CN103298823A - 一种使用n-硫代化合物用于寡核苷酸合成的新方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用一种具有通式(I)的硫化剂，该硫化剂用于硫化该寡核苷酸的前体的至少一个磷核苷酸间连键，其中R是通过一个环形碳原子结合到该S原子上的一个芳基基团或杂芳基基团；并且R1和R2独立地是有机残基，优选是一个C1．C20烃残基。该方法可以进一步包括将该寡核苷酸进行纯化。同样包括的是一种用于合成该硫化剂的方法。

Description

一种使用N-硫代化合物用于寡核苷酸合成的新方法
技术领域
本发明要求于2010年6月30日提交的美国临时专利申请号N°61/360324的优先权，该专利申请涉及通过使用新颖的硫化剂制备寡核苷酸，出于所有的目的将其全部内容通过引用而结合。 
背景技术
寡核苷酸属于生物制药的一个类别，其具有用于治疗不同疾病的大的潜能，这些疾病列举几个包括癌症、病毒感染、以及炎性疾病。推进作为治疗剂的寡核苷酸的一个重要方法涉及对寡聚体骨架的改性，以便提供在其他事物之间的代谢耐受性、化学稳定性，并且以便改进体内到作用点的输送。改性的骨架化学物质的实例包括:肽核酸(PNA)(参见，Nielsen(尼尔森)，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]，208:3-26，2002)、锁核酸(LNA)(参见，Petersen(彼得森)&Wengel(文格尔)，Trends Biotechnol.[生物技术动向]，21(2):74-81，2003)、硫代磷酸酯(参见，Eckstein(艾克斯坦)，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.[反义核酸药物开发]，10(2):117-21，2000)、甲基膦酸酯(参见，Thiviyanathan(特维亚纳桑)等人，Biochemistry[生物化学]，41(3):827-38，2002)、氨基磷酸酯(参见，Gryaznov(格里亚兹诺夫)，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]，1489(1)；131-40，1999;Pruzan(布鲁赞)等人，Nucleic AcidS Res.[核酸研究]，30(2):559-68，2002)、三亚乙基硫代磷酰胺(参见，GryaznoV(格里亚兹诺夫)等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids[核苷、核苷酸和核酸]，20(4-7):401-10，2001;Herbert(赫伯特)等人，Oncogene[癌基因]，21(4):638-42，2002)。 
与大量选择用于将未取代的硫原子引入到磷酯中有用的试剂相比，允许对具有受保护的硫的H-膦酸酯的酯类进行硫化的基团的范围是有限的(例如，Dreef(瑞弗)等人的，Synlett[合成有机化学快报1，481-483，1990，U56，506。894)。实际上，在寡核苷酸的溶液合成过程中，在该反应中仅仅已经广泛地使用了氰基乙基硫基团，其中在各个步骤使用色谱纯化。本申请人名下的专利申请PCT/EP2009/067902披露了新颖的硫化试剂、其制造方法，以及其在经由H-膦酸酯方法在溶液中经济和方便的合成和纯化 硫代磷酯酸寡核苷酸中的用途，将该专利申请的内容通过通过引用结合到本专利申请中。溶液合成寡核苷酸的关键问题涉及在各个合成步骤以优异特异性获得高底物转化的必要性，给出了处于有助于简单纯化的形式高纯度产物，特别地避免了色谱法。假设缺乏允许经济的溶液相合成的方法，该溶液相技术似乎目前没有被用于商业规模的寡核苷酸合成。 
本发明现在做出了一种可获得的用于通过使用新颖的硫化试剂合成寡核苷酸的新方法，该方法允许值得注意地在溶液中来经济且有效地合成和纯化寡核苷酸。 
发明的披露内容 
本发明特别地涉及一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用具有通式(I)的硫化剂: 
Figure BDA00002785910000021
其中 
R是选自由通过一个环形碳原子而结合到S原子上的芳基基团和杂芳基基团组成的组。 
R1和R2独立地是有机残基，优选是C1-C20烃残基，任选是不饱和的或芳香族的; 
用于硫化所述寡核苷酸的一个前体的至少一个磷核苷酸间连键。 
本发明具有超过现有P-S键形成方法的多个优点，特别是在优选经由H-膦酸酯方法进行的寡核苷酸合成中。例如，用新颖的试剂转移例如到寡核苷酸上的残基R可以有助于寡核苷酸的结晶或沉淀，允许使用极小或不用色谱法来简单地纯化这些产物。在研发用于寡核苷酸合成的经济方法中一个重要的因素，尤其是在溶液也是在寡核苷酸链延伸的各个步骤中对转化产物的纯化。即使根据本发明的方法确保了产物的高产量和纯度，但各个延伸循环总体上包括三个步骤，并且有利的是除去了甚至是少量的杂质，这些杂质会以其他方式沿着该途径累积。因为大量的步骤，在各个步骤中使用色谱法可能在实际大规模的寡核苷酸合成中不会在经济上是可行的。 
