FI115399B

FI115399B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten metyylifosfonihappoestereiden valmistamiseksi

Info

Publication number: FI115399B
Application number: FI956341A
Authority: FI
Inventors: Eugen Uhlmann; Chris Meier
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1995-12-29
Publication date: 2005-04-29
Also published as: DE4321946A1; NO955352L; JPH08512039A; FI956341A0; JP3831407B2; ES2165391T3; US6028182A; NO955352D0; WO1995001363A1; EP0707591A1; CA2165971A1; PT707591E; EP0707591B1; FI956341A; CA2165971C; ATE206130T1; DK0707591T3; NO319860B1; AU698928B2; AU7073594A

Description

115399

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten metyylifosfoni-happoestereiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusien terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisten metyylifosfonihappoestereiden valmistusta.

Tunnetaan ennestään vaikuttavien aineiden fosfory-loituja johdannaisia, joita käytetään osittain myös farmaseuttisiin tarkoituksiin. Niinpä esimerkiksi julkaisussa J. Med. Chem. 36 (1993) 1048 - 1052 kuvataan fosfoamidaat- 10 tiestereitä AZT:n kanssa. Näiden yhdisteiden antiviraalinen aktiivisuus on kuitenkin kymmenesosa AZT:n aktiivisuudesta ja mainittujen yhdisteiden toksisuus on viisinkertainen AZT:hen nähden. Julkaisussa J. Med. Chem. 34 (1991) 1830 - 1837 kuvataan AZT-pitoisia fosfotriesterijohdannaisia; myös 15 näiden yhdisteiden kohdalla on aktiivisuus heikompi ja toksisuus suurempi kuin AZT:11a. Vastaavanlaisia tuloksia saavutetaan sukulaisyhdisteillä, joita selostetaan julkaisussa J. Org. Chem. 57 (1992) 7300 - 7307.

Pyrittäessä valmistamaan vaikuttavien aineiden fos-20 foryloituja johdannaisia, joilla ei ole tekniikan tasoa , vastaavien asianomaisten yhdisteiden haittapuolia, on nyt * * « i · havaittu, että kaavan (I) mukaisilla metyylifosfonihappoes- * * · ···! tereillä on erinomaisia ominaisuuksia. Keksinnön kohteena • · > • » · : .· on menetelmä sellaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joil- 25 la on kaava (I), • · * * · ©w

V ·’ *'-CH-fiT

I il "Ci V-*-J T 0

t t I

»M * missä / ,30 Y on OH-, SH-, OAc- tai SAc-ryhmä, joissa Ac = * < · ' ) Ci-i8-asyyliryhmä, joka on mahdollisesti 1-3 -kertaisesti * » » * · tyydyttymätön, j * : R’ on aryyli-, heteroaryyli- tai alkyyliryhmä, ·;·· W on farmaseuttisesti vaikuttava 5'-, 3'- tai 35 2'-nukleosidianalogi, 2 115399 R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W, jolloin R ja W voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tai R on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä tai W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kans-5 sa, johon ne ovat sitoutuneet, oiigonukleotidin, jolloin W on kaavan (II) mukainen ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen ryhmä, · o--( , e --1 * ·

H H

, .1 F —f--0—", „ I F F 0----s . £

s J \τΊ L ·' jrJ

I jj3 (J

c*’ (II) (IIT) 10 joissa X on oksi-, sulfaanidiyyli- tai mety-leeniryhmä, ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, n on riippumattomasti kokonaisluku 0-50, 15 kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riippumattomasti H- atomi, Ci-i8-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on • · •

• * I

• * t 0 • · · * * · Il • · · · v *’ 2 0 R4-P-OR5 jossa R4 on O"-, S"-, CH3- tai CHYR'-ryhmä, jossa .»* ; R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdolli- * » * 25 sesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1 - 18 hiiliato-. mia, • V kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, OCx-i8-alkyyli - tai OCi_i8-asyyliryhmä, F- tai Cl-atomi tai 3 115399 N3-, NH2- tai NHR6-ryhmä, jossa R6 on Ci-6-alkyyli- tai -asyyliryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3'-asemassa.

5 Edullisia ovat sellaiset kaavan I mukaiset yhdis teet, joille on tunnusomaista, että Y on OH-, SH-, OAc- tai SAc-ryhmä, joissa Ac =

Ci-is-asyyliryhmä, joka on mahdollisesti 1-3 -kertaisesti tyydyttymätön, 10 R1 on aryyliryhmä, jossa on 6 - 14 C-atomia ja joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien joukosta: Ci-s-alkyyliryhmä, halogeeniatomi ja N02-, CN-,

Ci-6-alkoksyyli-, amino-, Ci-4-alkyyliamino- ja Ci-8-dialkyy-15 liaminoryhmät, jolloin aryyliryhmään voi myös olla kondensoituneena C3-s-alkyleeniryhmä, jossa yksi CH2-ryhmä voi myös olla korvautunut oksiryhmällä; heteroaryyliryhmä, jossa on 3 - 13 C-atomia ja korkeintaan kolme N-, O- ja S-atomien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut 20 tai suoraketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyydyt tymätön Ci-i6-alkyyliryhmä, joka on mahdollisesti substi- « · · tuoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla • substituent ilia, jotka valitaan halogeeniatomien ja CN-, .* .· N02- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, ’. *, * 25 W on farmaseuttisen vaikuttava 5'-, 3'- tai : : 2 '-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W, jolloin R ja W voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tai R on Ci-6-alkyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjuinen .·*·, 30 ja on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toi sistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan halo-*: geeniatomien ja CN-, Ci-i8-asyylioksi- ja Ci-i8-alkoksyyli- ryhmien joukosta, tai

W ja R muodostavat yhdessä f osf onaattiryhmän kans-35 sa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W

4 115399 on kaavan II mukainen ryhmä ja R on kaavan II' mukainen ryhmä, joissa X on oksi- tai sulfaanidiyyliryhmä, ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, 5 n on riippumattomasti kokonaisluku 0-30, kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riipumattomasti H-atomi, Ci-i2-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on 0

10 II

r4-p-or5 jossa R4 on O- tai S-atomi tai CH3- tai CHYR'-ryhmä, jossa 15 R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1 - 12 hiiliatomia, kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, OCi-12-alkyyli- tai OCi-12-asyyliryhmä, Cl-atomi tai N3-, NH2-20 tai NHRs-ryhmä, jossa R6 on Ci-3-alkyyli- tai -asyyliryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3'-asemassa.

y,“. Erityisen edullisia ovat sellaiset kaavan I mukai-• » · 5 115399 S-atomien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut tai suoraketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyydyt tymätön Ci-8-alkyyliryhmä, joka on mahdollisesti substi-tuoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla 5 substituentilla, jotka valitaan Cl-atomien ja CN-, N02- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, W on 5'-, 3'- tai 2'-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai Ci-6-al-kyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjuinen 10 ja on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kahdella ryhmällä, jotka valitaan halogeeniatomien ja CN-, C3-6-asyyli-oksi- ja Cs-is-alkoksyyliryhmien joukosta, tai W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W 15 on kaavan II mukainen ryhmä ja R on kaavan II' mukainen ryhmä, joissa X on oksiryhmä, ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, n on riippumattomasti kokonaisluku 0-20, 20 kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riipumattomasti H- atomi, Ci-s-cisyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on < · ...V o ; ·1 25 R4-P-OR5

*·.1,·· I

• ( ·

* » I

· jossa R4 on O- tai S-atomi tai CH3- tai CHYR1-ryhmä, jossa R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ·;· 30 ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on • •ti 1-8 hiiliatomia, • 1 i ,1 , kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, • 1 1 * j OCi-8-alkyyli- tai OCi-8-asyyliryhmä, Cl-atomi tai N3-ryhmä, ja 35 aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä • · ;«>j oleva f osf onyyliryhmä voivat olla 2’- tai 3'-asemassa.

6 115399

Aivan erityisen edullisia ovat sellaiset kaavan I mukaiset yhdisteet, joille on tunnusomaista, että Y on OH-ryhmä, R' on aryyliryhmä, jossa on 6 C-atomia ja joka on 5 mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien joukosta: Ci-3-alkyyliryhmä, F- ja Cl-atomit ja NO2-, CN-, C1-4-I alkoksyyli-, amino-, C1-3-ai kyy li amino- tai Ci-6-dialkyyli- aminoryhmät, jolloin aryyliryhmään voi myös olla kondensoi-10 tuneena C3-6-aikyleeniryhmä, jossa yksi CH2-ryhmä voi myös olla korvautunut oksiryhmällä; heteroaryyliryhmä, jossa on 3-6 C-atomia ja korkeintaan kolme N-, 0- ja S-atomien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut tai suora-ketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyydyttymä-15 tön, edullisesti konjugoidusti tyydyttymätön, tyydyttymät- tömän sidoksen alfa-asemassa sisältävä, i-s-alkyyliryhmä, joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla substituentilla, jotka valitaan Cl-atomien ja CN-, N02- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, 20 W on 5'- tai 3'-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai C1-4-‘ * alkyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjui- nen, tai * * j ' : W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kans-

::: 25 sa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W

• ; ; on kaavan II mukainen ryhmä ja R on kaavan II' mukainen .' j', ryhmä, joissa X on oksiryhmä, . ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, ','.’1 30 n on riippumattomasti kokonaisluku 0 - 15, « · kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riipumattomasti H-atomi, Ci-4-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on * I M t « * 0

i .·' 35 II

r4-p-or5 7 115399 jossa R4 on 0- tai S-atomi tai CH2- tai CHYR'-ryhmä, jossa R1 ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1-3 hiiliatomia, 5 kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, 0Ci-3-alkyyli- tai OCi-3-asyyliryhmä, Cl-atomi tai N3-ryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3'-asemassa.

10 Erityistä merkitystä on lisäksi sellaisilla kaavan I mukaisilla yhdisteillä, joille on tunnusomaista, että Y on OH-ryhmä, W on 5'- tai 3'-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai Ci-4-al-15 kyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjuinen, R' on aryyliryhmä, jossa on 6 C-atomia ja joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien joukosta: Cl-atomi ja N02-, CN-, Ci-3-alkoksyyli-, amino- ja 20 Ci-3-alkyyliaminoryhmät.

Edellä useamman kerran esiintyvien substituenttien ’· *·* yhteydessä (esimerkiksi "B") käytetty ilmaus "riippumatto- tt’<* masti" tarkoittaa, että kulloisessakin yhdessä yhdisteessä kulloinkin olevat substituentit voivat olla erilaisia, mikä : 25 pätee myös n kertaa toistuviin yksiköihin.

• « * j Esimerkkejä edellä olevissa määritelmissä maini- tuista a syy li ryhmistä ovat asetyyli-, butyryyli-, pivaloyy-

• * I

li-, krotonoyyli-, pentanoyyli-, heksanoyyli-, oktadekano-. yyli- tai oleyyliryhmä.

30 Soveltuvia alkyyliryhmiä ovat esimerkiksi metyyli-, *··* etyyli-, propyyli-, butyyli-, isobutyyli-, pentyyli- tai heksyyl i ryhmä.

*:*·: Esimerkkejä aryyliryhmistä ovat fenyyli- tai naf- tyyliryhmä.

» · » * » 1 * » 8 115399

Soveltuvia heteroaryyliryhmiä ovat esimerkiksi py-ridyyli-, oksatsoli-, furyyli-, bentsofuryyli- tai feno-tiatsinyyliryhmä.

Esimerkkejä alkyyliaminoryhmistä ovat metyyli- ja 5 dimetyyliaminoryhmät.

Esimerkkejä dialkyyliaminoryhmistä ovat dimetyy-liamino- ja dietyyliaminoryhmät.

Keksinnön mukaisesti erityisen sopivia nukleosidi-analogeja ovat adeniini-, sytosiini-, guaniini-, tyrniini-, 10 puriini-, 7-deatsa-adeniini-, 7-deatsaguaniini- tai 5-kloo- risytosiiniemäksistä johdetut yhdisteet, erityisesti esimerkiksi 31-deoksi-3'-atsidotymidiini, 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini, 2',3'-dideoksitymidiini, 2 ' ,3 1 - dideoksiuridiini, 2',31-dideoksiadenosiini, 2',3'-dideoksi-15 inosiini, 3'F,3'-deoksitymidiini, asykloviiri ja gansyklo-viiri.

Edellä mainitut ryhmät R1 2 3 voivat olla mahdollisesti substituoituja halogeeniatomeilla, edullisesti Cl-atomeilla tai CF3-, CN-, NH2- tai Ci-6-, edullisesti Ci-3-alkoksyyli-20 ryhmillä.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä valmistetaan keksin-*· '·* non mukaisesti siten, että ;* a) saatetaan kaavan III mukainen yhdiste reagoimaan kaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa, • 1 . 25 t 1 | v ; μ

0 OR

..;i* (m) (iv) * * s * · * * t ( · 0 b) saatetaan kaavan V mukainen yhdiste halutussa järjestyksessä ja käyttämällä kondensointiainetta reagoi- 2 * » » 3 > maan kaavan VI mukaisten yhdisteiden kanssa tai tilit 9 115399 i s ! c) saatetaan kaavan V mukainen yhdiste halutussa järjestyksessä ja käyttämällä kondensointlainetta reagoimaan kaavan VI ja kaavan VII mukaisten yhdisteiden kanssa, o

ii/CK

· W0H * R0H

^ ΌΗ 3-S5 (V) (VI) (VII) 5 jolloin SG on suojausryhmä, joka kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi mahdollisesti lohkaistaan pois, tai saatetaan nukleotidiyksikkö, jossa on 3 ' (2')-terminaalinen H-fosfonaattiryhmittymä ja suojattu 5'-hydroksyy-10 liryhmä reagoimaan toisen nukleotidiyksikön kanssa, jossa on vapaa 5'-hydroksyyliryhmä ja suojattu 3 ' (21)-hydroksyy-liryhmä, aktivointiaineen läsnä ollessa H-fosfonaattidinuk-leosidiksi ja kondensoidaan tämä aldehydin kanssa dinukleo-sidi-Qf-hydroksialkyyli (aryyli) fosfonaatiksi, joka reagoitu-15 aan aktivoiduiksi johdannaisikseen reagoi muiden (oligo)-nukleotiditragmenttien kanssa oligonukleotideiksi, jolloin , tilapäiset suojausryhmät poistetaan, tai a) saatetaan nukleotidiyksikkö, jossa on 3 ' (2 ')- ·· terminaalinen fosfori(III)- tai fosfori(V)-ryhmittymä, rea- • * · : 20 goimaan toisen nukleotidiyksikön tai kasvavan oligonukle- otidiketjun vapaan 5 1 -hydroksyyliryhmän kanssa kondensoin-' ' : tiaineen läsnä ollessa tai

• « · I

b) niiden aktivoitujen johdannaisten kanssa, tai muodostetaan oligonukleotidianalogeja fragmenteit- 25 tain samalla tavalla, lohkaistaan pois kohdan a tai b mu-kaisesti valmistettuihin oligonukleot ideihin muiden funk-• tionaalisten ryhmien suojaamiseksi tilapäisesti lisätyt h suojausryhmät ja muutetaan siten saadut oligonukleoti- *·"· dianalogit, joilla on kaava I, jossa W on kaavan II mukai- jV. 30 nen ryhmä ja R on kaavan II' mukainen ryhmä, mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen.

