PT707591E

PT707591E - Esteres de acido metilfosfonico, processo para a sua preparacao e sua utilizacao

Info

Publication number: PT707591E
Application number: PT94919670T
Authority: PT
Inventors: Eugen Uhlmann; Chris Meier
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-29
Publication date: 2002-03-28
Also published as: DE4321946A1; NO955352L; JPH08512039A; FI956341A0; JP3831407B2; ES2165391T3; US6028182A; NO955352D0; WO1995001363A1; EP0707591A1; CA2165971A1; EP0707591B1; FI956341A; CA2165971C; FI115399B; ATE206130T1; DK0707591T3; NO319860B1; AU698928B2; AU7073594A

Description

*

DESCRIÇÃO "ÉSTERES DE ÁCIDO METILFOSFÓNICO, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO" 0 objectivo da presente invenção consiste em ésteres de ácido metilfosfónico, processo para a sua preparação , e -sua - utilização. . . - Já são conhecidos derivados activos fosforilados, que parcialmente são utilizados também para fins farmcêuticos. Assim, são descritos, por exemplo, em J. Med. Chem 1993, 36, 1048-1052 ésteres de fósfooamida com AZT. A actividade antiviral destes compostos é contudo um factor de 10 vezes menor que o AZT e a toxicidade dos compostos designados é em um factor 5 superior que o AZT. No J. Med. Chem. 1991, 34, 1830-1837 são descritos derivados de triéster de fósforo com AZT; também nestes compostos a actividade é menor e a toxicidade maior que no AZT. Resultados semelhantes com compostos utilizados foram obtidos, sendo descritos em J. Org. Chem. 1992, 567, 7300-7301. A publicação Tetrahedron Letters, vol. 33, página 2357-60 sugere oligonucleotideos em ponte com alquilfosfonatos para estudos de "antisense". 0 documento WO-A-93 10 140 vai mais longe, adiantando que os grupos alquilfosfónicos destes oligonucleotideos podem ser funcionalizados, isto é através da introdução de grupos iónicos na cadeia alquilica. A literatura Bioorg. Med. Chem. Lett. Vol. 1, 1991, página 527-30 afirma que dinucleotideos lipofilicos consistindo em mononucleotídeos anti-HIV (AZT entre outros) possam ser agentes interessantes contra o HIV.

Com o objectivo de se obterem derivados activos 1 y i 7 fosforilados, que não possuam a desvantagem dos compostos sugeridos pelo estado da técnica, foi verificado que os ésteres metilfosfónicos de acordo com a presente invenção, possuem caracteristicas extraordinárias. 0 objectivo da presente invenção consiste assim em

1) compostos de fórmula I

OW r^hÍNor -<'> Y o caracterizados por Y significar OH, SH, Oac ou Sac, com Ac= H(C1-C18)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo, heteroarilo ou alquilo W significar um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' farmaceuticamente activo R significar o mesmo que W, em que R e W podem ser iguais ou diferentes, sendo eventualmente um grupo alquilo substituído ou W e R em conjunto formarem, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotideo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotídeo modificado,

2 τ

em que X significa Oxi, sulfandilo ou metileno B independentemente entre si significa uma base nucleotidica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 50, R1 e R2 significam independentemente entre si H(C1-C18)-acilo ou um grupo de fórmula

O * II 5

R^P-OR em que R4, O", S", CH3 ou CHYR' , significam como se descreveu acima para Y e R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-18 átomos de C, R3 signiifca, independentemente entre si, H, 0(C1-C18)-alquilo, 0 (C1-C18)-acilo, F, Cl, N3, NH2 ou NHR6, em que R6 significa (C1-C6)-alquilo ou acilo e o parêntesis recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'.

De preferência os compostos de fórmula I são como se menciona em 1), caracterizados por Y significar OH, SH, OAc ou SAc, com Ac= (C1-C8)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo com 6-14 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por (C1-C5)-alquilo, halogénio, N02, CN, (C1-C6)-alcóxilo, amino, (C1-C4)-alquilamina, (C1-C8)-dialquilamina, em que o grupo alquilo pode também estar condensado a um grupo (C3-C8)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3-13 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, 0 e S; (C1-C16)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, eventualmente substituído, 3 »

independentemente entre si com até três substituintes escolhidos do grupo constituído por halogénio, CN, N02 e (Cl-C3)-alcóxilo, W significa um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' farmaceuticamente activo R significa o mesmo que W, cm que R e W podem 3er iguais ou diferentes, ou R significa (C1-C6)-alquilo, que pode ser ramificado ou não ramificado e eventualmente·.substituído independentemente entre si com até 3 -grupos do grupo constituído por halogénio, CN, (C1-C8)-acilóxilo, (C1-C18)-alcóxilo ou W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotídeo modificado, em que X significa Oxi, sulfandilo B independentemente entre si significa uma base nucleotídica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 30, RA e R2 significam independentemente entre si H(C1-C12)-acilo ou um grupo de fórmula

O R—P-OR5 em que R4, significa O', S', CH3 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-12 átomos de C, R3 significa, independentemente entre si, H, 0(C1-C12)-alquilo, O (C1-C12)-acilo, F, Cl, N3, NH? ou NHR6, em que R6 significa (C1-C3)-alquilo ou acilo e o parêntsise recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'. São especialmente preferidos os compostos de fórmula I como 4

I \ se elucidam em 1) ou 2) caracterizados por Y significar OH, SH, OAc ou SAc, com Ac= (C1-C8)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo com 6-14 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por (C1-C3)-alquilo, f, Cl, N02, CN, (C1-C4)-alcóxilo, amino, (C1-C3)-alquilamina, (C1-C6)^dialquilamina, em que o grupo alquilo pode também estar condensado a um grupo (C3-C8)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3 a 6 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, 0 e S; (C1-C8)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, eventualmente substituído, independentemente entre si com até três substituíntes escolhidos do grupo constituído por Cl, CN, N02 e (C1-C3)-alcóxilo, W significa um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' farmaceuticamente activo R significa o mesmo que W ou significa (C1-C8)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado eventualmente com até 2 grupos substituíntes do grupo constituído por , CN, (C1-C6)-acilóxilo, (C1-C18)-alcóxilo ou W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotídeo modificado, em que X significa Oxi, B independentemente entre si significa uma base nuc.leotídica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 20, R1 e R2 significam independentemente entre si H(C1-C8)-acilo ou um grupo de fórmula 5 ο 4 II 5

R—P-OR em que R4, significa O-, S', CH3 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-8 átomos de C, R3 significa, · independentemente entre si, H, O (Çl-ce)·1*·, alquilo,· 0(C1-C8)-acilo, Cl ou N3, e o parêntises rectò assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2’, em particular, 3'.

Muito especialmente preferidos os compostos de fórmula I como se elucidam de 1) a 2) caracterizados por Y significar OH, R' significar arilo com 6 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por (C1-C3)-alquilo, F, Cl, N02, CN, (C1-C4)-alcóxilo, amino, (C1-C3)-alquilamina, (C1-C6)-dialquilamina, em que o grupo alquilo pode também estar condensado a um grupo (C3-C8)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3 a 6 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, O e S; (C1-C8)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, de preferência na forma conjugada com uma ligação insaturada na posição alfa, eventualmente substituída independentemente entre si com até três substituíntes escolhidos do grupo constituído por Cl, CN, no2 e (C1-C3)-alcóxilo, W significa um análogo nucleosídeo 5' ou 3' farmaceuticamente activo R significa o mesmo que W ou significa (C1-C4)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado, 6

W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotideo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotideo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotideo modificado, em que X significa Oxi, B independentemente entre si significa uma base nucleotidica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 15, ‘ R1 e R2 significam independentemente· entre si H(C1-C4)-acilo ou um grupo de fórmula 0 4 II 5 R—P-OR5 em que R4, significa 0, S, CH2 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-3 átomos de C, R3 significa, independentemente entre si, H, 0(C1-C3)-alquilo, 0(C1-C3)-acilo, Cl ou N3, e o parêntesis recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'.

Para além disso são de especial significado os compostos de fórmula I como se elucida de 1) a 4), caracterizados por Y significxar OH, W possuir o significado de um análogo nucleosídeo 5'- ou 3'-farmaceuticamente activo , R significar o mesmo que W ou significa (C1-C4)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado, R' significar arilo com 6 átomos de C, eventualmente substituído com até 3 grupos independentemente entre si, escolhidos do grupo constituído por Cl, N02, CN e (C1-C3)-alcóxilo, amino e (C1-C3)-alquilamino. 7 τ

ϊ A designação "independentemente entre si" utilizada para os substituíntes (por exemplo "B") deve significar na âmbito do que acima se descreveu, que em cada composto cada substituinte pode ser diferente, o que também é válido para os n elementos repetidos.

Exemplos para as designações acima dos grupos acilo são, acetilo, butirilo, pivaloilo, crotonilo, pentanoilo, hexanoilo, octadeeanoilo, ou oleilo.

Os grupos alquilo adequados são, por exemplo, metilo, etilo, butilo, isobutilo, pentilo ou hexilo.

Exemplos de grupos arilo são fenilo e naftilo.

Grupos hetero-arilo adequados são, por exemplo, piridilo, oxazolo, furilo, benzofurilo ou fenotiazinilo.

Exemplos para grupos alquilaminas são os grupos metilamina e dimetilamina.

Exemplos para os grupos dialquilaminas são o grupo dimetilamina e o grupo dietilamina.

Os análogos nucleosidicos farmaceuticamente activos especialmente adequados de acordo com a presente invenção são compostos derivados das bases adenina, citosina, guanina, timina, purina, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanina, ou 5-clorocitosina, em especial por exemplo, 3'-deóxi-3'- azidotimimidina, 2',3'-dideóxi-2',3'-didehidrotimidina, 2',3'-dideóxitimidina, 2',3'-dideóxiuridina, 2',3'- dideóxiadenosina, 2',3'-dideóxiinosina, 3'F, 3'- dideóxitimidina aciclovir e ganciclovir.

Os grupos R5 acima mencionados podem eventualmente estar

S

substituídos com halogénio, de preferência Cl, CF3, CN, ΝΗχ· ou (C1-C6)alcóxilo, de preferência (C1-C3)-alcóxilo.

Ao objectivo da presente invenção pertence, para além disso, um processo para a preparação de compostos de acordo com uma ou maio dao reivindicações de 1-5, caracterizado por a) um composto de fórmula III é convertido com um composto :de ' fórmula IV ' pw H π-ΪΌ* 0 (Hl) (iv) ou que b) um composto de fórmula V com uma sequência preferida e sob utilização de um agentes de condensação ser convertido com compostos de fórmula VI, ou c) um composto de fórmula V com uma sequência preferida e sob utilização de um agentes de condensação ser convertido com compostos de fórmula VI e de fórmula VII,

r. p^OH Ys<^OH

WOH ROH (V) (VI) (VII) em que SG significa um grupo de protecção, que para a obtenção do composto de fórmula I é eventualmente hidrolisado, ou uma unidade nucleotídica com grupos H-fosfonatos terminais em 3' (2')- e grupos 5'-hidróxilos protegidos com outras unidades nucleotídicas com grupos hidróxilo em 5'- e grupos hidróxilo em 3' (2'), na presença de um agente de 9 activação para conversão em dinucleosídeo de H-fosfonato, e este ser condensado com um aldeído em fosfonato de dinucleosídeo-a-hidróxialquilo(arilo) / em que depois da conversão nos seus derivados, reagem com outros fragmentos (oligo)nucleotídeos para originarem oligonucleotídeos, em que os grupos de protecçao temporariamente introduzidos são hidrolisados, ou que a) unidades de nucleotídeos com fósforo (III) ou fósforo (V) nas posições 3' (2' ) terminais são convertidos com os seus grupos hidróxilo em 5' numa outra unidade de nucleotídeo, em particular, cadeia oligonucleotídica crescente, na presença de um agente de condensação ou b) os seus derivados activos são convertidos, ou os análogos dos oligonucleotídeos são fragmentados nos seus constituintes, em que os oligonucleotídeos obtidos em a) ou b) são introduzidos como grupos de protecção de outras funções de forma temporária, sendo posteriormente hidrolisados, e os análogos de oligonucleotídeos de fórmula I assim obtidos, em que W significa um grupo de fórmula II ou um oligonucleotídeo modificado e R um grupo de fórmuça II' ou um oligonucleotídeo modificado, eventualmente na forma de seus sais fisiologicamente compatíveis. A reacção descrita em a) decorre de preferência sob as seguintes condições. A) Reacção do diéster de fosfonato de fórmula III com os correspondentes aldeídos substituídos dc fórmula IV num solvente orgânico, por exemplo, trietilamina seca (NEt3) a elevadas temperaturas, de preferência à temperatura de ebulição. B) Reacção do diéster de fosfonato de fórmula III com o aldeído de fórmula IV num solvente aprótico seco, por 10 « exemplo, tetra-hidrofurano (THF) e sob adição de uma base orgânica, por exemplo, NEt3 ou quinino à temperatura ambiente ±10°C.

