CN102307889A - 硫化剂及其用于寡核苷酸合成的用途 - Google Patents

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Abstract

一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合化学式(I)，其中A是成对取代的亚烷基基团，优选CH2，X和Y独立地选自S和O，并且R0是选自下组，该组由以下各项组成：任选地取代的、碳键合的有机残基，例如特别是任选地取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和/或Ry是选自H以及有机残基并且至少Rx是一个非H的取代基。本发明的另一个目的是可用于寡核苷酸制造的硫化剂及其制造。

Description

硫化剂及其用于寡核苷酸合成的用途
本申请要求2008年12月23日提交的美国申请号61/140391的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及硫代磷酸酯寡核苷酸、其使用新硫化剂的制备、所述硫化剂及其制备。
背景技术
寡核苷酸属于一类生物药剂，具有非常大的治疗不同疾病的潜力，这些疾病列举几个包括：癌症、病毒感染、以及炎性疾病。推动寡核苷酸作为疗法的一个重要途径涉及对该寡聚物主链的修饰以提供除其他之外的代谢抗性、化学稳定性并且以改进至作用部位的体内运输。修饰的主链化学物的例子包括：肽核酸类(PNA)(参见Nielsen，Methods Mol.Biol.，208：3-26，2002)，锁核酸类(LNA)(参见Petersen & Wengel，TrendsBiotechnol.，21(2)：74-81，2003)，硫代磷酸酯类(参见Eckstein，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.，10(2)：117-21，2000)，甲基膦酸酯类(参见Thiviyanathan等人，Biochemistry，41(3)：827-38，2002)，氨基磷酸酯类(参见Gryaznov，Biochem.Biophys.Acta，1489(1)：131-40，1999；Pruzan等人，Nucleic Acids Res.，30(2)：559-68，2002)，硫代氨基磷酸酯类(参见Gryaznov等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids，20(4-7)：401-10，2001；Herbert等人，Oncogene，21(4)：638-42，2002)。硫代磷酸酯的形成属于最有用的修饰，因为用P＝S部分取代P＝O使得寡核苷酸耐受核酸裂解降解而同时在大多数情况下保持了天然寡聚物的生物特性。
硫代磷酸酯可以通过氧化硫化作用而形成(Oligonucleotide synthesis，methods and applications，P.Herdewij n Methods in Molecular Biology，volume 288，Chapter 4，51-63)。主要存在两种制造硫代磷酸酯的方法，取决于对于这个反应所使用的磷酯(phosphorous esters)的性质以及所预期的产物。其中之一涉及将未取代的硫原子引入到磷中，例如通过元素硫、二苯酰基四硫化物、3-H-1，2-苯并二硫-3-酮-1，1-二氧化物(还称为Beaucage试剂，(Iyer等人，J.Org.Chem.55，4693-4699(1990))，二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、二硫化二甲基秋兰姆(DTD)、苯乙炔二硫化物(PADS)以及双(O，O-二异丙氧基硫膦基)二硫化物(称为Stec’s试剂)。这些反应主要用于通过亚磷酰胺法在固体载体上的寡核苷酸的自动合成中并且包括在寡聚物的延长反应过程中所形成的磷三酯的氧化硫化作用。
制造寡聚硫代磷酸酯的第二种方法是与H-膦酸酯法一起使用的并且涉及H-膦酸酯二酯与硫转移试剂之间的反应，其中带有脂肪族或芳香族取代基的硫原子被转移到磷上。在硫上的辅助取代基在该合成操作中起到了保护基团的作用并且通常在寡核苷酸制备的最后阶段被切除。这种方法特别适合于在溶液中合成寡核苷酸。
