのうちさらに特に重要である化合物は式中、
ＹはOHであり、
Ｗは5'−または3'−ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり
R'はCl、NO2、CN、（C1〜C3）−アルコキシ、アミノおよび（C1〜C3）−アルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリールである化合物である。
数回現れる置換基（例えば“Ｂ”）に関して前記で使用されている“互いに独立して”の用語は各場合の１つの化合物において個々の置換基が相異なりうることを明確にすることを意図しており、これはまたｎ回繰り返す要素にも適用される。
前記定義で述べたアシル基の例としてはアセチル、ブチリル、ピバロイル、クロトニル、ペンタノイル、ヘキサノイル、オクタデカノイルまたはオレイルを挙げることができる。
適当なアルキル基としては例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルまたはヘキシルを挙げることができる。
アリール基の例はフェニルまたはナフチルである。
適当なヘテロアリール基は例えばピリジル、オキサゾール、フリル、ベンゾフリルまたはフェノチアジニルである。
アルキルアミノ基の例はメチルアミノおよびエチルアミノ基である。
ジアルキルアミノ基の例はジメチルアミノおよびジエチルアミノ基である。
本発明で特に適当なヌクレオシド類似体は塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシン、特に例えば3'−デオキシ−3'−アジドチミジン、2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン、2',3'−ジデオキシチミジン、2',3'−ジデオキシウリジン、2',3'−ジデオキシアデノシン、2',3'−ジデオキシイノシン、3',F,3'−デオキシチミジン、アシクロビルおよびグアシクロビルから誘導される化合物を挙げることができる。
前記の基R5はハロゲン好ましくはCl、CF3、CN、NH2または（C1〜C6）−好ましくは（C1〜C3）−アルコキシで場合により置換されることができる。
本発明はさらに以下の方法を特徴とする化合物の製造方法に関する。
ａ）式IIIの化合物を式IVの化合物と反応させる、
ｂ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物と反応させるか、
または
ｃ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物および式VIIの化合物と反応させる、
3'(2')−末端Ｈ−ホスホネート基および保護された5'−ヒドロキシ基を有するヌクレオチド単位を活性化剤の存在下で遊離5'−ヒドロキシ基および保護された3'(2')−ヒドロキシ基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させてＨ−ホスホネートジヌクレオシドを得、これをアルデヒドと縮合してジヌクレオシドα−ヒドロキシアルキル（アリール）ホスホネートを得、それをその活性誘導体を得るための反応後にさらに別の（オリゴ）ヌクレオチド断片と反応させてオリゴヌクレオチドを得、次いで一時的に導入した保護基を除去する、すなわち
ｉ）3'(2')−末端リン（III）またはリン（Ｖ）基を有するヌクレオチド単位を縮合剤の存在下でさらに別のヌクレオチド単位または成長するオリゴヌクレオチド鎖の遊離5'−ヒドロキシ基と反応させるか、または
ii）その活性誘導体またはオリゴヌクレオチド類似体を同じ手法で断片中に作成し、その他の官能基保護のためにｉ）またはii）によって得られたオリゴヌクレオチド中に一時的に導入した保護基を除去し、こうして得られた式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体（ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'の基である）を場合によりそれらの生理学的に許容し得る塩に変換する。
ａ）に記載の反応は下記の条件下で行うのが好ましい。
Ａ）式IIIのホスホネートジエステルを有機溶媒例えば乾燥トリエチルアミン（NEt3）中で高められた温度好ましくは沸騰加熱の下で式IVの適当な置換アルデヒドと反応させる。
Ｂ）式IIIのホスホネートジエステルを乾燥非プロトン性溶媒例えばテトラヒドロフラン（THF）中で、有機塩基例えばNEt3またはキニンを加えて室温±10℃で式IVのアルデヒドと反応させる。
反応の完了後に生成物を知られた方法で例えばクロマトグラフィーにより精製する。
ｂ）およびｃ）に記載の反応は従来技術のエステル化で知られた条件下で進行する。特に良好な結果は、例えばトリアゾール／ジメシチレンスルホニルクロリドを用い、中間体活性エステル形成を介して達成される。
反応後に従来技術の方法によって場合により除去される適当な保護基は例えばアルキルシリル、アルキルアリールシリルおよびアシル特にｔ−ブチルジメチルシリルである。最後の保護基はメタノール中でフッ化アンモニウムを使用して有利に除去されうる。
本発明化合物はまた従来技術の種々の方法により立体選択的に製造され得る。α−炭素原子上のキラリティーの導入に好ましい出発点は、ｔ−ブチルジメチルシリルで保護されたアルコール（式Ｖの化合物）のＣ陰イオンとキラル助剤としての(＋)−エフェドリンから誘導されるオキサザホスホリジンとの反応である。このオキサザホスホリジンは例えばホスホリルクロリドを(＋)−エフェドリンと反応させることにより60％収率およびジアステレオマー比24：１で得られる。キラリティーの導入のさらに別の可能性はエナンチオ選択性オキサザボロリジンの触媒による還元にある（Tetrahedron Lett., 31, 611,（1990）参照）。
前記反応を実施するのに必要な出発物質は商業的に入手しうるか、または一般に知られた方法に従って製造されうる。いくつかの好ましい方法は実施例に記載されている。
出発化合物として使用される式（III）のヌクレオシド Ｈ−ホスホネートジエステルは、例えば、ジイソピロピルアミンジクロロホスフィンを対応するヌクレオシドと反応させてホスホルアミダイトを得、それを“ワンポット反応”でテトラゾール活性化により水を用いて直接加水分解して式IIIの化合物を得ることにより製造されうる。
別法として、この合成は例えば5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルをピバロイルクロリド活性化により第２のヌクレオシド同等物でエステル化することにより実施される。5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルは、三塩化リンをイミダゾールと反応させてリントリイミダゾリドを得、その後対応するヌクレオシドを反応させ次いで加水分解することにより入手することができる。
別法として、式IIIの化合物は5'−ヌクレオシド亜リン酸モノエステルをピバロイルクロリド活性化により第２の適当なヌクレオシド同等物でエステル化することにより製造することができる。
式IIおよびII'の基を有する式Ｉの化合物の製造は、原則的には後記式XIの二量体ヌクレオチドを製造し次にそれを慣用法でオリゴヌクレオチド中に混入させるように実施するのが好ましい。例えば（スキーム１）、式VIIIの5'−保護されたヌクレオシド3'−Ｈ−ホスホネートエステルをピリジン中で縮合剤例えばピバロイルクロリドの存在下で式IXの3'−保護された5'−ヒドロキシ成分と反応させて式Ｘのジヌクレオシド Ｈ−ホスホネート エステルを得ることができる。次にこれを適当なアルデヒドと反応させてジヌクレオシドヒドロキシアルキルホスホネートを得る。この遊離のα−ヒドロキシ基は次の各反応のために好ましくはTBDMS（ｔ−ブチルジメチルシリル）保護基を用いて保護されなければならないが、これは合成の終了時にフッ素イオンを用いて除去される。式XIの化合物は、例えば3'−保護基（SG2）の除去後に反応して式XIIのホスホルアミダイトになり、これは知られた手法によってホスホルアミダイトの類似体としてオリゴヌクレオチド中に導入されうる。
しかし、プロドラッグのヌクレオチドもまた、適当に保護されたヌクレオシド−3'（または5'）−ホスホネート エステルを3'（または5'）保護されたヌクレオシドの5'(または3')−ヒドロキシ基と縮合させることにより単量体単位として作製させうる(スキーム２)。式ＸIII（ここで(Ｐ)＝Ｐ−Ｎ（ｉ−プロピル）2である）のヌクレオシド-3'−ほすほンアミデートを使用するのが好ましい。これは慣用法でオリゴヌクレオチド中に混入させることができる。
式IIまたはII'の基を有する式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体は生物学的オリゴヌクレオチドの合成と同様にして溶液中または好ましくは固相上で、適切な場合には自動合成装置を用いて製造される。
すなわち、本発明はまた１種以上の本発明化合物を含有することを特徴とする医薬特にウイルス性疾患抑制用医薬に関する。それらは例えば経口的に、筋肉内にまたは静脈内に投与されうる。
１種以上の一般式Ｉの化合物を活性化合物として含有する医薬は、式Ｉの化合物を１種以上の薬理学的に許容しうる賦形剤または希釈剤例えば緩衝剤物質と混合し、それらを適当な製剤形態にすることによって製造されうる。
希釈剤としては例えばポリグリコール、エタノールおよび水がある。緩衝剤物質としては例えば有機化合物例えばN',N'−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンまたは無機化合物例えばホスフェート緩衝剤、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムがある。経口投与用では緩衝物質を含有するかまたは含有しない水中の懸濁液または溶液が適している。賦形剤または希釈剤を用いずに活性化合物をそのままで適当な形態例えばカプセル剤として投与することも可能である。
式Ｉの化合物またはそれらの医薬的に許容しうる塩の適当な投与量は、それらがベースとする各活性化合物に非常に左右される。例えばAZTの場合には体重約75kgの成人について１日当たり約0.4g、好ましくは0.5gないし多くて20gまでである。個別用量または一般には多数回用量を投与することができ、その個別用量は活性化合物を約50〜1000mgの量で含有することができる。
本発明はさらに新規なオリゴヌクレオチド類似体（式IIおよびII'の基を有する式Ｉの化合物）の遺伝子発現阻害剤（アンチセンス オリゴヌクレオチド、リボザイム、センス オリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）としての使用に関する。