Após a reacção ter decorrido, os produtos são purificados através de processos conhecidos, por exemplo, cromatogratia.

As reacções descritas em··, b) e c) decorrem de acordo com o estado da" ' técnica nas condições conhecidas para' esterificação. Resultados especialmente bons são obtidos através da formação de ésteres activos intermediários, por exemplo, com triazolo/cloreto de ácido dimetilestilbenosulfónico.

Os grupos de protecção adequados, que são eventualmente hidrolisados depois da reacção, de acordo com o estado da técnica, são por exemplo, alquilsililo, alquilarilsililo, e acilo, em especial, t-butildimetilsililo. O último grupo de protecção mencionado pode ser, de forma vantajosa, hidrolisado com fluoreto de amónio em metanol. ·

Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser preparados também estereoselectivamente de acordo com métodos conhecidos do estado da técnica. Uma forma de introdução de quiralidade preferida em átomos de carbono a, é a reacção de aniões de C de um álcool protegido com um grupo de t-butildimetilsililo (composto de fórmula V) com uma oxazafosfolidina derivada de (+)-efedrina, como auxiliar quiral. A oxazafosfolidina é obtida, por exemplo, através da reacção de cloreto de fosforilo com (+)-efedrina com 60% de rendimento e uma razão diastereoisomérica de 24:1. Uma outra possibilidade para a introdução de quiralidade consiste na redução enantioselectiva catalizada de oxazaborolidina (Tetrahedron Lett., 31, 611,(1990)).

Os componentes de partida necessários para as reacções 11

acima mencionadas, são obtidos comercialmente, ou podem ser preparados geralmente de acordo com métodos conhecidos. Métodos de preparação preferidos são descritos nos Exemplos. Os diésteres deH-fosfosfonato de nucleosideo de fórmula III, que servem de compostos de partida, podem ser preparados, por exemplo, através da conversão dc diclorofosfina dc di-isopropilamina com os correspondentes nucleosideos em fosforoamidite, que são directamente hidrolisados via activação de tetrazolo e água, numa. "reacção fechada", obtendo-se os compostos de fórmula III.

Alternativamente é possível proceder à síntese, por exemplo, através de esterificação de um monoéster de 5f-nucleosídeo de ácido fosfórico com um segundo equivalente de nucleosideo sob activação de cloreto de pivaloílo. Obtém assim um monoéster de 5'-nucleosideo de ácido fosfórico através de reacção de tricloreto de fósforo com imidazolo para se obter tri-imidazolido de fósforo, seguindo-se a reacção com o correspondente nucelosideo e hidrólise.

Alternativamente, os compostos de fórmula III são possíveis de preparar através da esterificação de um monoéster de 5'-nucleosideo de ácido fosfórico com um segundo equivalente do nucleosideo correspondente sob activação de cloreto de pivaloílo. A preparação de compostos de fórmula I com um grupo de fórmula II e II' decorre de preferência, da forma que em princípio, como se descreve acima, se preparam dímeros de nucleotídeos de fórmula XI, que depois por métodos habituais formam oligonucleotídeos. Por exemplo, (esquema 1) um éster protegido protegido em 5'-3'H de fosfonato de fórmula VIII reage com um componente protegido em 3'-5'hidróxilo de fórmula IX na presença de um agente de condensação como cloreto de pivaloílo em piridina, originando éster de 12

dinucleosídeo H-fosfonato de fórmula X. Este é de seguida convertido com o aldeído correspondente em hidróxialquilfosfonato de dinucleosídeo. Os grupos hidróxilo nas posições α devem ser protegidos para as seguintes tranbsformações, de preferência com grupos de protecção de TBDMS (t-butildimetildililo), que no finai da síntese são hidrolisados com iões de fluoreto. Os compostos de fórmula IX, são, por exemplo, depois'" da hidrólise do grupo 3'-protegido (SG2) transformados em fosforoamidite de fórmula XII, que pode ser introduzida através de métodos conhecidos como análogo de fosforoamidite nos oligonucleotídeos.

As pró-drogas de nucleotídeos podem-se formar também como unidades de monómeros através de condensação dos correspondentes ésteres protegidos de nucleosído 3' (em particular, 5') com grupos 5' (em particular 3' )-hidróxilo de um nucleosídeo protegido em 3' (em particular 5') (esquema 2). De preferência utiliza-se o fosfonamidato de 3'-nucleosídeo de fórmula XIII (em que (P) = P-N(ipropilo) 2), que formam, de acordo com métodos habituais, oligonucleotídeos. A formação de análogos de oligonucleotídeos de fórmula I com grupos de fórmula II e II' decorre de forma similar à síntese biológica de oligonucleotídeos, em solução ou de preferência em fase sólida, eventualmente utilizando o auxilio de um equipamento de síntese automática. 13 c* \ Γ\\il o.

Esquema 1

(VIII) (IX)

Ό

H 1-) 2.) SG-reagente

CH3 i . J SG-reagente porexemplo Cl—Si—C(CH3)3 CH3 XII SG1 - Dimetilhexiltritilo

SG

ιμινμ -P-Nf ^ iprop OCHjCHj—CN 14

Esquema 2

Os compostos de acordo com a presente invenção de fórmula I e os seus sais farmaceuticamente compativeis revelam a actividade farmacêutica dos compostos activos que lhes deram origem. Uma vez que revelam caracteristicas toxicológicas e farmacocinéticas favoráveis, representam quimioterapêuticos com elevado valor. A invenção refere-se também a medicamentos, em especial medicamentos para combater doenças de origem virai, que são caracterizados por um teor de um ou mais compostos de acordo com a presente invenção. Eles podem ser administrados, por exemplo de forma oral ou intravenosa.

Os medicamentos que possuem um ou mais dos compostos de fórmula geral I como compostos activos, podem ser preparados misturando os compostos de fórmula I com um ou mais compostos veiculares ou agentes de diluição farmacologicamente compativeis, como por exemplo, substâncias tampão, resultando uma forma de preparado adequada.

Como agentes de diluição, podem-se mencionar, por exemplo, poliglicóis, etanol e água. Substâncias tampão, são por exemplo, compostos orgânicos, como por exemplo, Ν',N'-dibenziletilenodiamina, dietanolamina, etilenodiamina, N-metilglucamina, N-benzilfenetilamina, dietilamina, tris(hidróximetilo)aminometano, ou compostos inorgânicos, como por exemplo, tampão fosfato, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio. Para aplicação oral, sugerem-se, por exemplo, suspensões ou soluções em água com ou sem substâncias tampão. Também é possivel aplicar o composto activo como tal, sem agentes veiculares ou de diluição, numa forma adequada, por exemplo em cápsulas.

As doses adequadas dos compostos de fórmula I ou dos seus sais farmaceuticamente compativeis, são fortemente 16

dependentes de cada composto que lhe serve de base; por exemplo, no caso de AZT, as doses são de cerca de 0,4 g, de preferência 0,5 g até ao máximo de 20 g por dia para um adulto de cerca de 75 kg de peso de corpo. Podem ser administradas doses únicas ou mais que uma dose, em que a dose única do composto activo pode possuir uma quantidade de composto activo de cerva de 50 a 1000 mg. A presente invenção refere-se para além disso à utilização de novos análogos de oligonucleotideos (compostos de fórmula I com um grupo de fórmula II ou um oligonucleotideo modificado ou compostos de fórmula II' ou oligonucleotideos modificados) para a preparação de medicamentos (oligonucleotideos "antisense", ribozimas, oligonucleotideos "sense" e oligonucleotideos formadores de triplex).

Os oligonucleotideos encontram, de forma crescente, aplicação como inibidores da expressão genética (G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539, (1988); J. S. Cohen, "Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann e A. Peyman, Chemical Reviews, 90, 543 (1990). Os oligonucleotideos "antisense" são fragmentos de ácidos nucleicos, cujas bases da sequência são complementares a uma outra inibidora de mARN. Este mARN alvo, pode ser celular, virai ou com outra origem patogénica. Como sequências celulares sugerem-se por exemplo aqueles dos receptores, enzimas, imunomodeladores, canais de iões ou oncogénes. A inibição da multiplicação de virus com auxilio de oligonucleotideos "antisense" foi descrito por exemplo, para RSV (viros de sarcoma de Rous), HSV-1 w 2 (virus de herpes simplx do tipo I e II), HIV (sindroma da imunodeficiência humana) e virus de gripe. Aqui, utilizam-se os oligonucleotideos, que sejam complementares aos ácidos nucleicos virais. Os oligonucleotideos "sense" são, pelo contrário, concebidos na sua sequência de modo, a por 17 exemplo, se ligarem (prenderem) a proteínas formadoras de ácidos nucleicos ou enzimas que processem ácidos nucleicos, de forma a inibirem a sua actividade biológica (Helene 1990) . Como alvos virais, mencionam-se aqui, por exemplo, a transcriptase reversa, a polimerase do ADN, e as proteínas transactivadoras. Os oligonuleotídeos formadores de tiplex possuem em geral o ADN como alvo e formam por ligação a estes uma estrutura em tripla hélice. Enquanto que com o auxilio dos oligonucleotideos "antisense"·· se inibe em geral o processamento ("splicing" etc) do mARN ou a sua tradução na proteína, os oligonucleotideos formadores de triplex inibem a transcripção ou replicação do ADN (Helene et al., 1990; Uhlmann e Peyman 1990). Também é possível formar ácidos nucleicos numa única cadeia, durante uma primeira hibridação com oligonucleotideos "antisense" formando uma cadeia dupla, que depois numa segunda hibridação com oligonucleotideos "antisense" formam uma estrutura triplex. Os oligonucleotideos "sense" e as regiões de formação de triplex podem assim ser acomodados em dois oligonucleotideos separados ou num oligonucleotídeo. Uma outra aplicação de oligonucleotideos sintéticos consiste nas designadas ribozimas, que destroem os ARN alvo na sua actividade da ribonuclease (J.J. Rossi e N. Sarver, TIBTECH 8, 179 (1990) .

Para a maioria das aplicações, os oligonucleotideos na forma como ocorrem naturalmente, são pouco ou completamente inadequados. Eles têm de ser modificados de tal forma para que o que deles se exige seja conseguido. Assim para que possam ser ser utilizados oligonucleotideos em sistemas biológicos, por exemplo, para a inibição da multiplicação de virus eles devem respeitar as seguintes condições: 1. Eles devem em condições in vivo, bem como no soro tal como intracelularmente, possuir uma suficientemente elevada estabilidade. 2. Eles devem conseguir passar a membrana da célula e do 18

núcleo. 3. Eles devem, sob condições fisiológicas ligar-se aos ácidos nucleicos alvo com as bases especificas, de forma a promoverem o efeito inibidor.

Quando o grupo dc foofato do internucleotideo é modificado, modificam-se drasticamente as características dos oligonucleotideos. Por· .exemplo, os oligonucleotideos fosforotioato^são-frequentemente inespecificos.

Outro objectivo da presente invenção consiste preparar análogos de oligonucleotideos com uma actividade especifica e uma elevada estabilidade no soro, e que em sistemas biológicos (soro, orgãos, células) se transformam de novo em diésteres de oligonucleotideos.