相比对于将未取代的硫原子引入到磷酯中可得的试剂的大量选择，允许H-膦酸酯与受保护的硫进行硫化作用的基团的范围是有限的(例如，Dreef等人，Synlett，481-483，1990，US 6,506,894)。在实施中，仅氰基乙基硫化物基团在寡核苷酸的溶液合成过程中被广泛地用在这种反应中，其中在每一步骤都进行色谱纯化。寡核苷酸溶液合成的一个关键问题涉及在每个合成步骤中获得高的底物转化率与优异特异性的必要性从而给出高纯度的、处于有助于简单纯化之形式的产品，特别是避免了色谱法。鉴于缺少用于允许经济的溶液相合成的方法，这种溶液相技术目前似乎并未被用于商业规模的寡核苷酸合成。
现在本发明披露了新的硫化剂，用于制造它们的方法以及它们在硫代磷酸酯寡核苷酸的经济并且合适的合成以及纯化中(特别是在溶液中)的用途。
发明内容
本发明具体地涉及在所附的权利要求中所描述的发明。本发明还涉及在本发明的说明书、特别是在实施例中实质性描述的方法以及试剂。
本发明具有许多超过P-S连键(linkage)形成的现有方法的优点，特别是在所进行的寡核苷酸的合成中，优选地通过H-膦酸酯法。例如，使用这种新试剂转移到例如寡核苷酸上的残基R可以有助于寡核苷酸的结晶或沉淀，从而允许使用最小量的或不使用色谱法而简单地纯化这些产品。已经发现使用这种方法制造的、具有从两个到至少十六个核苷酸单元的寡核苷酸直到对所要求的寡核苷酸进行最终脱保护之后才有必要通过色谱法进行纯化。中间体寡聚物可以足够纯地获得以用于任选地在5’-和3’-位置上的脱保护作用以及(若希望的话)这些粗制脱保护材料与更高级的寡核苷酸的连接。在另一个优点中，所披露的方法提供了使用多种硫化剂的途径，这些硫化剂在使简单的、无色谱法的纯化的效率最大化的方面可以被用来修饰所形成的寡核苷酸的特性。根据本发明方法的又一个优点在于：例如硫保护的酰氧基亚甲基RC(O)-OCH2的简单切除可以在温和的条件下，例如使用伯胺或仲胺或受阻胺(例如正丙胺或叔丁胺)容易地完成。当使用胺任选地处理时，发生了自发切除，包括硫-亚甲基键，由此允许P＝S键的干净的形成。这些切除产物可以很容易地通过溶剂或水的洗涤而去除。例如酰氧基亚甲基基团的稳定性特征(例如在碱性的非亲核条件下)允许沿着合成路径的选择性脱保护反应并且由此允许合成方案的更大的灵活性，例如通过阻止核碱基保护基团的切除。
开发一种用于合成寡核苷酸(尤其是在溶液中)的经济方法的重要因素是在寡核苷酸链延长过程的每个步骤的转化产物的纯度。尽管根据本发明的方法确保了高的产物产率以及纯度，每个延长周期总体上包括三个步骤并且有利的是除去即使少量的杂质，否则这些杂质将会沿着路径而累积。由于有众多的步骤，因此在每个步骤中使用色谱法在实际的大规模寡核苷酸合成中可能不是经济上可行的。因此，我们还披露了用于纯化链延长过程中所形成的寡核苷酸的无色谱法的方法。
本发明的一个第一具体目的是提供寡核苷酸，这些寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)
其中A是成对取代的(geminally substituted)亚烷基基团，优选CH2，X和Y独立地选自S和O，并且R0是选自下组，该组由以下各项组成：任选取代的、碳键合的有机残基，例如特别是任选取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和Ry是选自H以及有机残基并且至少Rx是非H取代基。
已经发现，根据本发明的寡核苷酸是用于合成P-硫化的寡核苷酸的有价值的合成中间体，这些中间体关于它们的溶解度特征具有有利的特性由此允许有效的纯化，该纯化可以例如通过沉淀与萃取技术的组合来有效地完成。根据本发明的寡核苷酸还被认为可有效地用作药物前体，通过在人体或动物体内切割R-基团能够在体内释放硫代磷酸酯寡核苷酸。
在本发明的框架中，术语“寡核苷酸”具体表示含有连接至核碱基之糖单元的核苷单体单元的寡聚物，所述核苷单体单元通过核苷酸间连键相连接。“核苷酸间连键”具体是指在两个核苷部分之间的化学连接，例如典型地在天然核酸中存在的磷酸二酯连接，或在合成核酸以及核酸类似物中典型存在的其他连接。这种核苷酸间连键可以，例如，包括磷酸(phospho)或亚磷酸酯基团，并且可以包括一些连接，在这些连接中磷酸或亚磷酸基团的一个或多个氧原子或被取代基修饰、或被另一种原子取代，例如硫原子或者单或二烷基氨基中的氮原子。典型的核苷酸间连键是磷酸的二酯类或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯。