オリゴヌクレオチドは遺伝子発現阻害剤としてますます多く使用されている（G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J.S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillon Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochemica and Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E, Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)参照）。アンチセンス オリゴヌクレオチドはその塩基配列が、阻害されるmRNAに対して相補的である核酸断片である。この標的mRNAは細胞、ウイルスまたはその他の病原由来であることができる。可能な細胞標的配列は、例えばレセプター、酵素、免疫調整剤、イオンチャンネルまたは腫瘍遺伝子の配列である。アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いるウイルス複製阻害は、例えばRSV（ラウス肉腫ウイルス）、HSV-1および-2（単純性疱疹ウイルス型ＩおよびII）、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)およびインフルエンザ ウイルスについて記載されている。この場合、ウイルス性核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドが用いられる。他方、センス オリゴヌクレオチドはそれらの配列が、例えば核酸結合タンパク質または核酸プロセシング酵素を結合（“捕獲し”）、それにより生物活性を阻害するように設計されている（Helene、1990）。ここで挙げることができるウイルス性標的は例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼおよびトランスアクチベータータンパク質である。一般に、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは１つの標的としてDNAを有しそしてこれに結合した後に三重のらせん状構造を形成する。一方、アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いるとmRNAのプロセシング（スプライシンク等）またはそれのタンパク質への翻訳は一般に阻害され、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドがDNAの転写または複製を阻害する(Helene et al., 1990, Uhlmann and Peyman, (1990))。しかしまた、１次雑種形成において一本鎖核酸をアンチセンス オリゴヌクレオチドと結合させて二重鎖を形成し、次にそれを２次雑種形成においてトリプレックス形成オリゴヌクレオチドと結合させてトリプレックス構造を形成することも可能である。この場合アンチセンスおよびトリプレックス結合の領域は２個の別々のオリゴヌクレオチドまたは１個のオリゴヌクレオチドのいずれかの中に適応させうる。合成オリゴヌクレオチドのさらに別の適用はいわゆるリボザイムであり、それはそれらのリボヌクレアーゼ活性の結果標的RNAを破壊する（J.J. Rossi and N. Sarver, TIBTECH 8, 179（1990）参照）。
前述の大部分の適用においてオリゴヌクレオチドはそれらの天然産の形態で必ずしも不適当である訳ではない。それらは特異的要件をみたすように化学的に修飾されなければならない。オリゴヌクレオチドが生物系中で例えばウイルス複製阻害のために用いられうるためには、それらは以下の先行必要条件：
１．それらはin vivo状態すなわち血清または細胞内の双方で適当な高い安定性を有していなければならない；
２．それらは細胞および核膜を通過することができるように構成されなければならない；
３．それらは阻害作用を示すために生理学的条件下において塩基−特異的方法でそれらの標的核酸に結合しなければならない；
をみたさなければならない。
ヌクレオチド間のホスフェート基が永久に変わるならば、それらヌクレオチドの性質は徹底的に変化することが多い。例えば、ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドはしばしば配列非特異的方法で作用する。
すなわち、本発明のさらに別の目的は、特異活性を有しかつ血清安定性の増大されたオリゴヌクレオチド類似体を入手し、それを再び生物系（血清、器官、細胞）中のそれらのもとの天然ホスホジエステル オリゴヌクレオチドに戻すことである。
オリゴヌクレオチドの１種以上のヌクレオチド間のホスフェート基はプロドラッグとして修飾されうる。本発明によれば3'および／または5'−末端プロドラッグ修飾を有するオリゴヌクレオチドは血清中でさえ天然産のホスホジエステル オリゴヌクレオチドよりも安定であるということが見出された。
本発明はα−およびβ−Ｄ−またはＬ−リボフラノシド、α−およびβ−Ｄ−またはＬ−デスオキシリボフラノシドおよび対応する炭素環式５員環類似体に制限されるのではなく、さらにまたその他の糖単位例えば環拡張ないし環縮小された糖、種々の非環式、環−架橋されたまたは異なった種類の適当な糖誘導体から作製されるオリゴヌクレオチド類似体にも適用される。本発明はさらに式Ｉで例示されているホエフェート基の誘導体に制限されるのではなくて、さらにまた知られたデホスホ誘導体にも関する。
すなわち、これらのオリゴヌクレオチドは種々の方法で天然構造から修飾されうる。それ自体知られた方法により導入されるこのような修飾は例えば下記のとおりである。
ａ）ホスフェート架橋の修飾
その例としてはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、ホスフェートメチルエステル、ホスフェートエチルエステル、フェニルホスホネートを挙げることができる。このホスフェート架橋の好ましい修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびメチルホスホネートである。
ｂ）ホスフェート架橋の置換
その例としてはホルムアセタール、3'−チオホルムアセタール、メチル−ヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン、シリル基による置換がある。好ましいのはホルムアセタールおよび3'−チオホルムアセタールによる置換である。
ｃ）糖の修飾
その例としてはα−アノマー糖、2'−Ｏ−メチルリボース、2'−Ｏ−ブチルリボース、2'−Ｏ−アリルリボース、2'−フルオロ−2'−デオキシリボース、2'−アミノ−2'−デオキシリボース、α−アラビノフラノース、炭素環式糖類似体がある。好ましい修飾は2'−Ｏ−メチルリボースおよび2'−Ｏ−ｎ−ブチルリボースによるものである。
ｄ）ワトソン−クリック塩基対合の特異性を変化させない塩基の修飾
その例としては５−プロピニル−2'−デオキシウリジン、５−プロピニル−2'−デオキシシチジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシシチジン、５−フルオロ−2'−デオキシシチジン、５−フルオロ−2'−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−2'−デオキシウリジン、５−メチル−2'−デオキシシチジン、５−ブロモ−2'−デオキシシチジンがある。好ましい修飾は５−プロピニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシウリジン、５−ヘキシニル−2'−デオキシシチジンおよび５−プロピニル−2'−デオキシシチジンである。
ｅ）3'−3'−および5'−5'−逆位〔例えばM. Koga et al., J. Org. Chem. 56（1991）3757〕。
ｆ）5'−および3'−ホスフェートおよびまた5'−および3'−チオホスフェート
細胞内吸収に好都合な基の例としては種々の親油性基例えば-O-(CH2)x-CH3（ここでｘは６〜18の整数である）、-O-(CH2)n-CH=CH-(CH2)m-CH3（ここでｎおよびｍは互いに独立していて６〜12の整数である）、-O-(CH2CH2O)4-(CH2)9-CH3、-O-(CH2CH2O)8-(CH2)13-CH3および-O-(CH2CH2O)7-(CH2)15-CH3があるが、さらにまたステロイド基例えばコレステリルまたはビタミン基例えばビタミンＥ、ビタミンＡもしくはビタミンＤおよび天然担体系を使用するその他の抱合体例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アルコキシ）アミノアントラキノンおよびマンノースのコンジュゲート並びにレセプターを介してのオリゴヌクレオチドのエンドサイト−シスをもたらす対応するレセプターのペプチド例えばEGF（上皮成長因子）、ブラジキニンおよびPDGF（血小板由来成長因子）を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は当業者に知られた手法例えばトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはホスホルアミダイト法により、好ましくはCaruthers（M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185（1981）参照）による標準的なホスホルアミダイト化学により実施される。
さらに本発明によれば動物モデルでの細胞培養中および選ばれた例において、Ｗが式IIでありそしてＲが式II'である式Ｉの化合物はDNA部分の塩基配列によるが、例えば酵素、レセプターまたは成長因子の特定の遺伝子の発現を阻害するということが見出された。
極めて一般的には、本発明は医薬の治療活性成分としての式Ｉの化合物の使用にまで及ぶ。治療活性オリゴヌクレオチド誘導体は一般的意味ではアンチセンス オリゴヌクレオチド、トリプル ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、アプタマー（aptamer）またはリボザイム特にアンチセンス オリゴヌクレオチドとして理解される。
本発明の医薬は例えばウイルス例えばHIV、HSV-1、HSV-2、インフルエンザ、VSV、Ｂ型肝炎ウイルスまたは乳糖腫ウイルスによって惹起される疾患の治療に使用することができる。
このような目標に対して活性である本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）HIVに対して、例えば
１）核の癌タンパク質例えばc-myc、N-myc、c-myb、c-fos、c-fos／jun、PCNA、p120
２）細胞質／膜に結合した癌タンパク質例えばEJ-ras、c-Ha-ras、N-ras、rrg、bcl-2、cdc-2、c-raf-1、c-mos、c-src、c-abl
３）細胞レセプター例えばEGFレセプター、c-erbA、レチノイド レセプター、タンパク質キナーゼ調節サブユニット、c-fms
４）サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス例えばCSF-1、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、bFGF、ミエロブラスチン、フィブロネクチン。
前記標的に対して活性である本発明の式Ｉで表されるアンチセンス オリゴヌクレオチドは例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）c-Ha-rasに対して、例えば