Podem-se transformar um ou mais grupos de fosfato de internucleotideo dos oligonucleotideos como pró-droga. Foi verificado gue os oligonucleotideos com modificações de pró-droga nas zonas terminais 3' e/ou 5', são estáveis no soro tal como os fosfodiéster de oligonucleotideos que ocorrem naturalmente. A invenção não se limita a a- e β- D, em particular, L-ribofuranosídeos, a- e β- D, em particular L- desóxiribofuranosideos e análogos de aneis de cinco membros carbociclicos correspondentes, mas também é válida para análogos de oligonucleotideos, que são formados de outros esqueletos de açúcar, por exemplo, aumento de anel e diminuição de anel do açúcar, aclcllcos, formação de pontes ou outros derivados de açúcar adequados. A invenção não é, para além disso, limitada aos derivados de grupos fosfato introduzidos pela fórmula I, por exemplo, mas também se refere a derivados defosfo conhecidos. 19

Os oligonucleotídeos podem variar também, de muitas formas, relativamente à estrutura natural. Este tipo de modificações, que podem ser introduzidas por métodos conhecidos, são por exemplo: a) Modificação de pontes de fosfato

Por exemplo mencionam-se: tioato de fósforo, . ditioato de fósforo, fosfonato de metilo, amidato de fósforo, fosfato de borano, éster metilico de fosfato, éster etílico de fosfato, fosfonato de fenilo. As modificações preferidas das pontes de fosfato são o tioato de fósforo, ditioato de fósforo e o fosfonato de metilo. b) Substituição da ponte de fosfato

Por exemplo mencionam-se: substituição através de acetal fórmico, 3'-tioformoacetal, metil-hidróxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetilenosulfona, grupos sililo. São preferidas as substituições através de acetal fórmico e 3'-tioformoacetal. c) Modificação de açúcares

Por exemplo mencionam-se: anómeros α de açúcares, 2'-0-metilribose, 2'-O-butilribose, 2'-O-alilribose, 2'-fluoro-2'-desóxiribose, 2'-amino-2'-desóxoribose, a-arabinofuranose, análogos de açúcar carbocíclicos. A modificação preferida é 2'-O-metilribose e 2'-O-butilribose. d) Modificações das bases que não alteram a especificidade do par de bases watson-crlck

Por exemplo mencionam-se: 5-propinil-2'-desóxiuridina, 5-propinil-2'-desóxicitidina, 5-hexinil-2'-desóxiuridina, 5-hexinil-2' -desóxicitidina, 5-fluoro-2'-desóxicitidina, 5-fluoro-2'-desóxiuridina, 5-hidróximetilo-2'-desóxiuridina. 20 5-hidróximetilo-2'-desóxicitidina, 5-bromo-2'-desóxicitidina São prefridos as modificações, 5-propinil-2'-desóxiuridina, 5-hexinil-2'-desóxiuridina, 5-hexinil-2'-desóxicitidina e 5-propinil-2'-desóxicitidina. e) Inversões 3-3' e 5-5' [por exemplo, M. Koga et al., J.

Org. Chem. 56 (1991) 3757] f) Fosfatos 5' è 3', bem como tiofosfatos 3' e 5'. . * ·.

Exemplos de grupos que aumentam a incorporação intracelular são diferentes grupos lipofilicos como -O-(CH2) X-CH3 em que que x significa um número inteiro de 6 a 18, -O-(CH2) „-CH=CH-(CH2)m-CH3, em que nem são independentes um do outro e significam um número inteiro de 6 a 12, -0- (CH2CH20) 4- (CH2) 9- CH3, -0-(CH2CH20)8-(CH2)i3-CH3 e -0-(CH2CH20)7-(CH2)i5-CH3, mas também estroides como colesterol ou grupos vitaminas, como a vitamina E, vitamina A ou vitamina D e outros conjugados, que utilizam transportadores naturais como ácido gálico, ácido fólico, 2-/N-alquilo, N-alcóxilo)-aminoantraquinona e conjugados de manose e peptídeos dos receptores correspondentes, que conduzem à à endocitose dos receptores de oligonucleotideos como EGF ("Epidermal Growth Factor"), "bradykinin" e PDGF ("Platelet Derived Growth Factor). A formação dos oligonucleotideos decorre de acordo com métodos conhecidos do especialista, como o método de triéster, o método do H-fosfonato ou o método de amidite de fósforo, de preferência de acordo com a química de estandartizada de amidite de fósforo de Caruthers (M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, J. Am. Chem Soc., 103, 3185 (1981)).

Para além disso foi verificado que os compostos de fórmula I, em que W é igual à fórmula II e R igual à fórmula II' , dependendo da sequência das bases do fragmento de AND, inibem a expressão especifica do gene, por exemplo de enzimas, receptores ou factores de crescimento, em cultura de células e nos exemplos escolhidos em modelos animais.

Muito em geral, a presente invenção extende-3e à utilização de compostos de fórmula I como componentes activos terapêuticos de um medicamento. Como derivados de oligonucleotideos activos .terapeuticamente, entendem-se os oligonucleotideos "antisense", oligonucleotideos formadores de tripla hélice, aptâmaros ou ribozimas, em especial oligonucleotideos "antisense".

Os medicamentos da presente invenção podem, por exemplo, ser utilizados para o tratamento de doenças que são originadas por virus, por exemplo, através de HIV, HSV-1, HSV-2, gripi, VSV, hepatite B ou virus de papiloma.

Os derivados de oligonucleotideos "antisense" de acordo com a presente invenção, que são activos contra este tipo de alvos, são por exemplo as seguintes sequências de base: 1) Oncoproteinas nucleares como por exemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20 2) Oncoproteinas associadas citoplasmáticas/membrana como por exemplo, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf, c-mos, c-src, c-abl 3) Receptores celulares como por exemplo receptor EGF, c-erbA, receptores de retinoide, subunidade refuladora da quinase da proteína, c-fms. 4) Citoquinas, factores de crescimnento, matriz extracelular como por exemplo CSF-1, IL- 6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, 22

b-bFGF, mieloblastina, fibronectina

Os oligonucleotídeos "antisense" de acordo com a presente invenção de fórmula I, que são activos contra este tipo de alvos, estão exemplificados nas seguintes sequências de bases: • .a) contra c-Ha-ras, por exemplo t * . 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' (VIII) c) c-myc, por exemplo 5' -GGCTGCTGGAGGCGGGGCACAC-3' (IX) 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3' (X) d) c-myb, por exemplo 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3' (XI) e) c-fos, por exemplo 5' -GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3' (XII) 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3' (XIII) 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3' (XIV) 23

f) pl20, por exemplo 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3' (XV) a) Receptor EGF, por exemplo 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3' (XVI) 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3' (XVII) b) supressor de tumor p53, por exemplo 5' -GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3' (XVIII) 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3' (XIX)

Os medicamentos da presente invenção são adequados por exemplo, para além disso para o tratamento de doenças que são influenciadas pela integrina ou receptores de adesão célula-célula, por exemplo, através de VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM ou ELAM.

Os derivados de oligonucleotideos "antisense" que são activos contra este tipo de alvos, estão exemplificados nas seguintes sequências de bases: a) VLA-4 por exemplo 5' -GCAGTAAGCATCCATATC- 3' 24 (XX)

b) ICAM, por exemplo 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3' (XXI) 5'-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3' (XXII) 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3' (XXIII) c) ELAM, por exemplo 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3' (XXIV) 5' -CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3' (XXV)

Os medicamentos da presente invenção adequam-se também, por exemplo, para inibir a restenose. Por exemplo, podem ser utilizados sequências de oligonucleotideos, que se direccionam contra este alvo, e que são responsáveis pela proliferação ou migração. Este tipo de alvos são, por exemplo: 1) Proteínas transactivadoras nucleres e ciclinas, como por exemplo, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclinas e cdc2-quinase 2) Mitogene ou factores de crescimento, como por exemplo, PDGF, bFGF, EGF, HB-EGF e TGF-β 25

3) Receptores celulares como por exemplo, receptor bFGF, receptor EGF e receptor PDGF

Os oligonucleotídeos "antisense" de acordo com a presente invenção de fórmula I, que são activos contra este tipo de alvos, estão exemplificados nas seguintes sequências de bases: a) c-myb 5'-GGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' (XXVI) b) c-myc 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGG-3' (XXVII) c) cdc-2 quinase 5'-GGAGGATGCTGAGGAGG-3' (XXVIII) d) PCNA ("proliferating cell nuclear antigen of rat") 5'-GGAGGATGCTGAGG-3' (XXIX)

As forma de administração adequadas para os compostos de fórmula I, nos quais W e R em conjunto com o grupo fosfonato que possuem formam um oligonucleotideo, são administrações tópicas, administrações locais, como por ecom auxilio de catéteres ou também injecções. Para a injecção, formula-se os oligonucliotideos "antisense" numa solução liquida, de preferência num tampão fisiologicamente ingerivel, 26 como por exemplo solução de Hank ou solução de Ringer. Os oligonuclietídeos "antisense" podem também ser formulados na forma sólida, sendo dissolvidos ou suspendidos antes da toma. As doses preferidas para uma administração sistemática são de 0,01 mg/kg até cerca de 50 mg/kg de peso de corpo e diariamente.

Os medicamentos podem, por exemplo, ser utilizados na forma de preparados farmacêuticos, que podem ser administrados oralmente, por exemplo na forma de comprimidos, drageias, cápsulas de gelatina rígida ou mole, soluções, emulsões ou suspensões. A introdução do medicamento em lipossomas, que eventualmente podem conter outros componentes como proteínas, constitui também outra forma adequada de administração. Podem também ser administradas na forma rectal, por exemplo, em supositórios, ou parenteralmente, por exemplo na forma de soluções injectáveis. Para a preparação de preparados farmacêuticos, estes compostos podem ser manipulados em agentes veiculares orgânicos e inorgânicos inertes. Exemplos para este tipo de agentes veiculares para comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina rígida são a lactose, amido de milho, ou derivados destes, sebo, e ácido esteárico ou sais destes. Os agentes veiculares adequados para a preparação de soluções são, água, polióis, sacarose, açucares invertidos, e glucose. Agentes veiculares para as soluções injectáveis são água, álcoois, polióis, glicerol e óleos vegetais. Agentes veiculares adequados para supositórios são óleos de origem vegetal e viscosos, ceras, gordura e polióis semi-líquidos. Os preparados farmacêuticos podem também conter conservantes, solvente, estabilizadores, agentes reticuladores, emulsionantes, edulcorantes, corantes, agentes de paladar, sais e modificadores e pressão osmótica, tampão, agentes de revestimento, anti-oxidantes, bem como, eventualmente, outros agentes terapeuticamente activos. 27

Testes in-vitro anti HIV de dinucleosideo-a-hidróximetilarilfosfonato 1-3

Com dinucleosídeo-a-hidróximetilarilfosfonato 1-3 foram efectuados testes in-vitro de HIV. Como sistema de teste foram utilizados linfócitos T (CEM/O). Para além disso os compostos foram testados numa cultura de linfócitos T (CEM/TK) deficientes em quinase da timidina. As células.CEM/O· foram infectadas quer com HIV-1 quer com HI'V-2. Antes dos testes foi garantido que os compostos a testar estavam livres de nucleosideos (max: 0,5% HPLC). Os resultados dos teste estão representados na Tabela 1.

Como se observa da Tabela 1, todos os compostos revelam elevada actividade, quer contra a replicação de HIV-1, quer contra a replicação de HIV-2.

Pelo contrário, para as formas de pró-droga descritas na literatura, os compostos de acordo com a presente invenção não apresentam qualquer actividade citotóxica.