术语“核苷”应理解为具体表示由连接到糖上的核碱基构成的化合物。糖类包括但不限于呋喃糖环，如核糖、2’-脱氧核糖，以及非呋喃糖环，如环己烯基、脱水己糖醇、吗啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修饰、取代以及位置是参考呋喃糖而讨论的，但是相同的修饰和位置也适用于其他糖环的类似位置。该糖可以被进一步修饰。作为糖修饰的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2’-或3’-位置的修饰，特别是在呋喃糖环的2’-位的修饰，包括例如氢；羟基；烷氧基，如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；叠氮基；氨基；烷氨基；氟、氯和溴；2’-4’-和3’-4’-连接的呋喃糖环修饰，在该呋喃糖环中的修饰包括例如针对环的4’-O被S、CH2、NR、CHF或CF2取代。
术语“核碱基”应理解为具体表示能够与核碱基或核碱基类似物配对(特别是互补)的含氮杂环部分。典型的核碱基是天然存在的核碱基，包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，以及修饰的核碱基；包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、以及氟化的碱基。进一步被修饰的核碱基包括三环嘧啶类，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G字夹型物例如取代的吩噁嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3’，2’：4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。其他可能的合适碱基包括通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous bases)和尺寸扩大碱基(size-expanded bases).
“寡核苷酸”典型地是指具有约2至约50个邻近子单元的核苷子单元聚合物。这些核苷子单元可以通过多个子单元间的连键而连接。此外，“寡核苷酸”包括本领域普通技术人员已知的对于糖主链(例如氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯)、糖(例如2’取代物，如2’-F、2’-OMe)、碱基、以及3’和5’末端的修饰。典型地，在本发明中，这种寡核苷酸包括2至30个核苷酸。在本发明的不同实施方案中，该寡核苷酸包括选自以下各项的核苷：核糖核苷、2’-脱氧核糖核苷、2’-取代的核糖核苷、’-4’-锁-核糖核苷、3’-氨基-核糖核苷、3’-氨基-2’-脱氧核糖核苷。
在本发明的一些寡核苷酸中，R选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基碳酸酯(methylene carbonate)基团以及亚甲基氨基甲酸酯基团。
当R是亚甲基酰氧基基团时，它优选地符合化学式-CH2-O-C(O)-R0，其中R0是C1-C20的、饱和的、不饱和的、杂环的或芳香族的烃残基。当R0是饱和的烃残基时，它优先选自直链的、支链的或环状的烷基残基。R0可以选自例如低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的饱和烃残基是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基以及环己基。甲基、乙基、或正丙基基团是优选的。乙基基团是更特别优选的。当R0是芳香族残基时，它适当的是选自具有从6至14个碳原子的芳香族体系。特别优选的芳香族残基选自苯基以及萘基基团，这些基团可以是取代的，例如，用芳基或杂芳基、烷基、环烷基、杂环或杂取代基例如卤素、胺、醚、羧酸酯、硝基、硫醇、磺酸以及砜取代的。苯基是优选的。当R0是杂环残基时，它经常是选自包含至少一个环N、O或S原子的杂环，该杂环通过环碳原子键合到羰基上。此种杂环残基的具体例子包括吡啶以及呋喃。