* i 10 115399

Kohdassa a kuvattu reaktio etenee edullisesti seu-raavissa olosuhteissa: A) kaavan III mukaisen fosfonaattidiesterin reaktio kaavan IV mukaisten asianmukaisesti substituoitujen aldehy- 5 dien kanssa orgaanisessa liuotteessä, esimerkiksi kuivassa trietyyliamiinissa (NEt3) korotetussa lämpötilassa, edullisesti kiehumislämpötilassa; B) kaavan III mukaisen fosfonaattidiesterin reaktio kaavan IV mukaisen aldehydin kanssa kuivassa aproottisessa 10 liuotteessa, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa (THF), johon on lisätty orgaanista emästä, esimerkiksi NEt3:a tai kiniiniä, huoneenlämpötilassa ± 10 °C.

Reaktion tapahduttua tuotteet puhdistetaan tunnetuin menetelmin, esimerkiksi kromatografisesti.

15 Kohdissa b ja c kuvatut reaktiot etenevät tekniikan tason mukaisesti tunnetuissa esteröintiolosuhteissa. Erityisen hyviä tuloksia saadaan muodostamalla aktiivinen es-terivälituote, esimerkiksi triatsolilla/dimesityleenisulfo-nihappokloridilla. Soveltuvia suojausryhmiä, jotka mahdol- 20 lisesti poistetaan reaktion jälkeen tekniikan tasoa vastaavin menetelmin, ovat esimerkiksi alkyylisilyyli-, alkyyli-

• * I

aryylisilyyli- ja asyyliryhmät, erityisesti t-butyylidime-tyylisilyyliryhmä. Viimeksi mainittu suojausryhmä voidaan

* · I

• V edullisesti lohkaista irti ammoniumfluoridilla metanolissa.

25 Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa myös ste- i reoselektiivisesti erilaisin tekniikan tasoa vastaavin me- ♦ · » * netelmin. Yksi edullinen malli a-hiiliatomin tekemiseksi kiraaliseksi on t-butyylidimetyylisilyylisuojatun alkoholin (kaavan V mukainen yhdiste) C-anionin reaktio ( + ) -efedrii- 30 nistä kiraaliseksi apuaineeksi johdetun oksatsafosfolidii- Ί* nin kanssa. Oksatsafosfolidiinia saadaan esimerkiksi fosfo- *,*·· ryylikloridin reaktiolla ( + )-efedriinin kanssa saannon ol- lessa 60 % ja diastereomeerisuhteen ollessa 24:1. Yksi toi-nen mahdollisuus kiraalisuuden aikaansaamiseksi on enan- * i>; 35 tioselektiivinen oksatsaborolidiinikatalysoitu pelkistys [Tetrahedron Lett. 31 (1990) 611].

11 115399

Edellä mainittujen reaktioiden toteuttamiseen tarvittavat lähtöaineet ovat kaupallisia tuotteita, tai ne voidaan valmistaa yleisesti tunnettujen ohjeiden mukaisesti. Esimerkeissä kuvataan muutamia edullisia valmistusmene-5 telmiä. Lähtöaineina toimivat kaavan III mukaiset nukleosi-di-H-fosfonaattidiesterit voidaan valmistaa esimerkiksi saattamalla di-isopropyyliamiinidikloorifosfiini reagoimaan asianmukaisten nukleosidien kanssa fosforiamidiitiksi, joka voidaan tetratsolilla aktivoituna hydrolysoida vedellä suo-10 raan "yksiastiareaktiolla" kaavan III mukaisiksi yhdisteiksi .

Vaihtoehtoisesti synteesi onnistuu esimerkiksi es-teröimällä 5'-nukleosidin fosforihappomonoesteri toisen nukleosidekvivalentin kanssa pivaloyylikloridilla aktivoi-15 den. 5'-nukleosidin fosforihappomonoesteri on valmistettavissa saattamalla fosforitrikloridi reagoimaan imidatsolin kanssa fosforitri-imidatsoliksi, asianomaisen nukleosidin kanssa tapahtuneen reaktion ja sitä seuraavan hydrolyysin j älkeen.

20 Kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa on kaavan II ja kaavan II' mukainen ryhmä, valmistetaan edullisesti siten, ' * että valmistetaan periaatteessa edellä kuvatulla tavalla dimeerisiä kaavan XI mukaisia nukleotideja, jotka sisälly- • '_·* tetään sitten tavanomaisin menetelmin oligonukleotideihin.

: 25 Voidaan esimerkiksi (kaavio 1) saattaa kaavan VIII mukainen

• 5'-suojattu 5 ' -hydroksyy li komponentti reagoimaan kaavan IX

.’j·. mukaisen 3'-suojatun 5 '-hydroksyylikomponentin kanssa kon- • densointiaineen, kuten pivaloyylikloridin, läsnä ollessa pyridiinissä kaavan X mukaiseksi dinukleosidi-H-fosfonaat-30 tiesteriksi. Tämä saatetaan sitten reagoimaan asianmukaisen • » aldehydin kanssa dinukleosidin hydroksialkyylifosfonaatik- !/·· si. Vapaa u-hydroksyyliryhmä täytyy suojata jatkoreaktioita varten, edullisesti TBDMS (t-butyylidimetyylisilyyli) -suo- :Λ jausryhmällä, joka lohkaistaan synteesin lopuksi pois fluo-

t I

35 ridi-ioneilla. Kaavan XI mukaiset yhdisteet saatetaan esimerkiksi 31-suojausryhmän (SG2) poistamisen jälkeen reagoi- 12 115399 maan kaavan XII mukaisiksi fosforiamidiiteiksi, jotka voidaan fosforiamidiittianalogeina sisällyttää tunnetuin menetelmin oligonukleotideihin. Lääkeaineen esiasteina toimivia nukleotideja voidaan kuitenkin muodostaa myös monomeerisina 5 yksiköinä kondensoimalla asianmukaisesti suojattuja nukleo-sidi-3'(tai 5’)-fosfonaattiestereitä 3'(tai 5')-suojatun nukleosidin 5'(tai 3')-hydroksyyliryhmän kanssa (kaavio 2).

On edullista käyttää kaavan XIII mukaisia nukleosidi-3'-fosfoniamidaatteja [joissa (P) = P-N-(i-propyyli) 2] , joita 10 voidaan sisällyttää oligonukleotideihin tavanomaisin mene telmin. Kaavan I mukaisten oligonukleotidianalogien valmistus, joissa on kaavan II tai II' mukainen ryhmä, tapahtuu samalla tavalla kuin biologisten oligonukleotidien synteesi liuoksessa tai edullisesti kiinteällä faasilla, mahdolli-15 sesti automaattisen synteesilaitteen avulla.

* t » » 1 • « ♦ » • » t < » • 1 » * · » t 1 t • · · > · 13 115399

Kaavio 1 H» p£ H ^ h_1~o_w

H— J—o<-J °SCi W

" fi5 0 1 OSG2

Vili IX X

"'“"Ti 1.) R— Π3 --* ^>CM—Ä—0 l^o^f 2 . ) SG-reagenssi OSG 0 \ / \! ft OSG2 • · > : xi * 1 1 I M « · CK, SG-reagenssi, Cl-SI-C(CK,)j 111 SC1 - dimetoksitrityyli *;· esim. I Iprop .1·1. 5 SCJ - -P-K<^ • · ‘ \ ^1 p r e p

, X0CHjCH2-CN

14 115399

Kaavio 2

sc’-0-1 0 B

., n* , H*Tj - “'~Ύι 0>cK-(i) |i> p· ' 0-5 G2 R\ 0 >CH_i_o , osc o \ / 0-SG*

XIII XIV XV

. JOcj j R5

OH K

0- S G 2

XVI XVII

S G 1 , S G2 * ortogonaalisia suojausryhmiä | ||

;·!: T

: .* /"“λ I

. esim. S G 1 · dimetoksitrityyli (HjC-0“—\ yJj-C- • * · • * * » ; ; ; esim. S G2 " levulinoyy li - C — ( C H * ) «-C-CH*

II II

0 0 KW kondensointiaine I e» p=<io<-> *. '! hapoille herkkä * ί *1 i r II (P) . p-n<Cr

» I

15 115399

Kaavan I mukaisilla yhdisteillä ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävillä suoloilla on niiden perustana olevien vaikuttavien aineiden farmaseuttinen vaikutus. Koska niillä on lisäksi edullisia toksikologisia ja farmakoki-5 neettisiä ominaisuuksia, ovat ne arvokkaita kemoterapeutti-siä aineita.

Kaavan (I) mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia lääkkeissä, erityisesti virussairauksien torjuntaan tarkoitetuissa lääkkeissä, joille on tunnusomaista, että ne si-10 sältävät yhtä tai useampaa kaavan (I) mukaista yhdistettä.

| Niitä voidaan antaa suun kautta, lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti.

Lääkkeitä, jotka sisältävät vaikuttavana aineena yhtä tai useampaa yleisen kaavan I mukaista yhdistettä, 15 voidaan valmistaa sekoittamalla kaavan I mukaisia yhdisteitä yhden tai useamman farmakologisesti hyväksyttävän kantaja- tai laimennusaineen, kuten puskuriaineiden, kanssa ja saattamalla ne sopivan valmisteen muotoon.

Laimennusaineina mainittakoon esimerkiksi polygly-20 kölit, etanoli ja vesi. Puskuriaineet ovat esimerkiksi orgaanisia yhdisteitä, kuten esimerkiksi N',N'-dibents-'* yylietyleenidiamiini, dietanoliamiini, etyleenidiamiini, N- <ti ;‘ metyyliglukamiini, N-bentsyylifenyylietyyliamiini, dietyy- : * : liamiini ja tris(hydroksimetyyli)aminometaani, tai epäor- ; 25 gaanisia yhdisteitä, kuten esimerkiksi fosfaattipuskuri, : natriumvetykarbonaatti ja natriumkarbonaatti. Suun kautta

t I I I

tapahtuvan annon yhteydessä tulevat edullisesti kyseeseen • · » puskuriaineita sisältävät tai sisältämättömät vesisuspensi-. ot tai -liuokset. On myös mahdollista antaa vaikuttavia ai- i ’h’,’ 30 neita sellaisinaan ilman kantaja- tai laimennusaineita so- i « pivassa muodossa, esimerkiksi kapseleissa.

.***.: Kaavan I mukaisten yhdisteiden tai niiden far- ·;··· maseuttisesti hyväksyttävien suolojen sopivat annokset riippuvat voimakkaasti kulloinkin perustana olevista vai- • · · ‘ \ 35 kuttavista aineista; esimerkiksi AZT:n ollessa kyseessä ne ovat vähintään noin 0,4 g, edullisesti 0,5 g, ja korkein- 16 115399 taan 20 g vuorokaudessa noin 75 kg painavalle aikuiselle. Voidaan antaa kerta-annoksia tai yleensä useita annoksia, jolloin kerta-annos voi sisältää noin 50-1 000 mg vaikuttavaa ainetta.

5 Kaavan (I) mukaiset oligonukleotidianalogit (kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa on kaavan II ja kaavan II' mukainen ryhmä) ovat lisäksi käyttökelpoisia geenien ilmentymisen estäjinä (antisense-oligonukleotidit, ribotsyymit, sense-oligonukleotidit ja kolmoissäikeen muodostavat oligo-10 nukleotidit). Oligonukleotideja käytetään lisääntyvässä määrin geenien ilmentymisen estäjinä [G. Zon, Pharmaceutical Reseach 5 (1988) 539; J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12, Macmillan Press 1989; C. Helene ja J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 99 (1990) 15 1049; E. Uhlmann ja A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543] . Antisense-oligonukleotidit ovat nukleiinihappofrag-mentteja, joiden emässekvenssi on komplementaarinen inhiboitavalle mRNA:11e Tämä kohde-mRNA voi olla peräisin soluista, viruksista tai muista patogeeneistä. Soluperäisinä 20 kohdesekvensseinä tulevat kyseeseen esimerkiksi reseptori en, entsyymien, immuunimodulaattoreiden, ionikanavien tai » 1 · onkogeenien sekvenssit. Virusten lisääntymisen estämistä • * * ••h antisense-oligonukleotidien avulla on kuvattu esimerkiksi : ,· RSV:n (Rousin sarkoomavirus), HSV-l:n ja -2:n (tyypin I ja 25 II herpes simplex -virukset), HIV:n (ihmisen immuunikatovi- : rus) ja influenssavirusten suhteen. Tällöin käytetään oli- gonukleotideja, jotka ovat komplementaarisia virusten nukleiinihapoille. Sense-oligonukleotidit on puolestaan suun-niteltu sekvenssiltään sellaisiksi, että ne sitovat ("van-.···, 30 gitsevat") esimerkiksi nukleiinihappoja sitovia proteiineja i* tai nukleiinihappoja prosessoivia entsyymejä ja estävät si- *: ten niiden biologisen aktiivisuuden (Helene 1990) . Virus- kohteina mainittakoon tässä yhteydessä esimerkiksi kään-teistranskriptaasi, DNA-polymeraasi ja transaktivaattori->ii>; 35 proteiinit. Kolmoissäikeen muodostavien oligonukleotidien kohteena on yleensä DNA, ja ne muodostavat siihen sitoudut- 17 115399 tuaan kolmoiskierrerakenteen. Antisense-oligonukleotidien avulla estetään yleensä mRNA-.n prosessointi (silmukoitumi-nen jne.) tai sen translaatio proteiiniksi, kun taas kol-moissäikeen muodostavat oligonukleotidit estävät DNA:n 5 transkriptiota tai replikaatiota (Helene et ai. 1990; Uhl- mann ja Peyman 1990). On kuitenkin myös mahdollista sitoa j yksisäikeisiä nukleiinihappoja ensimmäisessä hybridisaa- [ tiossa antisense-oligonukleotidilla, jolloin muodostuu kak- soissäie, joka sitten muodostaa toisessa hybridisaatiossa 10 kolmoissäikeen muodostavan oligonukleotidin kanssa kolmois- säierakenteen. Antisense- ja kolmoissäikeen muodostavat si-toutumisalueet voivat tällöin olla joko kahdessa erillisessä oligonukleotidissa tai myös yhdessä oligonukleotidissa. Synteettisten oligonukleotidien yksi lisäkäyttö ovat niin 15 kutsutut ribotsyymit, jotka hävittävät kohde-RNA:ta ribo- nukleaasiaktiivisuutensa seurauksena [J. J. Rossi ja N. Sarver, TIBTECH 8 (1990) 179].

Oligonukleotidit ovat luonnossa esiintyvässä muodossaan vähän tai täysin sopimattomia useimpiin mainittui-20 hin käyttötarkoituksiin. Niitä täytyy muuntaa kemiallisesti siten, että ne täyttävät erityisvaatimukset. Jotta oligo-nukleotideja voitaisiin käyttää biologisessa järjestelmis-sä, esimerkiksi virusten lisääntymisen estämiseen, täytyy ; ',· niiden täyttää seuraavat edellytykset: : : : 25 1. Niillä täytyy olla riittävän suuri stabiilius in • vivo -olosuhteissa, siis sekä seerumissa että solun sisäl- • · · · • · · lä.

• I » 2. Niiden täytyy olla sellaisia, että ne pystyvät t;. läpäisemään solu- ja tumakalvon.

*!!! 30 3. Niiden täytyy sitoutua fysiologisissa olosuh- • · teissä emässpesifisesti kohdenukleiinihappoonsa, jotta • · V·· niillä olisi inhiboiva vaikutus.

Kun nukleotidien välisiä fosfaattiryhmiä muutetaan pysyvästi, muuttuvat oligonukleotidien ominaisuudet usein » · * 35 dramaattisesti. Esimerkiksi fosforitioaattioligonukleotidit vaikuttavat usein sekvenssiepäspesifisesti.

18 115399

Kaavan (I) mukaisilla oligonukleotidianalogeilla on spesifinen vaikutus ja parannettu stabiilius seerumissa ja ne muuttuvat biologisissa järjestelmissä (seerumissa, elimissä, soluissa) takaisin luonnollisiksi fosfodiesterioli-5 gonukleotideikseen.