Tabela 1: Resultados dos testes in-vitro de anti-HIV de 1-3, 11-13, 4-6, 28-30, contra HIV-1 e HIV-2 em linfócitos T humanos (CEM/O e CEM/TK) 28

Tabela 1: Diéster de ácido a-hidróximetilarilfosfónico 1-3

Análogos de nudeosideos Análogos de nideosídeos /Y io5 1: Nucleosídeo = 2',3'-dideóxitimidina (ddT); 2: Nucleosideo = 2 ',3'-dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina (d4T); 3 Nucleosideo = 3'-Deóxi-3'-azidotimidina (AZT) 1-3 X' Y Z a NMe2 H H b och3 H H c ch3 H H d H H H e Cl H H f H Cl Cl g CN H H h no2 H H i H no2 H j no2 no2 H k H no2 no2

Actividade antiviral EC50a) (μς/πιΐί) CEM/O Substituinte HIV-1 HIV-2 CEM/TK HIB-2 Toxicidade CC50b) (μς/πιΕ) la NMe2 3,25±1,06 7,0±4,24 >100 >100 lb och3 0,5±0,0 0,55±0,07 >20 >20 1 c CH, 3,25+1,06 10,0+0,0 >100 >100 29

Composto Substituinte HIV-1 HIV-2 CEM/TK HIB-2 Toxicidade CCso0’ ^g/mL) ld H 2,93±1,85 13,3±2,9 >100 >100 le Cl 4,0+0,0 4,0±0,0 >100 >100 lf 2,6-Di-Cl 1,4±0,85 2,0±0,0 >20 >20 ig CN 3,93+3,10 7,7±4,6 >100 >100 lh no2 2, 25+0,35 3,0+1,41 >100 >100 ij 2,4-di-N02 2, 0+0,0 3,50+0,71 >100 >100 2b och3 0,10±0,065 0,12+0,06 >100 >20 2c och3 0,12±0,064 0,33+0,24 >100 >20 2d H 0,16±0,0 0,19±0,19 >100 >100 2e Cl 0,10+0,05 0,12±0,06 >100 >100 2f 2,6-Di-Cl O,056±0,034 0,12±0,06 >20 >100 2g CN 0,091+0,034 0, 33±0,24 >100 >100 2h no2 0,0 6 6±0,048 0,12+0,06 >100 >100 2j 2,4-di-N02 0,16+0,0 0,33±0,24 >100 >100

Os compostos de acordo com a presente invenção possuem coeficientes de partição numa mistura de octanol/água, como os análogos nucleosideos que lhes dão origem. Assim são mais passivamente transportáveis através das biomembranas.

Através dos seguintes Exemplos de execução e através do conteúdo das reivindicações a invenção deverá ser melhor elucidada. 30

Exemplos 1. Preparação de éster bis (5'-0-2', 3' -dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-metilfenilo)-metilfosfónico: 904 mg (4,0 mmole) de 2',3'-dideóxitimidina foram secos a alto vácuo e de seguida dissolvidos eiu 60 mL de acetonitrilo. Esta solução foi adicionada com 774 mg (6,0 mmole; 1,07 mL) de- di-isopropiletilamina e arrefecida a 0°C num banho de gelo. De seguida adicionam-se em porções, durante 15 minutos, 404 mg (2,0 mmole) de di-isopropilamina-diclorofosfina. Após terminar a adição, deixa-se aquecer até á temperatura ambiente e agita-se 15 minutos. À temperatura ambiente decorre a adição de 254 mg (4,0 mmole) de tetrazolo e 80 mL de água. Após 30 minutos de agitação, o solvente é condensado numa instalação de vácuo. O resíduo foi purificado através numa Chromatotron em sílica-gel com o auxílio de um gradiente de acetato de etilo/metanbol (0% a 30% de metanol). 0 produto isolado era um sólido incolor (797 mg [1,06 mmole]; 80% rendimento]. 797 mg /1,6 mmole) de diéster de 2'-,3'-ddT-H-fosfonato foram dissolvidos em 40 mL de tetra-hidrofurano seco e adicionados de 518 mg (4,8 mmole) de 4-metilbenzaldeído. Sob agitação são adicionados 20 mL de trietilamina seca anteriormente destilada. Após 4 horas à temperatura ambiente o educto reagiu. O controlo seguinte decorre com o auxilio de cromatografia de HPLC (cromatografia líquida de elevada eficiência) em fase reversa. A mistura reaccional foi neutralizada com adição de 20 mL de ácido acético, e levada ao rotavapor até à secura. O residuo foi foi purificado através numa Chromatotron em sílica-gel com o auxílio de um gradiente de acetato de etilo/metanbol (0% a 30% de metanol). O produto foi isolado, após liofilização, na forma de um sólido incolor (921 mg [1,52 mmole]; 95% de rendimento). Para a purificação do composto para os testes in-vitro anti-HIV efectuou-se uma purificação adicional por HPLC semipreparativa com uma mistura de eluentes 31 \

isocrática (30% de metanol em acetonitrilo). 2. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-dimetilaminofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se· / , '4-dimetilaminobenzaldeido (rendimento 90%). , . - 3. Preparação de éster bis (5'-0-2', 3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-metóxifenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 4-metóxibenzaldeído (rendimento 87%) . 4. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(fenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se benzaldeido (rendimento 93%). 5. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-clorofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 4-clorobenzaldeído (rendimento 90%) . 6. Preparação de éster bis (5' -0-2', 3' -dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-cianofenilo)-metilfosfónico: 32

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 4-cianobenzaldeído (rendimento 86%) . 7. Preparação de éster bis (5'-0-2', 3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos sãb análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4n-metilbênzaldeído utiliza-se 4-nitrobenzaldeído (rendimento 85%) . 8. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(2-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se 2-nitrobenzaldeído (rendimento 87%) . 9. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(2,4-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em. 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 2,4-dinitrobenzaldeido (rendimento 85%). 10. Preparação de éster bis (5'-0-2', 3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(9—fluorenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 9-fluorenona (rendimento 91%). 11. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-piridilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 4- 33

metilbenzaldeído utiliza-se piridialdeido (rendimento 82%). 12. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(2,6-diclorofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em l. Em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se diclorobenzaldeído (rendimento 87%) . 13. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2', 3'-dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-metóxifenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-.se 4-metóxibenzaldeído (rendimento 80%). 14. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2', 3' -dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-metilfenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato (rendimento 83%). 15. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2', 3'-dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(fenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-se 4-benzaldeído (rendimento 87%). 34

16. Preparação de éster bis (5'-0-2',3' -dideóxi-2', 3' -dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-clorofenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-se 4-clorobenzaldeido (rendimento 86%). 17. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2',3'-dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-cianofenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-se 4-cianobenzaldeído (rendimento 80%). 18. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2', 3' çdide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-nitrofenilo)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-se 4-nitrobenzaldeído (rendimento 81%). 19. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2',3'-dide- hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2-nitrofeniío)- metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4 metilbenzaldeído utiliza-se 2-nitrobenzaldeído (rendimento 80%) . 35 20. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2',3' -dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2,4-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar dc diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonatò e em lugar de 4 metilbenzaldeido utiliza-se 2,4-dinitrobenzaldeído (rendimento 80%). 21. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(4-piridilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se 4-piridilaldeido (rendimento 80%). 22. Preparação de éster bis (5'-0-2', 3'-dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2,6-diclorofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se 2, 6-diclorobenzaldeído (rendimento 87%) . 23. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) dc ácido hidróxi-heptilo-meti1o-fosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se octanal (rendimento 75%) . 36 éster bis (5'-0-2', 3'-dideóxi-3'-ácido hidróxilo-(4-nitrofenilo)- 24. Preparação de azidotimidina) de metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2', 3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeldo utiliza-se 4-nitrobenzaldeído (rendimento 96%). 25. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-3'-azidotimidina) de ácido hidróxilo-(2-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2', 3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se 2-nitrobenzaldeído (rendimento 92%). 26. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-3' -azidotimidina) de ácido hidróxilo-(2,6-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeido utiliza-se 2,6-dinitrobenzaldeído (rendimento 88%). 27. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-3'-azidotimidina) de ácido hidróxilo—(2,4-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e em lugar de 4- metilbenzaldeido utiliza-se 37 2,4-dinitrobenzaldeído (rendimento 90%). 28. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-3'- azidotimidina) metilfosfónico: de ácido hidróxilo-(4-piridilo)-

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2' ,3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e 'em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 4-· piridilaldeido (rendimento 90%). 29. Preparação de éster bis (5'-0-2',3'-dideóxi-3'-azidotimidina) de ácido hidróxilo-heptilo-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se octanal (rendimento 96%). 30. Preparação de éster (5'-0-2',3'-dideóxi-3'- azidotimidina)-(5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(2,6-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de ddT/AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 2,6-dinitrobenzaldeído (rendimento 88%). 31. Preparação de éster (5'-0-2',3'-dideóxi-3'- azidotimidina) - (5'-0-2',3'-dideóxitimidina) de ácido hidróxilo-(4-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2', 3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de ddT/AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído 38 utiliza-se 4-nitrobenzaldeído (rendimento 96%). 32. Preparação de éster (5'-0-2',3'-dideóxi-3'- azidotimidina)-(5' -0-2', 3'dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2,6-dinitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T/AZT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 2,6-dinitrobenzaldeído (rendimento 87%). 40. Preparação de éster (5'-0-2',3'-dideóxi-3'- azidotimidina)-(5' -0-2' , 3'dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T/ddT-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 2-nitrobenzaldeído (rendimento 91%). 41. Preparação de éster (5'-0-2',3'-dideóxitimidina)-(5'-0-timidina)-(5' -0-2' , 3' dideóxi-2',3'-dide-hidrotimidina) de ácido hidróxilo-(2-nitrofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se diéster de d4T/T-H fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 2-nltrobenzaldeldo (rendimento G5%). 42. Preparação de éster (5'-0-3'-O-levuliniltimidiba) de ácido hidróxilo-(4-clorofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 39

diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se éster de levuliniltimidina-H-fosfonato e em lugar de 4- metilbenzaldeído utiliza-se 4-clorobenzaldeído (rendimento 93%) . (5'-0-3'-O-t-ácido hidróxilo-(4- 43. Preparação de éster butildimetilsililtimidina) de clorofenilo)-metilfosfónicó:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2', 3' -ddT-H-fosfonato utiliza-se éster de levuliniltimidina-H-fosfonato e em lugar de 4- metilbenzaldeído utiliza-se 4-clorobenzaldeído (rendimento 85%) . 44. Preparação de éster (5'-0-3'-O-acetiltimidina) de ácido hidróxilo-(4-clorofenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de., diéster de 2', 3' -ddT-H-fosfonato utiliza-se éster de 3'- acetiltimidina-H-fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utiliza-se 4-clorobenzaldeído (rendimento 75%). 45. Preparação de éster (5'-0-3'-O-acetiltimidina) de ácido hidróxilo-(4-metóxifenilo)-metilfosfónico:

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2’, 3' -ddT-H-fosfonato utiliza-se éster de 3'- acetiltimidina-H-fosfonato e em lugar de 4-metilbenzaldeído utillza-se 4-clorobenzaldeído (rendimento 70%). 46. Preparação de éster (5'-timidina) de ácido hidróxilo-(4-clorofenilo)-metilfosfónico: A preparação decorre de acordo com os derivados de protecção 40

V^. --· ν' Λ/-’'·* 7 descritos em 5a) 3'-O-levulinilo com condições padrão com auxilio de 5 equivalentes de hidrato de hidrazina em piridina/ácido acético 4:1, durante 15 minutos à temperatura ambiente. 47. Preparação de fosfito de di-(5'-0-2', 3'-dideóxi-2',3'-di-de-hidrotimidina):

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se 2', 3'-dideóxi-2',3'-di-de-hidrotimidina (rendimento 75%). 48. Preparação de fosfito de di-(5'-0-2',3'-dideóxi-3'-azidotimidina):

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se 2', 3'-dideóxi-3'-azidotimidina (rendimento 85%). 49. Preparação de fosfito de di-(5'-O-levuliniltimidina):

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se 3'-levuliniltimidina (rendimento 65%). 50. Preparação de fosfito de di-(5'-0-3'-t- butildimetilsililtimidina):

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de diéster de 2',3' ddT-H-foofonato utiliza-se 3'-t-butildimetilsililtimidina (rendimento 65%). 51. Preparação de fosfito de di-(5'-0-3'-acetiltimidina):

Os passos são análogos como se descreve em 1. Em lugar de 41

diéster de 2',3'-ddT-H-fosfonato utiliza-se 3'-acetiltimidina (rendimento 86%).