在本发明的框架中，术语“寡核苷酸”具体表示含有连接到核碱基上的糖单元的一种核苷单体单元的低聚物，所述核苷单体单元通过核苷酸间的键相连接。一个"核苷酸间的键"具体是指在两个核苷部分之间的一个化学键，例如典型地在天然的核酸中存在的磷酸二酯键，或在合成的核酸以及核酸类似物中典型存在的其他键。这种核苷酸间的键可以，例如，包括一个磷酸(phospho)或亚磷酸酯基团，并且可以包括一些键，在这些键中磷酸或亚磷酸基团的一个或多个氧原子被一个取代基修饰、亦或被另一个原子(例如硫原子或者单或二烷基氨基中的氮原子)取代。典型的核苷酸间键是磷酸的二酯类或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯。 
术语“核苷”应理解为具体表示由连接到一个糖上的核碱基所构成的一种化合物。糖类包括但不限于呋喃糖环，如核糖、2'-脱氧核糖，以及非呋喃糖环，如环己烯基、脱水己糖醇、吗啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修饰、取代以及位置是参考呋喃糖而讨论的，但是相同的修饰和位置也适用于其他糖环的类似的位置。该糖可以被进一步修饰。作为糖的修饰的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2，-或3，-位置的修饰，特别是在一个呋喃糖环的2'-位置的修饰，包括例如氢;羟基;烷氧基，如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；叠氮基；氨基；烷氨基；氟、氯和溴；2'-4'-和3'-4'-连接的呋喃糖环修饰，在该呋喃糖环中的修饰包括例如针对环的4'-O被S、CH2、NR、CHF或CF2取代。 
术语“核碱基”应理解为具体表示能够与特别是一种互补的核碱基或核碱基类似物成对的含氮的杂环部分。典型的核碱基是天然存在的核碱基，包括嘌呤碱基中的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基中的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，以及修饰过的核碱基;包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮 鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、以及氟化的碱基。进一步被修饰的核碱基包括三环的嘧啶类，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G字夹型物例如一种被取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，41苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3'，2':4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。其他可能的合适碱基包括通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous bases)和尺寸扩大碱基(size-expanded bases)。 
"寡核苷酸"典型地是指一种具有从约2到约50个邻接亚基的核苷亚基聚合物。这些核苷亚基可以通过各种各样的亚基间键而进行拼接。此外"寡核苷酸"包括本领域内一个技术人员已知的对糖骨架(例如，氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯)、糖(例如，2'取代基，例如2'4、2'-OMe)、碱基、以及3'和5'端的修饰。典型地，在本发明中，寡核苷酸包括从2到30个核苷酸。优选地，它包括从3到30个核苷酸。在本发明的不同的实施方案中，该寡核苷酸包含选自以下项的核苷:核糖核苷、2'-脱氧核糖核苷类、2'-取代的核糖核苷、2'-4'-锁-核糖核苷、3'-氨基-核糖核苷、3'-氨基-2'-脱氧核糖核苷类。 
术语"芳基基团"旨在特别是指一种包括从6到24个碳原子、优选从6到12个碳原子的芳香族碳环体系。该芳基基团可以是未取代的或者是例如用芳基或杂芳基、烷基、环烷基、或官能团取代的。优选地，该芳基基团是在4位用烷基或卤素取代的。 
术语"杂芳基"旨在特别是指一种包括从5到24个原子、优选从5到12个原子的芳香族碳环体系，这些原子中的至少一个是一个杂原子。该杂原子通常选自B、N、O、Si、P和S。它更通常选自N、O和S。 
术语"烷基"旨在特别是指一种包括从1到20个碳原子、优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个碳原子的直链或支链的烷基取代基。此类取代基的特定实例是:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、2-己基、正庚基、正辛基、以及苄基。 
术语"环烷基基团"旨在特别是指一种包括含3到10个碳原子、优选5、6、或7个碳原子的至少一个饱和的碳环的取代基。此类取代基的特定实例是:环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。 
术语“官能团”旨在特别是指一个包括一个杂原子或由其组成的取代 基。该杂原子通常选自B、N、O、Al、Si、P、S、Sn、As以及Se和这些卤素。它更通常选自N、O、S以及卤素，特别是卤素。 
该官能团总体上包括1、2、3、4、5、或6个原子。 