Yksi tai useampi oligonukleotideissa oleva nukleo- i | tidien välinen fosfaattiryhmä voidaan muuttaa lääkeaineen i esiaste -muotoon. On havaittu, että jo oligonukleotidit, joissa on 3'- ja/tai 5'-terminaalinen esiastemuunnos, ovat 10 seerumissa stabiilimpia kuin luonnossa esiintyvät fosfo- diesterioligonukleotidit.

Keksintö ei rajoitu a- ja β-Ό- tai L-ribofuranosi-deihin, a- ja β-Ό- tai L-deoksiribofuranosideihin ja vastaaviin karbosyklisiin viisirengasanalogeihin, vaan pätee 15 myös oligonukleotidianalogeihin, jotka koostuvat muista so-kerirakenneyksiköistä, esimerkiksi renkaan suhteen suurennettuihin ja pienennettyihin sokereihin, asyklisiin, ren-gassilloitettuihin tai muunlaisiin sopiviin sokerijohdannaisiin. Keksintö ei myöskään rajoitu kaavassa I esimerk-20 keinä esitettyihin fosfaattiryhmän johdannaisiin, vaan koskee myös tunnettuja defosfojohdannaisia.

Oligonukleotidien luonnollista rakennetta voidaan I t · myös muuttaa monin tavoin. Mainitunlaisia muunnoksia, joita • · · • voidaan tuoda molekyyliin sinänsä tunnetuin menetelmin, > .‘J! 25 ovat esimerkiksi seuraavat: 19 115399 silyyliryhmillä. Korvaaminen formasetaaleilla ja 3'-tio-formasetaaleilla on edullista.

c) Sokerimuunnokset

Esimerkkeinä mainittakoon a-anomeeriset sokerit, 5 2'-O-metyyliriboosi, 2'-O-butyyliriboosi, 2'-O-allyyliri- boosi, 2'-fluori-2'-deoksiriboosi, 2'-amino-2'-deoksiriboo-si, α-arabinofuranoosi ja karbosykliset sokerianalogit. Edullinen muunnos on 21-O-metyyliriboosin ja 2'-O-n-butyy-liriboosin kautta tehtävä.

10 d) Emäsmuunnokset, jotka eivät muuta Watson-Crick- emäspariutumisen spesifisyyttä

Esimerkkeinä mainittakoon 5-propinyyli-2'-deoksi-uridiini, 5-propinyyli-2'-deoksisytidiini, 5-heksinyyli-2'-deoksiuridiini, 5-heksinyyli-21-deoksisytidiini, 5-fluori- 15 2'-deoksisytidiini , 5-fluori-2'-deoksiuridiini, 5-hydroksi- metyyli-2'-deoksiuridiini, 5-metyyli-2'-deoksisytidiini ja 5-bromi-2'-deoksisytidiini. Edullisia muunnoksia ovat 5-propinyyli-2'-deoksiuridiini, 5-heksinyyli-2'-deoksiuridiini, 5-heksinyyli-2'-deoksisytidiini ja 5-propinyyli-2'-de-20 oksisytidiini.

e) 3'-3'- ja 5'-51-inversiot [esimerkiksi M. Koga et ai., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757]; f) 5'- ja 3 '-fosfaatit samoin kuin 5'- ja 3'- • · « * · tiofosfaatit.

• » :j‘: 25 Esimerkkejä ryhmistä, jotka edistävät ottoa solun • sisään, ovat erilaiset lipofiiliset ryhmät, kuten • · · · -O- (CH2) X-CH3, jossa x on kokonaisluku 6 - 18, -O- (CH2) n-CH=CH (CH2) m-CH3, jossa n ja m ovat toisistaan riippumattomasti kokonaisluku 6 - 12, 30 -O- (CH2CH2O) 4- (CH2) 9CH3, -0(CH2CH20)8, (CH2) 13-CH3 ja " -O- (CH2CH2O) 7- (CH2) 15-CH3, mutta myös steroidiryhmät, kuten koiesteryyliryhmä, tai vitamiiniryhmät, kuten E-vitamiini-, :**: A-vitamiini- tai D-vitamiiniryhmät ja muut konjugaatit, ;]*_ jotka hyödyntävät luonnon kantajajärjestelmiä, kuten gal- 8 ψ 35 lushappo, foolihappo, 2-(N-alkyyli,N-alkoksi)-aminoantraki-noni ja mannoosin ja asianomaisten reseptorien peptidien 20 115399 konjugaatit, jotka johtavat oligonukleotidien reseptorivä-litteiseen endosytoosiin, kuten EGF (epodermaalinen kasvutekijä) , bradykiniini ja PDGF (verihiutaleperäinen kasvutekijä) .

5 Oligonukleotidin muodostaminen tapahtuu ammattimie helle tutuin menetelmin, kuten triesterimenetelmällä, H-fosfonaattimenetelmällä tai fosforiamidiittimenetelmällä, edullisesti tavanomaisilla fosforiamidiittireaktioilla Ca-ruthersin mukaisesti [M. D. Matteucci ja M. H. Caruthers, 10 J. Am. Chem. Soc. 103 (1981) 3185] .

Lisäksi on havaittu, että kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa W on kaavan II mukainen ja R kaavan II' mukainen, estävät DNA-osan emässekvenssistä riippuvalla tavalla esimerkiksi entsyymien, reseptorien tai kasvutekijöiden 15 spesifisten geenien ilmentymistä soluviljelmässä ja vali tuissa esimerkeissä eläinmallissa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia lääkkeen terapeuttisesti vaikuttavina aineosina. Terapeuttisesti vaikuttavina oligonukleotidijohdannaisina pidetään 20 yleensä antisense-oligonukleotideja, kolmoiskierteen muo dostavia oligonukleotideja, aptameereja tai ribotsyymejä, * 1 erityisesti antisense-oligonukleotideja.

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä sisältäviä lääkkeitä j voidaan käyttää esimerkiksi virusten, esimerkiksi HIV:n,

; 25 HSV-l:n, HSV-2:n, influenssavirusten, VSV:n, hepatiitti B

• -viruksen tai papilloomavirusten, aiheuttamien sairauksien hoitoon.

Kaavan (I) mukaisilla antisense-oligonukleoti-. deilla, jotka vaikuttavat mainitunlaisten kohteiden vastai- 3 0 sesti, on esimerkiksi seuraavat emässekvenssit: · t · 115399 ί 21 ί a) HIV:n vastaisesti esimerkiksi 51-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' tai (I) 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-31 tai 5 (II) 5'-GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA-3' tai (III) 5'-GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA-31 tai (IV) 10 5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCA tai (VI) b) HSV-l:n vastaisesti esimerkiksi 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3' (VII) 15

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä sisältävät lääkkeet soveltuvat myös esimerkiksi syövän hoitoon. Siinä yhteydessä voidaan käyttää esimerkiksi oligonukleotidisekvenssejä, jotka suuntautuvat syövän synnystä tai kasvusta vastuussa 20 olevia kohteita vastaan. Mainitunlaisia kohteita ovat esimerkiksi seuraavat: ’ 1) tuman onkoproteiinit, kuten esimerkiksi c-myc, ,·’ N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA ja pl20; 2) sytoplasman/kalvoon liittyvät onkoproteiinit, 25 kuten esimerkiksi EJ-ras, C-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-:‘l 2, c-raf-1, c-mos, c-src ja c-abl; '·. 3) solujen reseptorit, kuten esimerkiksi EGF- reseptori, c-erbA, retinoidireseptorit, proteiinikinaasia . säätelevä alayksikkö ja c-fms; 30 4) sytokiinit, kasvutekijät, solunulkoinen matrik- * t si, kuten esimerkiksi CSF-1, IL-6, Il-la, IL-lb, IL-2, • | IL-4, bFGF, myeloblastiini ja fibronektiini .

Kaavaa I vastaavilla antisense-oligonukleotideilla, jotka vaikuttavat mainitunlaisten kohteiden vastaisesti, on > * 35 esimerkiksi seuraavat emässekvenssit: • » 22 115399 a) cHa-ras:n vastaisesti esimerkiksi 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' (VIII) 5 c) c-myc, esimerkiksi 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC- 3' (IX) 51 -AACGTTGAGGGGCAT- 3' (X) 10 d) c-myb, esimerkiksi 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC- 3' (XI) 15 e) c-fos, esimerkiksi 5’-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-31 (XII) 5 -CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3' (XIII) 20 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3' (XIV) ,·' f) pl20, esimerkiksi ' ’: 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC- 3' :\· 25 (XV) 1 · 1 · * · g) EGF-reseptori, esimerkiksi # · 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3' .:. (XVI) •;;; 30 5'-ggcaaaactttcttttcctcc- 3'

» I

(XVII) • · · • » · • · *;**· h) p53-tuumorisuppressor!, esimerkiksi ./. 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG- 3' : ·’ 3 5 (XVII) 5 -GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG- 3'r (XIX) 23 115399

Yhdisteitä (I) sisältävät lääkkeet soveltuvat lisäksi esimerkiksi sellaisten sairauksien hoitoon, joihin vaikuttavat integriinit tai solu-soluadheesioreseptorit, esimerkiksi VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM tai ELAM.

5 Kaavan (I) mukaisilla antisense-oligonukleotidijoh- dannaisilla, jotka vaikuttavat mainitunlaisten kohteiden vastaisesti, on esimerkiksi seuraavat emässekvenssit: a) VLA-4, esimerkiksi 10 5 ' - GCAGTAAGCATCCATATC - 3 ' (XX) b) ICAM, esimerkiksi 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3' 15 (XXI) 5’-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-31 (XXII) 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG- 3' (XXIII) 20 c) ELAM-1, esimerkiksi 5 ' -ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3 ' j* (XXIV) 5 1 - CAATCAATGACTTCAAGAGTTC - 3 ' : 2 5 (XXV) • * · ' » ·

Yhdisteitä (I) sisältävät lääkkeet soveltuvat li- ‘ » · säksi esimerkiksi restenoosin estoon. Siinä yhteydessä voi- . daan käyttää esimerkiksi oligonukleotidisekvenssejä, jotka > < · ' ;; 30 suuntautuvat proliferaatiosta tai migraatiosta vastuussa > * ’ ;* olevia kohteita vastaan. Mainitunlaisia kohteita ovat esi- : ·..* merkiksi seuraavat: » > G 1) tuman transaktivaattoriproteiinit ja sykliinit, kuten esimerkiksi c-myc, c-myb, c-fos, s-fos/jun, sykliinit 35 ja cdc2-kinaasi; 24 115399 2) mitogeenit tai kasvutekijät, kuten esimerkiksi PDGF, bFGF, EGF, HB-EGF ja TGF-β; 3) solun reseptorit, kuten esimerkiksi bFGF-reseptori, EGF-reseptori ja PDGF-reseptori.

5 Kaavaa I vastaavilla antisense-oligonukleotideilla, jotka vaikuttavat mainitunlaisten kohteiden vastaisesti, on esimerkiksi seuraavat emässekvenssit: a) c-myb 10 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC- 3' (XXVI) b) c-myc 51 -CACGTTGAGGGGCAT- 3' 15 (XXVII) c) cdc2-kinaasi 5-GTCTTCCATAGTTACTCA-3' (XXVIII) 20 d) PCNA (rotan proliferoivan solun tuma-antigeeni) ; 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3' (XXIX) .

« · 1

• » I

• · : 25 Sellaisille kaavan I mukaiselle yhdisteille sovel- • tuvia antomuotoja, joissa W ja R muodostavat yhdessä fosfo-naattiryhmän kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukle-otidin, ovat paikallinen anto, paikallinen anto esimerkiksi , katetrin avulla tai myös injektiot. Injektointia varten an- 30 tisense-oligonukleotidijohdannaiset formuloidaan juoksevaan * > I * liuokseen, edullisesti fysiologisesti hyväksyttävään pusku-riin, kuten Hankin liuokseen tai Ringerin liuokseen. An-tisense-oligonukleotideja voidaan formuloida kuitenkin myös kiinteään muotoon ja liuottaa ja suspendoida ne ennen käyt-35 töä. Systeemisen annon yhteydessä edulliset annostukset ovat noin 0,001 - 50 mg/painokilo vuorokaudessa.

25 115399 ! Lääkkeitä voidaan käyttää myös esimerkiksi farmaseuttisten valmisteiden muodossa, joita voidaan antaa oraalisesti, esimerkiksi tablettien, rakeiden, kovien ja pehmeiden gelatiinikapseleiden, liuosten, emulsioiden tai 5 suspensioiden muodossa. Lääkkeen sulkeminen liposomeihin, jotka sisältävät mahdollisesti muita komponentteja, kuten proteiineja, on myös soveltuva käyttömuoto. Niitä voidaan j antaa myös rektaalisesti, esimerkiksi peräpuikkojen muodos sa, tai parenteraalisesti, esimerkiksi injektioliuosten 10 muodossa. Farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseksi voidaan nämä yhdisteet sekoittaa terapeuttisesti inertteihin orgaanisiin ja epäorgaanisiin kantajiin. Esimerkkejä mainitunlaisista tabletteihin, rakeisiin ja koviin gelatiinikap-seleihin tarkoitetuista kantajista ovat laktoosi, maissi-15 tärkkelys tai sen johdannaiset, tali ja steariinihappo tai ‘ sen suolat. Soveltuvia kantajia liuosten valmistamiseksi ovat vesi, polyolit, sakkaroosi, ivenrttisokeri ja glukoosi. Injektioliuoksiin soveltuvia kantajia ovat vesi, alkoholit, polyolit, glyseroli ja kasviöljyt. Peräpuikkoihin 20 soveltuvia kantajia ovat kasvi- ja kovetetut öljyt, vahat, rasvat ja puolikiinteät polyolit. Farmaseuttiset valmisteet voivat sisältää myös säilöntäaineita, liuotteita, stabi- >t’;' lointiaineita, kostutusaineita, emulgointiaineita, makeut- • · : ' ; teitä, väriaineita, makuaineita, suolojen osmoottisen pai- ; 2 5 neen muuttamiseksi, puskureita, päällystysaineita, hapettu- f * s j ,misenestoaineita samoin kuin mahdollisesti muita terapeut-tisesti vaikuttavia aineita.

• · · »

Dinukleosidi-a-hydroksimetyy1iaryy1ifosfonaattien 1-3 HIV:n vastaisuuden testaaminen in vitro * .3 0 Tehtiin in vitro -HIV-testejä dinukleosidi-a-hyd- * ;·* roksimetyyliaryylifosfonaateilla. Testijärjestelmänä käy- : tettiin ihmisen T-lymfosyyttejä (CEM/O). Yhdisteitä testat- » • tiin lisäksi T-lymfosyyttikannassa CEM/TK") , jolta puuttuu tymidiinikinaasi. CEM/O-solut infektoitiin sekä HIV-l:llä ( 35 että HIV-2:lla. Ennen testiä varmistettiin, etteivät tes tattavat yhdisteet sisältäneet vapaata nukleosidia (kor- 26 115399 ϊ ί keintaan 0,5 %, HPLC). Määritystulokset luetellaan taulukossa 1.

Kuten taulukosta 1 on nähtävissä, on kaikilla yhdisteillä sekä HIV-1:n että myös HIV-2:n replikaation vas-5 täinen voimakas aktiivisuus.