前記標的に対して活性である本発明のアンチセンス オリゴヌクレオチド誘導体は例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）VLA-4、例えば
１）核トランスアクチベータータンパク質およびサイクリン例えばc-myc、c-myb、c-fos、c-fos／junおよびcdc−２−キナーゼ；
２）有糸分裂促進または成長因子例えばPDGF、bFGF、EGF、HB-EGFおよびTGF-β；
３）細胞レセプター例えばbFGFレセプター、EGFレセプターおよびPDGFレセプター。
このような標的に対して活性である本発明の式Ｉのアンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば下記の塩基配列を有する。
ａ）c-myb
またこれらの医薬は例えば経口投与用製剤の形態例えば錠剤、被覆錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤、溶液、乳液または懸濁液の形態で使用することもできる。場合によりさらに別の成分例えばタンパク質を含有するリポソームに医薬を含有させるのもまた適当な剤形である。それらはまた、例えば坐薬の形態で直腸投与されうるかまたは例えば注射液の形態で非経口投与されうる。製剤を製造するにはこれらの化合物を治療的に不活性な有機または無機の賦形剤に加工することができる。錠剤、被覆錠剤および硬質ゼラチンカプセル剤用の賦形剤の例としてはラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、タロウ酸およびステアリン酸またはそれらの塩がある。溶液製剤に適当な賦形剤は水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適当な賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐薬用の適当な賦形剤は植物油および硬化油、ワックス、脂肪および半液状ポリオールである。製剤はまた保存剤、溶剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧調整用塩、緩衝剤、被覆剤、抗酸化剤およびまた、所望によりその他の治療活性化合物を含有することもできる。
ジヌクレオシド、α−ヒドロキシメチルアリールホスホネート１〜３のin vitro抗HIV試験
in vitro HIV試験をジヌクレオシドα−ヒドロキシアリールホスホネート１〜３を用いて実施した。１つの試験系としてヒトＴリンパ球（CEM／Ｏ）を使用した。これらの化合物はさらにチミジンキナーゼ欠損Ｔリンパ球菌株（CEM／TK-）中で試験された。CEM／Ｏ細胞をHIV-1およびHIV-2の両方に感染させた。試験の前に供試化合物は遊離ヌクレオシドを含んでいないことを確かめた（最大、0.5％HPLC）。試験アッセイの結果を表１に示す。
表１から分かるように、全ての化合物はHIV-1およびHIV-2複製の両方に対して高活性を示す。
文献に既述されたプロドラッグ形態とは対照的に、本発明の式Ｉの化合物は細胞毒性作用を全く示さなかった。
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例
実施例１
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−メチルフェニル）メチルホスホネートの製造
904mg（4.0ミリモル）の2',3'−ジデオキシチミジンを高真空下で乾燥し、60mlの乾燥アセトニトリル中に溶解した。この溶液を774mg（6.0ミリモル；1.07ml）のジイソプロピルエチルアミンで処理し、氷浴中で０℃まで冷却した。次に、404mg（2.0ミリモル）のジイソプロピルアミンジクロロホスフィンを15分かけて少しずつ加えた。添加の終了後、混合物を室温まで加温しながら15分間撹拌した。室温で254mg（4.0ミリモル）のテトラゾールおよび80mlの水を加えた。30分間撹拌した後、溶媒を高真空装置で濃縮した。残留物をクロマトトロン（Chromatotoron）において酢酸エチル／メタノール（０％〜30％メタノール）の勾配を用いてシリカゲル上で精製した。生成物を無色の固体として単離した（797mg〔1.6ミリモル〕；80％収率）。
797mg（1.6ミリモル）の2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルを40mlの乾燥テトラヒドロフラン中に溶解し、518mg（4.8ミリモル）の４−メチルベンズアルデヒドで処理した。20mlの予め蒸留した乾燥トリエチルアミンをこの溶液に撹拌しながら加えた。室温で４時間後、出発物質は反応した。逆相HPLCクロマトグラフィーを用いて最終のチエックを行なった。反応混合物を20mlの酢酸の添加により中和し、回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を塩化メチレン／メタノール（０％〜15％メタノール）の勾配を用いてクロマトトロンで精製した。凍結乾燥後、生成物を無色の固体として単離した（921mg〔1.52ミリモル〕；95％収率）。生体外での抗HIV試験のための化合物を精製するため、さらに半−分取（semi-preparative）HPLC精製を溶離剤混合物（アセトニトリル中の30％メタノール）を用いて行なった。
実施例２
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ジメチルアミノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ジメチルアミノベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例３
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例４
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（フェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを使用した（収率93％）。
実施例５
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例６
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−シアノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−シアノベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例７
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例８
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例９
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例10
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（９−フルオレニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに９−フルオレノンを使用した（収率91％）。
実施例11
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジルアルデヒドを使用した（収率82％）。
実施例12
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジクロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジクロロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例13
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例14
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−メチルフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用した（収率83％）。
実施例15
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（フェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例16
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例17
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−シアノフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−シアノベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例18
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率81％）。
実施例19
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率86％）。
実施例20
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例21
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジンアルデヒドを使用した（収率80％）。
実施例22
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジクロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジクロロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例23
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシヘプチルメチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにオクタナールを使用した（収率75％）。
実施例24
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例25
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率92％）。
実施例26
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率88％）。
実施例27
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（2,4−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,4−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率90％）。
実施例28