通过官能团，可以例如提及:卤素羟基基团，烷氧基基团，巯基基团，氨基基团，硝基基团，羰基基团，酰基基团，任选酯化的羰基基团，甲酰胺基团，脲基团，氨基甲酸乙酯基团以及包含羰基基团、膦、膦酸酯或磷酸酯基团、亚砜基团、砜基团、以及磺酸酯基团的上述基团的硫醇衍生物。 
术语"有机残基"旨在特别是指可以包含多个杂原子的直链或支链的烷基或烯烃基团，这些杂原子例如特别是硼、硅、氮、氧、或硫原子、以及卤素原子、环烷基基团、杂环和芳香系。该有机残基可以包含双键或三键以及官能团。 
这些有机残基包括至少1个碳原子。它通常包括至少2个碳原子。它优选包括至少3个碳原子。更特别优选地，它包括至少5个碳原子。 
该有机残基总体上包括至多100个碳原子。它通常包括至多50个碳原子。它优选包括至多40个碳原子。更特别优选地，它包括至多30个碳原子。 
术语“烯烃基团”或“亚环烷基基团”旨在特别是指衍生自如以上定义的烷基或环烷基基团的二价原子团。 
当该有机残基包含一个或任选多个双键时，它通常选自包括从2到20个碳原子，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的链烯基或环烯基基团。此类基团的特定实例是:乙烯基、1-烯丙基、2-烯丙基、正丁-2-烯基、异丁烯基、1，3-丁二烯基、环戊烯基、环己烯基和苯乙烯基。 
当该有机残基包含一个或任选多个三键时，它通常选自包括从2到20个碳原子，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的炔基基团。此类基团的特定实例是:乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、正丁-2-炔基和2-苯基乙炔基。 
当该有机残基包含一个或任选多个芳香系时，它通常是一个包括从6到24个碳原子，优选从6到12个碳原子的芳基或烷芳基基团。此类基团的特定实例是:苯基、1-甲苯基、2-甲苯基、3-甲苯基、二甲苯基、1-萘基和2-萘基。 
术语“杂环”旨在特别是指一个包括由3、4、5、6、7、或8个原子构成的至少一个饱和的或不饱和的环的环体系，这些原子中的至少一个是一个杂原子。该杂原子通常选自B、N、O、Si、P和S。它更通常选自N、O和S。 
此类杂环的特定实例是:氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、吗啉、1，2，3，4-四氢喹林、1，2，3，4-四氢异喹啉、全氢化喹啉、全氢化异喹啉、异噁唑烷、吡唑琳、咪唑啉、噻唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡喃、四氢吡喃和二噁烷。 
如以上定义的这些有机残基可以是未取代的或用官能团取代的。应理解，在同等地应用之前，在此给出对这些官能团的相同定义。 
在根据本发明的方法的优选实施方案中，R是一个非取代的或者取代的苯基基团，优选地，R是卤代苯基或烷基苯基。R具体地是4-卤代苯基基团或者一个4-烷基苯基基团，一般是一个4-(C1-C4-烷基)苯基基团;R更优选是一个4-卤代烷基基团，并且尤其是一个4-氯苯基基团;并且R1和R2独立地是C1-C20，饱和的、不饱和的、杂环的或芳香族的烃残基。 
如以上提及，R1和R2可以是相同的或不同的。 
当R1是一个饱和的烃残基时，它优选是选自:直链的、支链的、或环状的烷基残基。R1可以例如独立地选自低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的饱和烃残基是选自:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基和环己基。优选是一个甲基、乙基、或正丙基基团。一个甲基基团是更特别优选的。当R1是一个芳香族残基时，它合适地选自具有从5到14个原子的芳香系。具体的芳香族残基是选自:苯基和萘基基团，这些苯基基团可以是例如被芳基或杂芳基、烷基、环烷基、杂环或杂取代基(例如卤素、胺类、醚类、羧酸根类、硝基、硫醇类、磺酸和砜类)所取代。同样地，这些萘基基团可以是例如被芳基或杂芳基、烷基、环烷基、杂环或杂取代基(例如卤素、胺类、醚类、羧酸根类、硝基、硫醇类、磺酸和砜类)所取代。如果R1是芳香族残基，那么优选是一个苯基基团。 
当R1是一个杂环残基时，它通常选自包含至少一个环形N、O、或S原子的杂环，这些杂原子通过一个环形碳原子而结合到N上。此类杂环残基的具体实例包括:吡啶和呋喃。 
当R2是一个饱和的烃残基时，它优选是选自:直链的、支链的、或 环状的烷基残基。R2可以例如独立地选自低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的饱和烃残基是选自:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基和环己基。优选是一个甲基、乙基、或正丙基基团。一个甲基基团是更特别优选的。当R2是一个芳香族残基时，它合适地选自具有从5到14个原子的芳香系。具体的芳香族残基是选自:苯基和萘基基团，这些苯基和萘基基团可以是例如被芳基或杂芳基、烷基、环烷基、杂环或杂取代基(例如卤素、胺类、醚类、羧酸根类、硝基、硫醇类、磺酸和砜类)所取代。如果R2是芳香族残基，那么优选是一个苯基基团。 
在一个优选的实施方案中，R1和R2是相同的，并且是指甲基。 
