DD273064A1 - Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden, von Desoxy- und Ribonucleotiden nach der Phosphotriestermethode, wobei der Kondensationsschritt zur internucleotidischen Phosphatbindung mittels neuartiger spezifischer Reagenzien vorgenommen wird. Es wird ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden nach der Phosphotriestermethode beschrieben, bei welchem als Kondensationsreagenzien zur Herstellung der internucleotidischen Phosphatbindung Chloride oder Azolide der Durensulfosaeure, insbesondere Durensulfo-1-oxy-6-nitrobenzo-1,2,3-triazol zur Verwendung gelangen.

Description

Weiter zeigte sich erfindungsgemeß, daß vergleichbar gute Ergebnisse erhalten werden, wonn statt der Kombination Durensulfochlorid/I-Methyürnidazol das 1-Oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazolid der Durensulfonsäu'e als Kondensationsmittel verwendet wird (Formel 3). Das hierfür benötigte 1-Hydroxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol zeichnet sich gegenübarden anderen in der Nucleotidsynthese verwendeten Azolen wie 1,2,4-Triazol,3-Nitro-1,2,4-triäzol,Tetrazol sowie tlucrmethylierten und höher nitrierten 1-Hydroxy-benzo-1,2,3-ti iazolen dadurch aus, daß es speziell in der Kombination mit Durensulfonsäuren ein hochaktives spezifisches Kondensationsmittel liefert, das zudsm eine gute Haltbarkeit aufweist. Ein weiterer Vorteil des Durensulfo-1 -oxy-6-nitro-benzo-i ,2,3-triazoles besteht darin, daß seine Azolkomponente im Gegensatz zu den meisten anderen verwendeten Azolen bequem und gefahrlos aus 2,4-Dinitrochlorbenzen dargestellt werden kann.

Ausfuhrungsbelspfele Verwendete Abkürzungen: Bz = Ben.ioyl

Mb = 4-Methoxybenzyl Cp = 2-Chlorphenyl Dmtr = Dimethoxytrityl Tea⁺ = Triethylammonium Ce = Cyanoethyl

Ausgangsstoffe:

— Durensulfochlorid

Fp.: 97⁰C (Lit.: 98-99⁰C)

— 1 -Hydroxy-6-nitro-benzo-i ,2,3-triazol Fp.: 206⁰C (Zers.) (Lit,: 206⁰C [Zers.])

— Durensulfo-i-oxy-e-nitro-benzo-I^.S-triazol Fp.: 158⁰C (Zers.)

C₁₆H₁₈N₄O₅S (376,39)

Bar.: C: 51,05% H:4,28% N: 14,89%Gef.: C: 51,07% H:4,22% N: 14,97%

— Durensulfonyltetrazol Fp.: 91⁰C (Zers.) C₁₁H₁₄N₄O₂S (266,32)

Ben: C: 49,61% H: 5,30% N: 21,04% Gef.: C: 49,32% H: 5,39% N: 20,83%

- Nucleotidderivate

Nucleotidderivat

(⁰C) R_f ^a'

(ppm) Elementaranalyse (#)

Ber.: Gef.:

,3s -OKb (1)

DmtrO -0-P-O" Tea⁺ N I· OCp

95-96

0,10 -6,2 C: 64.17 H: 5,76 N: 7,74

64,06 5,91 7,65

DmtrO

,Bz -OMb (2)

0 -O-P-0 Tea^H

102-104 0,27 -5,7

OCp C: 64,49 H: 5,58 N: 5,28

64,52 5,72 5,37

DmtrO

-OLIb 0 -O-P-0

Il

OCp

(3)

118-120 0,06 -8,3 C: 62,66 63,03 H: 5,99 6,19 N: 4,38 4,50

KO

,Bz

-OBs (4) 140-142 0,19

-OBz C: 62,52 62,16 H: 4,20 4,31 IJ: 11,76 11,47

a: CH₂CI₂/Me0H (95:5, V/V) auf Kieselgel 60 F_2M (Merck)b: gemessen in CHCI, gegen H₁PO₄ (85%ig) als externen Standard

Beispiel 1

Aus den Rausteinen (1), (2) und (4) wird nach den genannten Arbeitsprinzipien der Nucleotidtriestörsynthese, jedoch unter Anwendung von Durensulfonyltetrazoi bei den einzelnen Kupplungsschritten, das geschützte Oligonucleotid (5) aufgebaut.