在一个具体方面，该寡核苷酸包括至少两个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少三个核苷酸，其中R是如本文所述的亚甲基酰氧基基团。
当R是亚甲基氨基甲酸酯基团时，它优选地符合化学式-CH2-O-C(O)-NRxRy，其中Rx和Ry独立地选自烷基或(杂)芳基。优选地，Rx和/或Ry是烷基基团。在这种情况下，Rx和/或Ry可以选自例如低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的烷基基团是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基以及环己基。甲基、乙基、或正丙基基团是优选的。在一个特别优选的方面，在亚甲基氨基甲酸酯基团中的Rx和Ry均是烷基基团，特别是如之前在本文中所述的。N，N-二甲基或N，N-二乙基基团是更特别优选的。在这个实施方案的另一个方面，Rx和Ry一起形成3至8元环，任选地包含选自O、N和S的附加的环杂原子。具体的例子包括N-哌啶基或N-吡咯烷基基团。
当R是亚甲基碳酸酯基团时，它优选地符合化学式-CH2-O-C(O)ORx，其中Rx任选地选自取代的烷基、环烷基以及(杂)芳基基团。优选地，Rx是烷基基团。在这种情况下，Rx可以选自例如低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的烷基基团选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基以及环己基。甲基、乙基、或正丙基基团是优选的。乙基基团是更特别优选的。当Rx是芳基基团时，它适当的是选自具有从6至14个碳原子的芳香族体系。具体的芳香族残基是选自苯基以及萘基基团。苯基是优选的。当Rx是杂环的残基时，它经常选自包含至少一个环N、O或S原子的杂环，该杂环通过环碳原子键合到氧基羰基上。此类杂环残基的具体例子包括吡啶以及呋喃。
应理解的是，之前本文中对于当R是选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基碳酸酯基团以及亚甲基氨基甲酸酯基团的情况而给出的取代基Rx、Ry和R0的定义以及优选项同样适用于对应的硫代类似物，其中化学式(I)中的X和/或Y是硫。还应理解的是，以上提及的取代基可以是任选地取代的，例如用卤素或烷氧基取代基取代的，或它们可以被修饰，例如通过在烷基链中包含链状杂原子(特别是氧)而被修饰。
本发明的一个第二具体目的涉及一种具有化学式R”-S-R的硫化剂，其中R是如之前结合本发明寡核苷酸时在本文中定义的，并且R”是离去基团。
已经发现，根据本发明的硫化剂允许特别有效的硫转移，特别是在寡核苷酸中形成S-保护的硫代磷酸酯核苷酸间连键。根据本发明的硫化剂引入了受保护的硫，保护基团可以从该硫上被选择性地并且有效地切除。
在根据本发明的硫化剂中，该离去基团R”总体上是亲电基团(electrophilic group)。经常，R”是包含键合到硫上的亲电氮原子的基团。这种亲电氮原子适当的是用至少一个吸电子基团取代的。
在本发明硫化剂的一个具体实施方案中，该硫化剂符合化学式(II)
Figure BPA00001407137100071
其中RA和RB是彼此相同或不同的并且RA和RB中至少一个是选自取代的磺酰基或酰基基团，所述RA和RB任选地一起形成环状取代基。
当RA和RB中至少一个(优选一个)是取代磺酰基时，它总体上是选自烷基以及芳基磺酰基基团。当优选地，RA和RB中至少一个是烷基磺酰基基团时，其中的烷基取代基优先选自低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的烷基基团是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基以及环己基。甲基、乙基、或丙基基团是优选的。甲基基团是更特别优选的。当RA和RB中至少一个是芳基磺酰基基团时，其中的芳基取代基是例如任选地取代的苯基基团。当RA和RB中至少一个是(优选两个都是)酰基时，它总体上是选自烷基以及芳基酰基基团。当优选地，RA和RB中至少一个是烷基酰基基团时，其中的烷基取代基优先选自低级烷基或环烷基(C1-C7)残基。具体的烷基基团是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、环戊基以及环己基。甲基、乙基、或丙基基团是优选的。甲基基团是更特别优选的。在一个特别优选的实施方案中，RA和RB是一起形成了环状取代基(优选4至7元环)的酰基基团。