Toisin kuin kirjallisuudessa kuvatuilla lääkeaine-esiastemuodoilla ei keksinnön mukaisilla, kaavaa I vastaavilla yhdisteillä ollut minkäänlaista sytotoksista vaikutusta .

j » i * $ i » # » · • It « ♦ » · » « · · iti * · · » » · t > 27 115399

Taulukko 1

Tulokset, joista saatiin määritettäessä in vitro yhdisteinen 3, 11 - 13, 4 - 6 ja 28 - 30 anti-HIV-vaikutus HIV-l:n ja HlV-2:n suhteen ihmisen T-lymfosyyteissä (CEM/0 ja 5 CEM/TK'1)

Taulukko 1

Syntetisoiduta-hydroksimetyyliaryylifosfonihappodiesterit 1-3 10 Y 0 0* " nukleosidianalogit / X ft y-/ ^ nukleosidianalogit

OH

Z

15 1: nukleosidi = 2 1,3'-dideoksitymidiini (ddT); 2: nukleosidi = 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini (d4T); 3: nukleosidi = 3'-deoksi-3'-atsidotymidiini (AZT)

20 1 - 3 X* Y Z

a NMe2 H H

b och3 h h c ch3 h h

Ϊ]: d h H H

: 25 e ci h h ; f H Cl Cl » « » » g cn h h » » »

h N02 H H

1 H n°2 h 30 j no2 no2 h • · ’·;·* k h no2 no2 • · • * * • · » • · * » # · » ! i 28 115399

Antiviraalinen aktiivisuus

I EC50a> <V>9/»1) CEM/O

Yhdiste Subetituentti HIV-1 HIV-2 CEM/TK' Toksisuus HIB-2 cc50b) 5 la NMe2 3,25 ± 1,06 7.0 ± 4.24 > 100 > 100 lb 0CH3 0.5 i 0.0 0.55 t 0,07 >20 >20 lc CH3 3,25 ± 1.06 10.0 ± 0,0 > 100 > 100

Id H 2,93 ± 1,85 13,3 ± 2,9 > 100 > 100 le Cl 4,0 ± 0,0 4.0 ± 0,0 > 100 > 100 10 If 2,6-di-Cl 1.4 ± 0,85 2,0 ± 0,0 >20 >20 lg CN 3,93 ± 3,10 7.7 ± 4,6 > 100 > 100 lh NOz 2.25 ± 0,35 3.0 ± 1,41 > 100 > 100 lj 2,4-di-N02 2,0 ± 0.0 3,50 t 0,71 > 100 > 100 ' 2b 0CH3 0,10 t 0,065 0.12 ± 0,06 > 100 > 20 15 2c CH3 0,12 t 0.064 0.33 ± 0,24 > 100 > 20 2d H 0,16 t 0.0 0,19 ± 0,19 > 100 > 100 2e Cl 0,10 t 0,05 0,12 ± 0,06 > 100 > 100 2f 2,6-di-Cl 0,056 i 0,034 0,12 ± 0,06 > 20 > 100 2g CN 0,091 ± 0,065 0.33 ± 0,24 > 100 > 100 20 2h N02 0.066 ± 0.048 0,12 ± 0,06 > 100 > 100 2j 2,4-di-NOz 0,16 ± 0,0 0,33 t 0,24 > 100 > 100

Keksinnön mukaisilla yhdisteillä on suuremmat ja-kautumiskertoimet oktanoli-vesiseokseen kuin niiden perus-25 tana olevilla nukleosidanalogeilla. Ne ovat siten kuljetettavissa passiivisesti biologisten kalvojen läpi.

. Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavilla esimer- 4 » » » . keillä ja patenttivaatimusten sisällöllä.

< * ·

Esimerkit « » i • « · 30 1. Hydroksi-(4-metyylifenyyli)-metyylifosfonihappo- • * * bis-(51 -0-2',3' -dideoksitymidiini)-esterin valmistus : Kuivattiin 904 mg (4,0 mmol) 2',3' -dideoksitymidii- v : niä suuressa alipaineessa ja liuotettiin se siten 60 ml:aan kuivaa asetonitriiliä. Tähän liuokseen lisättiin · 35 774 mg (6,0 mmol; 1,07 ml) di-isopropyylietyyliamiinia ja jäähdytettiin lämpötilaan 0 °C jäähauteessa. Sen jälkeen lisättiin annoksittain 15 min:n kuluessa 404 mg (2,0 mmol) di-isopropyyliamiinidikloorifosfiinia. Kun lisäys oli saa-• tettu loppuun, jälkisekoitettiin 15 min antaen seoksen 40 lämmetä huoneenlämpötilaan. Lisättiin huoneenlämpötilassa 29 115399 ί 254 mg (4,0 mmol) tetratsolia ja 80 ml vettä. Kun oli sekoitettu 30 min, poistettiin liuote kondensoimalla suurva-kuumilaitteistossa. Jäännös puhdistettiin Chromatotron-laitteella silikageelin läpi käyttämällä etyyliasetaatti-5 metanoligradienttia (0 - 30 % metanolia). Tuote eristettiin värittömänä kiinteänä aineena [797 mg (1,6 mmol); saanto 80 %]. Liuotettiin 797 mg (1,6 mmol) 2',3'-ddT-H-fosfonaattidiesteriä 40 ml:aan kuivaa tetrahydrofuraania ja lisättiin 518 mg (4,8 mmol) 4-metyylibentsaldehydiä. 10 Tähän liuokseen lisättiin sekoittaen 20 ml kuivaa, ennalta tislattua trietyyliamiinia. Kun oli kulunut 4 tuntia huoneenlämpötilassa, lähtöaine oli reagoinut loppuun. Jälki-kontrolli tehtiin käänteisfaasi-HPLC-kromtografiällä. Re-aktioseos neutraloitiin lisäämällä 20 ml etikkahappoa ja 15 haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella. Jäännös puhdistettiin Chromatotron-laitteella dikloorimetaani-metanoli-gradientin (0 - 15 % metanolia) avulla. Tuote eristettiin kylmäkuivauksen jälkeen värittömänä kiinteänä aineena [921 mg (1,52 mmol); saanto 95 %]. Yhdisteen puhdistami-20 seksi in vitro -anti-HIV-testejä varten tehtiin lisäksi puolipreparatiivinen HPLC-puhdistus isokraattisella elu-;··· enttiseoksella (30 % metanolia asetonitriilissä).

:. 2. Hydroksi- ( 4-dimetyyliaminofenyyli) -metyylifosfo- nihappo-bis-(51-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterinvalmis- * · ’ i 25 tus * * ♦

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si-jasta käytettiin tässä yhteydessä 4-dimetyyliaminobentsal-’·’ dehydiä (saanto 90 %).

3. Hydroksi- (4-me t oksi f enyyli) -metyylif osfonihappo-30 bis-CS'-O^' ,3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus ·,,,: Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si- ,·. : jasta käytettiin tässä yhteydessä 4-metoksibentsaldehydiä t " ‘. (saanto 87 %).

115399 30 4. Hydroksifenyylimetyylifosfonihappo-bis-(5'-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin sijasta käytettiin tässä yhteydessä bentsaldehydiä (saanto 5 93 %).

5. Hydroksi-(4-kloorifenyyli)-metyylifosfonihappo-bis-(51-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 4-klooribentsaldehydiä 10 (saanto 90 %).

6. Hydroksi-(4-syaanifenyyli)-metyylitosfonihappo-bis-(5'-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 4-syaanibentsaldehydiä 15 (saanto 86 %).

f 7. Hydroksi-(4-nitrofenyyli)-metyylitosfonihappo-bis-(5'-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 4-nitrobentsaldehydiä 20 (saanto 85 %).

8. Hydroksi- (2-nitrofenyyli) -metyylitosfonihappo- •j bis-(5'-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si-: .. jasta käytettiin tässä yhteydessä 2-nitrobentsaldehydiä 25 (saanto 87 %).

* » * 9. Hydroksi-(2,4-dinitrof enyyli)-metyylifosfonihap- ; · po-bis-(5'-0-231-dideoksitymidiini)-esterin valmistus ' Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si jasta käytettiin tässä yhteydessä 2,4-dinitrobentsaldehy-*’ 30 diä (saanto 85 %).

10. Hydroksi-(9-fluorenyyli)-metyylifosfonihappo-bis-(5’-0-21,3·-dideoksitymidiini)-esterin valmistus t · ! Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si jasta käytettiin tässä yhteydessä 9-fluorenonia (saanto 35 91 %).

31 115399 11. Hydroksi-(4-pyridyyli) -metyylifosfonihappo-bis-(51-0-2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 9-pyridyylialdehydiä 5 (saanto 82 %).

12. Hydroksi-(2,6-dikloorifenyyli)-metyylitosfoni-happo-bis-(5'-0-2', 3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 4-metyylibentsaldehydin si-10 jasta käytettiin tässä yhteydessä 2,4-diklooribentsaldehy-diä (saanto 96 %).

13. Hydroksi-(4-metoksifenyyli)-metyylitosfonihap-po-bis-(5'-0-2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin valmistus 15 Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-metoksi-bentsaldehydiä (saanto 80 %).

14. Hydroksi-(4-metyylitenyyli)-metyylitosfonihap- 20 po-bis-(5'-0-2',3’-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-es terin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3' -ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat- !!", tidies teriä (saanto 83 %).

• > · « » * 25 15. Hydroksifenyylimetyylifosfonihappo-bis-(5'-0- ·;* 2' ,3' -dideoksi-21,3' -didehydrotymidiini) -esterin valmis- ’ * · : : tus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2’,3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-30 tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta bentsalde-hydiä (saanto 87 %).

* I > · * · < · i i f · 32 115399 16. Hydroksi- (4-kloorifenyyli) -metyylifosfonihappo-bis- (5' -0-2', 3' -dideoksi-2', 3' -didehydrotymidiini) -esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-5 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-kloori-bentsaldehydiä (saanto 86 %).

17. Hydroksi - (4-syaani f enyyli) -metyylifosfonihappo-bis- (5 1 -0-2',3' -dideoksi-2 1, 3' -didehydrotymidiini) -esterin 10 valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-syaani-bentsaldehydiä (saanto 86 %).

15 18. Hydroksi-(4-nitrofenyyli)-metyylifosfonihappo- bis- (5' -0-2', 3' -dideoksi-2', 3' -didehydrotymidiini) -esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 23'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-20 tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-nitro- bentsaldehydiä (saanto 81 %).

. 19. Hydroksi-(2-nitrofenyyli)-metyylifosfonihappo- bis-(5'-0-2' ,3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin !!'! valmistus • 1 · ,1 25 Ohje vastaa kohtaa 1. 2' ,3'-ddT-H-fosfonaattidies- * V » terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat- * » · : : tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2-nitro- * 1 · V · bentsaldehydiä (saanto 86 %).

20. Hydroksi-(2,4-dinitrofenyyli) -metyylifosfoni-* 30 happo-bis-(5'-0-2',31-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)- esterin valmistus

• I I

. Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- ’ | terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat- ’ tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,4-dinit- 35 robentsaldehydiä (saanto 80 %).

• » 33 115399 21. Hydroksi- (4-pyridyyli) -metyylifosfonihappo-bis-(5 »-0-2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-5 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-pyridyy-lialdehydiä (saanto 80 %).

22. Hydroksi-(2,6-dikloorifenyyli)-metyylifosfoni-happo-bis-(5'-0-2',3’-dideoksi-2',31-didehydrotymidiini)- 10 esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,6-dikloo-ribentsaldehydiä (saanto 87 %).

15 23. Hydroksiheptyylimetyylifosfonihappo-bis-(5'-0- 2',3'-dideoksi-2’,3'-didehydrotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T-H-fosfonaat-20 tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta oktanaalia (saanto 75 %).

24. Hydroksi-(4-nitrofenyyli)-metyylifosfonihappo-bis-(5,-0-2' ,3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-esterin vai- > mi s tus » * # ! 25 Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- • * · terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat- » * » : tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-nitro- ' bentsaldehydiä (saanto 96 %).

25. Hydroksi-(2-nitrofenyyli)-metyylifosfonihappo-30 bis-( 5'-0-2’,3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-esterin val- mistus

t I I

t.’ . Ohje vastaa kohtaa 1. 2', 3'-ddT-H-fosfonaattidies- I terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat-

! I I I I

. ’ tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2-nitro- ; ' 35 bentsaldehydiä (saanto 92 %).

34 115399 26. Hydroksi-(2,6-dinitrofenyyli)-metyylifosfoni-happo-bis- (5' -0-2', 3' -dideoksi-3' -atsidotymidiini) -esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-5 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,6-dinit-robentsaldehydiä (saanto 88 %).

27. Hydroksi- (2,4-dinitrof enyyli) -metyylif osioni-happo-bis- (51 -0-2 ', 3' -dideoksi-3' -atsidotymidiini) -este- 10 rin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat-tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,4-dinit-robentsaldehydiä (saanto 90 %).

15 28. Hydroksi-(4-pyridyyli)-metyylif osf onihappo-bis- (5'-0-2', 3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2’,3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat-20 tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-pyriryy-lialdehydiä (saanto 96 %).

29. Hydroksiheptyylimetyylifosfonihappo-bis-(5'-0-2',3' -dideoksi-3' -atsidotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3' -ddT-H-fosfonaattidies- 25 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä AZT-H-fosfonaat- ; tidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta oktanaalia * · • (saanto 96 %).

' 30. Hydroksi-(2,6-dinitrof enyyli)-metyylif osf oni- happo-bis-(5'-0-2',31-dideoksi-3'-atsidotymidiini) — (5 *-0-30 2',3'-dideoksitymidiini)-esterin valmistus : Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- : terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä ddT/AZT-H-fosfo- naattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,6-nitrobentsaldehydiä (saanto 88 %).

35 115399 31. Hydroksi-(4-nltrofenyyll)-metyylifosfonihappo-bis-(5'-0-2',3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-(5'-0-2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-5 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T/AZT-H-fosfo-naattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-nit-robentsaldehydiä (saanto 96 %).

32. Hydroksi- (2,6-dinitrofenyyli) -metyylitosfoni-happo-bis-(51-0-2', 3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-(5'-0- 10 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin valmis tus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T/AZT-H-fosfo-naattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2,6-15 dinitrobentsaldehydiä (saanto 87 %).

40. Hydroksi-(2-nitrofenyyli)-metyylitosfonihappo-bis- (5' -0-2', 3' -dideoksitymidiini )-(5'-0-2',3' -dideoksi-2',3'-didehydrotymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-20 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T/ddT-H-fosfo-naattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2-nit-robentsaldehydiä (saanto 91 %).

41. Hydroksi-(2-nitrofenyyli)-metyylitosfonihappo- . i (51 -0-tymidiini)-(51 -0-2' ,3' -dideoksi-2',3' -didehydrotymi- 25 diini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2', 3 ' -ddT-H-fosfonaattidies-·; ·’ terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä d4T/T-H-fosfo- ’ naattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 2-nit- robentsaldehydiä (saanto 85 %).

30 42. Hydroksi-(4-kloorifenyyli)-metyylifosfonihap- : po-bis-(5'-0-3'-O-levulinyylitymidiini)-esterin valmistus ’ : Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- ! terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 3'-levulinyyli- tymidiini-H-fosfonaattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehy-35 din sijasta 4-klooribentsaldehydiä (saanto 93 %).

36 115399 43. Hydroksi-(4-kloorifenyyli) -metyylifosfonihap-po-bis-(5'-0-31-O-t-butyylidimetyylisilyylitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-5 terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 3'-levulinyyli-tymidiini-H-fosfonaattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehy-din sijasta 4-klooribentsaldehydiä (saanto 85 %).

44. Hydroksi-(4-kloorifenyyli) -metyylifosfonihap-po-bis-(5 1-0-3’-O-asetyylitymidiini)-esterin valmistus 10 Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies- terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 3'-asetyylityrni-diini-H-fosfonaattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-klooribentsaldehydiä (saanto 75 %).