DmtrO

,Bz

-OMb 0

Il

-0-P-0

OCp

.,Bz -OMb

Il

-0-P-0.

Il \

OCp >

Bz -OBz

-OBz

Bei den jeweiligen Kupplungsschritten wurden Ausbeuten von >80% erreicht und chromatographisch reine Produkte erhalten.

Fp.: 72-74⁰C FV¹0,49

R,^b) 14,31 min UV/VIS (MeOH): A_nllJI.225nm,277nm

^„.255 nm

a: CH₂C!₂/Me0H (95:5, V/V) auf Kieselgel 60 F_2H (Merck)

b: HPLC: RP 18-Säule (100 x 2,1 mm), Druck: 40 · 10³kPa bei40'C Durchfluß0,4ml/min, Elutionsmittel: 0.05M NH₄-acetat-Lsg. pH 7 gegen einen MeOH-Gradienten.

Beispiel 2

Unter Verwendung der Bausteine (1M4) mit Einsatz von Durensulfo-1-oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol als Kupplungsreagenz

werden zunächst die geschützten Dinucleotide (6) und (7) aufgebaut.

„Bz

,Bz

DmtrO

-O-P-0 it OCp

,Bz

-OMb 0

Il

Lo-P-OCe

DmtrO

-OMb

-0-P-O. OCp

-OBz -OBz

(6) (7)

Diese werden dann au' dem gleirhe Wege in hoher Ausbeute zum geschützten, chromatographisch reinen Tetranucieotid (8) kondensiert.

DmtrO.

,Bz

-OMb 0

Il

-0-P-O

OCp

,3z -OMb

-o-p-a

OCp ^N

-OMb

-O-P-0, H \

OCp ^N

,Bz

-OBz

-03z

Fp.: 65-68TR,¹¹0,44

R,^bl 14,35 min UV/VIS (MeOH): X_m,«.226nm,265nm A_min. 243 nm

a: Angaben wie bei a) Beispiel b: Angaben wie bei b) Beispiel

Beispiel 3

Ausgehend von nem Dinucleotidderivat (6) und dem Ti inucleotidderival (5) wird unter Einsatz von Ourensulfochlorid/1 -Methylimidazol als Kupplungsreagenz das geschützte Pentanucleotid (9) in chromatographisch reiner Form und einer Ausbeute von >90% gewonnen.

DnrfcrO.

-OMb

0 Ii

-0-P-O II OCp

-OMt»

-0-P-O. OCp

'\J

,Bz -OLIb

-0-P-0

OCp

,Bz -OMb

-0-P-O.

Bz -OBz

-OBz

(9)

Fp.: 69-72⁰C

R(^bl 14,64 min

UV/VIS (MeOH): X_1111x. 230nm,275nm

X_m,_n.250nm

a: Angaben wie bei a) Beispiel 1

b: Angaben wie bei b) Boispiel 1.

Formelschema

5¹

O (ORS)

-Ρ·0 I X

VY

9 cor)

Cl

Dmtr = Dimethoxytrityl

X = Arensulfonyl Y z.B. = Acyl R z.B. = Tetrahydropyranyl

DmtrO

HX

FORM E L1

NQ₂

N-

-N

N-SO

0=P-0(5')-R 00 0

CH.

f Cf-

FO RM E". 2

CH₃ CH₃

NO-

FORMJLUL

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden, von Desoxy- und Ribonukleotiden nach der Phosphotriestermethode, dadurch gekennzeichnet, daß Chloride oder Azolide, wie z.B. TetrazoI, 1-Hydroxybenzo-1,2,3-triazol und deren Substitutionsprodukte, die abgeleitet sind von 2,3,5,6-Tetramethylbenzensulfonsäure (Durensulfosäure) als Kondensationsmittel für die Herstellung der internucleotidischen Phosphatbindung verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den genannten Zweck Durensulfo-1-oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol zur Anwendung gelangt.

Hierzu 2 Seiten Formeln

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Desoxyribo- und Ribonucleotlden nach der Phosphotriestermethode, wobei der Kondensationsschritt zur internucleotidischen Phosphatbindung mittels neuartiger spezifischer Reagenzien vorgenommen wird.