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシ（４−ピリジル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ピリジンアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例29
ビス（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ヒドロキシヘプチルメチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにAZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりにオクタナールを使用した（収率96％）。
実施例30
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにddT／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率88％）。
実施例31
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（４−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率96％）。
実施例32
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（2,6−ジニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／AZT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに2,6−ジニトロベンズアルデヒドを使用した（収率87％）。
実施例40
（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシチミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2,3−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率91％）。
実施例41
（5'−Ｏ−チミジン）−（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ヒドロキシ（２−ニトロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりにd4T／Ｔ−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに２−ニトロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例42
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ）−レブリニルチミジンヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−レブリニルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率93％）。
実施例43
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−レブリニルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率85％）。
実施例44
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−アセチルチミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−アセチルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−クロロベンズアルデヒドを使用した（収率75％）。
実施例45
ビス（5'−Ｏ−3'−Ｏ−アセチルチミジン）ヒドロキシ（４−メトキシフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ddT−Ｈ−ホスホネートジエステルの代わりに3'−アセチルチミジン−Ｈ−ホスホネートジエステルを使用し、４−メチルベンズアルデヒドの代わりに４−メトキシベンズアルデヒドを使用した（収率70％）。
実施例46
ビス（5'−Ｏ−チミジン）ヒドロキシ（４−クロロフェニル）メチルホスホネートの製造
実施例５ａ）に記載の3'−Ｏ−レブリニル保護誘導体から標準条件下、４：１のピリジン／酢酸中、５当量のヒドラジン水和物を用いて室温で１５分かけて製造を行なった。
実施例47
ジ（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに2',3'−ジデオキシ−2',3'−ジデヒドロチミジンを使用した（収率75％）。
実施例48
ジ（5'−Ｏ−2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに2',3'−ジデオキシ−3'−アジドチミジンを使用した（収率85％）。
実施例49
ジ（5'−Ｏ−3'−レブリニルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−レブリニルチミジンを使用した（収率65％）。
実施例50
ジ（5'−Ｏ−3'−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−ｔ−ブチルジメチルシリルチミジンを使用した（収率65％）。
実施例51
ジ（5'−Ｏ−3'−アセチルチミジン）ホスフィットの製造
実施例１と同様にして行なった。本実施例では2',3'−ジデオキシチミジンの代わりに3'−アセチルチミジンを使用した（収率86％）。
強力な受容体で置換されたベンズアルデヒド（４−ニトロ−、２−ニトロ−および2,4−ジニトロベンズアルデヒド）との反応もまた、キラルなキニンを塩基として使用して行なうことができた。上記の実験の代わりに、供与体で置換されたベンズアルデヒド（４−ジメチルアミノ−、４−メトキシ−および４−メチルベンズアルデヒド）との反応もまた、純粋なトリエチルアミン中で加熱しながら行なった。
実施例52
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−チミジン−3'−（（Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−OHホスホネート ダイマーＤ）の製造
ａ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−Ｈ−ホスホネート（Ｈ−ホスホネート ダイマーＡ）の製造：
1.9g（2.7ミリモル；1.1当量）の5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−3'−Ｈ−ホスホネートを高真空下で乾燥し、30mlの乾燥ピリジン中に溶解した。828mg（2.4ミリモル；1.0当量）の予備乾燥した3'−Ｏ−レブリニルチミジンをこの溶液に加えた。次に、899mlの蒸留したばかりの塩化ピバロイルを滴加し、撹拌を室温で継続した。８分後、混合物を150mlの塩化メチレンで希釈し、150mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液を使用して分液ロートで抽出した。それぞれ150mlの塩化メチレンを使用してさらに２回抽出した後、その抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥剤を濾去し、そして回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール（＋0.1％酢酸の添加）溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物を黄色の固体として単離した（1.972g；2.12ミリモル；78％）。
ｂ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−（（−ヒドロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（α−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢ）の製造
予備乾燥した1.5g（1.6ミリモル；１当量）のＨ−ホスホネートダイマーＡを20mlの乾燥塩化メチレン中に溶解した。この溶液を725mg（4.8ミリモル；３当量）の予備乾燥した２−ニトロベンズアルデヒド、次に40mlのトリエチルアミンで処理した。室温で８時間撹拌した後、それを酢酸で中和し、溶液を直接フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール（＋0.1％酢酸の添加）溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物は無色の固体であった（1.374g；1.27ミリモル；79％）。
ｃ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−3'−Ｏ−レブリニルチミジン−3'−（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＣ）の製造
予備乾燥した1.1g（1.01ミリモル；１当量）の−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢを20mlの乾燥ピリジン中に溶解した。914mg（6.07ミリモル；1.02ml；６当量）の塩化トリエチルシリルをこの溶液に滴加し、それを室温で撹拌した。７時間撹拌した後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから４％メタノールまで増加した。生成物は淡黄色の固体であった（1.13g；0.95ミリモル；93％）。
ｄ）5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）−チミジン−3'−（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（Ｄ）の製造
1,1g（0.92ミリモル）のTES−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＣを10mlのピリジン中に溶解し、３mlのヒドラジン水和物（水中、24％）、6.92mlのピリジンおよび4.61mlの酢酸の溶液10mlで処理した。室温で３分間撹拌した後、溶液を０℃まで冷却し、100mlの水および100mlの酢酸エチルで希釈した。分液ロートで相を分離した後、有機相を25mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を分離した後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから７％メタノールまで増加した。生成物を淡黄色の固体として単離した（858mg；0.78ミリモル；85％）。
実施例53