As reacções com o forte aceitador de substituintes, benzaldeído (4-nitro, 2-nitro, 2,6-dinitro e 2,4-dinitro) deixam-se também efectuar com quinina como base. as reacçOes com substituintes doadores no benzaldeído (4-dimetilamino, 4-metóxilo, 4-metilo e benzaldeído) são alternativos às experiências acima descritas, aquecidos também em trietilamina pura. 52. Preparação de fosfonato de 5' -O-(4,4'-dimetóxitritilo)-timidililo-(3' ,5')-timidina-3'-(((O-trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (dímero D de fosfonato de hidróxilo-3'-OH protegido com TES): a) Preparação de 3'-H-fosfonato de 5'-0-(4, 4'-dimetóxitritilo)-timidililo-(3',5')-3'-O-levulinilo-timidina (H-fosfonato-dímero Ά) 1,9 g (2,7 mmole; 1,1 eq) de 3'-H-fosfonato de 5' — (4,4' — dimetóxitritilo)-timidililo-3'-O-levulinilo-timidina foram secos em alto vácuo e dissolvidos em 30 mL de piridina. A esta solução foram adicionados 828 mg (2,4 mmole; 1,0 eq) de 3'-O-levulinilo-timidina pré-seca. De seguida foram adicionados gota-a-gota 899 mL de cloreto de pivaloílo destilado e agitou-se de novo à temperatura ambiente. Após 8 minutos, diluí-se com 150 mL de cloreto de metileno e extraído numa ampola com 150 mL de uma solução a 5% de hidrogenocarbonato de sódio. Após mais duao cxtracções com 150 mL de cada vez de cloreto de metileno, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se o agente secante e levou-se a evaporador rotativo até à secura. O produto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". O gradiente do eluente foi acetato de etilo/metanol (+ uma porção 42

de 0,1% de ácido acético) indo de 0% a 5% de metanol. 0 produto foi isolado na forma de um sólido amarelo (1,972 g; 2,12 mmole; 78%). b) Preparação de fosfonato de 5'-O-(4,4'-dimetóxitritilo) -timidililo- (3' , 5' ) -3' -O-levulinllo-tiiuidina-3' - ( (hidróxilo) -2-nitrobenzilo) (α-hidróxifosfonato - dimerò JB) 1,5 g (1,6 mmole; f eq) de dímero A H-fosfonato foram pré-secos e dissolvidos em 20 mL de cloreto de metileno. Esta solução foi adicionada de 725 mg (4,8 mmole; 3 eq) de 2-nitrobenzaldeído pré-seco e de seguida com 40 mL de trietilamina. Após 8 horas de agitação, neutralizou-se com ácido acético e a solução foi directamente purificada por cromatografia em "flash". 0 gradiente do eluente foi cloreto de metileno/metanol (+ uma porção de 0,1% de ácido acético) indo de 0% a 5% de metanol. O produto foi isolado na forma de um sólido incolor (1,374 g; 1,27 mmole; 79%). _ c) Preparação de fosfonato de 5'-O-(4, 4'-dimetóxitritilo)-timidililo-(3', 5')-3'-O-levulinilo-timidina-3'-((O-trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (hidróxifosfonato - dimero C protegido com TES) 1,1 g (1,01 mmole; 1 eq.) de dimero B hidróxifosfonato foram pré-secos e dissolvidos em 20 mL de piridina. A esta solução adicionou-se gota-a-gota 914 mg (6,07 mmole; 1,02 mL; 6 eq) de cloreto de trietilsililo e agitou-se à temperatura ambiente. Após sete horas de agitação, concentrou-se à secura num evaporador rotativo. O pruduto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". O gradiente do eluente foi acetato de etilo/metanol indo de 0% a 4% de metanol. O produto era um sólido amarelo claro (1,13 g; 0,95 mmole; 93%) . 43

- Pr*

/ d) Preparação de fosfonato de 5'-0-(4,4'-dimetóxitritilo)-timidililo-(3',5')-timidina-3'-((O-trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (D) 1,1 g (0,92) de hidróxifosfonato -dímero C protegido com TES foram dissolvidos em 10 mL de uma solução de 3 mL de hidrato de hidrazina (24% em água), 6,92 mL de piridina e 4,61 mL de ácido acético. Após três minutos de agitação à temperatura ambiente, à solução foi arrefecida a 0°C e diluida com 100'.mL . de água e 100 mL de acetato de etilo. Após a separação das fases numa ampola, a fase orgânica foi lavada uma vez com 25 mL de uma solução a 5% de hidrogenocabonato de sódio e de seguida seca sobre sulfato de sódio. Após separação do agente de secagem concentrou-se à secura em evaporador rotativo. O produto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". O gradiente do eluente foi cloreto de metileno/metanol indo de 0% a 7% de metanol. O produto foi isolado na forma de um sólido amarelo claro (858 mg; 0,78 mmole; 85%). 53. Preparação de fosfonato de 5' -O-(4,4'-dimetóxitritilo) -timidililo-(3',5')-timidina-3'-(Ο-β-cianoetilo-di-isopropilaminofósforoamidite)-((O-trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (dimero E de fosfonato de hidróxilo-3'-fósforoamidite protegido com TES) 230 mg (0,21 mmole; 1 eq) de dimero D de fosfonato de hidróxilo-3'-OH protegido com TES pré-seco, foram dissolvidos em 15 mL de cloreto de metileno e sob agitação, adicionados de 177 mL (1,05 mmole; 135 mg; 5 eq) de di-isopropiletilamina e de seguida com 70 mL (0,31 mmole; 74,2 mg; 1,5 eq) de clorofosfina de β-cianoetilo-di-isopropilo. Agitou-se durante 5 horas à temperatura ambiente, adicionaram-se 20 mL de acetato de etilo e concentrou-se à secura em evaporador rotativo. De seguida extraiu-se 2 vezes com 20 mL de cada vez 44

com uma solução a 2% de hidrogenocarbonato de sódio seguido de uma solução saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. Após filtração do agente secante, concentrou-se à secura em evaporador rotativo. 0 produto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". 0 gradiente do eluente foi cloreto de metileao/acetonitrilo 1:1 (+ uma porção de 1% de trietilamina). O produto foi isolado na forma de um sólido amarelo claro (123 mg; 0,095 mmole; 45%) . . - - · 54. Preparação de fosfonato de 5'-O-(4,4'-dimetóxitritilo)-timidililo-(3' ► 5' )-timidina-3'-O-succinilo-((O- trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (dimero F de fosfonato de hidróxilo-3'-succinil protegido com TES) 200 mg (0,18 mmole; 1,4 eq) de dimero D de fosfonato de hidróxilo-3'-OH protegido com TES pré-seco, foram dissolvidos em 2 mL de piridina. De seguida adicionaram-se sucessivamente 24,4 mg (0,2 mmole) de 4-dimetilaminopiridina e 20,0 mg (0,2 mmole) de anidrido . succínico e deixou-se reagir durante 4 horas sob agitação à temperatura ambiente. Adicionaram-se 45 mL de água e após 10 minutos de agitação, concentrou-se em evaporador rotativo até à secura. 0 resíduo foi retomado em 15 mL de cloreto de metileno e extraído uma vez com 8 mL de uma solução a 10% de ácido cítrico e duas vezes com 8 mL de água fria. De seguida a fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. Após filtração, concentrou-se à secura em evaporador rotativo. O produto bruto foi retomado em 3 mL de cloreto de metileno e adicionaram-se gota-a-gota, 25 mL de hexano. O produto precipita na forma de um sólido incolor. Para a precipitação total, as águas mães fora colocadas a -20°C e aí armazenadas durante algumas horas, de seguida filtrou-se e secou-se. O produto é um sólido incolor (167 mg; 0,14 mmole; 78%). 45

55. Preparação de fosfonato de 5'-O-(4,4'-dimetóxitritilo)- timidililo-(3' * 5')-timidina-3'-O-succinilo-CPG-((a-0- trietilsilóxilo)-2-nitrobenzilo) (dímero G de fosfonato de hidróxilo-3'-succinilo ligado a CPG e protegido com TES)

Num frasco de Pierce foram colocados 50 mg (0,042 mmole; 1,5 eq.) de dimero F de fosfonato de hidróxilo-3'-succinil protegido com TES f e dissolveram-se em 1,5 mL de dimetilformamiàa, adicionando-se 13,41 mg (0,042 mmole; 1,5 eq) de tetrafluoroborato de O-benzotriazolo-l-ilo-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametilurónio (TBTU) e 4,2 mL (0,033 mmole); 3,84 mg; 1,2 eq) de N-etilmorfolina. De seguida adicionou-se 370 mg de agente veicular CPG e agitou-se durante mais 4 horas à temperatura ambiente. Foi colocado num filtro e lavou-se com metanol e cloreto de metileno, recolocando-se num frasco de Pierce e adicionou-se 1,5 mL de reagente de Capping. Agitou-se por mais 1 hora, recolocou-se no filtro, filtrou-se e lavou-se com metanol, cloreto de metileno, tetra-hidrofurano e éter dietilico, secando-se a 40°C com uma bomba de ,óleo. Carga do agente veicular: 47,12 mmole/g 56. Preparação de um oligonucleotideo de fórmula

TTTTTTTTT(pp)T (pp significa uma ponte de fosfonato de α-hidróxilo-(o-nitrofenilo)metilo) 0 agente veicular CPG de acordo com o Exemplo 55, que contém 1 Mmole de dinucleotideo nas zonas terminais 3', é tratado sucessivamente com os seguintes reagentes: 1. Acetonitrilo absoluto 2. 2% de ácido dicloroacético em diclorometano 3. acetonitrilo absoluto 4. 10 Mmole de éster β-cianoetilo do ácido 5'-0- 46

dimetóxitritiltimidina-3'-fosfórico-diísopropilamidite e 40 pmole de tetrazolo em acetonitrilo absoluto 5. acetonitrilo 6. 20% de anidrido acético em THF com 40% de lutidina e 10% de dimetilaminopiridina 7 . Acetonitrilo 8. Iodo (1,3 g em THF/água/piridina; 70:20:5=v:v:v)., r.

Os passos de 1 a 8 que se designam como ciclo de reacção, são repetidos 7 vezes para a formação do derivado de decatimidilato. Após a síntese ter terminado, decorre a hidrólise dos grupos dimetóxitritilo como se descrevem nos passos de 1 a 3. Após tratamento com amoníaco, o oligonucleotídeo é hidrolizado do agente veicular e os grupos β-cianoetilo são eliminados. A hidrólise dos grupos sililo de protecção decorre através do tratamento com 80% de ácido acético. O produto bruto obtido em derivado de decatimidilato, que contém na zóna terminal 3' uma ligação internucleotídica com (-hidóxi-o-nitrofenilmetilfosfonato), é purificado por HPLC através de electroforese em gel de poliacrilamida.

57. Preparação de um oligonucleotídeo de fórmula T(pp)TTTTTTTTT O agente veicular CPG obtido comercialmente, que contém 1 (imole de 5'-O-dimetóxitritilo-timidina nas zonas terminais 3', é tratado sucessivamente com os seguintes reagentes: 1. Acetonitrilo absoluto 2. 2% de ácido dicloroacético em diclorometano 3. acetonitrilo absoluto 47 4.