在一个具体实施方案中，该硫化剂符合以下化学式(III)
Figure BPA00001407137100072
其中R1、R3和R4独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，优选直链的或支链的烷基或环烷基。
在根据本发明的硫化剂的另一个具体实施方案中，R”是二羧基酰胺。在这个实施方案的一个特定的方面，该硫化剂符合以下化学式(IV)
Figure BPA00001407137100081
其中Z是选自下组的基团，该组为：-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH2-O-CH2-、
Figure BPA00001407137100082
优选地Z是基团。
本发明的一个第三具体目的涉及一种用于合成根据本发明的硫化剂的方法，该方法包括：(a)将磺酰卤素，优选磺酰氯，与具有化学式R-S-C(O)-R2的硫缩醛进行反应，其中R是如以上所描述的并且R2是有机残基，该残基优先选自C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，以产生具有化学式R-S-W的中间产物，其中W是卤素，优选Cl；并且(b)将所述中间产物与N-磺酰化合物或N-酰基化合物进行反应。在本发明的一个更具体的实施方案中，该硫缩醛具有化学式R1-C(O)-O-CH2-S-C(O)-R2，其中R1和R2独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，并且使所述硫缩醛与磺酰氯进行反应以产生具有化学式R1-C(O)-O-CH2-S-Cl的中间产物，其中R1独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。在本发明的另一个具体实施方案中，在步骤(b)中使该中间体与具有化学式R3-S(O)2-NH-R4的N-磺酰基化合物进行反应，其中R3和R4独立地是有机残基，优选C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(a)的反应总体上在疏质子的(aprotic)极性有机溶剂中例如像卤代烃溶剂(特别是氯代烃溶剂，如二氯甲烷)中进行。
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(a)的反应总体上在从-80℃至30℃的温度下进行。
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(b)的反应总体上在疏质子的极性有机溶剂中例如像卤代烃溶剂(特别是氯代烃溶剂，如二氯甲烷)中进行。
在根据本发明的用于合成硫化剂的方法中，步骤(b)的反应总体上在从-20℃至50℃，优选地从0℃至30℃的温度下进行。
本发明的一个第四具体目的涉及一种使用根据本发明的硫化剂制造寡核苷酸的方法。
总体上，根据本发明的方法包括至少(a)连接步骤，其中在选自核苷酸和寡核苷酸的两种反应物之间形成了磷核苷酸间连键，以及(b)硫化作用步骤，其中根据本发明的硫化剂被用来硫化所述磷核苷酸间连键。步骤(a)和(b)可以在该硫化的寡核苷酸的3’或5’位的脱保护之后重复。
所述制造方法的步骤(a)优选地包括通过将H-膦酸酯单酯盐与受保护的核苷或具有游离羟基的寡核苷酸连接而形成该H-膦酸酯二酯键。该连接优选地在溶液相中进行。
步骤(a)优选地在疏质子极性有机溶剂中进行，例如卤化溶剂(halogenated solvent)或含氮溶剂，更特别的是N-杂环溶剂或氯代烃，甚至更特别是乙腈以及吡啶并且优选吡啶。形成H-膦酸酯二酯的反应优选地通过酰卤特别是新戊酰氯进行活化。