当R2是一个杂环残基时，它通常选自包含至少一个环形N、O、或S原子的杂环，这些杂原子通过一个环形碳原子而结合到磺酰基基团(S(0)2)上。此类杂环残基的具体实例包括:吡啶和呋喃。 
在一个具体的方法，R2对应于化学式(1I) 
Figure BDA00002785910000071
其中Rx和Ry是独立地选自烷基或(杂)芳基。优选地，Rx和/或Ry和或是烷基。在这种情况下，Rx和/或Ry可以例如选自低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的烷基是选自:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基和环己基。优选是一个甲基、乙基、或正丙基基团。在一个特别优选的方面，Rx和Ry都是烷基，特别如以上所述。一个N，N-二甲基或N，N-二乙基基团是更特别优选的。在这个实施方案的另一个方面，Rx和Ry一起形成了一个3到8元环，该环任选地包含选自O、N和S的一个额外的环形杂原子。具体的实例包括一个N-哌啶基或一个N-吡咯烷基基团。 
还应理解，提及的取代基可任选地例如被卤素或烷氧基取代基所取代，或者它们可以例如通过将多个链状杂原子，特别是氧包括在一个烷基链中而进行修饰。 
已经发现，根据本发明的硫化剂允许特别有效地将硫转移，特别地以形成具有化学式P-S-R的S-受保护的硫代核苷酸间连键，其中R是如以上在寡核苷酸中所述。根据本发明的硫化剂引入了一个受保护的硫，保护基团可以从这个硫原子选择性地并且有效地被切割。 
在根据本发明的方法中，硫化剂相对于待硫化的磷核苷酸间连键的量值的摩尔比总体上是至少1.0，通常是从1.0到4.0，更通常是从1.0到2.0，优选地从1.05到2.0。 
本发明的一个具体方面涉及一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用具有通式(I)的硫化剂的溶液: 
其中 
R是选自由通过一个环形碳原子而结合到S原子上的芳基基团和杂芳基基团组成的组。 
R1和R2独立地是有机残基，优选是C1-C20烃残基，任选是不饱和的或芳香族的; 
用于硫化所述寡核苷酸的一个前体的至少一个磷核苷酸间连键。 
上述针对在根据本发明的方法中使用的硫化剂的定义和优选项在该硫化剂是在溶液中时同等地应用。 
为了本发明的目的，术语"溶液"旨在是指其构成为一种或多种被称为溶质的物质(特别是硫化剂)溶解在被称为溶剂的另一物质中的一种均相混合物。 
为了本发明的目的，一种均相混合物是视觉上彼此无从区分的两种或更多种化合物的混合物。 
为了本发明的目的，"硫化剂的溶液"应理解为特别表示该硫化剂在一种选自有机溶剂("有机溶液")或其混合物的一种溶剂中的溶液。 
待使用的有机溶剂可以例如是选自含氮溶剂，例如酰胺溶剂，包括例如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO);N-杂环溶剂，包括例如吡啶;腈溶剂包括例如乙腈;芳香族烃型溶剂，例如苯、甲苯;卤代烃型溶剂，例如氯代烃溶剂，包括例如二氯甲烷(DCM)以及氯仿，酯类例如乙酸乙酯 (AcOEt)以及乙酸异丙酯(AcOiPr)以及醚类例如二乙基醚、二异丙基醚、二噁烷、四氢呋喃(THF)以及MTBE(甲基叔丁基醚)。优选地，该有机溶剂是选自:卤代烃溶剂、吡啶和乙腈。优选地，该硫化剂溶解在一种卤代烃溶剂中。更优选地，该有机溶剂是选自氯代烃型溶剂。使用二氯甲烷获得了良好的结果。 
已经令人惊讶地发现，该硫化剂可以有效地溶解在有机溶剂中，在此提供了一种浓度的有机溶液。因此，更低消耗的有机溶剂有利地使本发明的方法是更经济且环境更友好并且更安全的。 
在根据本发明的方法中，在该溶液中的硫化剂含量相对于硫化剂和有机溶剂的总重量总体上是等于或至少1%wt。在多个优选的实施方案中，该硫化剂含量相对于硫化剂和疏质子极性有机溶剂的总重量是等于或至少是1%wt。在一些实施方案中，在该溶液中的硫化剂含量相对于硫化剂和有机溶剂(它优选是一种疏质子极性有机溶剂)的总重量是大于1%wt。该硫化剂含量通常大于或等于20%wt。优选地，该硫化剂含量大于或等于40%wt。在该溶液中的硫化剂含量相对于硫化剂和有机溶剂(它优选是一种疏质子极性有机溶剂)的总重量总体上至多60%wt。在一个特定优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的硫化剂溶解在一种卤代烃溶剂中，特别是一种氯代烃溶剂，例如二氯甲烷中，并且在该卤代烃溶剂中的硫化剂含量是如在此以上所述。 
在根据本发明的方法中，该前体的磷核苷酸间连键是通过两个选自核苷酸和寡核苷酸的反应物之间的偶联反应形成的。涉及此种偶联反应的形成信息可以例如在专利申请PCT/EP2009/067902中发现，并且在以下实例中进行展示。 
本发明因此在另一个具体的方面涉及一种用于合成寡核苷酸的方法，包括以下步骤: 
(a)一个偶联步骤，其中在选自核苷酸和寡核苷酸的反应物之间形成了该前体的一个磷核苷酸间连键，并且 
(b)一个硫化步骤，其中如以上描述的具有化学式(I)的硫化剂被用于硫化所述磷核苷酸间连键。 
在此描述的本发明的一个最优选方面，该磷核苷酸间连键是一个H-磷酸二酯键。 
所述合成方法的步骤(a)优选包括通过将一种H-膦酸酯单酯盐与一 种具有游离羟基基团的保护的核苷或寡核苷酸进行偶联而形成H-磷酸二酯键。该偶联优选是在溶液相中进行的。 