10 μιηοΐβ de éster β-cianoetilo do ácido 5'-0-dimetóxitritiltimidina-3'-fosfórico-diísopropilamidite e 40 pmole de tetrazolo em acetonitrilo absoluto 5. acetonitrilo 6. 20% de anidrido acético em THF com 40% de lutidina e 10% de dimetilaminopiridina 7. Acetonitrilo 8. Iodo (1,3 g em THF/água/piridina; 70:20:5=v:v:v)

Os passos de 1 a 8 que se designam como ciclo de reacção, são repetidos 7 vezes para a formação do derivado de decatimidilato. No último ciclo em lugar do monómero do passo 4 do correspondnete dinucleotideo, utiliza-se o que se preparou no Exemplo 53. Após a síntese ter terminado, decorre a hidrólise dos grupos dimetóxitritilo como se descrevem nos passos de 1 a 3. Após tratamento com amoníaco, o oligonucleotideo é hidrolizado do agente veicular e os grupos β-cianoetilo são·eliminados. A hidrólise dos grupos sililo de protecção decorre através do tratamento com 80% de ácido acético. 0 produto bruto obtido em derivado de decatimidilato, que contém na zona terminal 3' uma ligação internucleotídica com (-hidóxi-o-nitrofenilmetilfosfonato), é purificado por HPLC através de electroforese em gel de poliacrilamida. 58. Preparação de um oligonucleotideo de fórmula T(pp)TTTTTTTTT(pp)x (pp significa uma ponte de fosfonato de α-hidróxilo-(o-nitrofenilo)metilo) A síntese decorre de acordo com o Exemplo 56, partindo de T(pp)T-CPG-agente veicular do Exemplo 55, que contém 1 jxmole de dinucleotideo ligado na zona terminal 3'. 48 7

Os passos de 1 a 8 que se designam como ciclo de reacção, são repetidos 7 vezes para a formação do derivado de decatimidilato. No último ciclo em lugar do monómero do passo 4 do correspondnete dinucleotideo, utiliza-se o que se preparou no Exemplo 53. Após a síntese ter terminado, decorre a hidrólise dos grupos dimetóxltritilo como se descrevem nos passos de 1 a 3. Após tratamento com amoníaco, o oligonucleotídeo é hidrolizado do agente veicular e os grupos β-cianoetilo são eliminados. A hidrólise dos grupos sililo de protecção decorre através do tratamento com 80% de ácido acético. O produto bruto obtido em derivado de decatimidilato, que contém na zona terminal 3' uma ligação internucleotídica com (-hidóxi-o-nitrofenilmetilfosfonato), é purificado por HPLC através de electroforese em gel de poliacrilamida. 59. Preparação de GCAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C (alvo HSV) A preparação decorre de forma análoga ao descrito para o Exemplo 56, em que em lugar de se utilizar, T(pp)T-CPG utiliza-se o correspondente G(pp)-C-CPG-agente veicular. Nas reacções de condensação, são utilizadas no passo 4 as correspondentes sequências do esuqeleto monomérico de desóxiadenosina, desóxiguanosina ou desóxicitidina. De preferência utilizam-se esqueletos comercialmente disponíveis, que permitem uma mais rápida hidrólise dos grupos de protecção (RExpedite Fast Deprotecting Amidites; Fairma Millipore, Eschborn).

60. Preparação de G(pp)CAGGAGGATG(pp)CTGAGGAGG(pp)C A preparaçáo decorre de forma análoga ao Exemplo 5 descrito, em que no oitavo e no último passo da condensação em lugar de T(pp)-T-fósforoamidite, se utiliza o correspondente G(pp)-C-fósforoamidite. 49

61. Preparação de G(pp)CAGGAGGATGCTGAGGAGG(pp)C A preparação decorre de forma análoga ao Exemplo 5 descrito, em que no passo de condensação se utiliza em cada um o correspondente G(pp)-C-fósforoamidite.

62. Preparação de G(pp)CGGGGCTCCATGGGGGGTC(pp)G A preparação decorre de acordo com o Exemplo 60, em que em lugar de G(pp)-C-CPG se utiliza correspondentemente^o C(pp)G-CPG-agente veicular. 63. Preparação de C(pp)GAGAACATCATGGTC(pp)G (alvo c-fos) A preparação decorre de acordo com o Exemplo 62, em que no último ciclo de utiliza a correspondente C(pp)G-fósforoamidite 64. Caracterização dos oligonucleotideos A caracterização decorre através de HPLC, electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e espectrometria de massa de elctrospray de iões negativos (ES-MS”) . O sprodutos são purificados como se descreve acima, e revelam depois através de PAGE (20% de acrilamida, 2% de bisacrilamida e 7M de ureia) uma única banda. O HPLC decorre em fase reversa em coluna de RP-18, da firma Merck ou numa coluna PA-100 da firma Dionex.

Para a ES-MS” os oligonucleotideos são convertidos através de precipitação com amoníaco ou outra salinização, em sais de amónio. A introdução da amostra decorre numa solução de acetonitrilo/água (1:1) com 5 OD26o/mL de oligómero. A exactidão do método é de cerca de ±1,5 Dalton. 65. Determinação da estabilidade e do crescimento declular após marcação radioactiva

Marcação Radioactiva

Uma marcação geral utilizável com 3iS consiste por na 50 Γ'

síntese dos oligonucleotídeos, pelo menos uma oxidação do ciclo de síntese de AND (passo 20 no Exemplo 11) ser efectuada com 35enxofre. Os oligonucleotídeos que possuam um grupo hidróxilo livre 5'-, podem ser marcados, com auxilio da quinase de polinucleotídeos e por métodos conhecidos, com 32P ou 3Ss.

Os oligonucleotídeos que possuam um grupo hidrxilo em 3'-livre podem ser marcados, 'jpor métodos conhecidos com transferase de 3'-. Como exemplo sugere-se a marcação em 5'-. do fragmento de ADN: O oligonucleotídeo com o grupo hidróxilo em 5'- (500 pmole) foi dissolvido em 425 pL de água, esta solução foi aquecida a 90°C e arrefecida bruscamente. Depois adiciona-se 50 pL 10 x tampão quinase e 50 pL de 32P-gamma-ATP (6000Ci/mole) , em particular 35S-gamma-ATP e incubou-se 1 hora a 37°c. A reacção foi parada através da adição de 0,5 M de solução de EDTA. A desalinização decorreu com o auxilio de uma coluna NAPR da firma Pharmacia.

Estudo da estabilidade dos oligómeros em meio com células- 0 sobrenadante 1 (10 pL) foi misturado com 5 pL de 80% de formamida (cm XC e BB) e aquecido a 95°C (5 minutos) e lançado sobre gel de poliacrilamida (20% de acrilamida, 7 M de ureia). Após o desenvolvimento do gel num campo eléctrico, ordenam-se as bandas no gel através de autoradiografia dos "oligomeros estáveis", em particular as bandas de campo dos "oligómeros decompostos".Resultados após 24 horas de tempo de incubação: em comparação com oligonucleotídeos não modificados, os compostos de fórmula I (W igual à fórmula II, R igual à fórmula II') possuem todos um forte período de duração de vida.

Determinação do crescimento celular.

Incuba-se células Vero em microplacas com 96 cavidades em 51 DMEM, 5% FCS durante 24 horas a 37°C. De seguida o meio é removido, lavam-se as células mais duas vezes com DMEM livre de soro. 0 oligómero marcado radioactivamente (106 cpm) é diluído com oligómero não marcado até uma concentração de 10 μΜ no soro e as células são assim incubadas a 37°C. Após 1, 7 e 24 horas, retiram-se de cada vez 150 μΐι (designação de "sobrenadante 1") . As células nas cavidades das microplacas são lavadas 7 vezes com 300 μΐ. de meio fresco e os meips.· de lavagem reunidos (designação de "sobrenadante 2") medidos num medidor de cintilações. De seguida adicionam-se 100 μΐι de solução de tripsina, espera-se 30 segundos e retira-se o sobrenadante. Para retirar as células das placas, incuba-se 3 minuntos a 37°C. As células resultantes são colocadas em frascos "eppendorf" e centrifugadas a 200 rpm (designação de "sobrenadante 3") . Os sobrenadantes 1 (5 μΐ,) , 2 e 3 (0,5 mL) são cada um separadamente medidos num medidor de cintilações. Daqui calcula-se o crescimento dos oligómeros em pmole por 100 000 células, em que o sobrenadante 3 representa a fracção de oligómeros ligados às células e a soma dos sobrenadantes 1 e 2 a fracção de oligómeros não ligados às células. 66. Determinação do crescimento de células após marcação por fluorescência.

Deixam-se crescer células COS até à confluência num MEM da Dulbecco que está suplementado com 10% de FCS, em placas de peti de 5 cm. As células são lavadas duas vezes com DMEM sem soro. Com auxilio de uma lâmina esterilizada, uma área de 1 cm2 é retirada do centro da placa de petri. Nesta área é colocada a solução de oligómero-ADN (0,1 mM) a ser estudada. Incuba-se a 37°C sob atmosfera de C02. Após 2, 4 e 16 horas, são estudadas as células por microscopia de fluorescência. As células são lavadas para este efeito, quatro vezes com DMEM sem soro, são tapadas com uma placa de vidro e medidas dentro do microscópio de fluorescência, em particular, 52

em contraste de fase. 67. Determinação das temperaturas de fusão: A determinação das temperaturas de fusão decore com auxilio de um espectrómetro de vector de díodos HP 8452A, de um Peltier-elemenLs HP 89090A e de um software de controlo de temperaturas da HP, Rev B5.1 (firma Hewlwt Packard). Foram medidos em pasos de 0,5°C/min em 10 mM de HEPES.. e 140 mM de NaCl (pH 6,5) como tampão. A concentração de oligómeros foi de 0,5 a 1,5 OD260 por mL. 68. Teste de actividade antiviral em cultura de células A actividade antiviral das substâncias teste contra diferentes virus de herpes patogénicas aos humanos foi estudada em sistemas de culturas de células. Para o teste fora semeadas células de rim de macaco (Vero, 2 x 105/mL) em MEM da Dulbecco contendo soro (5% de soro fetal de vitela FCS) em microplacas com 96 cavidades e incubadas durante 24 horas a 37°C e a 5% de C02. O meio contendo soro foi então filtrado e as células fora lavadas com meio MEM da Dulbecco sem soro (-FCS). As substâncias teste foram pré diluídas com H20 a uma concentração de 600 μΜ e armazenadas a -18°C. Para 0 teste decorrem mais passos de diluição em meio mínimo essencial (MEM) da Dulbecco. Cada 100 pL de cada diluição de substância teste foram adicionados com 100 μΐ, de meio sem soro MEM (-FCS) da Dulbecco a de células lavadas. Após 3 horas de incubação a 37 °C com 5% de C02 infectou-se com células de virus de herpes simplex do tipo 1 (ATCC VR733, HSV-1 linha-F) ou com células de virus de herpes simplex tipo 2 (ATCC VR734, HSV-2 linha-G) em concentrações, em que no espaço de 3 dias todas as células foram destruídas. Para HSV- 1 a força da infecção foi de 500 unidades por cavidade da placa (PFLJ), epara HSV-2 350 PFU/cavidade. As amostras teste contém então a amostra teste em concentrações de 80 μΜ até 53

0,04 μΜ em ΜΕΜ, e ainda 100 U/mL de pinincilina G e 100 mg/L de streptomicina. Todos os ensaios foram conduzidos em ensaios duplos com a excepção do controlo, que foi efectuado oito vezes por cada placa. As amostras teste foram incubadas 17 horas a 37°C a 5% de C02. A citotoxicidade das substância teste foi determinada após 20 horas de tempo total de incubação através de microscopia das culturas de células. Como dose toleradsa máxima (DTM) foi considerada a concentração máxima de preparado, que sob as condições experimentais não apresentassem ainda qualquer dano microscopicamente reconhecível nas células. Assim decorre a adição de FCS até uma concentração final de 4% com mais uma incubação de 55 horas a 37°C e a 5% de C02. Os controlos não tratados de infecção revelam um efeito citopático total (CPE). Após verificação microscópica das culturas de células, corou-se com vermelho neutro correspondentemente de acordo com os processos de coloração vital de Finter (1966). A actividade antiviral de uma substância teste foi definida como a concentração mínima de inibição (MHK), ,que é necessária, de forma a proteger 30-60% das células do efeito citopatogénico provocado pelo virus. Os valores de MIC de diferentes oligonucleotídeos encontram-se na gama de 0,1 a 80 |xmol/L. 69. Determinação da actividade in vivo contra virus Para o teste dos compostos in vivo, foram utilizados ratos NMRI de 5 semanas com um peso de cerca de 16 a 18 gramas. Os ratos foram mantidos em condições habituais em grupos de cinco animais e em condições de ab libitum de alimentação e água. A infecção dos ratos decorreu de forma intraperitoneal com cerca de 10 a 50 unidades de LD50 de uma cultura de HSV (HSV "corneae"). O doseamento de composto decorreu duas vezes por dia, i.p com 1, 10 ou 50 mg/kg. Os animais de controlo receberam uma solução de 1% de cloreto de 3Ódio. A taxa dc 54 Γ\ r -·