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'5'）チミジン−3'−Ｏ−（β−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホラミジット）−（（Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−ホスホラミジット ホスホネート ダイマーＥ）の製造
予備乾燥した230mg（0.21ミリモル；１当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−OHホスホネート ダイマーＤを15mlの乾燥塩化メチレン中に溶解し、撹拌しながら177ml（1.05ミリモル；135mg；５当量）のジイソプロピルエチルアミン、次に70ml（0.31ミリモル；74.2mg；1.5当量）のβ−シアノエチルジイソプロピルクロロホスフィンで処理した。混合物を室温で５時間撹拌し、20mlの酢酸エチルを加え、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。次にそれをそれぞれ20mlの２％炭酸水素ナトリウム溶液で２回、次に飽和塩化ナトリウム溶液で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、残留物を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。溶離剤として、１：１の塩化メチレン／アセトニトリル（＋１％トリエチルアミンの添加）を使用した。生成物は淡黄色の固体であった（123mg；0.095ミリモル；45％）。
実施例54
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'→5'）チミジン−3'−Ｏ−スクシニル（（−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＦ）の製造
予備乾燥した200mg（0.18ミリモル；1.4当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＤを２mlの乾燥ピリジン中に溶解した。次に、24.4mg（0.2ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジンおよび20.0mg（0.2ミリモル）の無水コハク酸を連続的に加え、混合物を撹拌しながら室温で４時間反応させた。45mlの水を加え、10分間撹拌した後、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を15mlの塩化メチレンに溶解し、８mlの冷10％クエン酸で１回、それぞれ８mlの冷水で２回抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、それを回転蒸発器で濃縮乾固した。粗生成物を３mlの塩化メチレンに溶解し、25mlの氷冷ｎ−ヘキサンに滴加した。生成物は無色の沈殿物として沈殿した。沈殿を終了させるために母液を−20℃で数時間保存し、固体を濾過し、乾燥した。生成物は無色の固体であった（167mg；0.14ミリモル；78％）。
実施例55
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリチル）チミジリル−（3'→5'）チミジン−3'−Ｏ−スクシニル−CPG（（α−Ｏ−トリエチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（CPG−結合TES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＧ）の製造
50mg（0.042ミリモル；1.5当量）のTES−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネートダイマーＦをピアスフラスコ中における1.5mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、13.41mg（0.042ミリモル；1.5当量）のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート(TBTU)および4.2ml（0.033ミリモル；3.84mg；1.2当量）のＮ−エチルモルホリンで処理した。次に、370mgのCPG支持体を加え、混合物を室温で４時間振とうした。それをフリットに移し、メタノールおよび塩化メチレンで洗浄し、再びピアスフラスコに移し、そして1.5mlのキャッピング試薬で処理した。それをさらに１時間振とうし、再びフリットに移し、濾過し、メタノール、塩化メチレン、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルで洗浄し、そして油ポンプ真空装置において40℃で乾燥した。支持体の負荷量：47.12ミリモル／g
実施例56
式TTTTTTTTT(pp)T（ppはα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである）のオリゴヌクレオチドの製造
１μモルの3'−末端を介して結合したジヌクレオチドを含有する実施例55のCPG支持体を次の試薬を用いて連続的に処理する：
１．無水アセトニトリル
２．ジクロロメタン中、２％ジクロロ酢酸
３．無水アセトニトリル
４．無水アセトニトリル中、10μモルのβ−シアノエチル5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3'−ホスフェートジイソプロピルアミジットおよび40μモルのテトラゾール
５．アセトニトリル
６．40％ルチジンおよび10％ジメチルアミノピリジンを含有するTHF中の20％無水酢酸
７．アセトニトリル
８．ヨウ素（1.3g，THF／水／ピリジン中；70：20：5＝v：v：v）
工程１〜８（以後、反応サイクルと称する）を７回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、3'−末端に（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例57
式T(pp)TTTTTTTTTのオリゴヌクレオチドの製造
１μモルの3'−末端を介して結合した5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを含有する商業的に入手可能なCPG支持体を次の試薬を用いて連続的に処理する：
１．無水アセトニトリル
２．ジクロロメタン中、２％ジクロロ酢酸
３．無水アセトニトリル
４．無水アセトニトリル中、10μモルのβ−シアノエチル5'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−3'−ホスフィット ジイソプロピルアミジットおよび40μモルのテトラゾール
５．アセトニトリル
６．40％ルチジンおよび10％ジメチルアミノピリジンを含有するTHF中の20％無水酢酸
７．アセトニトリル
８．ヨウ素（1.3g，THF／水／ピリジン中；70：20：5＝v：v：v）
工程１〜８（以後、反応サイクルと称する）を７回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。最後のサイクルにおいて、工程４のモノマーの代わりに実施例53のようにして製造した対応するジヌクレオチドを使用する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、5'−末端に（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例58
式T(pp)TTTTTTTT(pp)T（ppはそれぞれのα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネートブリッジである）のオリゴヌクレオチドの製造
合成は実施例56に記載の方法と同様にして、１μモルのの3'−末端を介して結合したジヌクレオチドを含有する実施例55のT(pp)T-CPG支持体から開始して行なわれる。最後のサイクルにおいて、工程４のモノマーの代わりに実施例53のようにして製造した対応するジヌクレオチドを使用する。合成の終了後、ジメトキシトリチル基を工程１〜３に記載のようにして除去する。アンモニアで処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、同時にβ−シアノエチル基を除去する。80％酢酸で処理してシリル保護基を除去する。得られる、3'−末端および5'−末端のそれぞれに（−ヒドロキシ−ｏ−ニトロフェニルメチルホスホネート）ヌクレオチド間結合を含有するデカチミジレート誘導体粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
実施例59
GCAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C（HSVターゲット）の製造
製造は実施例56に記載の方法と同様にして、T(pp)T-CPGの代わりに対応するG(pp)C-CPG支持体から開始して行なわれる。縮合反応において、工程４でそれぞれその配列に対応するデオキシアデノシン、デオキシグアノシンまたはデオキシシチジンのモノマー構成単位を使用する。すぐに除去できる保護基を有する商業的に入手可能な構成単位（RExpedite Fast Deprotecting Amidites; Millipore社製）が好ましい。
実施例60
G(pp)CAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)Cの製造
製造は実施例５に記載の方法と同様にして行なわれる。最後の縮合工程において、T(p)Tホスホラミジットの代わりに対応するG(pp)Cホスホラミジットを使用する。
実施例61
G(pp)CAGGAGGATG(pp)CTGAGGAGG(pp)Cの製造
製造は実施例５に記載の方法と同様にして行なわれる。第８工程および最後の縮合工程のそれぞれにおいて、対応するG(pp)Cホスホラミジットを使用する。
実施例62
G(pp)CGGGGCTCCATGGGGGTC(pp)Gの製造
製造は実施例60に記載の方法と同様にして、G(pp)C-CPGの代わりに対応するC(pp)G-CPG支持体から開始して行なわれる。
実施例63
C(pp)GAGAACATCATGGTC(pp)G（c-fosターゲット）の製造
製造は実施例62に記載の方法と同様にして行なわれる。最後のサイクルにおいて、対応するC(pp)Gホスホラミジットを使用する。
実施例64
オリゴヌクレオチドの特性決定
特性決定はHPLC、ポリアクリルアミドゲル特定泳動（PAGE）および陰イオンエレクトロスプレー質量分析法（ES-MS）を用いて行なわれる。生成物は上記のようにして精製され、PAGE（20％アクリルアミド、２％ビスアクリルアミドおよび７Ｍ尿素）で均質のバンドを示す。HPLCはMerck社製の逆相カラムRP-18またはDionex社製のPA-100カラムを用いて行なわれる。
ES-MS-のため、オリゴヌクレオチドは酢酸アンモニウム沈殿または他の塩交換によりアンモニウム塩に変換される。試料は５ OD260／mlのオリゴマーを含有するアセトニトリル／水（１：１）中の溶液として使用される。本法の精度は約±1.5ダルトンである。