步骤(a)优选是在一种疏质子有机溶剂中进行的，该疏质子有机溶剂例如是一种卤化的溶剂或者含氮溶剂，更特别地是N-杂环的溶剂或者氯代烃，甚至更特别是乙腈以及吡啶并且优选是吡啶。形成H-磷酸二酯的反应优选是通过一种羧酸卤化物(特别是新戊酰氯)而激活的。 
步骤(a)总体上是在从-40℃至30℃，优选地从0℃至20℃的温度下进行的。 
在根据本发明的方法的步骤(a)中以及它的具体实施方案中，该液体反应介质总体上含有相对于该反应介质的总重量按重量计至少10%的H-膦酸酯寡核苷酸。优选地，该含量是至少20%重量。该液体反应介质总体上包含相对于该反应介质的总重而言按重量计至多50%的H-膦酸酯寡核苷酸。 
步骤(a)的偶联产物，具体地是一种H-膦酸酯，在步骤(b)中被分离出并且随后被硫化。它还可以优选在无步骤(b)的分离的情况下就被使用。所形成的二酯的硫化可以通过原位添加硫化剂来进行，该硫化剂如以上所述合适地溶解在一种适当的溶剂中，或者在预纯化之后从该反应混合物中形成二酯。 
步骤(b)优选地是在一种疏质子极性有机溶剂中进行的，该疏质子极性溶剂例如像一种包括卤代烃溶剂(特别是一种氯代烃溶剂例如二氯甲烷)的溶剂。在一个具体的方面，步骤(b)是在一种溶剂混合物中进行的，该溶剂混合物包括一种卤代烃溶剂和含氮溶剂，更特别地是N-杂环的溶剂，优选吡啶。一种吡啶/二氯甲烷混合物是更特别优选的，特别是当步骤(a)的偶联产物在没有分离的情况下就进行硫化时。 
步骤(b)总体上是在从-40℃至30℃，优选地从0℃至20℃的温度下进行的。 
在步骤(b)中，硫化剂相对于待硫化的核苷酸间连键的量值的摩尔比总体上是至少1，通常是从1.5到4.0，优选从2.0到3.0。 
在一个实施方案中，在步骤(b)中，硫化剂相对于待硫化的磷核苷酸间连键的量值的摩尔比总体上是至少1，通常是从1.0到4.0，优选从1.0到2.0，非常优选是从1.05到2。 
在硫化剂与核苷酸间连键以及磷核苷酸间连键的量值的所述摩尔比 分别是处于从1.0到2.0的优选范围中的时，还可以获得非常令人满意的结果。 
在步骤(b)中，该中间体H-膦酸酯二酯优选是被一种活化剂激活的，特别是一种碱。合适的碱包括烷基胺，特别是叔烷基胺、二异丙基乙胺是优选的。本发明的一个第二具体目的涉及一种用于合成硫化剂的方法，如以上所述，该方法包括(a)使一种磺酰卤(优选磺酰氯)与一种具有化学式R-S-H(其中R是一种选自下组的芳香族基团，该组由以下各项组成:芳基、烷芳基、卤芳基、硝芳基、烷氧基芳基)的硫醇发生反应以便产生一种具有化学式R-S-W的中间产物，其中R是如以上所述并且W是卤素，优选Cl，并且(b)使所述中间产物与一种具有化学式R1-NH-S(O)2-R2的N-磺酰基化合物发生反应，其中R1和R2独立地是有机残基，优选是一种C1-C20烃残基，任选地不饱和的或芳香族的。 
如以上所述，该硫化剂可以在用于合成寡核苷酸的方法中使用。对于根据本发明的方法的以上所述定义和选项同等地适用于根据本发明的方法。具体地说，R优选是卤苯基，更优选地，是一个4-卤苯基，并且尤其是4-氯苯基。R1和R2优选是选自低级烷基或环烷基(C1-C7)、苯基(包括取代的苯基)和萘基基团，更优选是甲基基团。同样这些萘基基团也可以是取代的。这些苯基和萘基基团的优选的任选取代基是以上给出的。最优选地，R1、R2是甲基。 
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(a)的反应总体上是在一种疏质子有机溶剂中进行的，该疏质子有机溶剂例如像一种卤化的溶剂，特别是一种氯化的溶剂，例如四氯化碳。 
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(a)的反应总体上是在从-80℃到30℃的温度下进行的。 
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(b)的反应总体上是在一种疏质子极性有机溶剂中进行的，该疏质子有机溶剂例如像一种卤代烃溶剂，特别是一种氯代烃溶剂，例如二氯甲烷。 
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(b)的反应总体上是在从-20℃到50℃、优选从0℃到30℃的温度下进行的。 
在一个第三方面，本发明涉及一种用于纯化寡核苷酸的方法，该寡核苷酸是根据如以上所述的本发明的方法而获得的。在这个方面的一个实施方案中，该方法包括沉淀该寡核苷酸。在更具体的实施方案中，该方法进 一步包括提取寡核苷酸，特别是用一种溶剂从由该沉淀步骤中回收的固体材料中提取。用于提取的合适溶剂包括一种极性有机溶剂。 
已经发现，该纯化可以通过对根据所述方法获得的保护的寡核苷酸的沉淀和提取技术的一个组合来有效完成。沉淀的精确条件可以基于给定序列的量和寡核苷酸的长度来进行确定。沉淀方法总体上包括(a)将该寡核苷酸溶解在一种极性有机溶剂中，以及(b)添加一种非极性有机溶剂，直到该溶液变浑浊。 
已经发现，根据本发明的这些寡核苷酸可以总体上通过沉淀被分离出并且纯化。 
用于在步骤(a)中溶解该寡核苷酸的溶剂优选是选自卤代烃，例如二氯甲烷和氯仿，含氮溶剂，例如乙腈和吡啶，以及含羰基的溶剂，例如丙酮。 
总体上，在步骤(a)中，使用了一种范围从约0.5(n+1)mL到约2.0(n+1)mL、优选是约1.0(n+1)mL的溶剂体积，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。 