η sobrevivência dos animais foi seguido durante um período de duas semanas. Por aplicação de oligonucleotídeos "antisense" resultaram 1 a 5 sobrevivências, enquanto que para as doses de placebo todos os animais morreram. 70. Determinação da actividade in vivo: Inibição da expressão proteica de c-fos nos ratos: A determinação decorre como se descreve (Sandkuhler et ai,, (1991) em: "Proceedings of the Vith World Congress on Pain, Charlton and Woolf, Editors; Elsevier, Amsterdam; página 313-318) através de superfusão da espinal medula. Através de laminectomia de um rato Sprague-Dawley anestesiado com barbiturato, formou-se uma câmara dupla de sílica para ser preenchida com aoligómeros "antisense". Uma câmara foi cheia com derivado de oligonucleotídeo "antisense" (concentração de 75 μΜ) . Cada uma hora o superfusato foi foi trocado. Após 6 horas de superfusão foi estimulada a expressão de c-fos através de tratamento térmico (52°C) dos membros traseiros. A inibição da expressão c-fos pôde ser determinada através de amostras de tecido correspondente de forma imuno-histoquimicamente. 71. Preparação de fosfonato de 3'-((α-0-tributilsilóxilo)-2- nitrobenzilo de 5'-O-(4,4'-dimetóxitrifenilmetilo)-2'-desóxitimidililo-(3'-\ 5')-3'0-levulinilo-2'-desóxitimidina (dímero H de hidróxifosfonato protegido com TBS (tributilsilóxilo) 1,77 g (1, 636 mmole; 1 eq.) de dimero B a-hidróxifosfonato foram pré-secos e dissolvidos em 30 mL de piridina. A esta solução adicionaram-se 2,62 mL (9,816 mmole; 2,306 g; 6 eq.) de clorotributilsilano. Após oito horas de agitação à temperatura ambiente a reacção foi interrompida por adição de metanol e concentrada à secura num evaporador rotativo. 55 0 produto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". 0 gradiente do eluente foi acetato de etilo/metanol, elevado de de 0% a 2% de metanol. O produto é um sólido amarelo claro (1,78 g; 1,39 mmole; 85%) . 72. Preparação de fosfonato de 3'-((α-0-tributilsilóxilo)-2- nitrobenzilo de 5'-O-(4,4'-dimetóxitrifenilmetilo)-2'-desóxitimidililo-(3'-1 5')-’ 2'-desóxitimidina (dimero I de hidróxi-3'-OH-fosfonato protegido com TBS) 1,2 g (0,94 mmole) de dimero H de hidróxifosfonato protegido com TBS foram dissolvidos em 10 mL de piridina e adicionados de 10 mL de uma solução de 3 mL de hidrato de hidrazina (24% em água), 6,92 mL de piridina e 4,61 mL de ácido acético. Após três minutos de agitação à temperatura ambiente a solução foi arrefecida a 0°C e diluída com 100 mL de água e 100 mL de acetato de etilo. Após a separação das fases numa ampola, a fase orgânica foi lavada uma vez com 25 mL de uma solução a 5% de hidrogenocarbonato de sódio e deseguida seca sobre sulfato de sódio. O agente secante foi filtrado e o filtrado concentrado até à secura em rotavapor. O produto bruto foi purificado por cromatografia em "flash". O gradiente do eluente foi acetato de diclorometano/metanol, elevado de de 0% a 5% de metanol. O produto é um sólido amarelo claro (910 mg; 0,77 mmole; 82%) . 73. Preparação de fosfonato de 3'-succinilo-((a-O- tributilsilóxilo)-2-nitrobenzilo de 5'-0-(4,4'-dimetóxitrifenilmetilo)-2'-desóxitimidililo-(3' ► 5')- 2'- desóxitimidina (dimero J de hidróxi-3'-succinil-fosfonato protegido com TBS) 56

120 mg (0,10 mmole; 1 eq.) de dímero I de hidróxi-3' -OH-fosfonato protegido com TBS foram pré-secos e dissolvidos em 1 mL de piridina seca. De seguida adicionaram-se sucessivamente 14,8 mg (0,12 mmole; 1,2 eq.) de 4-dimetilaminopiridina e 12,1 mg (0,12 mmole; 1,2 eq.) de anidrido succinico, agitando-se durante 4 noras â temperatura ambiente. Adicionaram-se 40 mL de água e após 10 minutos de agitação, concentrou-^se à: secura em evaporador rotativo. O resíduo foi’retomado em 10 mL de diclorometano e extraiu-se uma vez com 5 mL de solução fria a 10% de ácido cítrico e duas vezes com água fria. De seguida a fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. Após a filtração concentrou-se à secura em evaporador rotativo. 0 produto bruto foi retomado em 3 mL de diclorometano e adicionaram-se gota-a-gota 25 mL de n-hexano. O produto que precipitou era incolor. Para completar a precipitação, as águas mães foram armazenadas a -20°C durante algumas horas, filtrando-se de seguida e secando-se. -0..produto é um sólido incolor (115 mg; 0,09 mmole; 90%). 74. Preparação de fosfonato de 3'-succinilo-CPG-((a-O-tributilsilóxilo)-2-nitrobenzilo de 5'-0-(4,4'- dimetóxitrifenilmetilo)-2'-desóxitimidililo-(3'-► 5')- 2'- desóxitimidina (dímero K de hidróxi-3'-succinil-fosfonato protegido com TBS e ligado a CPG)

Num frasco de Pierce foram dissolvidos em 0,7 mL de dimetilformamida seca, 26,5 mg (0,021 mmole; 1,5 eq.) de dímero J de hidróxi-3'-succinil-fosfonato protegido com TBS e adicionados de 6,74 mg (0,021 mmole; 1,5 eq.) de tetrafluoroborato de O-benzotriazolo-l-ilo-Ν,Ν, N',N'- tetrametilurónio (TBTU) e 2,1 mL (0,017 mmole; 1,96 mg; 1,2 eq.) de N-etilmorfolina. De seguida adicionaram-se 183 mg de CPG-agente transportador e agitou-se por mais 4 horas à temperatura ambiente. Passou- se por um filtro, lavou-se 57

com metanol e diclorometano, e colocou-se de novo num frasco de Pierce com 0,7 mL de reagente de Capping. Agitou-se por mais uma hora, filtrou-se de novo por um filtro, filtrou-se e lavou-se com metanol, diclorometano, tetra-hidrofurano e éter dietilico, secando-se em bomba de vácuo.

Carga do transportador: 33,15 mmolefg. 75.·Preparação de GCTCCATGTCGGCAAACAGCT(pp)C (alvo HSV) .. A preparação decorre de forma análoga ao descrito para o Exemplo 56, em que em lugar de se utilizar T(pp)T-CPG utiliza-se o correspondente T(pp)-T-CPG-agente transportador do exemplo 74. Nas reacções de condensação, são utilizadas no passo 4 as correspondentes sequências do esuqeleto monomérico de desóxiadenosina, desóxiguanosina ou desóxicitidina. De preferência utilizam-se esqueletos comercialmente disponiveis, que permitem uma mais rápida hidrólise dos grupos de protecção (RExpedite Fast Deprotecting Amidites; Fairma Millipore, Eschborn).

Tabela 2 X Nucl δΗ« [ppm] 6oh [ppm] 8Ca [ppm] δ31Ρ [ppm] NMe2 d4T “ - - — och3 d4T 4,85 6, 64 69,06/68,86 (1648hZ)(163 ,49hz) 24,09/24,01 ch3 d4T 4,95 6, 30 69,50/69,10 23,84/23,81 H d4T 4,975/5,0 1 6,35 69,53/69,35 23,72/23,64 Cl (MS = O.K. ) d4T 5,05 6, 47 68,47 23,18/23,09 2,6-DiCl d4T 5,77 6, 45 — 22,24/22,14 CN d4T 5,19 6, 64 68,99/68,90 22,41/22,32 4-N02 d4T 5,28 6,71 22,11/22,10 2-N02 d4T 6, 06 6, 83 — 21/72/21,65 58 X Nucl δκα [ppm] δ0Η [ppm] ôCa [ppm] δ31Ρ [ppm]23,37 2,4-DiN02 d4T 7,13/7,09 6,13/6,11 — 20,21/20,46 2,6-DiN02 d4T π d4T 5,14 6, 605 69, 3 22,24/22,13 Octilo d4T 3, 74 5,55 - 27,86/27,82 NMe2 ddT 4,885 6, 08 69,2 (163,78hz) 24,72/24,67 och3 ddT 4,98 6/24 68,83 (165,72hz) 24,28/24,25 ch3 ddT 5,015 6, 27 69,18 (159,06hz) 24,09/24,06 H ddT 5,056 6, 355 69, 33 (163hz) 23,91/23,88 Cl ddT 5,15 6, 465 68,59 (164,016hz) 23,38/23,35 2,6-DiCl ddT 5,82 6, 67 67,64 (170,2hz) 22,54/22,44 CN ddT 5,82 6, 63 68,77 (166,3hz) 22,65/22,60 4-N02 ddT 5,25 6, 69 68,74 22,44/22,40 2-N02 ddT 5,32 6, 81 N.D. 22,12/22,10 2,4-DíN02 ddT 6, 07 7,07 69, 25 20,77/20,61 2,6-DiN02 ddT N.D. N.D. N.D. N.D. π (MS O.K. ) ddT 5,17 6, 67 67,55 22,51/22,49 Fluorenona ddT 6,75 80, 59 165,71hz) NMe2 AZT och2 AZT Cii3 AZT H AZT Cl AZT CN AZT 4-N02 AZT 5,38 6, 82 22,745(DMSO) 59 -"7

' —~ί. X Nucl δΗα [ppm] δ0Η [ppm] δαχ [ppm] δ3ιρ [ppm]23,37 2-Ν02 ΑΖΤ 6, 27 7,31 23,17/23,08 (MeOD) 2,6-Ν02 ΑΖΤ 6, 32 7,51 21,37/21,30 (MeOD) 2,4-DÍN02 Triéster Ο.Κ. (MS Ο.Κ.) .. ΑΖΤ 6, 16 [6,39] 7,173 [7,48] 20,95/20,83 [21,57/21,38] MeOD π ΑΖΤ 5,22 6, 69 — 22,79/22,76 Octilo (MS: Ο.Κ.) 3, 83 5,63 66, 72 28,17/28,09 X Núcleo.I NucleoII δΗα [ppm] 13C [ppm] δθΗ [ppm] δ3ΐρ [ppm] 2,6-DiN02 Triéster O.K. ddT AZT 6,34 21,27/21,25 (MeOD) 21,23/21,17 2,6-DiN02 Triéster O.K. d4T AZT 6,29 7,22 20,38/20,28 (DMSO) 20,06/19, 56 4-N02 d4T AZT 5,32 6,78 22,63/22,20 (DMSO) 2-N02 ddT d4T 6, 01 6,86 22,24/22,23/2 1,71/21,40 (DMSO) 2-N02 3' T d4T 6,15 6,86 22,37/22,15 (DMSO) 4-C1 T T 5,12 68,36 (163,20hz) 21,5/21,01/23 ,55/23,52 (DMSO) 4-C1 T3'heo T3'heo 5,16 68,38 (163,30hz) 6,58 23,68/23,66 (DMSO) 4-C1 T3'TBDMS T3'TBDMS 5,12 68,32 (163hz) N.D. 23,25/22,68 (CDCI3) 4-C1 T3' -Ac T3' -Ac 5,16 68, 49 (164,05hz) 6, 59 23,77/23,73 (DMSO) 60