45. Hydroksi-(4-metoksifenyyli)-metyylitosfonihap- 15 po-bis-(5'-0-3'-O-asetyylitymidiini)-esterin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-ddT-H-fosfonaattidies-terin sijasta käytettiin tässä yhteydessä 3'-asetyylitymi-diini-H-fosfonaattidiesteriä ja 4-metyylibentsaldehydin sijasta 4-metoksibentsaldehydiä (saanto 70 %).

20 46. Hydroksi-(4-kloorifenyyli)-metyylifosfonihap- po-bis-(5'-0-tymidiini)-esterin valmistus

Valmistus tapahtui kohdassa 5a kuvatusta 3'-0-levu-linyylisuojatusta johdannaisesta tavanomaisissa olosuh- ! teissä käyttämällä 5 ekvivalenttia hydratsiinihydraattia » · | 25 pyridiinin ja etikkahappon seoksessa suhteessa 4:1 15 mi- /·** nuutissa huoneenlämpötilassa.

• 47. 01-(5^0-21,3’-dideoksi-2',3’-didehydrotymidii- • ni)-fosfiitin valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-dideoksitymidiinin si- ;1 30 jasta käytettiin 2',3'-dideoksi-2',3'-didehydrotymidiiniä (saanto 75 %).

48. Di-(5'-0-2',3'-dideoksi-3'-atsidotymidiini)-fosfiitin valmistus • » 37 115399

Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-dideoksitymidiinin sijasta käytettiin 2',3'-dideoksi-3'-atsidotymidiiniä (saanto 85 %).

49. Di-(5’-0-3'-levulinyylitymidiini)-fosfIitin 5 valmistus

Ohje vastaa kohtaa 1. 2’,3’-dideoksitymidiinin sijasta käytettiin 3'-levulinyylitymidiiniä (saanto 65 %).

50. Di-(5 1 -0-3' -t-butyylidimetyylisilyylitymidii-ni)-fosfiitin valmistus 10 Ohje vastaa kohtaa 1. 23'-dideoksitymidiinin si jasta käytettiin 3'-t-butyylidimetyylisilyylitymidiiniä (saanto 65 %).

51. Di-(5'-0-3'-asetyylitymidiini)-fosfiitin valmistus 15 Ohje vastaa kohtaa 1. 2',3'-dideoksitymidiinin si jasta käytettiin 3'-asetyylitymidiiniä (saanto 86 %).

Reaktiot voimakkaalla akseptorilla substituoitujen bentsaldehydien (4-nitro-, 2-nitro-, 2,6-dinitro- ja 2,4-dinitrobentsaldehydin) kanssa olivat toteutettavissa myös 20 käyttämällä kiraalista kiniiniä emäksenä. Reaktiot dono-rilla substituoitujen bentsaldehydien (4-dimetyyliamino-, ,4-metoksi-, 4-metyyli- ja bentsaldehydin) kanssa tehtiin vaihtoehtoisesti edellä kuvattujen kokeiden sijasta myös II’» puhtaassa trietyyliamiinissa kuumentaen.

25 52. 5 '-0-(4,4'-dimetoksitrityyli)-tymidylyyli- (3' ,5')-[ (-0-trietyylisiloksi)-2-nitrobentsyyli]-fosfo-naatin (TES-suojatun hydroksi-3’ -OH-fosfonaattidimeerin D) valmistus a) 5'-0-(4,4'-dimetoksitrityyli)-tymidylyyli- 30 (3',5')-3'-0-levulinyylitymidiini-3 *-H-fosfonaatin valmis tus (H-fosfonaattidimeeri A) . Kuivattiin 1,9 g (2,7 nunol; 1,1 ekv) 5'-0-(4,4'- • ; dimetoksitrityyli)-tymidylyyli-3'-H-fosfonaattia suuressa alipaineessa ja liuotettiin se 30 ml:aan kuivaa pyridii- • ; 35 niä. Tähän liuokseen lisättiin 828 mg (2,4 mmol; 1,0 ekv) 38 115399 ennalta kuivattua 3'-O-levulinyylitymidiiniä. Sitten lisättiin pisaroittain 899 ml juuri tislattua pivaloyyliklo-ridia ja jatkettiin sekoitusta huoneenlämpötilassa. Laimennettiin 8 min:n kuluttua 150 ml:11a dikloorimetaania ja 5 uutettiin erotussuppilossa 150 ml:11a 5-%:ista natriumve-tykarbonaattiliuosta. Kun oli uutettu vielä kaksi kertaa käyttämällä 150 ml dikloorimetaania kummallakin kerralla, tehtiin kuivaus natriumsulfaatilla, erotettiin liuos kui-vausaineesta suodattamalla ja haihdutettiin se kuiviin 10 pyöröhaihduttimella. Raakatuote puhdistettiin flash-kroma-tografialla. Eluenttigradientin etikkahappo-metanoli (+ 0,1 % lisättyä etikkahappoa) metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 5 %:iin. Tuote eristettiin keltaisena kiinteänä aineena (1,972 g; 2,12 nunol; 78 %).

15 b) 5'-0-(4,4'-dimetoksitrityyli)-tymidylyyli (3’, 5') -3' -0-levulinyylitymidiini-3' - [ (-hydroksi) -2-nitrobent-syyli]-fosfonaatin valmistus (a-hydroksifosfonaattidimeeri B) 1,5 g (1,6 mmol; 1 ekv) H-fosfonaattidimeeriä A 20 liuotettiin ennalta kuivattuna 20 ml:aan kuivaa dikloorimetaania. Liuokseen lisättiin 725 mg (4,8 mmol; 3 ekv) en-naita kuivattua 2-nitrobentsaldehydiä ja sitten 40 ml tri-etyyliamiinia. Kun seosta oli sekoitettu 8 tuntia huoneen-lämpötilassa, se neutraloitiin etikkahapolla ja puhdistet- • · ’ ; 25 tiin liuos suoraan flash-kromatografialla. Eluenttigra- • * · ’··;* dientin dikloorimetaani-metanoli (+0,1 % lisättyä etikka- • * · *··' ·' happoa) metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 5 %:iin. Tuo- V · te on väritön kiinteä aine (1,374 g; 1,27 mmol; 79 %).

c) 5 ’ -0-(4,4’-dimetoksitrityyli)-tymidylyyli-,f ’ j* 30 (3^5^-31 -0-levulinyylitymidiini-3' -1 (-O-trietyylisilok- : si)-2-nitrobentsyyli]-fosfonaatin valmistus (TES-suojattu hydroksifosfonaattidimeeri C) » ► ’ ; 1,1 g (1,01 mmol; 1 ekv) -hydroksifosfonaattidimee- riä B liuotettiin ennalta kuivattuna 20 ml:aan kuivaa py-’35 ridiiniä. Tähän liuokseen lisättiin pisaroittain 914 mg > » » · » * * 39 115399 (6,07 mmol; 1,02 ml; 6 ekv) trietyylisilyylikloridia ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa. Kun oli sekoitettu 7 tuntia, seos haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografialla. Eluentti-5 gradientin etyyliasetaatti-metanoli metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 4 %:iin. Tuote on vaaleankeltainen kiinteä aine (1,13 g; 0,95 mmol; 93 %).

c) 5,-0-(4,4,-dimetoksitrityyli)-tymidylyyli-(3,, 5' )-tymidiini-3' -[ (-O-trietyylisiloksi) -2-nitrobentsyyli] -10 fosfonaatin (D) valmistus

Liuotettiin 1,1 g (0,92 mmol) TES-suojattua hydrok-sifosfonaattidimeeriä C 10 ml;aan pyridiiniä ja lisättiin 10 ml liuosta, joka koostui 3 ml:sta hydratsiinihydraattia (24 % vedessä), 6,92 ml:sta pyridiiniä ja 4,61 ml:sta 15 etikkahappoa. Kun liuosta oli sekoitettu 3 min huoneenläm pötilassa, se jäähdytettiin lämpötilaan 0 eC ja laimennettiin 100 ml;11a vettä ja 100 ml;11a etyyliasetaattia. Kun faasit oli erotettu erotussuppilossa, orgaaninen faasi pestiin kerran 25 ml;11a 5-prosenttista natriumvetykarbo-20 naattiliuosta ja kuivattiin sitten natriumsulfaatilla. Kun kuivausaine oli erotettu, liuos haihdutettiin kuiviin pyö-, röhaihduttimella. Raakatuote puhdistettiin flash-kromato grafialla. Eluenttigradientin dikloorimetaani-metanoli ’! metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 7 %:iin. Tuote eris- • · * ; 25 tettiin vaaleankeltaisena kiinteänä aineena (858 mg; *··;’ 0,78 mmol; 85 %).

:·! ί 53. S^O-^^^dimetoksitrityyliJ-tymidylyyli-O', .· · 5 ’) -tymidiini-3' -0- (8-syaanietyylidi-isopropyyliaminofos- foriamidiitti) -[ (-O-trietyylisiloksi) -2-nitrobentsyyli] -30 fosfonaatin valmistus (TES-suojattu hydroksi-3'-fosfori-amidiittifosfonaattidimeeri E) , Liuotettiin 230 mg (0,21 mmol; 1 ekv) TES-suojattua ' ; hydroksi-3'-OH-fosfonaattidimeeriä D ennalta kuivattuna 15 ml:aan kuivaa diklooriraetaania ja lisättiin sekoittaen : ‘ : 35 177 ml (1,05 mmol; 135 mg; 1,5 ekv) di-isopropyylietyyli- 40 115399 amiinia ja sitten 70 ml (0,31 mmol; 74,2 mg; 1,5 ekv) B-syaanietyylidi-isopropyylikloorifosfiiniä. Sekoitettiin 5 tuntia huoneenlämpötilassa, lisättiin 20 ml etyyliasetaattia ja haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella. Sitten 5 uutettiin kahdesti käyttämällä kerralla 20 ml 2-prosent-tista natriumvetykarbonaattialiuosta ja sen jälkeen kylläisellä natriumkloridiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatilla. Suodatuksen jälkeen haihdutettiin jäännös kuiviin pyöröhaihduttimella. Raakatuote puh-10 distettiin flash-kromatografialla. Eluenttina käytettiin dikloorimetaanin ja asetonitriilin seosta suhteessa 1:1 (+ 1 % lisättyä trietyyliamiinia). Tuote on vaaleankeltainen kiinteä aine (123 mg; 0,095 mmol; 45 %).

54. 5 ' -0-(4,4' -dimetoksitri tyyli) - tyrni dylyyli- (3 15 5')-tymidiini-3'-O-sukkinyyli-[(-O-trietyylisiloksi)-2- nitrobentsyyli]-fosfonaatin valmistus (TES-suojattu hyd-roksi-3’-sukkinyylifosfonaattidimeeri F)

Liuotettiin 200 mg (0,18 mmol; 1,4 ekv) TES-suojat-tua hydroksi-3'-OH-fosfonaattidimeeriä D ennalta kuivattu-20 na 2 ml:aan kuivaa pyridiiniä. Sen jälkeen lisättiin peräkkäin 24,4 mg (0,2 mmol) 4-dimetyyliaminopyridiiniä ja 20,0 mg (0,2 mmol) meripihkahappoanhydridiä ja annettiin reagoida sekoittaen huoneenlämpötilassa 4 tuntia. Lisättiin 45 ml vettä ja haihdutettiin 10 minuuttia kestäneen * * · ** 25 jälkisekoituksen jälkeen kuiviin pyöröhaihduttimella.

Jäännös siirrettiin 15 ml:aan dikloorimetaania ja uutet-; I tiin kerran 8 ml:11a kylmää 10-prosenttista sitruunahappoa : * ja kahdesti käyttäen kerrallaan 8 ml kylmää vettä. Sen jälkeen orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatilla.

;* 30 Haihdutettiin suodatuksen jälkeen kuiviin pyöröhaihdutti mella. Raakatuote siirrettiin 3 ml:aan dikloorimetaania ja lisättiin seos pisaroittain 25 ml:aan jääkylmää n-heksaa- » ' ; nia. Tuote erottui värittömänä sakkana. Täydellisen saos- tumisen aikaansaamiseksi pidettiin emäliuosta muutamia : 35 tunteja lämpötilassa -20 °C, erotettiin sitten tuote suo- 41 115399 dattamalla ja kuivattiin se. Tuote on väritön kiinteä aine (167 mg; 0,14 mmol; 78 %).

55. 5 ' -O- (4,4' -dimetoksitrityyli) -tymidylyyli- (3' -1 5') -tymidiini-3' -O-sukkinyyli-CPG- [ (a-O-trietyylisiloksi) - 5 2-nitrobentsyyli]-fosfonaatin valmistus (CPG:hen sidottu TES-suojattu hydroksi-3'-sukkinyylifosfonaattidimeeri G)

Liuotettiin Pierce-pullossa 50 mg (0,042 mmol; 1,5 ekv) TES-suojattua hydroksi-3'-sukkinyylifosfonaatti-dimeeriä F 1,5 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia ja lisät-10 tiin 13,41 mg (0,042 mmol; 1,5 ekv) 0-bentrotriatsol-l-yyli-N,N,N',N'-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraattia (TBTU) ja 4,2 ml (0,0033 mmol; 3,84 mg; 1,2 ekv) N-etyyli-morfoliinia. Sen jälkeen lisättiin 370 mg CPG-kantajaa ja ravistetiin vielä 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Seos siir-15 rettiin suodatinupokkaaseen, pestiin metanolilla ja di-kloorimetaanilla, siirrettiin takaisin Pierce-pulloon ja lisättiin 1,5 ml pääteryhmienmuodostusreagenssia, ravisteltiin vielä tunti, siirrettiin uudelleen suodatinupokkaaseen, erotettiin suodattamalla, pestiin metanolilla, 20 dikloorimetaanilla, tetrahydrofuraanilla ja dietyylieet-terillä ja kuivattiin lämpötilassa 40 °C öljypumpulla ai-kaansaadussa alipaineessa. Kantajan kuormittuminen: 47,12 mmol/g.

56. Kaavan TTTTTTTTT(pp)T mukaisen oligonukleotidin • 1 · > * > ;1 25 valmistus • 1 · [pp merkitsee a-hydroksi(o-nitrofenyyli Jmetyylifos-fonaattisiltaa. ] · Esimerkistä 55 peräisin oleva CPG-kantaja, joka sisältää 1 pmol dinukleotidia sidottuna 31-pään kautta, *;· 30 käsitellään peräkkäin seuraavilla reagensseilla: ; 1. Absoluuttinen asetonitriili . 2. 2 % dikloorietikkahappoa dikloorimetaanissa • ; 3. Absoluuttinen asetonitriili 42 115399 4. 10 pmol 5' -0-dimetoksitrityylitymidiini-3'-fos-forihappo-B-syaanietyyliesteridi-isopropyyliamidiittia ja 40 pmol tetratsolia absoluuttisessa asetonitriilissä 5. Asetonitrlili 5 6. 20 % etikkahappoanhydridiä THFrssa, joka sisäl tää 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä 7. Asetonitriili 8. Jodi (1,3 g THF-vesi-pyridiiniseoksessa; tilavuussuhde 70:20:5).

10 Vaiheet 1-8, joita kutsutaan jäljempänä reaktio- sykliksi, toistetaan 7 kertaa dekatymidylaattijohdannaisen muodostamiseksi. Kun synteesi on saatettu loppuun, lohkaistaan dimetoksitrityyliryhmä pois vaiheissa 1-3 kuvatulla tavalla. Oligonukleotidi irrotetaan kantajasta kä-15 sittelemällä ammoniakilla ja lisäksi poistetaan B-syaani-etyyliryhmät. Silyylisuojausryhmä poistetaan käsittelemällä 80-%:isella etikkahapolla. Saatu dekatymidylaattijoh-dannaisraakatuote, joka sisältää 3'-päässä nukleotidien välisen -hydroksi-o-nitrofenyylimetyylifosfonaattisidok-20 sen, puhdistetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesilla tai HPLC:llä.