步骤(a)总体上在从-40℃至30℃，优选地从0℃至20℃的温度下进行的。
在根据本发明方法的步骤(a)中以及在它的一些具体实施方案中，该液体反应介质总体上含有相对于该反应介质的总重量按重量计至少20％的H-膦酸酯二酯寡核苷酸。优选地，该含量是至少20％重量。该液体反应介质总体上包含相对于该反应介质的总重量按重量计最多50％的H-膦酸酯二酯寡核苷酸。
步骤(a)的连接产物，特别是H-膦酸酯，可以将其进行分离并且随后在步骤(b)进行硫化。它优选地还可以无需分离而在步骤(b)中使用。所形成二酯的硫化作用可以通过硫化剂(适当的是溶解在合适溶剂中)的原位加成或者在将所形成二酯从反应混合物中预纯化之后而进行。
步骤(b)优选地在疏质子的极性有机溶剂中例如像包含卤代烃溶剂(特别是氯代烃溶剂，例如二氯甲烷)的溶剂中进行。在一个具体的方面，步骤(b)是在包含卤化烃溶剂以及含氮溶剂(更具体的是N-杂环溶剂，优选吡啶)的溶剂混合物中进行。吡啶/二氯甲烷混合物是更特别优选的，特别是当步骤(a)的连接产物在不进行分离而被硫化时。
步骤(b)总体上在从-40℃至30℃，优选地从0℃至20℃的温度下进行。
在步骤(b)中，硫化剂相对于该核苷酸间连键的量的摩尔比总体上是至少1，经常是从1.5至4.0，优选地从2.0至3.0。
在步骤(b)中，该中间体H-膦酸酯二酯优选是通过活化剂，特别是碱进行活化的。合适的碱包括烷基胺类，特别是叔烷基胺类，二异丙基乙胺是优选的。
在一个第五方面，本发明涉及一种用于纯化根据本发明的、具有至少一个如之前在本文中描述的P-S-R连键的寡核苷酸的方法。在这个方面的一个实施方案中，该方法至少包括沉淀该第二寡核苷酸。在更具体的实施方案中，这种方法进一步包括使用溶剂萃取该第二寡核苷酸(特别是从沉淀步骤所回收的固体材料中)。用于萃取的合适溶剂包括极性有机溶剂。
已经发现，该纯化可以通过将根据所描述的方法获得的受保护的寡核苷酸进行沉淀以及萃取的技术相组合而有效地完成。沉淀的萃取条件可以在考虑到给定寡核苷酸的序列以及长度时来确定。该沉淀方法总体上包括(a)将该寡核苷酸溶解在极性有机溶剂中并且(b)加入非极性有机溶剂直至溶液变浑浊。
已经发现，根据本发明的寡核苷酸总体上可以通过沉淀进行分离并且纯化。
在步骤(a)中用来溶解该寡核苷酸的溶剂优先选自卤代烃类，例如二氯甲烷以及氯仿；含氮溶剂类，例如乙腈以及吡啶；以及含羰基溶剂类，例如丙酮。
总体上，在步骤(a)中，所使用的溶剂体的范围是从约0.5(n+1)mL至约2.0(n+1)mL。优选地，约1.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
将该第二寡核苷酸的溶液使用非极性有机溶剂进行处理直至该溶液变浑浊，该溶剂优先选自烃类，例如烷溶剂例如己烷，醚溶剂特别是MTBE，及其混合物，例如优选己烷/MTBE混合物。在另一个具体实施方案中，将该浑浊的溶液随后使用沉淀助剂进行处理。
在这种情况下，该沉淀助剂总体上是选自惰性多孔固体，这些固体优先选自硅藻土(Celite)、木炭(charcoal)、木纤维素、以及色谱固定相，如硅胶或氧化铝。
在这种情况下，该沉淀助剂总体上是以范围从约0.25(n+1)g至约1.5(n+1)g，优选地约0.75(n+1)g的量使用的，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
优选地，加入该沉淀助剂之后，将该混合物使用如之前在本文中描述的第二部分的非极性有机溶剂进行处理。所述部分的体积范围总体上是从约1(n+1)mL至约4(n+1)mL，优选地约2.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
沉淀之后，特别是当使用沉淀助剂时，将所获得的混合物总体上经受固体/液体分离操作，例如优选过滤。该寡核苷酸总体上通过从固体/液体分离操作中所回收的固体(特别是从沉淀助剂)中回收的，特别是使用极性有机溶剂萃取从沉淀助剂中回收，该有机溶剂优先选自羰基类型的溶剂，例如丙酮，选自含氮的溶剂，例如乙腈以及选自卤代烃类，例如二氯甲烷以及氯仿。