実施例65
放射性標識後の安定性および細胞吸収の測定
放射性標識：
一般に応用できる35Sでの標識はオリゴヌクレオチドの合成で35S原子を使用するDNA合成サイクル（実施例11の工程20）において酸化を少なくとも１回行なうことからなる。遊離の5'−ヒドキシ基を有するオリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを用いて知られている方法により32Pまたは35Sで標識することができる。遊離の3'−ヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチドは3'−末端トランスフェラーゼを用いて知られている方法により標識することができる。例として、DNA部分の5'−標識をここで示す：遊離の5'−ヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチド（500ピコモル）を420μｌの水に溶解し、この溶液を90℃まで加熱し、冷却した。次に、50μｌの10×キナーゼ緩衝液および50μｌの32P-γ-ATP（6000Ci／ミリモル）または35S-γ-ATPを加え、混合物を37℃で１時間インキュベートする。0.5Ｍ EDTA溶液を加えて反応を終了させる。Pharmacia社製のNAPRカラムを用いて脱塩を行なう。
細胞を含有する培地中のオリゴマーの安定性の調査：
上澄み１（10μｌ）を５μｌの80％ホルムアミド（XCおよびBBを含む）と混合し、95℃で（５分間）加熱し、そしてポリアクリルアミドゲル（20％アクリルアミド、７Ｍ尿素）に負荷する。ゲルを電場で展開した後、ゲル上のバンドをオートラジオグラフィーにより“安定なオリゴマー”に、または欠けているバンドを“分解したオリゴマー”に割り当てる。24時間のインキュベーション後の結果：非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、式Ｉ（Ｗ＝式II、Ｒ＝式II'）の化合物はすべて大きく増大した寿命を有する。
細胞吸収量の測定：
Vero細胞をDMEM、５％FCS中、96−ウエルマイクロタイタープレートにおいて37℃で74時間インキュベートする。培地を取り除いた後、細胞を無血清DMEMで２回洗浄する。放射性標識オリゴマー（106cpm）を非標識オリゴマーを使用して血清中、10μｍの濃度まで希釈し、細胞をそれと一緒に37℃でインキュベートする。１、７および24時間後、それぞれ150μｌを採取（表示：“上澄み１”）する。マイクロタイタープレートのウエル中の細胞を300μｌの新鮮な培地で７回洗浄し、そして合一した洗浄培地（表示：“上澄み２”）をシンチレーションカウンターで測定する。次に、100μｌのトリプシン溶液を加え、30秒間待ち、上澄みを取り除く。細胞をプレートから取り出し、それを37℃で３分間インキュベートする。取り出した細胞を1.5mlのEppendorf容器に移し、2000rpmで６分間遠心分離する（“上澄み３”）。上澄み１（５μｌ）、２および３（0.5ml）をそれぞれ別々にシンチレーションカウンターで測定する。この結果からオリゴマーの吸収量（ピコモル／100,000個の細胞）を計算する。上澄み３は細胞に結合したオリゴマーフラクションであり、そして上澄み１および２は細胞に結合していないオリゴマーフラクションである。
実施例66
蛍光標識後の細胞吸収の測定
COS細胞を５cmのペトリ皿において、10％FCSを追加したダルベッコ（Dulbecco）MEM中で全面成長させる。細胞を無血清DMEMで２回洗浄する。無菌の針を用いて、ペトリ皿の中心の約１cm2領域をかき取る。調査対象のDNAオリゴマー溶液（0.1mM）をこの領域に加える。それをCO2雰囲気下、37℃でインキュベートする。２、４および16時間後、細胞を蛍光顕微鏡検査法により調査する。この目的のため、細胞を無血清DMEMで４回洗浄し、ガラス支持体でカバーし、そして蛍光顕微鏡または位相差顕微鏡で評価する。
実施例67
融解温度の測定
融解温度をHP 8452Ａダイオードアレー分光光度計、HP 89090Ａペルチエ素子およびHP温度制御ソフトウエアRev. B5.1（Hewlett Packard社製）を用いて測定する。それを緩衝剤として10mMのHEPESおよび140mMのNaCl（pH6.5）中、0.5℃／分で測定する。オリゴマー濃度は0.5〜1.5OD260／mlである。
実施例68
細胞培養における抗ウイルス活性試験
試験物質の様々なヒト病原性ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性を細胞培養試験法で調査する。本試験では、サルの腎臓細胞（Vero、２×105／ml）を96−ウエル マイクロタイタープレートにおいて、血清を含有するダルベッコMEM（５％ウシ胎児血清FCS）中に接種し、そして５％CO2下、37℃で24時間インキュベートする。次に、血清を含有する培地を吸引し、細胞を無血清ダルベッコMEM（-FCS）で２回洗浄する。試験物質は予め水で600μＭの濃度まで希釈し、−18℃で保存する。本試験のため、ダルベッコ最少必須培地（MEM）の希釈工程をさらに行なう。それぞれ100μｌの各試験物質希釈液を100μｌの無血清ダルベッコMEM（-FCS）と共に、洗浄した細胞に加える。５％CO2下、37℃で３時間インキュベートした後、細胞に単純ヘルペスウイルス１型（ATCC VR733、HSV-1 Ｆ株）または単純ヘルペスウイルス２型（ATCC VR734、HSV-2 Ｇ株）を細胞層が３日以内で完全に崩壊する濃度で用いて感染させる。HSV-1の場合、感染能力は500プラーク形成単位（PFU）／ウエルであり、HSV-2の場合は350 PFU／ウエルである。実験バッチは100Ｕ／mlのペニシリンＧおよび100mg／ｌのストレプトマイシンを追加したMEM中、80μM〜0.04μMの濃度で試験物質を含有する。対照を除いてすべての実験を二重測定により行ない、１個のプレートにつき８回行なう。実験バッチを５％CO2下、37℃で17時間インキュベートする。試験物質の細胞毒性を20時間の全インキュベーション時間後、細胞培養物の顕微鏡検査により測定する。最大許容用量（MTD）を前記条件下で顕微鏡で検査可能な細胞の損傷をもたらさない最高調製濃度として表わす。この後、FCSを最終濃度が４％となるまで加え、さらに５％CO2下、37℃で55時間インキュベートする。未処置の感染対照は完全細胞変性効果（CPE）を示す。細胞培養物の顕微鏡検査後、これらをFinterの生体染色法（1966年）に従ってニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性はウイルスによる細胞変性効果から30〜60％の細胞を保護するのに必要な最小阻止濃度（MIC）として定義される。種々のオリゴヌクレオチドのMIC値は0.1〜80μモル／ｌの範囲である。
実施例69
生体内の抗ウイルス活性の測定
生体内で本化合物を試験するため、体重が約16〜18gの５週齢のNMRIマウスを使用する。マウスを通常の条件下、５匹以下のグループに分けて飼育し、食料および水を自由に与える。マウスに約10〜50 LD50単位のHSV株（HSV“角膜”）を腹腔内に感染させる。本化合物を１日に２回、１、10または50mg／kgの用量で腹腔内に投与する。対照動物には１％塩化ナトリウム溶液を与える。動物の生存率を２週間にわたって監視する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合１〜５匹が生き残るが、プラシーボ投与後はすべての動物が死亡する。
実施例70
生体内活性の測定；ラットにおけるc-Fosタンパク質発現の阻害
測定は
実施例71
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−２−デオキシチミジリル−（3'→5'）−3'−Ｏ−レブリニル−2'−デオキシチミジン3'−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS（トリブチルシロキシ）−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＨ）の製造
予備乾燥した1.77g（1.636ミリモル；１当量）のα−ヒドロキシホスホネート ダイマーＢを30mlの乾燥ピリジン中に溶解した。2.62ml（9.816ミリモル；2.306g；６当量）のクロロトリブチルシランをこの溶液に滴加した。室温で８時間撹拌した後、メタノールを加えて反応を停止させ、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチル／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから２％メタノールまで増加した。生成物は淡黄色の固体であった（1.78g；1.39ミリモル；85％）。
実施例72
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＩ）の製造
1.2g（0.94ミリモル）のTBS−保護ヒドロキシホスホネート ダイマーＨを10mlのピリジン中に溶解し、そして３mlのヒドラジン水和物（水中、24％）、6.92mlのピリジンおよび4.61mlの酢酸の溶液10mlで処理した。室温で３分間撹拌した後、溶液を０℃まで冷却し、100mlの水および100mlの酢酸エチルで希釈した。分液ロードで相を分離した後、有機相を25mlの５％炭酸水素ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾過し、濾液を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。塩化メチレン／メタノール溶離剤の勾配を０％メタノールから５％メタノールまで増加した。生成物を淡黄色の固体として単離した（910mg；0.77ミリモル；82％）。
実施例73
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−Ｏ−スクシニル−（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（TBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＪ）の製造
予備乾燥した120mg（0.10ミリモル；１当量）のTBS−保護ヒドロキシ−3'−OH−ホスホネート ダイマーＩを１mlの乾燥ピリジン中に溶解した。次に、14.8mg（0.12ミリモル；1.2当量）の４−ジメチルアミノピリジンおよび12.1mg（0.12ミリモル；1.2当量）の無水コハク酸を連続的に加え、混合物を室温で４時間撹拌した。40mlの水を加え、10分間撹拌した後、混合物を回転蒸発器で濃縮乾固した。残留物を10mlの塩化メチレンに溶解し、５mlの冷10％クエン酸で１回、それぞれ５mlの冷水で２回抽出した。次に、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、濾液を回転蒸発器で濃縮乾固した。
粗生成物を３mlの塩化メチレンに溶解し、25mlの氷冷ｎ−ヘキサンに滴加した。生成物は無色の沈殿物として沈殿した。沈殿を終了させるために母液を−20℃で数時間保存し、固体を濾過し、乾燥した。生成物は無色の固体であった（115mg；0.09ミリモル；90％）。