用一种非极性有机溶剂来处理该寡核苷酸溶液直到该溶液变浑浊，该非极性有机溶剂优选是选自:烃类，例如烷类溶剂，例如己烷，一种或多种醚溶剂，特别是MTBE和它们的混合物，例如优选是己烷/MTBE混合物。在另一个具体的实施方案中，随后用一种沉淀助剂来处理该浑浊溶液。 
在这种情况下，沉淀助剂总体上是选自惰性的多孔固体，这些多孔固体优选是选自硅藻土、炭、木质纤维素、以及色谱固定相，例如硅胶或氧化铝。硅藻土(Celite)还被称为硅藻土(diatomaceous earth)。 
在这种情况下，该沉淀助剂总体上使用的量值的范围是从约0.25(n+1)9到约1.5(n+1)g、优选是约0.75(n+1)g，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。 
优选地，在添加该沉淀助剂之后，用一种如之前所述的非极性有机溶剂的一个第二级分来处理该混合物。所述级分的体积总体上范围是从约1(n+1)mL到约4(n+1)mL、优选是约2.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。 
在沉淀之后，特别是当使用一种沉淀助剂时，所获得的混合物总体上经受到一种固/液分离操作，例如，优选是一种过滤。优选地，在该沉淀步骤中获得的这些固体材料被过滤掉并且洗涤。总体上从该固/液分离操 作中，特别是从沉淀助剂中，通过用使用一种溶剂，尤其是使用一种极性有机溶剂进行提取而回收的固体中回收了该寡核苷酸，该溶剂优选是选自碳基型溶剂，例如丙酮，选自含氮溶剂，例如乙腈或甲酰胺型溶剂，选自极性醚类，例如四氢呋喃，选自卤代烃，例如二氯甲烷和氯仿或一种脂肪醇。该极性有机溶剂优选是选自乙腈、四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、以及一种脂肪醇。 
从以上沉淀处理中获得的寡核苷酸可以通过在一种有机溶剂与水之间进行分区而进一步纯化。这个步骤通常从该产物中分离出了极性杂质，这些极性杂质溶解在水层中。在这个实施方案扎该寡核苷酸被合适地溶解在一种有机溶剂中，特别是一种极性有机溶剂中，该溶剂特别选自:乙腈、四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、以及一种脂肪醇。在这个实施方案中，该溶剂优选地包括极性溶剂与一种水介质的混合物，该有机溶剂优选是选自:乙腈、THF、DMF、以及一种脂肪醇。 
所使用的有机溶剂的体积总体上范围是从2.0(n+1)mL到8.0(n+1)mL、优选是约4.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。用一种水介质，特别是水来处理该溶液。所使用的水介质的体积总体上是从有机溶剂的约0.5体积当量到有机溶剂的约1.5体积当量，通常是有机溶剂的约0.7体积当量。在用水介质处理之后，一个含寡核苷酸层总体上被分离出，并且如果适当的话，可以进一步处理，以便获得纯化的寡核苷酸。 
总体上，可以通过肟化处理，在该硫代磷酸酯核苷酸间连键上进行保护的R基团的切割。醛肟的合适实例是例如选自E-2-硝基苯醛肟、E-4-硝基苯醛肟、以及syn-吡啶-2-羧基醛肟。所述切割总体上导致了磷酸二酯核苷酸间连键。 
因此，根据本发明的方法对于制造一种包括至少一个磷酸二酯核苷酸间连键的寡核苷酸是特别有用的。 
若任何引用结合在此的专利、专利申请以及公开物中的披露内容与本申请的描述相冲突的程度到了可能使术语不清楚，则本说明应该优先。 
以下实例旨在说明本发明而非限制其范围。 
实例 
在这些实例中，并且贯穿本说明书，使用的缩写定义如下: 
CH2Cl2是二氯甲烷；DIPEA是二异丙基乙胺；MTBE是甲基叔丁基醚；HCl是氢氯酸；Na2SO4是硫酸钠；N2是氮气；SO2Cl2是磺酰氯；NaHCO3是碳酸氢钠；CDCl3是氘化的氯仿；THF是四氢呋喃；DMSO是二甲亚砜；DMF是N,N-二甲基甲酰胺。 
Ap、Gp、Tp是如前所述，对应地连接到A、G、和T核碱基上的的2-脱氧核糖核碱基，其中A、G、以及T如以下进行保护： 
DMTr是本领域一个技术人员已知的双对-甲氧基三甲苯基保护基团，如前所述，当连接到其上时，该保护基团结合到的对应的寡核苷酸的5-O’上。Lev是本领域一个技术人员已知的戊醛1,4-二酮保护基团，如前所述，该保护基团结合到的对应的寡核苷酸的3-O’上。 
实例1：4-氯苯基-(N,N-甲基-甲磺酰基)-次磺酰胺的合成 
Figure BDA00002785910000141
(a)4-氯苯次磺酰氯2的制备 
将4-氯苯硫酚1（20.15g，0.139mol）在170mL的无水四氯化碳中的溶液置于一个0.5L3-颈圆底烧瓶中，该圆底烧瓶装备有一个磁性搅拌器、热电偶、添加漏斗、氮气管线、加热套、冷凝器以及碱洗气器以便吸收酸性气体（SO2和HCl）。将一种催化量值的吡啶（3mL）添加到该溶液中，将该烧瓶的内容物冷却到～10°C。将磺酰氯（55.2g，0.409mol）缓慢地添加到1的溶液中，并且将该反应混合物轻轻地回流3小时。将生成的红色溶液冷却到室温，通过玻璃棉快速过滤，并且通过旋转蒸发进行浓缩，以便产生23g的4-对氯苯磺酰氯，2，为一种粘性的红色油。将这种粗材料立即用于制备4。 
(b)4-氯苯基-(N,N-甲基-甲磺酰基)-次磺酰胺(4) 