从以上的沉淀处理中所获得的寡核苷酸可以进一步通过在有机溶剂和水之间分配而进行纯化。这个步骤通常将产物与溶解在水层中的极性杂质分离开来。在这个实施方案中，该寡核苷酸被适当地溶解在有机溶剂中，特别是极性有机溶剂，例如含氮溶剂，特别是选自乙腈、甲酰胺如DMF、以及N-杂环类如吡啶，羰基类型的溶剂，如丙酮、或THF或DMSO。
所使用的有机溶剂的体积总体上范围是从约2.0(n+1)mL至8.0(n+1)mL，优选地约4.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。将该溶液使用水性介质，特别是水进行处理。所使用的水性介质的体积总体上是从约0.5体积当量的有机溶剂至约1.5体积当量的有机溶剂，通常是约0.7体积当量的有机溶剂。使用该水性介质处理之后，总体上将含寡核苷酸的层进行分离并且可以将其进一步处理(适当时)以获得纯化的寡核苷酸。
本发明的一个第六具体目的涉及一种用于生产具有至少一个硫代磷酸酯基团的第二寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)提供根据本发明的第一寡核苷酸并且(b)从所述第一寡核苷酸切除至少一个R基团以生产所述具有至少一个硫代磷酸酯连键的所述第二寡核苷酸。在本发明的一些具体实施方案中，通过使该第一寡核苷酸与碱在溶液中进行反应而将R基团切除，该碱优先选自烷基、环烷基以及芳香族的胺，更优先选自伯胺，例如烷基伯胺，其中烷基基团带有相同或不同的取代基，这些取代基优先选自C1至C8直链或支链的烷基或仲烷基胺，最优先选自正丙基以及叔丁基胺，优选地该碱是受阻的伯胺。
在一个具体实施方案中，根据本发明的第六方面的切除是在空间受阻的碱以及一种一般是N-杂芳香族碱的活化剂的存下进行的。优选地，活化剂是1，2，4-三唑或其他三唑以及四唑衍生物，并且更优选地，此种活化剂与空间受阻的碱(特别是叔丁基胺)一起使用。
S-亚甲基-酯、-碳酸酯或-氨基碳酸酯基团的脱保护作用可以例如在用空间受阻的碱(例如叔丁基胺)对该受保护的核苷酸进行的处理中完成。这些庞大的胺是特别有选择性的，因为它们不与核碱基(特别是那些在羰基氧处受保护的那些)反应。它们事实上允许限制或基本上避免与该核碱基部分(moiety)的可能副反应。为了改进空间受阻的胺与例如S-亚甲基丙酸酯在标准条件下的反应性，发现可以适当地加入激活剂。适当的激活剂的例子包括N-杂环碱，例如二唑、三唑以及它们的衍生物。这个实施方案特别是允许干净、快速以及有效的脱保护反应。
在本发明的某些实施方案中，这种脱保护方法涉及使用取代的苯胺作为碱，其中该苯胺的芳基基团包含在2和/或6位上的直链或支链的烷基或芳基取代基，例如像2，6-二甲基苯胺以及2，6-二乙基苯胺。
根据这个第六方面的脱保护优选地在疏质子的极性有机溶剂中进行，例如包括含氮溶剂的溶剂，更特别地是N-杂环溶剂，优选吡啶。
根据这个第六方面的脱保护总体上在从-10℃至50℃，优选地从0℃至30℃的温度下进行。
在根据本发明的第六方面以及在它的一些具体实施方案中，该液体反应介质总体上含有相对于该反应介质的总重量按重量计至少20％的第一寡核苷酸。优选地，该含量是至少50％重量。
在本发明的第六方面，所用碱的量总体上是范围从5n mmol至15nmmol，优选地约10n mmol，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
当在本发明的第六方面中使用激活剂时，所用激活剂的量总体上是范围从0.5n mmol至3n mmol，优选1.5n mmol，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
以下实施例旨在说明本发明而非限制其范围。
实施例
在这些实施例中并且贯穿本说明书使用的缩写定义如下：
CH2Cl2是二氯甲烷，KI是碘化钾，Na2S2O3是硫代硫酸钠，DME是二甲氧基乙烷，DIPEA是二异丙基乙胺，NaCl是氯化钠，MTBE是甲基叔丁基醚，EtOAc是乙基乙酸酯，HCl是盐酸，Na2SO4是硫酸钠，N2是分子氮，Br2是溴，SO2Cl2是亚硫酰二氯，NaHCO3是碳酸氢钠，CDCl3是氘化的氯仿，THF是四氢呋喃，DMSO是二甲亚砜，DMF是N，N-二甲基甲酰胺。
Ap、Gp、Tp是如以上描述地分别连接到以上描述的A、G、以及T上的2-脱氧核糖核碱基，其中A、G、以及T如下进行保护：