Charakteristik der bisher bekannten technischen Lösungen

Für den Aufbau von Desoxyribo- oder Ribonucleotiden ist die Phosphotriestermethode ein bewährtes Arbeitsprinzip, bei welchem die 3'-OH-Gruppe eines geschützten Nucleosides in tun voll maskiertes 3'-Phosphotriester-Derivat überführt und nach Freilegung sowie Aktivierung einer Phosphat-OH-Gruppe desselben die internucleotidische Bindung mit der 5'-OH-Gruppe eines zweiten Nucleosidbaustei.ies hergestellt wird (Prinzip Formel 1).

Für die Aktivierung der Phosphatkomponente (X in Formel 1) und ihrer Kondensation mit der 5'-OH-freien Nucleosidkomponente wurden bisher bevorzugt Mesitylensulfochlorid (MS) oder 2,4,6-Triisopropylbenzensulfochlorid (TPS) in Gegenwart substituierter Imidazole wie z. B. 1 -Methylimidazol als Katalysator verwendet. Alternativ dazu haben sich auch die 1,2,4,-Triazolide,Tetrazolide, 1-Hydroxy-benzo-1,2,3-triazolidesowie3-Nitro-1,2,4-triazolide der genannten Sulfonsäuren bewährt (Prinzip Formel 2). Die dabai gebildeten reaktionsfähigen Intermediate vom Mischanhydrid-Typ reagieren anschließend entweder unmittelbar mit der 5'-OH-Kcmponente zum Nucleotid weiter oder disproportionieren sich zunächst zu Pyrophosphaten, die dann ihrorseits die internucleotidische Bindung ausbilden. Wesentliche Voraussetzung bei dieser Aktivierungsmethode ist es, daß Sulfensäurederivate hochalkylierterArene zur Anwendung gelangen, wodurch eine Spaltung der P-O, nicht aber der S-O-Bindung des M;sch a η hydrides gewährleistet ist und somit Nebenreaktionen an der 5'-OH-Komponente vermieden werden.

Die beiden dem genannten Aktivierungsprinzip zugrunde liegenden, bisher verwendeten Arensulfonsäuren besitzen nun aber den Nachteil, daß sie entweder relativ kostspielig in der Herstellung sind oder den genannten Anforderungen noch nicht optimal Rechnung tragen. Es ist deshalb erwünscht, nach anderen, für den Kondensationsschritt in der Nucleotidsynthese geeigneten Arensulfonsäurederivaten zu suchen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, die internucleotidische Phosphatbindung bei Oligonucleotidsynthesen nach der Triestermethoda durch neue, verbesnerte Kondensationsreagenzien in hoher Ausbeute und frei von Nebenprodukten herzustellen.

Darlegung de« Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, neue, leicht zugängliche Reagenzien vom Arensulfbnsäuretyp zu entwickeln, die es ermöglichen, den Kondensationsschritt bei Oligonucleotidsynthesen nach der Triestermethode in hoher Ausbeute und unter Bildung einheitlicher Endprodukte herzustellen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabenstellung dadurch gelöst, daß aktivierte Derivate der Durensulfonsäure (2,3,5,6-Tetramethyl-benzen-1 -sulfonsäure) zur Anwendung gelangen. Duren als Ausgangsstoff ist ein wohlfeiles Produkt der Steinkohlenteerverarbeitung und läßt sich mit einfachsten Mittein in die Sulfonsäure überführen. Ein besonderer Vorteil dieses Alkyl-arensulfonsäuretypes besteht auch darin, daß durch die Elektronendonatorwirkung und starke sterische Abschirmung der vier Methylgruppen gemäß Formel 2 das aktivierte Intermediat ausschließlich und rasch im gewünschten Sinne reagiert und keinerlei Nebenprodukte an der 5'-OH-Komponente gebildet werden. Auf diose Weise gelingt es, die intornucleotidische Phospha'bindung sehr spezifisch und in hoher Ausboute aufzubauen. Durensulfonsäure läßt sich entsprechend den bekannten Arbeitsweisen sowohl eis Chlorid in Gegenwart von 1-Methylimidazol als Katalysator wie auch in Form eines der gebräuchlichen Azolide mit sehr guten Ergebnissen für die Synthese von Desoxyribo· wie auch Ribonucleotiden einsetzen.