将粗N-甲基-甲磺酰基胺3（16.6g，0.152mol）置于一个1L的一颈圆底烧瓶中，并且通过旋转蒸发与无水乙腈共同蒸发（1x150mL）。将残余物溶解在120mL的无水二氯甲烷中，并且将无水吡啶（14.5g，0.183mol）和12g的分子筛添加到这种溶液中。该烧瓶装备有一个热电偶、磁力搅拌器、氮气管线以及冷却冰浴。将该烧瓶的内容物搅拌10min，并且然后冷却到～0°C。 
将粗4-氯苯磺酰氯2在80mL的无水二氯甲烷中的溶液缓慢引入一个含有胺3的烧瓶中，由此维持温度在约0°C。在完成添加之后，移开该冷却浴，并且在环境温度下，将生成的云状无色混合物搅拌过夜。 
用冷的饱和碳酸氢钠溶液（0.4L）淬灭该反应并且用二氯甲烷（2x100mL）萃取，并且经无水硫酸钠干燥。在通过旋转蒸发进行浓缩后，获得了总计40g的暗色油。将这个油再溶解在一个极小量的二氯甲烷（～20mL）中，并且经由一个短（～2cm）硅胶垫过滤。用MTBE-己烷=1:1(～1L)的混合物洗涤该垫。在将这些滤液进行浓缩后，获得了一种灰白色半固体。将MTBE-己烷=1:2(～0.5L)的混合物添加到该残余物中，并且在冰上冷却生成的悬浮液。过滤沉淀、首先用MTBE和己烷（1:2；50mL）的冷混合物洗涤，并且然后用己烷（100mL）洗涤，接着干燥，直到获得恒重。获得了所希望的化合物4，为一种白色的结晶固体，产率为75%（24.24g）。 
1H NMR(CDCl3,δ):7.38(m,4H),3.32(s,3H),3.00(s,3H) 
13C NMR APT(CDCl3,δ):134.64(上),134.32(上),129.45(下),128.63(下),42.02(下),37.91(下)。 
实例2：使用不同的硫化剂制备DMTrO-Tp(s)T-Lev 
Figure BDA00002785910000151
将三乙铵5’-O-(4,4’-二甲氧三苯甲基)-胸苷-3’-H-膦酸酯（4.26g，6.0mmol）和3’-O-乙酰丙酰基胸苷（1.70g，5.0mmol）在60mL吡啶中的溶液蒸干。向该残余物中添加无水吡啶（12.5mL），并且将生成的溶液在氩气下，在0°C搅拌。经3分钟缓慢地添加新戊酰氯（1.24mL，10.0mmol）。进一步在0°C将该混合物搅拌5分钟。经2分钟，添加6mmol的硫化剂（对应的硫化剂和其使用量值在表1中示出）在无水二氯甲烷（DCM）或无水吡啶中的溶液，接着添加N,N-二异丙基乙胺（0.87mL，5.0mmol）。移开冷却浴并且将该混合物在环境温度下搅拌30分钟。用100mL的二 氯甲烷稀释该反应混合物，并且用冷水（100mL），接着用饱和碳酸氢钠（100mL）洗涤。将该有机层干燥（Na2SO4）并且浓缩。将该残余物溶解在10mL的二氯甲烷和0.1mL的三乙胺中，并且在搅拌下经15分钟缓慢添加溶液A（MTBE：己烷=2:1，16mL）接着添加硅藻土（7.5g）。搅拌该混合物并且经15分钟缓慢地添加额外的溶液A（16mL）。在进一步搅拌30分钟后，过滤该混合物。用CH2Cl2/溶液A，1:4v/v（50mL×2）的混合物洗涤该固体。然后用二氯甲烷（50mL×3）洗涤该固体。将该二氯甲烷滤液浓缩。将该残余物溶解在40mL乙腈中，并且在冰水浴中搅拌，然后经20分钟添加水（36mL）。分离出该底部有机层，并且在二氯甲烷（80mL）与饱和碳酸氢钠（30mL）和盐水（30mL）的混合物之间进行分区。干燥该有机层（Na2SO4），并且浓缩以便给出所希望的产物，为一种白色固体。31P NMR(CDCl3,121.5MHz):δ=23.3,23.2。结果被总结在表1中。 
表1： 
Figure BDA00002785910000161
实例3：5’-OH全保护的三聚物的完全脱保护，如以下方案中所示 
通过蒸发所添加的吡啶，而使全保护的三聚物1（7.09g，5.0mmol）变成无水。向残余物中，添加1,2,4-三唑（690.7mg，10.0mmol）、
Figure BDA00002785910000172
分子筛（2.0g）以及无水吡啶（25.0mL）。在N2下，将该混合物进行搅拌，并且冷却到0°C，并且添加叔丁基铵（2.19g，30.0mmol）。然后将所得混合物在室温下搅拌4小时。向该溶液中，添加syn-2-吡啶醛肟（2.44g，20.0mmol），接着添加1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯（6.09g，40.0mmol）。在室温下搅拌15小时之后，将该分子筛进行过滤，并且用吡啶（10.0mL）洗涤。浓缩该滤液。将残余物溶解在28%的氨水（25.0mL）中。将所得溶液在55°C加热15小时。在冷却下来后，将该混合物浓缩并且用反向C18色谱法纯化。将所得到的产物施加到一个
Figure BDA00002785910000173
IR-120（加上）离子交换树脂（钠形式）的柱（100g）上。用水洗脱该柱并且将希望的级分进行组合和冻干,以便给出希望的产物2。 

Claims (25)

1.一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用具有通式(I)的硫化剂：
Figure FDA00002785909900011
其中
R是选自由通过环形碳原子而结合到S原子上的芳基基团和杂芳基基团组成的组；
R1和R2独立地是有机残基，优选是C1．C20烃残基，任选是不饱和的或芳香族的；