57. Kaavan T(pp)TTTTTTTTT mukaisen oligonukleotidin valmistus [i . Kaupallisesti saatavissa oleva CPG-kantaja, joka 25 sisältää 1 pmol 5'-O-dimetoksitrityylitymidiiniä sidottuna • * · 3'-pään kautta, käsitellään peräkkäin seuraavilla reagens-*;; * seilla: '· ’ 1. Absoluuttinen asetonitriili 2. 2 % dikloorietikkahappoa dikloorimetaanissa ,,30 3. Absoluuttinen asetonitriili : 4. 10 pmol 5'-0-dimetoksitrityylitymidiini-3'-fos- : forihappo-B-syaanietyyliesteridi-isopropyyliamidiittia ja ! 40 pmol tetratsolia absoluuttisessa asetonitriilissä 5. Asetonitriili 43 115399 6. 20 % etikkahappoanhydridiä THF:ssa, joka sisältää 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä 7. Asetonitriili 8. Jodi (1,3 g THF-vesi-pyridiiniseoksessa; tila-5 vuussuhde 70:20:5).

Vaiheet 1-8, joita kutsutaan jäljempänä reaktio-sykliksi, toistetaan 7 kertaa dekatymidylaattijohdannaisen muodostamiseksi. Viimeisessä syklissä käytetään monomeerin sijasta vaiheessa 4 vastaavaa dinukleotidia, joka on valio mistettu esimerkissä 53 kuvatulla tavalla. Kun synteesi on saatettu loppuun, lohkaistaan dimetoksitrityyliryhmä pois vaiheissa 1-3 kuvatulla tavalla. Oligonukleotidi irrotetaan kantajasta käsittelemällä ammoniakilla ja lisäksi poistetaan β-syaanietyyliryhmät. Silyylisuojausryhmä pois-15 tetäan käsittelemällä 80-%:isella etikkahapolla. Saatu dekatymidylaattijohdannaisraakatuote, joka sisältää 5’-päässä nukleotidien välisen -hydroksi-o-nitrofenyylimetyy-lifosfonaattisidoksen, puhdistetaan polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla tai HPLC:llä.

20 58. Kaavan T(pp)TTTTTTTT(pp)T mukaisen oligonukle- otidin valmistus [(pp merkitsee kulloinkin a-hydroksi(o-nitrofenyy- • · li)metyylifosfonaattisiltaa. ]

Synteesi tehdään esimerkissä 56 kuvatulla tavalla

• · I

' ; 25 lähtien esimerkistä 55 peräisin olevasta T(pp)T-CPG-kanta- /·’ jasta, joka sisältää 1 pmol dinukleotidia sidottuna 3'- ► 4 · · pään kautta. Viimeisessä syklissä käytetään monomeerin ' * sijasta vaiheessa 4 vastaavaa dinukleotidia, joka on val mistettu esimerkissä 53 kuvatulla tavalla. Kun synteesi on ;· 30 saatettu loppuun, lohkaistaan dimetoksitrityyliryhmä pois ; vaiheissa 1-3 kuvatulla tavalla. Oligonukleotidi irrote- . taan kantajasta käsittelemällä ammoniakilla ja lisäksi \ poistetaan β-syaanietyyliryhmät. Silyylisuojausryhmä pois tetaan käsittelemällä 80-%:isella etikkahapolla. Saatu 35 dekatymidylaattijohdannaisraakatuote, joka sisältää sekä » 44 115399 3'- että 5'-päässä nukleotidien välisen -hydroksi-o-nitro-fenyylimetyylifosfonaattisidoksen, puhdistetaan polyakryy-liamidigeelielektroforeesilla tai HPLC:llä.

59. GCAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C:n (HSV-kohteen) val- 5 mistus

Valmistus tapahtuu esimerkissä 56 kuvatulla tavalla lähtien T(pp)T-CPG-kantajan sijasta vastaavasta G(pp)C-CPG-kantajasta. Kondensaatioreaktioissa vaiheessa 4 käytetään kulloinkin sekvenssiä vastaavaa deoksiadenosiini-, 10 deoksiguanosiini- tai deoksisytidiinimonomeerirakenneosaa. Edullisia ovat sellaiset kaupallisesti saatavissa olevat rakenneosat, jotka sisältävät nopeasti lohkaistavissa olevia suojausryhmiä (Expedite" Fast Deprotecting Amidites; Millipore, Eschborn).

15 60. G(pp)CAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C:n valmistus

Valmistus tapahtuu esimerkissä 5 kuvatulla tavalla käyttäen viimeisessä kondensointivaiheessa T(pp)T-fosfori-amidiitin sijasta vastaavaa G(pp)C-fosforiamidiittia.

61. G(pp)CAGGAGGATG(pp)CTGAGGAGG(pp)C:n valmistus 20 Valmistus tapahtuu esimerkissä 5 kuvatulla tavalla käyttäen kahdeksannessa ja viimeisessä kondensointivai-heessa kummassakin vastaavaa G(pp)C-fosforiamidiittia.

62. G(pp)CGGGGCTCCATGGGGGTC(pp)G:n valmistus Valmistus tapahtuu esimerkissä 60 kuvatulla tavalla • f 25 lähtien G(pp)C-CPG-kantajan sijasta vastaavasta C(p)G-CPG- * » · kantajasta.

63. C(pp)GAGAACATCATGGTC(pp)G:n (c-fos-kohteen) . valmistus

Valmistus tapahtuu esimerkissä 62 kuvatulla tava-30 11a käyttäen viimeisessä syklissä vastaavaa C(pp)G-fosf- oriamidiittia.

64. Oligonukleotidien karakterisointi

• I

; Karakterisointi tapahtuu HPLC:n, polyakryyliamidi- I » » geelielektroforeesin (PAGE) ja negatiivisilla ionella ta-35 pahtuvaan sähköiseen suihkutukseen perustuvan massaspekt-

> I

45 115399 rometrian (Negativionen Elektrospray Massenspektrometrie; ES-MS") avulla. Tuotteet puhdistetaan edellä kuvatulla tavalla, ja ne antavat sen jälkeen PAGE:ssa (20 % akryyli-amidia, 2 % bisakryyliamidia ja 7 mol/1 ureaa) yhden yhte-5 näisen vyöhykkeen. HPLC tehdään käänteisfaasipylväillä RP-18, valmistaja Merck, tai PA-100-pylväässä, valmistaja Dionex. ES-MS':aa varten oligonukleotidit muutetaan ammo-niumasetaattisaostuksella tai muulla suolanmuodostusreak-tiolla ammoniumsuoloiksi. Näytteen syöttö tapahtuu aseto-10 nitriili-vesiseokseen (1:1) tehdystä liuoksesta, joka sisältää 5 OD260/ml oligomeeria. Tämän menetelmän tarkkuus on noin ±1,5 daltöniä.

65. Stabiiliuden ja soluunoton määrittäminen radioaktiivisen leimauksen jälkeen 15 Radioaktiivinen leimaus

Yleisesti käyttökelpoinen 35S-leimaus tehdään toteuttamalla oligonukleotidin synteesin yhteydessä vähintään yksi DNA-synteesisyklissä tehtävä hapetus (vaihe 20 esimerkissä 11) alkuainemuodossa olevalla rikki-35:llä. 20 Oligonukleotidit, joissa on vapaa 51-hydroksyyliryhmä, voidaan leimata 32P:lla tai 35S:llä sinänsä tunnetuilla me-,, netelmillä polynukleotidikinaasin avulla. Oligonukleoti dit, joissa on vapaa 3'-hydroksyyliryhmä, voidaan leimata tunnetulla tavalla 3'-terminaalisen transferaasin avulla.

• » I

• 25 Tässä esitetään esimerkkinä DNA-osan 5'pään leimaus: Oli-

• * I

*<!** gonukleotidi, jossa on vapaa 5'-hydroksyyliryhmä (500 ; pmol), liuotetaan 425 pl:aan vettä, kuumennetaan tämä liu- v : os lämpötilaan 90 °C ja jäähdytetään nopeasti. Sitten li sätään 50 μΐ väkevyydeltään kymmenkertaista (10 x) kinaa-·;· 30 sipuskuria ja 50 μΐ 32P-gamma-ATP:tä (6 000 > Ci/mmol) tai 35S-gamma-ATP:tä ja inkuboidaan 1 tunti lämpötilassa 37 °C.

. Reaktio keskeytetään lisäämällä EDTA-liuosta (0,5 mol/1).

• · · *· \ Suolojen poisto tehdään Pharmacian valmistaman NAPR-pylvään

I I I I

avulla.

» I t i I

» « « » > » 46 115399

Oligomeerien stabiiliuden tutkiminen soluja sisältävässä alustassa

Supernatantti 1 (10 μΐ) sekoitetaan 5 μ1:η kanssa 80-prosenttista formamidia (mukana XC ja BB), kuumennetaan 5 lämpötilaan 95 °C (5 min) ja ladataan polyakryyliamidigee-lille (20 % polyakryyliamidia, 7 mol/1 ureaa). Kun geeli on kehitetty sähkökentässä, geelillä olevat vyöhykkeet luokitellaan autoradiografian avulla "stabiilia oligomee-ria" vastaaviksi vyöhykkeiksi tai "hajonnutta oligomeeria" 10 vastaaviksi virhevyöhykkeiksi. Tulokset 24 tunnin inku-boinnin jälkeen: verrattuna muuntamattorniin oligonukleoti-deihin on kaikilla kaavan I mukaisilla yhdisteillä (W kaavan II mukainen, R kaavan II' mukainen) voimakkaasti pidentynyt elinikä.

15 Soluunoton määrittäminen

Inkuboidaan Vero-soluja 96-syvennyksisissä mikro-maljoissa 5 % FCS:a sisältävässä DMEM-alustassa 24 tuntia lämpötilassa 37 eC. Kun alusta on poistettu, solut pestään vielä kahdesti seerumittomalla DMEMrllä. Radioaktiivisesti 20 leimattu oligomeeri (105 min-1) laimennetaan leimaamatto-malla oligomeerilla pitoisuuteen 10 pmol/l seerumissa ja ( . inkuboidaan soluja tämän seoksen kanssa lämpötilassa 37 °C. Otetaan 1, 7 ja 24 tunnin kuluttua aina 150 μ1:η » näyte (merkintä: "supernatantti 1"). Mikromaljojen syven- • » » • 25 nyksissä olevat solut pestään 7 kertaa 300 pl:lla tuoret- * · > ta alustaa ja tehdään yhdistetyille pesuun käytetyille * · alustoille (merkintä: "supernatantti 2") mittaus tuikelas- kurilla. Sitten lisätään 100 μΐ trypsiiniliuosta, odotetaan 30 sekuntia ja imetään supernatantti pois. Solujen 30 irrottamiseksi maljasta inkuboidaan 3 min lämpötilassa . 37 °C. Irrotetut solut siirretään 1,5 ml:n Eppendorf-put- kiin ja sentrifugoidaan 6 min kierrostaajuudella : 2 000 min-1 ("supernatantti 3"). Supernatanteille 1 (5 μΐ), * 2 ja 3 (0,5 ml) tehdään kullekin erikseen mittaus tuike- ; 35 laskurilla. Tuloksista saadaan lasketuksi oligomeerin vas- 47 115399 taanotto pikomooleina 100 000 solua kohden, jolloin super-natantti 3 edustaa soluun sitoutunutta oligomeerifraktiota ja supernatanttien 1 ja 2 sumina sitoutumatonta oligomeerifraktiota.

5 66. Soluunoton määrittäminen f luoresenssileimauksen jälkeen COS-solujen annetaan kasvaa yhtenäiseksi kerrokseksi Dulbeccon MEM-alustassa, jota on täydennetty 10 %:lla FCS:a, 5 cm:n petrimaljoissa. Solut pestään kahdesti see-10 rumittomalla DMEMillä. Raaputetaan steriilillä neulalla petrimaljan keskelle alue, jonka pinta-ala on noin 1 cm2. Tälle alueelle lisätään tutkittavaa DNA-oligomeeriliuosta (0,1 mmol/1). Inkuboidaan lämpötilassa 37 °C (^-atmosfäärissä. Solut tutkitaan 2, 4 ja 16 tunnin kuluttua fluore-15 senssimikroskopialla. Sen tekemiseksi solut pestään neljästi seerumittomalla DMEMrllä, peitetään objektilasilla ja tutkitaan fluoresenssimikroskoopilla tai käyttämällä faasikontrastia.

67. Sulamislämpötilojen määrittäminen 20 Sulamislämpötilat määritetään HP8452A -diodirivi-

spektrofotometrin, HP 89090A -Peltier-elementin ja HP

., ,: Temperature Control Software Rev. B5.1 -ohjelmiston (vai- * · u mistaja Hewlett Packard) avulla. Mittaus tehdään ΙΓΙ 0,5 °C:n/min:n välein käyttämällä puskurina 10 mmol/1 * ; 25 HEPES:ä ja 140 mmol/1 NaCl:a sisältävää liuosta (pH 6,5).

Oligomeeripitoisuus on 0,5 - 1,5 OD260/ml.

: 68. Antiviraalisen aktiivisuuden testaaminen solu viljelmässä

Tutkitaan testattavien aineiden antiviraalista ak-:· 30 tiivisuutta erilaisten ihmiselle patogeenisten herpesvi- : rusten suhteen soluviljelmätestijärjestelmässä. Koetta , varteen siirrostetaan apinan munuaissoluja (Vero, 2*105/ml) ; seerumipitoiseen Dulbeccon MEM-alustaan ( 5 % naudan sikiö- seerumia, FCS) 96-syvennyksisiin mikromaljoihin ja inku-; 35 boidaan 24 tuntia lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä t 48 115399 atmosfäärissä. Seerumipitoinen alusta imetään sitten pois ja solut huuhdotaan kahdesti seerumittomalla Dulbeccon MEM-alustalla (-FCS). Tutkittavat aineet laimennetaan ennalta vedellä pitoisuuteen 600 pmol/l ja säilytetään läm-5 pötilassa -18 °C. Testiä varten tehdään laimennussarja Dulbecco's Minimal Essential Medium (MEM) -alustaan. Lisätään 100 μΐ kutakin yksittäistä tutkittavan aineen laimennosta yhdessä 100 μ1:η kanssa seerumitonta Dulbeccon MEM (-FCS) -alustaa huuhdottuihin soluihin. Kun on inku-10 boitu 3 tuntia lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä atmosfäärissä, solut infektoidaan tyypin 1 herpes simplex -viruksella (ATCC VR733, HSV-1, F-kanta) tai tyypin 2 herpes simplex -viruksella (ATCC VR7343, HSV-2, G-kanta), joita käytetään sellaisina pitoisuuksina, että solukasvus-15 tot tuhoutuvat täydellisesti 3 vuorokaudessa. HSV-I:n kohdalla infektointiin käytetään 500 pesäkkeenmuodostusyksik-köä (PFU) syvennystä kohden, HSV-2:n kohdalla 350 PFU/sy-vennys. Koe-erät sisältävät tällöin tutkittavaa ainetta pitoisuuksina 80 - 0,04 pmol/l MEM-alustassa, jota on täy-20 dennetty penisilliini G:llä (100 ky/ml) ja streptomysiinillä (100 mg/1). Kaikki kokeet tehdään kahtena rinnak-kaismäärityksenä lukuun ottamatta vertailukokeita, jotka tehdään kahdeksasti kutakin maljaa kohden. Koe-eriä inku-boidaan 17 tuntia lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä • · * ; 25 atmosfäärissä. Tutkittavien aineiden sytotoksisuus määri- tetään yhteensä 20 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen ··' - arvioimalla soluviljelmät mikroskooppisesti. Suurimmaksi V · siedetyksi annokseksi (dosis tolerata maxima, DTM) mer kitään suurin valmistepitoisuus, joka ei mainituissa koe-: · 30 olosuhteissa vielä aiheuta mikroskooppisesti havaittavissa : olevia soluvaurioita. Sen jälkeen lisätään FCS:a loppupi- . toisuudeksi 4 % ja jatketaan inkubointia 55 tuntia lämpö- ; tilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä atmosfäärissä. Käsit telemättömissä infektiovertailunäytteissä havaitaan täl-: 35 löin täydellinen sytopaattinen vaikutus (CPE). Mikrosko- 49 115399 pia-arvioinnin jälkeen soluviljelmät värjätään neutraali-punaisella Finterin (1966) vitaalivärjäysmenetelmällä. Tutkittavan aineen antiviraalinen aktiivisuus määritellään pienimmäksi estäväksi pitoisuudeksi (minimale Hemmkon-5 zentration, MHK), joka tarvitaan suojaamaan 30 - 60 % soluista virusten sytopatogeeniselta vaikutukselta. Erilaisten oligonukleotidien MIC-arvot ovat alueella 0,1 -80 pmol/l.