実施例74
5'−Ｏ−（4,4'−ジメトキシトリフェニルメチル）−2'−デオキシチミジリル−（3'→5'）−2'−デオキシチミジン3'−Ｏ−スクシニル−CPG（（α−Ｏ−トリブチルシロキシ）−２−ニトロベンジル）ホスホネート（CPG−結合TBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーＫ）の製造
26.5mg（0.021ミリモル；1.5当量）のTBS−保護ヒドロキシ−3'−スクシニルホスホネート ダイマーJをPierceフラスコ中における0.7mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し、6.74mg（0.021ミリモル；1.5当量）のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−N,N,N',N'−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）および2.1ml（0.017ミリモル；1.96mg；1.2当量）のＮ−エチルモルホリンで処理した。次に、183mgのCPG支持体を加え、混合物を室温で４時間振とうした。それをフリットに移し、メタノールおよび塩化メチレンで洗浄し、再びピアスフラスコに移し、そして0.7mlのキャッピング試薬で処理した。それをさらに１時間振とうし、再びフリットに移し、濾過し、メタノール、塩化メチレン、テトラヒドロフランおよびジエチルエーテルで洗浄し、そして油ポンプ真空装置で乾燥した。支持体の負荷量：33.15ミリモル／g
実施例75
CGTCCATGTCGGCAAACAGCT(pp)C（HSVターゲット）の製造
製造は実施例56に記載の方法と同様にして、T(pp)T-CPGの代わりに実施例４の対応するT(pp)T-CPG支持体から開始して行なわれる。縮合反応において、工程４でそれぞれその配列に対応するデオキシアデノシン、デオキシグアノシンまたはデオキシシチジンのモノマー構成単位を使用する。すぐに除去できる保護基を有する商業的に入手可能な構成単位（RExpedite Fast Deprotecting Amidites；Millipore社製）が好ましい。
配列番号：１
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：１：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：２：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..28
（xi）配列：配列番号：３：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..25
（xi）配列：配列番号：４：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：３１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＩＶ
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..31
（xi）配列：配列番号：５：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：ＨＳＶ−１
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
（xi）配列：配列番号：６：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：シトプラスミック／膜−結合オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-Ha-ras”
（xi）配列：配列番号：７：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：８：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：９：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“c-myb”
（xi）配列：配列番号：１０：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１１：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１２：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“c-fos”
（xi）配列：配列番号：１３：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“p120”
（xi）配列：配列番号：１４：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：細胞レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“EGFレセプター”
（xi）配列：配列番号：１５：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：細胞レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“EGFレセプター”
（xi）配列：配列番号：１６：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：p53腫瘍サプレッサー
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..19
（xi）配列：配列番号：１７：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：p53腫瘍サプレッサー
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
（xi）配列：配列番号：１８：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“VLA-4”
（xi）配列：配列番号：１９：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２０：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２１：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..19
他の情報：／注＝“ICAM”
（xi）配列：配列番号：２２：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“ELAM-1”
（xi）配列：配列番号：２３：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：インテグリンまたは細胞−細胞接着レセプター
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“ELAM-1”
（xi）配列：配列番号：２４：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“c-myb”
（xi）配列：配列番号：２５：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..15
他の情報：／注＝“c-myc”
（xi）配列：配列番号：２６：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核トランスアクティベータープロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“cdc2キナーゼ”
（xi）配列：配列番号：２７：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：核オンコプロテイン
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..18
他の情報：／注＝“PCNA”
（xi）配列：配列番号：２８：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：オリゴヌクレオチド
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：２９：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“5'−末端における最初のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３０：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：HSV標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..10
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３１：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３２：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３３：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..21
他の情報：／注＝“5'−末端から数えた第１、第11および第22番目のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３４：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２０塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..20
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３５：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：c-fos標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..17
他の情報：／注＝“最初のおよび最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３６：
（ｉ）配列の特徴：
配列の長さ：２２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル配列：Yes
（iii）アンチセンス：Yes
（vi）起源：
生物名：HSV標的
（ix）配列の特徴：
名称／記号：exon
存在位置：1..22
他の情報：／注＝“3'−末端における最後のヌクレオチド結合はα−ヒドロキシ（ｏ−ニトロフェニル）メチルホスホネート ブリッジである”
（xi）配列：配列番号：３７：
Claims (8)
- 式Ｉ
〔式中、
ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C18）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'はアリール、ヘテロアリールまたはアルキルであり、
Ｗはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシンから誘導される5'-、3'-または2'-ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは場合により置換されたアルキル基であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは下記の式IIの基でありそしてＲは下記の式II'
｛上記式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜50の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C18）−アシルまたは式
（ここでR4はO、S、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C18）−アルキル基である）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C18）−アルキル、Ｏ（C1〜C18）−アシル、Ｆ、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C6）−アルキルまたは（C1〜C6）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基であり、
式Ｉ中に含まれる塩基の合計は15個以上である〕で表される化合物。 - ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C8）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C5）−アルキル、ハロゲン、NO2、CN、（C1〜C6）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C4）−アルキルアミノ、（C1〜C8）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C13）−ヘテロアリール；または
（C1〜C16）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、ハロゲン、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシンから誘導される5'-、3'-または2'-ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有する（ここでＲおよびＷは同一であるかまたは相異なることができる）かまたはＲは（C1〜C16）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C1〜C8）−アシルオキシ、（C1〜C18）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜30の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C12）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C12）−アルキルである）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C12）−アルキル、Ｏ（C1〜C12）−アシル、Cl、N3、NH2またはNHR6（ここでR6は（C1〜C3）−アルキルまたは（C1〜C3）−アシルである）であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である請求項１記載の式Ｉの化合物。 - ＹはOH、SH、OAcまたはSAc（ここでAc＝（C1〜C3）−アシルであって、場合により１〜３回不飽和である）であり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されている（C6〜C14）−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C8）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和であって、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシンから誘導される5'-、3'-または2'-ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C8）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができ、そしてハロゲン、CN、（C3〜C6）−アシルオキシ、（C8〜C18）−アルコキシからなる群より選択される２個までの基で場合により置換されている）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜20の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C8）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C8）−アルキルである）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C8）−アルキル、Ｏ（C1〜C8）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である請求項１または２に記載の式Ｉの化合物。 - ＹはOHであり、
R'は（C1〜C3）−アルキル、Ｆ、Cl、NO2、CN、（C1〜C4）−アルコキシ、アミノ、（C1〜C3）−アルキルアミノ、（C1〜C6）−ジアルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリール｛ここでCH2基がオキシによりさらに置換されうる（C3〜C6）−アルキレン基がさらにこのアリール基に縮合することも可能である｝；
Ｎ、ＯおよびＳからなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する（C3〜C6）−ヘテロアリール；または
（C1〜C8）−アルキル（これは分枝鎖または非分枝鎖状、飽和または１〜３回不飽和、好ましくはα−位で不飽和結合を有する共役形態で不飽和であり、Cl、CN、NO2および（C1〜C3）−アルコキシからなる群より選択される３個までの互いに独立した置換基で場合により置換されている）であり、
Ｗはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシンから誘導される5'-または3'-ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり、または
ＷおよびＲはそれらを結合しているホスホネート基と一緒になってオリゴヌクレオチドを形成し、ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'｛各式中、Ｘはオキシであり、
Ｂは互いに独立していて、ヌクレオチド塩基であり、
ｎは互いに独立していて、０〜15の整数であり、
R1およびR2は互いに独立していて、Ｈ（C1〜C4）−アシルまたは式
（ここでR4はＯ、Ｓ、CH3またはCHYR'（ここでR'およびＹは前述の定義を有する）でありそしてR5は場合により置換された（C1〜C3）−アルキル基である）の基であり、
R3は互いに独立していて、Ｈ、Ｏ（C1〜C3）−アルキル、Ｏ（C1〜C3）−アシル、ClまたはN3であり、
そして括弧はR3および隣接ホスホニル基が2'または3'の位置にあることができることを示している｝の基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。 - ＹはOHであり、
Ｗはアデニン、シトシン、グアニン、チミン、プリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンまたは５−クロロシトシンから誘導される5'-または3'-ヌクレオシド類似体であり、
ＲはＷの意味を有するかまたは（C1〜C4）−アルキル基（これは分枝鎖または非分枝鎖状であることができる）であり、
R'はCl、NO2、CN、（C1〜C3）−アルコキシ、アミノおよび（C1〜C3）−アルキルアミノからなる群より選択される互いに独立した３個までの基で場合により置換されているC6−アリールである請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。 - 請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物の製造において、
ａ）式IIIの化合物を式IVの化合物と反応させるか、
または
ｂ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物と反応させるか、
または
ｃ）式Ｖの化合物をいずれか所望の順序で、縮合剤を用いて式VIの化合物および式VIIの化合物と反応させるか、
（式中、SGは保護基であって、場合により式Ｉの化合物を得るために除去される）、または
3'(2')-末端Ｈ−ホスホネート基および保護された5'-ヒドロキシ基を有するヌクレオチド単位を活性化剤の存在下で遊離5'-ヒドロキシ基および保護された3'(2')-ヒドロキシ基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させてＨ−ホスホネートジヌクレオシドを得、これをアルデヒドと縮合してジヌクレオシドα−ヒドロキシアルキル（アリール）ホスホネートを得、それをその活性誘導体を得るための反応後にさらに別の（オリゴ）ヌクレオチド断片と反応させてオリゴヌクレオチドを得、次いで一時的に導入した保護基を除去する、すなわち
ｉ）3'(2')-末端リン（III）またはリン（Ｖ）基を有するヌクレオチド単位を縮合剤の存在下でさらに別のヌクレオチド単位または成長するオリゴヌクレオチド鎖の遊離5'-ヒドロキシ基と反応させるか、または
ii）その活性誘導体またはオリゴヌクレオチド類似体を同じ手法で断片中に作成し、その他の官能基保護のためにｉ）またはii）によって得られたオリゴヌクレオチド中に一時的に導入した保護基を除去し、こうして得られた式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体（ここでＷは式IIの基でありそしてＲは式II'の基である）を場合によりそれらの生理学的に許容し得る塩に変換することを特徴とする前記の製造方法。 - 請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物からなる遺伝子発現阻害剤。
- 請求項１〜５のいずれか１項に記載の１種以上の式Ｉの化合物を含有するウイルス性疾患抑制用医薬。
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