用于硫化所述寡核苷酸的前体的至少一个磷核苷酸间连键。
2.根据权利要求1所述的方法，其中R是卤苯基或烷基苯基，优选是4．卤苯基，尤其优选是4．氯苯基。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中R1和R2选自低级烷基或环烷基(C1．C7)、苯基包括取代的苯基、和萘基基团，更优选是甲基基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将该硫化剂溶解在有机溶剂中，该有机溶剂优选是卤代烃溶剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中硫化剂与待硫化的磷核苷酸间连键的摩尔比是从1.0到2.0。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的前体包含选自以下项的核苷：核糖核苷类、2’．脱氧核糖核苷类、2’．取代的核糖核苷类、2’-4’-锁-核糖核苷类、3’-氨基-核糖核苷类、3’-氨基-2’-脱氧核糖核苷类。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该磷核苷酸间连键是H-膦酸酯二酯键。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该偶联是在溶液相中进行的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，该方法进一步包括将根据权利要求1至8中任一项获得的寡核苷酸进行纯化的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，该方法包括至少沉淀该寡核苷酸。
11.根据权利要求9或10所述的方法，进一步包括用溶剂提取该寡核苷酸。
12.根据权利要求10或11所述的方法，该方法包括将该寡核苷酸溶解在极性有机溶剂中，该极性有机溶剂优选选自二氯甲烷、氯仿、乙腈、丙酮和吡啶。
13.根据权利要求12所述的方法，其中使用范围从约0.5(n+1)mL到约2.0(n+1)mL、优选是约1.0(n+1)mL的溶剂体积，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中用非极性有机溶剂处理该寡核苷酸的溶液直到该溶液变浑浊，该非极性有机溶剂优选选自：烃类、醚溶剂以及它们的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用范围从约1(n+1)mL到约4(n+1)mL、优选是约2.0(n+1)mL的溶剂体积，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中用沉淀助剂来处理该浑浊溶液。
17.根据权利要求16所述的方法，其中该沉淀助剂选自惰性的多孔固体，这些多孔固体优选选自硅藻土、炭、木质纤维素、以及色谱固定相，例如硅胶或氧化铝。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中该沉淀助剂使用的量值的范围是从约0.25(n+1)g到约1.5(n+1)g、优选是约0.75(n+1)g，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
19.根据权利要求16所述的方法，其中在添加该沉淀助剂后，用第二级分的非极性有机溶剂处理该混合物，其中一般来说所述级分的体积范围从约1(n+1)mL到约4(n+1)mL，优选是约2.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
20.根据权利要求16到19中任一项所述的方法，其中将在该沉淀步骤中获得的这些固体材料过滤出来并且洗涤。
21.根据权利要求10到20中任一项所述的方法，其中用溶剂从该含寡核苷酸的沉淀中提取该寡核苷酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中该溶剂包括极性有机溶剂与水介质的混合物，该极性有机溶剂优选选自：乙腈、THF、DMF、和脂肪醇，该水介质优选是水，并且其中极性有机溶剂/水介质的体积比优选是从约0.5到约1.5，更优选是约0.7。
23.一种用于合成如在权利要求1到22中任一项中使用的硫化剂的方法，该方法包括(a)使磺酰卤，优选是磺酰氯，与具有化学式R-S-H的硫醇发生反应，其中R是选自下组的芳香族基团，该组由以下各项组成：芳基、烷芳基、卤芳基、硝芳基、烷氧基芳基，以便产生具有化学式R-S-W的中间产物，其中R是如以上所述，而W是卤素，优选Cl，以及(b)使所述中间产物与具有化学式R1-NH-S(O)2-R2的N-磺酰基化合物发生反应，其中R1和R2独立地是有机残基，优选是C1-C20烃残基，任选地不饱和的或芳香族的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中R是卤苯基，优选是4-卤苯基，更优选是4-氯苯基。
25.根据权利要求23和24中任一项所述的方法，其中R1和R2选自低级烷基或环烷基(C1-C7)、苯基包括取代的苯基、和萘基基团，更优选是甲基基团。
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