69. Virusten vastaisen in vivo -aktiivisuuden mää- 10 ritys yhdisteiden testaamiseen in vivo käytetään 5 viikon ikäisiä NMRI-hiiriä, jotka painavat noin 16 - 18 g. Hiiriä pidetään tavanomaisissa olosuhteissa viiden hiiren ryhmissä antaen rajoittamattomasti ravintoa ja vettä. Hiiret 15 infektoidaan intraperitoneaalisesti noin 10 - 50 LD50-yk-siköllä HSV-kantaa (HSV "corneae"). Yhdistettä annostellaan kahdesti vuorokaudessa intraperitoneaalisesti 1, 10 tai 50 mg/kg. Vertailueläimet saavat l-%:ista natriumklo-ridiliuosta. Eläinten henkiinjäämistä seurataan kahden 20 viikon ajan. Annettaessa antisense-oligonukleotidia on henkiin jääneitä eläimiä 1 - 5, kun taas plasebon annon jälkeen kaikki eläimet kuolevat.

• · 70. In vivo -aktiivisuuden määrittäminen: c-Fos- proteiini-iImentyrnisen inhibitio rotassa ' ; 25 Määritys tehdään tavalla, jota kuvaavat Sandkuhler

* » I

’*·* et ai. julkaisussa Proceedings on the VIth World Congress ί on Pain, toim. Charlton ja Woolf, Elsevier, Amsterdam : : 1991, s. 313 - 318, selkäydinsuperfuusion avulla. Kun on poistettu barbituraattianestesiassa olevan Sprague-Dawley-.'· 30 rotan nikamakaari, muodostetaan silikonista kaksikammioi- : nen säiliö antisense-oligomeerin vastaanottoa varten. Toi nen kammio täytetään antisense-oligonukleotidijohdannai- : » ; sella, kun taas toinen kammio täytetään vertailuoligomee- rillä (kummankin pitoisuus 75 pmol/l). Superfusaatti vaih-: 35 detaan aina tunnin välein. 6 tuntia kestäneen superfusoin- 50 115399 nin jälkeen stimuloidaan c-fos-ilmentymistä takaisinvir-tauksen lämpökäsittelyllä (52 °C). c-fos-ilmentymisen in-hibitio voidaan osoittaa immuunihistokemiallisesti asianomaisista kudosleikenäytteistä.

5 71. 5,-0-(4,4,-dimetoksitrifenyylimetyyli)-2’-deok- sitymidylyyli- (3 '-*5') -3' -0-levulinyyli-2' -deoksitymidiini-3' - [(α-0-tributyylisiloksi)-2-nitrobentsyyli]-fosfonaatin valmistus [TBS (tributyylisiloksi) -suojattu hydroksifos-fonaattidimeeri H] 10 Liuotettiin 1,77 g (1,636 mmol; 1 ekv) a-hydroksi- fosfonaattidimeeriä B ennalta kuivattuna 30 ml:aan kuivaa pyridiiniä. Tähän liuokseen lisättiin pisaroittain 2,62 ml (9,816 mmol; 2,306 g; 6 ekv) klooritributyylisilaania. Kun oli sekoitettu 8 tuntia huoneenlämpötilassa, reaktio kes- 15 keytettiin lisäämällä metanolia ja haihdutettiin seos kui viin pyöröhaihduttimella. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografiällä. Eluenttigradientin etyyliasetaatti-meta-noli metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 2 %:iin. Tuote on vaaleankeltainen kiinteä aine (1,78 g; 1,39 mmol; 20 85 %).

72. 5 ' -0-(4,4 ’ -dimetoksitrifenyylimetyyli)-2' -deok-sitymidylyyli- (3 ’-»5 ') -2 ' -deoksitymidiini-3 ' - [ (α-0-tribu-tyylisiloksi)-2-nitrobentsyyli]-fosfonaatin valmistus [TBS-suojattu hydroksi-3'-OH-fosfonaattidimeeri I] • · • ;* 25 Liuotettiin 1,2 g (0,94 mmol) TBS-suojattua hyd- *·:·* roksifosfonaattidimeeriä H 10 ml:aan pyridiiniä ja lisät- • * · : tiin 10 ml liuosta, joka koostui 3 ml:sta hydratsiinihyd- V * raattia (24 % vedessä), 6,92 ml:sta pyridiiniä ja 4,61 ml:sta etikkahappoa. Kun liuosta oli sekoitettu 3 min ':· 30 huoneenlämpötilassa, se jäähdytettiin lämpötilaan 0 'C ja ; laimennettiin 100 ml:11a vettä ja 100 ml:11a etyyliase- . taattia. Kun faasit oli erotettu erotussuppilossa, orgaa- ; ninen faasi pestiin kerran 25 ml:11a 5-prosenttista nat- riumvetykarbonaattiliuosta ja kuivattiin sitten natrium-; 35 sulfaatilla. Kuivausaine erotettiin suodattamalla ja liuos 51 115399 haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttimella. Raakatuote puhdistettiin flash-kromatografialla. Eluenttigradientin di-kloorimetaani-metanoli metanolipitoisuus nostettiin 0 %:sta 5 %:iin. Tuote eristettiin vaaleankeltaisena kiin-5 teänä aineena (910 mg; 0,77 mmol; 82 %).

73. 5' -0- (4,4' -dimetoksitrif enyy lime tyyli) -2' -deok-sitymidylyyli- (3 '-»δ1) -21 -deoksitymidiini-3' -0-sukki nyyli-[ (α-0-tributyylisiloksi)-2-nitrobentsyyli ]-fosfonaatin valmistus [TBS-suojattu hydroksi-3'-sukkinyylifosfonaatti-10 dimeeri J]

Liuotettiin 120 mg (0,10 mmol; 1 ekv) TBS-suojattua hydroksi-3'-OH-fosfonaattidimeeriä I ennalta kuivattuna 1 ml:aan kuivaa pyridiiniä. Sitten lisättiin peräkkäin 14,8 mg (0,12 mmol; 1,2 ekv) 4-dimetyyliaminopyridiiniä ja 15 12,1 mg (0,12 mmol; 1,2 ekv) meripihkahappoanhydridiä ja sekoitettiin 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Lisättiin 40 ml vettä ja haihdutettiin 10 minuuttia kestäneen jälkisekoi-tuksen jälkeen kuiviin pyöröhaihduttimella. Jäännös siirrettiin 10 ml:aan dikloorimetaania ja uutettiin kerran 20 5 ml:11a kylmää 10-%:ista sitruunahappoa ja kahdesti käyt tämällä kerralla 5 ml kylmää vettä. Sen jälkeen orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatilla. Haihdutettiin suodatuksen jälkeen kuiviin pyöröhaihduttimella. Raakatuote ! siirrettiin 3 ml:aan dikloorimetaania ja lisättiin seos * · * • 25 pisaroittain 25 ml:aan jääkylmää n-heksaania. Tuote erot- tui värittömänä sakkana. Täydellisen saostumisen aikaansaamiseksi pidettiin emäliuosta muutamia tunteja lämpöti- • lassa -20 °C, erotettiin sitten tuote suodattamalla ja kuivattiin se. Tuote on väritön kiinteä aine (115 mg; 30 0,09 mmol; 90 %).

> * 52 115399 74.5'-O-(4,4'-dimetoksitrifenyylimetyyli)-21-deok-sitymidylyyli- (3 '-*5') -2' -deoksitymidiini-3' -O-sukkinyyli-CPG-[ (α-0-tributyylisiloksi) -2-nitrobentsyyli] -fosfonaatin valmistus [CPG:hen sidottu TBS-suojattu hydroksi-3'-sukki-5 nyylifosfonaattidimeeri K]

Liuotettiin Pierce-pullossa 26,5 mg (0,021 mmol; 1,5 ekv) TBS-suojattua hydroksi-3'-sukkinyylifosfonaatti-dimeeriä J 0,7 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia ja lisättiin 6,74 mg (0,021 mmol; 1,5 ekv) O-bentrotriatsol-1-10 yyli-Ν,Ν,Ν’,N*-tetrametyyliuroniumtetrafluoriboraattia (TBTU) ja 2,1 ml (0,0017 mmol; 1,96 mg; 1,2 ekv) N-etyyli-morfoliinia. Sen jälkeen lisättiin 183 mg CPG-kantajaa ja ravistetiin vielä 4 tuntia huoneenlämpötilassa. Seos siirrettiin suodatinupokkaaseen, pestiin metanolilla ja di-15 kloorimetaanilla, siirrettiin takaisin Pierce-pulloon ja lisättiin 0,7 ml pääteryhmienmuodostusreagenssia, ravisteltiin vielä tunti, siirrettiin uudelleen suodatinupokkaaseen, erotettiin suodattamalla, pestiin metanolilla, dikloorimetaanilla, tetrahydrofuraanilla ja dietyylieet-20 terillä ja kuivattiin öljypumpulla aikaansaadussa alipaineessa. Kantajan kuormittuminen: 33,15 mmol/g.

. 75. CGTCCATGTCGGCAAACAGCT(PP)C:n (HSV-kohteen) vai- mistus ; Valmistus tapahtuu esimerkissä 56 kuvatulla tavalla * 25 lähtien T(pp)T-CPG-kantajan sijasta esimerkistä 74 saadus- * ta vastaavasta T(pp)T-CPG-kantajasta. Kondensaatioreakti- : oissa vaiheessa 4 käytetään kulloinkin sekvenssiä vastaa- -» ! vaa deoksiadenosiini-, deoksiguanosiini- tai deoksisyti- diinimonomeerirakenneosaa. Edullisia ovat sellaiset kau-!· 30 pallisesti saatavissa olevat rakenneosat, jotka sisältävät • . nopeasti lohkaistavissa olevia suojausryhmiä (Expedite" _ , Fast Deprotecting Amidites; Millipore, Eschborn).

» > 1 » 53 115399 T- T-rfCJi-iNoKtO n N N in g

’p' O CD_ CD_ o r- ro ·«- TT r CO tt) N O

ε TJ-1 to pj F) M1 W N Γ O CM" N·' 4“ 4" g cm cmcmcmcmcmcm£^cm n w w σΓ ^ CM~ CO~ 4~ T-~ T-' CM T-~ ^ (D W CD ra C o 00 N T- OI ^ 1- PJ CM CO h~-_ CM o .K "M-" CO CO CO CM1 CM" CM t- Q CM h-Γ «fr ^

K2 I CM CMCMCMCMCMCMCMCM CM CM CM CM CM

ν' X ^

en ^ N N

N X X

CO X CM cp CD CO o m o CO N-_ o „ oo_ J3, t-_ co en h in σι F cd 'Tr en en co £2 <0 12 Q_ CD ^ CD CD CD CD ^ C- ϋ cd co o co h- σΓ ^ n co c CO «jT ID ID 2 en CO CM_ CO T-_ e en ;£ en en cd cd en en cd en

<> i CD ·—- CD CD CD I CD ι I CD , CD CD CO

E

D.

D- CD

\ ID

T «t OlDN-lD^tr-COCO O W CO «fr h1

C CD. CO CO «·. V ί) N CO r CD tD O CM CM

‘O i CD1 CD1 CO CD CD CD" CD CD1 CD CD1 ID CD CD CO

• cT o en :, o. id Ä A Λ «d \ id m t iö inNin^Ciomn «a- «1 oo co t- ; -£ co cncnoN-_T-^cMOT- r s o ro q ; ‘-o · -fr 'f V id" id1 id1 id1 id s id' d 'i d 3 l·- H f— K- h- F- l·- H- H t t t Z Ό Ό TOTOTJOTOOOOTJTJOOOX) 2 O CV Cv

h - o O

2 0 X 2Γ co z Z Z 4 co y 5 O X

X Z O O X O c\T O 4 cm cm"" c\T fc g Z O O

54 115399

O

co _ co m m- o o o «- en 5 ρ o n t q r (o v £ CO CO CM W N W P N S·

g-WWWWWCMN CM

'—1 T- B) Tf W 'ί N S ^ b- jr conintD'fi-Snwn ^

, r. CO CO c\T cm' cm" cm" o" _· cm" CO JM

‘ocmcmcmcmcmcmcmZcmcm CM

*N ^

N X ,—s ,—. N

X CO JM N X

CO T- X X T- in O CM CO N-_ ,_, ro" m·" o" co in

ECO CD e- CO CD

t—_ t—^ y~ y— A ΓΟ CD M· N- -M- in in O) roincor^r^QCMQinin C CD cd" K cd" cd" en" · N." o" ^ococdcocdcoZcdZioco ·

eT

a Q.

•—1 n in

Tincor^cocDT-r^rir^in cm qcom^cdcdcdcooHcdn· cq

«O CD* CO CO co" CO CO N·" 2 (O CD CO

*: *: E' O.

'* Ä co ^inuocMincMN-inrCrv. cd ^ o t—^ co cm co o H t- co m" in m" in" in" co" co 2 m" ( in : Ifetetefekkfekfefelgfclgfclgtgfc ϊ2·σ·σ·σ·σ·σ·ο·Ό-ο·σ·ο<<<<<<<

V ·Η • R

‘ Π c> O e ~ cscvOOjnOj c\ : 9 0022§SaTx r o _ ci^ 2 Z Z 4 cq ^ R 2 Ö X _ Z 2 XXOcm Om-cmcmcm fe u,ZOOXOOm- 55 115399 _ _ S'

Q Q O

O O £ 0} ω 2 1 - r ., — , ,-1

Έ Έ X

77 o co co ^ o q δ δ δδ δ δ 3 ε m r οΤ. ty m ο w co in in ω Μ υ Ο- cm ο3 w “ «ΣΣΣΣΣΣα ϋ \ \ \ Σ α α α α α α ο s n min ro s - — - ^ ~ ~ c τ- CO Ο) - Ν in r-*· coco o co o in ^ cm cd co J5 00 T-“ o' cm c\T cd V *Ί-. ™ “l <Ί cm* - r-ω to α>

Ό CM CM CM t—. CM CM ErrOCDNN--N0.MnM

______g CM CM CM T- CM CM CM CM r- CM CM CM

— co coco co 57 ^ £! in co in

0. CM CM COO CO CMC' CO COCO CO CM

P) r- r~ OO CM (Μ *— CM r- CO CO CO

Ό CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

Έ· E

t a a. a Q- cm “ cm co co CD co ·

1—’ fC. § cm co CD If) Q

£ CD ‘O . CM co" CO CO . co" Z

, . Il I CO--------- "n n

I X

O 077

p' *i « X

c CO CO CO

Q. 7: CO CO CO

Q. C t- T- T- 1—1 CO 00 & ~

I T T* N Tt O) (O .5 CO CO CM

q n in r-_ λ. ω co u co co co Ό N s nL <0 10 « co' CO co"

-mm-m-m. —— _____ ** ί I | I I (0 CO CO

·, ·: ET I

a. o.