X Núcleo.I NucleoII δκα [ppm] 13 C [ppm] δο.Η [ppm] 83 ip [ppm] 4-OCH3 T3'-Ac T3'-Ac 5, 05 68,72 (165,12hz) 6,38 24,59/24,52 (DMSO

Diéster de H-fosfonato e Monoéster de H-fosfonato

Núcleo.X NucleoII δκα [ppm] JHP [HZ] δ3ιρ [ppm] · solvente ddT ddT 6,949 711,00 11,18 DMSO ddT 6,815 637,01 7,24 D20 d4T d4T 6,87 710,98 11,12 DMSO d4T - 6,71 637,67 7,07 D20 AZT AZT 6,97 719,4 11,40 DMSO AZT 7,02 674,54 1,06 DMSO ddT d4T 6,91 711,10 11,35/10,88 DMSO ddT AZT 6,939 736,51 11,35/11,26 DMSO d4T AZT 6, 954 739,59 11,46/11,09 DMSO 3' T AZT 7, 026 720,12 10,51/10,04 DMSO 3' T d4T 6, 97 716,55 10,15/10,07 DMSO

Lisboa, 20 de Dezembro de 2001 'AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 61

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula I R-CH-P' 6 ,0W OR (I) caracterizados por Y significar OH, SH, OAc ou SAc, com Ac= (C1-C8)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo com 6-14 átomos de C, eventualmente substituído com até três grupos independentes uns dos outros, escolhidos do grupo constituído por (C1-C5)-alquilo, halogéneo, NO2, CN, (C1-C6)-alcóxilo, amino, (Cl-C4)-alquilamino, (C1-C8)-dialquilamino, em que no grupo arilo pode encontrar-se condensado também um grupo alquileno (C3-C8), no qual um grupo CH2-também pode estar substituído com óxilo; heteroarilo com 3 a 13 átomos de C e até três hetepoátomos escolhidos do grupo constituído por N, o e S; (C1-C6)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, eventualmente substituído, e independentes uns dos outros, com até três substituíntes, escolhidos do grupo constituído por CN, N02 e (Cl—C3)— alcóxilo, W significar um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' farmaceuticamente activo R significar o mesmo que W, em que R e W podem ser iguais ou diferentes, ou R significa (C1-C6)-alquilo, que pode ser ramificado ou não ramificado, e eventualmente substituído com três grupos independentes uns dos outros do grupo escolhido do grupo constituído por CN, (C1-C8)-acilóxilo, (C1-C8)-alcóxilo ou W e R em conjunto formarem, com o grupo fosfonato que 1 possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonucleotídeo modificado,

em que X significa Oxi ou sulfandilo, B independentemente uns dos outros, significa uma base nucleotidica, n independentemnete uns dos outros significa um número inteiro de 0 a 30, R1 e R2 significam independentemente uns dos outros H(C1-C12)-acilo ou um grupo de fórmula O 4 II 5 R—P-OR5 em que R4, O, S, CH3 ou CHYR' , significam como se definiu acima para R'e Y e R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-12 átomos de C, R3 significa, independentemente uns dos outros, H, 0(C1-C12)-alquilo, O (C1-C12)-acilo, Cl, N3, NH2 ou NHR6, em que R6 significa (C1-C3)-alquilo ou acilo e o parêntesis recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'. Compostos de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por
2 X

Y significar OH, SH, OAc ou SAc, com Ac= (C1-C8)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo com 6-14 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por (C1-C5)-alquilo, halogénio, Νθ2, CN, (C1-C6)-alcóxilo, amino, (C1-C4)-alquilamina, (C1-C8)-dialquilamina, em que o grupo alquilo pode também estar condensado a um grupo (C3-C8)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3-13 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, 0 e S; (C1-C16)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, eventualmente substituído, independentemente um do outro com até três substituíntes escolhidos do grupo constituído por halogénio, CN, N02 e (C1-C3)-alcóxilo, W significar um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' farmaceuticamente activo R significar o mesmo que W, em que R e W podem ser iguais ou diferentes, ou R significa (C1-C6)-alquilo, que pode ser ramificado ou não ramificado e eventualmente substituído independentemente entre si com até 3 grupos do grupo constituído por halogénio, CN, (C1-C8)-acilóxilo, (C1-C18)-alcóxilo ou W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotídeo modificado, em que X significa Oxi ou sulfandilo, B independentemente uns dos outros significa uma base nucleotídica, n independentemnete uns dos outros significa um número inteiro de 0 a 30, 3

R1 e R2 significam independentemente entre si H(C1-C12)-acilo ou um grupo de fórmula 0 4 II g R—f^-OR5 em que R4, significa O, S, CH3 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e. R5 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-12 átomos de C, R3 significa, independentemente entre si, H, 0(C1-C12)-alquilo, O (C1-C12)-acilo, F, Cl, N3, NH2 ou NHR6, em que R6 significa (C1-C3)-alquilo ou acilo e o parêntesis recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'.
3. Compostos de fórmula I de acordo com a reivindicações 1 ou 2, caracterizados por Y significar OH, SH, OAc ou SAc, com Ac= (C1-C3)-acilo, eventualmente 1-3 vezes insaturado R' significar arilo com 6-14 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por (C1-C3)-alquilo, F, Cl, N02, CN, (C1-C4)-alcóxilo, amino, (C1-C3)-alquilamina, (C1-C6)-dialquilamina, em que o grupo alquilo pode também estar condensado- a um grupo (C3-C8)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3 a 6 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, 0 e S; (C1-C8)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, eventualmente substituído, independentemente entre si com até três substituíntes escolhidos do grupo constituído por Cl, CN, N02 e (C1-C3)-alcóxilo, W significar um análogo nucleosídeo 5',3' ou 2' 4 r farmaceuticamente activo R significar o mesmo que W ou significa (C1-C8)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado eventualmente com até 2 grupos substituíntes do grupo constituído por halogéneo, CN, (C3-C6)-acilóxilo, (C8-C18)-alcóxilo ou W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado .. e R significa um grupo de fórmula 11'ou-um oligonulceotídeo modificado, em que X significa Oxi, B independentemente entre si significa uma base nucleotídica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 20, Rx e R1 2 significam independentemente entre si H(C1-C8)-acilo ou um grupo de fórmula O
4 II 5 R—P-OR em que R3, significa 0, S, CH3 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e R4 um grupo alquilo eventualmente substituído com 1-8 átomos de C, R5 significa, independentemente entre si, H, 0(C1-C8)-alquilo, 0 (C1-C8)-acilo, Cl ou N3, e o parêntesis recto assinala que R5 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'. 1 Compostos de fórmula I de acordo com uma ou mais das 2 reivindicações de 1-3, caracterizados por 3 R' significar arilo com 6 átomos de C, eventualmente substituído até três grupos independentes entre si, escolhidos do grupo constituído por 4 5 5 Y significar OH, (C1-C3)-alquilo, F, Cl, N02, CN, (C1-C4)-alcóxilo, amino, (C1-C3)-alquilamina, (C1-C6)-dialquilamina, em que o grupo arilo pode também estar condensado um grupo (C3-C6)-alquileno, em que também um grupo CH2 pode estar substituído por um grupo oxi; heteroarilo com 3 a 6 átomos de C e até três heteroátomos átomos, escolhidos do grupo constituído por N, 0 e S; (C1-C8)-alquilo, ramificado ou não ramificado, saturado ou 1-3 vezes insaturado, de preferência na forma conjugada com uma ligação insaturada na posição alfa, eventualmente substituída independentemente entre si com até três substituíntes escolhidos do grupo constituído por Cl, CN, N02 e (C1-C3)-alcóxilo, W significar um análogo nucleosídeo 5' ou 3' farmaceuticamente activo R significar o mesmo que W ou significar (C1-C4)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado, W e R em conjunto formam, com o grupo fosfonato que possuem, um oligonucelotídeo em que W é um grupo de fórmula II, ou um oligonucleotídeo modificado e R significa um grupo de fórmula II'ou um oligonulceotídeo modificado, em que X significa Oxi, B independentemente entre si significa uma base nucleotídica, n independentemnete entre si significa um número inteiro de 0 a 15, R1 e R2 significam independentemente entre si H(C1-C4)-acilo ou um grupo de fórmula O 4 II 5 R—P-OR em que R4, significa O, S, CH2 ou CHYR' com R' e Y como acima se definiu e R5 um grupo alquilo eventualmente 6

substituído com 1-3 átomos de C, R3 significa, independentemente entre si, H, 0(C1-C3)-alquilo, O(C1-C3)-acilo, Cl ou N3, e o parêntesis recto assinala que R3 e os grupos fosfonilo vizinhos se podem encontrar na posição 2', em particular, 3'.
5. Compostos de fórmula I, de acordo com uma ou mais reivindicações'de 1-4, caracterizados por Y' significar OH, W possuir o significado de um análogo nucleosídeo 5'- ou 3'- farmaceuticamente activo , R significar o mesmo que W ou significar (C1-C4)-alquilo que pode ser ramificado ou não ramificado, R' significar arilo com 6 átomos de C, eventualmente substituído com até 3 grupos independentemente uns dos outros, escolhidos do grupo constituído por Cl, N02, CN, (C1-C3)-alcóxilo, amino e (C1-C3)-alquilamino.
6. Processo para a preparação de compostos de acordo com uma ou mais reivindicações de 1-5, caracterizado por a) um composto de fórmula III ser convertido com um composto de fórmula IV ow H h-^or 0 (III) (IV) ou b) um composto de fórmula V com uma sequência preferida e sob utilização de um agentes de condensação ser convertido com compostos de fórmula VI, ou c) um composto de fórmula V com uma sequência preferida e sob utilização de um agentes de condensação ser 7 convertido com compostos de fórmula VI e de fórmula VII,

(V) WOH ROH (VI) (VII) em que SG significa um grupo de protecção, que para a obtenção do composto de fórmula I é eventualmente hidrolisado, ou uma unidade nucleotidica com grupos H-fosfonatos terminais em 3' (2')~ e grupos 5'-hidróxilos protegidos com outras unidades nucleotidicas com grupos hidróxilo em 5'-e grupos hidróxilo em 3' (2' ) , na presença de um agente de activação para conversão em dinucleosideo de H-fosfonato, e este ser condensado com um aldeído em fosfonato de dinucleosídeo-a-hidróxialquilo(arilo), em que depois da conversão nos seus derivados, reagem com outros fragmentos (oligo)nucleotídeos para originarem oligonucleotídeos, em que os grupos de protecção temporariamente introduzidos são hidrolisados, ou a) unidades de nucleotídeo com fósforo (III) ou fósforo (V) nas posições 3' (2') terminais são convertidos com os seus grupos hidróxilo em 5' numa outra unidade de nucleotídeo, em particular, cadeia oligonucleotídica crescente, na presença de um agente de condensação ou b) os seus derivados activos são convertidos, ou os análogos dos oligonucleotídeos são fragmentados nos seus constituintes, em que os oligonucleotídeos obtidos em a) ou b) são introduzidos como grupos de protecção de outras funções de forma temporária, sendo posteriormente hidrolisados, e os análogos de oligonucleotídeos de fórmula I assim obtidos, em que W significa um grupo de fórmula II ou um oligonucleotídeo modificado e R um grupo de fórmula II' ou um oligonucleotídeo modificado, eventualmente na forma de seus sais fisiologicamente 8 compatíveis.
7. Utilização de um composto de fórmula I de acordo com uma ou mais reivindicações de 1-5 para a preparação de um medicamento.
8. Medicamento contendo um ou mais compostos de fórmula I, de acordo com uma ou mais reivindicações de 1-5.
9. Compostos de fórmula I de acordo com uma ou mais reivindicações de 1-5 para serem utilizados como medicamento. Lisboa, 20 de Dezembro de 2001

&GENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL W-

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