. Q. ___ Tf CD CM»- COCM CO CM

;· I-1 57 ÖCOCMCOO»-r-«-r- I) ) 6 N n rn- N 8 *o cd co' in co co' in in' in' : : o co to" (o£. in n * * w

, -— ----- ----------—— M

• · ’ · CO

o Σ ·: s s g I 5 5 5 § § __l_z__zjz__iiji

--- " ' "" 1 ^ - " M

^ * ΙΛ X V Σ . . d v S g s ~ 3 fe £ S £ >- £ z £ · ^ Ό -O T3T0 CO h- l·- h- NC ^________ '1 do d d ’ ': o ig do

_ ,rl w i»H CN *H

« —r <W %r» (J 0) 0) 7* H -u 9 -u

OZQi C λ ttl Ä (0 M «M CM

..2 £ 9 <u 9 o o o _ __

CO_ ΊΤ ^ £ co -H CO -H 2 2 20 UU

X CM CM CM ^ ^ O XcMHCMH'iCM CM Μ- 56 115399 « δ δ to to 2 2 O O ooooooo - - 22^2^2222222

rt cn -iQQQQQQQQQDQ

.—, r~ m E CO M·' a m im - fv ffl o. r* in n CO rt

Ό N M

___ 00 CD 03

— CO CN O O O

E o »“ »- o o *— ^ r- «— T— r“

Ed ^ ^ **** ^ ^ — co cn o in in cd r- in g. α.<-^ι-Ν^©Γ)Γθ<ίΐη«- a *- ·· cn - o 'O - - - ' * x in co ^ r^r-»— <— »— T-T— *-

Ό CD CD

l — “n n X X tn cn o ^ in " co co n o ·- oo r-> o i- tn cm in £ «— T- J,0 0 03COTttn»-inin»-in g _ Γ| o. «- rC ö rC ai *i cd oi ö co •i± 52 CN X<-n>-P)t-NrP)nCMr· -or^cor^tor^tor^r^r^r^r'- n co co ------------

- co CD

u i Ή ,» ,. ·£ μ

E CU

. O- M-1 :. a cn _ . “ co tn ai p <3 1- O O rt

'*’ I - ' e “ 03 ID cn O' CO

!*.' Όΐηιη 0 S-'i’—f"'·*— (''CN.— coidcni'' * * ___g χ 03 0303 Cv 03 O 03 03 03 O 03^ , M Tl Ό CO (θ' cd" ® <o‘ N © co" ID K ffl ,;,· M t.------------ , . cd • · ij cd : ' : O g : : 3 < < Ή * ^ ro n a

ä *- *- V

P3 M

H CH M

* <ö , -Γ-) · , o d3·- h- H f— I— I— I— |—

• ® ·Η 3 Ό Tt N

,H S 2 u ' ~o ,< ,^<<<X) 5 ? . ai___.___________ . β t~ t- cn • g___ ai * Ή * T3

* -H

u

D

. cd • cd

„ Π H

« o ; x 4-i

O cn i-H

u o ,° -^1— l— I— h-Hl— i_i_j— ., V . CM 3 ΤΙΌτί^ΝΝζζζΐ-Η- X ^ ^ ^ 2;O^OO<<-0-0O<«)ri

Claims

57 115399

1. Menetelmä sellaisten yhdisteiden valmistamiseksi, joilla on kaava (I), 5 fr—CH-Pif t o missä Y on OH-, SH-, OAc- tai SAc-ryhmä, joissa Ac =

10 Ci-i8-asyyliryhmä, joka on mahdollisesti 1-3 -kertaisesti tyydyttymätön, R' on aryyli-, heteroaryyli- tai alkyyliryhmä, W on farmaseuttisesti vaikuttava 5'-, 3'- tai 2'-nukleosidianalogi, 15. on merkitykseltään sama kuin ryhmä W, jolloin R ja W voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tai R on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä tai W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W 20 on kaavan (II) mukainen ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen • · · » ryhmä, rv .r i r Ί . . . —0' —^ % j e «* o *J : : : , « . i ..... ! ^ di) (iit) • · * ♦ » • » » . 25 joissa X on oksi-, sulfaanidiyyli- tai metyleeni- ; \· ryhmä, 't : ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, n on riippumattomasti kokonaisluku 0-50, 58 115399 kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riippumattomasti H-atomi, Ci-i8-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on 0 5 li r4-p-or5 jossa R4 on 0"-, S”-, CH3- tai CHYR'-ryhmä, jossa R' 10 ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1 - 18 hiiliatomia, kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, OCi-ia-alkyyli- tai OCi-is-asyyliryhmä, F- tai Cl-atomi tai N3-, NH2- tai NHR6-ryhmä, jossa R6 on Ci_6-alkyyli- tai 15 -asyyliryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 31-asemassa, tunnettu siitä, että a) saatetaan kaavan (III) mukainen yhdiste reagoi-20 maan kaavan (IV) mukaisen yhdisteen kanssa, yM ; K—1\ 8 : , o nor ;7. (m) (iv) « 1 t 25 tai b) saatetaan kaavan (V) mukainen yhdiste halutussa “! järjestyksessä ja käyttämällä kondensointlainetta reagoi- *; maan kaavan (VI) mukaisten yhdisteiden kanssa tai ·,* ; c) saatetaan kaavan (V) mukainen yhdiste halutussa : 3 0 järjestyksessä ja käyttämällä kondensointlainetta reagoi maan kaavan (VI) ja kaavan (VII) mukaisten yhdisteiden kanssa, 59 115399 . WOK , ft 0 K o-sc (V) (VI) (VII) jolloin SG on suojausryhmä, joka kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi mahdollisesti lohkaistaan 5 pois, tai saatetaan nukleotidiyksikkö, jossa on 3'(21)-terminaalinen H-fosfonaattiryhmittymä ja suojattu 51-hydroksyy-liryhmä reagoimaan toisen nukleotidiyksikön kanssa, jossa on vapaa 5'-hydroksyyliryhmä ja suojattu 3 ' (2')-hydroksyy-10 liryhmä, aktivointiaineen läsnä ollessa H-fosfonaattidinuk-leosidiksi ja kondensoidaan tämä aldehydin kanssa dinukleo-sidi-oi-hydroksialkyyli (aryyli) fosfonaatiksi, joka reagoituaan aktivoiduiksi johdannaisikseen reagoi muiden (oligo) -nukleotiditragmenttien kanssa oligonukleotideiksi, jolloin 15 tilapäiset suojausryhmät poistetaan, tai a) saatetaan nukleotidiyksikkö, jossa on 3 ' (2 ') -terminaalinen fosfori(III) - tai fosfori(V)-ryhmittymä, rea-goimaan toisen nukleotidiyksikön tai kasvavan oligonukleo-tidiketjun vapaan 5’-hydroksyyliryhmän kanssa kondensoin-:*·*: 20 tiaineen läsnä ollessa tai : b) niiden aktivoitujen johdannaisten kanssa, tai ‘ muodostetaan oligonukleotidianalogeja fragmenteit- tain samalla tavalla, lohkaistaan pois kohdan (a) tai (b) mukaisesti valmistettuihin oligonukleotideihin muiden funk-t*t 25 tionaalisten ryhmien suojaamiseksi tilapäisesti lisätyt ::: suojausryhmät ja muutetaan siten saadut oligonukleotidiana- logit, joilla on kaava (I), jossa W on kaavan (II) mukainen * * ·.**: ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen ryhmä, mahdollisesti fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen. » · · » 60 115399

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa Y on OH-, SH-, OAc- tai SAc-ryhmä, joissa Ac = Ci-is-asyyliryhmä, joka on mahdollisesti 1-3 -kertaisesti 5 tyydyttymätön, R' on aryyliryhmä, jossa on 6 - 14 C-atomia ja joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien joukosta: Ci-5-alkyyliryhmä, halogeeniatomi ja NO2-, CN-,

10 Ci-6-alkoksyyli-, amino-, Ci-4-alkyyliamino- ja Ci-e-dialkyy-1iaminoryhmät, jolloin aryyliryhmään voi myös olla kondensoituneena C3-8-alkyleeniryhmä, jossa yksi CH2-ryhmä voi myös olla korvautunut oksiryhmällä; heteroaryyliryhmä, jossa on 3 - 13 C-atomia ja korkeintaan kolme N-, 0- ja

15 S-atomien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut tai suoraketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyydyttymätön Ci-16-alkyyliryhmä, joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla substituentilla, jotka valitaan halogeeniatomien ja CN-,

20 NO2- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, W on farmaseuttisesti vaikuttava 5'-, 3'- tai :· ; 2 1-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W, jolloin R • · · * :v. ja W voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tai R on C1-6- . .*, 25 alkyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketj uinen ; ,·, ja on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toi- sistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan halogee-’ niatomien ja CN-, Ci_i8-asyylioksi - ja Ci-is-alkoksyyliryh- mien joukosta, tai ··* 30 W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kans- sa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin VJ * :*>. on kaavan (II) mukainen ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen , . : ryhmä, joissa X on oksi- tai sulfaanidiyyliryhmä, 35 ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, * n on riippumattomasti kokonaisluku 0 - 30, 61 115399 kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riippumattomasti H-atomi, Ci-12-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on 0

5 II r4-p-or5 jossa R4 on 0- tai S-atomi tai CH3- tai 10 CHYR'-ryhmä, jossa R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia, kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, 0Ci-i2-alkyyli- tai 0Ci-i2-asyyliryhmä, Cl-atomi tai N3-, NH2-15 tai NHRs-ryhmä, jossa R6 on Ci-3-alkyyli tai -asyyliryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3’-asemassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa Y on OH-, SH-, OAc- tai SAc-ryhmä, joissa Ac = Ci_3- i asyyliryhmä, joka on mahdollisesti 1-3 -kertaisesti tyydyt tymätön, ! 25 R' on aryyliryhmä, jossa on 6 - 14 C-atomia ja joka : on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisis- : : taan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien joukosta: Ci-3- alkyyliryhmä, F- ja Cl-atomit ja N02-, CN-, . Ci-4-alkoksyyli-, amino-, Ci-3-alkyyliamino- ja Ci-6-dialkyy- 30 liaminoryhmät, jolloin aryyliryhmään voi myös olla kondensoituneena C3-8-alkyleeniryhmä, jossa yksi CH2-ryhmä voi • i myös olla korvautunut oksiryhmällä; heteroaryyliryhmä, jos- t • sa on 3 - 6 C-atomia ja korkeintaan kolme N-, O- ja S-ato- mien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut tai 35 suoraketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyydyt-tymätön Ci_8-alkyyliryhmä, joka on mahdollisesti substi- 62 115399 tuoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla substituentilla, jotka valitaan Cl-atomien ja CN-, N02- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, W on 5'-, 3'- tai 2'-nukleosidianalogi, 5. on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai Ci-6-al- kyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjuinen ja on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kahdella ryhmällä, jotka valitaan halogeeniatomien ja CN-, C3-6-asyyli-oksi- ja Cs-ie-alkoksyyliryhmien joukosta, tai 10 W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kans sa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W on kaavan (II) mukainen ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen ryhmä, joissa X on oksiryhmä, 15 ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, n on riippumattomasti kokonaisluku 0-20, kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riipumattomasti H-atomi, Ci-8-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on 20 0 II R4-P-OR5 ·:* I * » # * ! : : 25 jossa R4 on O- tai S-atomi tai CH3- tai • : ; CHYR'-ryhmä, jossa R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ; ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 1-8 hiiliatomia, kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi,

30 OCi-s-alkyyli- tai OCi-8-asyyliryhmä, Cl-atomi tai N3-ryhmä, ja • aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä » ! oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3'-asemassa.

4. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-3 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmiste-taan yhdiste, jossa 63 115399 Y on OH-ryhmä, R' on aryyliryhmä, jossa on 6 C-atomia ja joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien jou-5 kosta: Ci-3-alkyyliryhmä, F- ja Cl-atomit ja N02-, CN-, C1-4-alkoksyyli-, amino-, Ci-3-alkyyliamino- tai Ci-6-dialkyyli-aminoryhmät, jolloin aryyliryhmään voi myös olla kondensoituneena C3-6-alkyleeniryhmä, jossa yksi CH2-ryhmä voi myös olla korvautunut oksiryhmällä; heteroaryyliryhmä, 10 jossa on 3 - 6 C-atomia ja korkeintaan kolme N-, O- ja S-atomien joukosta valittavaa heteroatomia; haaroittunut tai suoraketjuinen, tyydyttynyt tai 1-3 -kertaisesti tyy-dyttymätön, edullisesti konjugoidusti tyydyttymätön, tyy-dyttymättömän sidoksen alfa-asemassa sisältävä, Ci-s-alkyy-15 liryhmä, joka on mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla substituentilla, jotka valitaan Cl-atomien ja CN-, NO2- ja Ci-3-alkoksyyliryhmien joukosta, W on 5'- tai 3'-nukleosidianalogi, 20. on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai Ci-4-al- kyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjuinen, ; tai W ja R muodostavat yhdessä fosfonaattiryhmän kans-. , sa, johon ne ovat sitoutuneet, oligonukleotidin, jolloin W , , 25 on kaavan (II) mukainen ryhmä ja R on kaavan (II1) mukainen ; t ryhmä, ‘1 joissa X on oksiryhmä, • > t ' ryhmä B on riippumattomasti nukleotidiemäs, n on riippumattomasti kokonaisluku 0-15, ·*· 3 0 kumpikin ryhmistä R1 ja R2 on riipumattomasti H- ·...· atomi, Ci-4-asyyliryhmä tai ryhmä, jonka kaava on » : o » II : 35 R4-P-OR5 » : I 64 115399 jossa R4 on 0- tai S-atomi tai CH2- tai CHYR'-ryhmä, jossa R' ja Y ovat edellä määriteltyjä ryhmiä ja R5 on mahdollisesti substituoitu alkyyliryhmä, jossa on 5 1-3 hiiliatomia, kukin ryhmistä R3 on riippumattomasti H-atomi, 0Ci-3-alkyyli- tai OCi_3-asyyli ryhmä, Cl-atomi tai N3-ryhmä, ja aaltosulut osoittavat, että ryhmä R3 ja vieressä 10 oleva fosfonyyliryhmä voivat olla 2'- tai 3'-asemassa.

5. Yhden tai useamman patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdiste, jossa Y on OH-ryhmä, 15. on 5'- tai 31-nukleosidianalogi, R on merkitykseltään sama kuin ryhmä W tai C1-4-alkyyliryhmä, joka voi olla haaroittunut tai suoraketjui-nen, R' on aryyliryhmä, jossa on

6 C-atomia ja joka on 20 mahdollisesti substituoitu korkeintaan kolmella toisistaan riippumattomalla ryhmällä, jotka valitaan seuraavien jou- • · kosta: Cl-atomi ja NO2-, CN-, Ci-3-alkoksyyli-, amino- ja :· Ci-3-alkyyliaminoryhmät. * * · * » « · * » » 65 115399