Ap是2-脱氧核糖核碱基，其中A是N-(嘌呤-6-基)苯甲酰胺；Gp是2-脱氧核糖核碱基，其中G是N-(6-(2，5-二氯苯氧基)-嘌呤-2-基)异丁酰胺；并且Tp是核碱基，其中T是5-甲基-4-苯氧基嘧啶-2-酮。
Ap(S)、Gp(S)和Tp(S)是分别为如以上描述的Ap、Gp和Tp的对应的4’O-P-硫代甲基丙酸酯。Ap(H)、Gp(H)和Tp(H)是分别为如以上描述的Ap、Gp和Tp的对应的4’O-P-膦酸酯。
DMTr是本领域普通技术人员已知的键合到如以上描述的对应寡核苷酸的5-O’上(当连接到其上时)的对甲氧基三苯甲基保护基团。Lev是本领域普通技术人员已知的键合到如以上描述的对应寡核苷酸的3-O’上(当连接到其上时)的戊1，4-二酮保护基团。
本发明的说明书中所使用的缩写的惯例进一步通过以下方案来说明。
Figure BPA00001407137100131
实施例1：合成双-氯甲基二硫化物
向一个1.0L的圆底烧瓶中加入无水CH2Cl2(200mL)以及二甲基二硫化物(27.1mL，300mmol)。将该混合物在N2气氛中搅拌并且冷却到78℃，并且将Cl2气体缓慢地鼓泡通过该搅拌过的混合物。当该混合物变成黄绿色的浆料时停止加入Cl2气体。将该冷却浴移除并且将该混合物自然地加温至室温。随着HCl从该溶液中释放出形成了一种红色的溶液。将该混合物首先用N2鼓泡15min，并且然后旋转蒸发以除去挥发的CH2Cl2。向残余物中加入新鲜的CH2Cl2(300mL)。将该溶液在冰水浴中搅拌，并且经15min缓慢加入在水(200mL)中的KI(139.4g，840mmol)水溶液。移开冷却浴并且将混合物在环境温度下搅拌2小时。将有机层分离并且在冰水浴中搅拌；缓慢加入水性的Na2S2O3饱和溶液直至I2的颜色消失。将有机层分离，接着用水(100mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，接着浓缩以产生作为红色油的产物(42.2g)。产率：(87.3％)。该粗品不经进一步纯化而用于下一步骤。
实施例2：合成双(丙酰氧基甲基)二硫化物
Figure BPA00001407137100151
向一个1.0L的圆底烧瓶中加入碘化钠(1.50g，10.0mmol)、双-氯甲基二硫化物(16.2g，100mmol)以及无水DME(150mL)。在室温下搅拌20min之后，将该混合物在冰水浴中冷却，并且然后加入DIPEA(42.0mL，240mmol)，接着加入丙酸(16.4mL，220mmol)。移开冷却浴并且将混合物在室温下搅拌18小时。整体部分的溶剂通过旋转蒸发除去。将乙酸乙酯(400mL)加入该残余物中，然后将混合物用水(150mL×2)、接着用盐水洗涤(80mL)。将有机层浓缩并且残余物通过硅胶色谱法纯化以产生所希望的作为一种橙色油的产物(9.62g)。产率：(40.4％)。
实施例3：合成N-甲基甲磺酰胺
Figure BPA00001407137100152
将甲磺酰氯(38.7mL，500mmol)经15min滴加到在冰水浴中冷却的搅拌过的水性甲胺(在水中40％，152mL，1.75mol)中。内部温度在加入过程中保持在20℃和24℃之间。加入之后，将冷却浴移开并且将混合物在室温下搅拌过夜。加入NaCl(40g)并且将混合物在室温下搅拌30min。将混合物用CH2Cl2(150mL，100mL×2)萃取。用Na2SO4干燥之后，将溶剂蒸发以产生所希望的作为一种无色油的产物(48.7g)。产率：89.2％。
实施例4：合成N-甲基-N-丙酰氧基甲基硫烷基甲磺酰胺
Figure BPA00001407137100161
向一个100mL的干燥圆底烧瓶中加入N-甲基甲磺酰胺(1.09g，10.0mmol)，吡啶(1.66g，21.0mmol)，双(丙酰氧基甲基)二硫化物(1.2g，5.0mmol)以及无水CH2Cl2(8mL)。将该混合物在N2中在室温下搅拌并且经30min滴加在4mL的CH2Cl2中的Br2(0.882g，5.52mmol)溶液。将产生的混合物在室温下搅拌2小时。加入MTBE(15mL)并且将产生的混合物过滤。固体用CH2Cl2(5mL)以及MTBE(5mL)的混合物洗涤。将滤液浓缩并且通过硅胶色谱法纯化以产生所希望的作为无色油的产物(1.62g)。产率：71.3％。
实施例5：合成氯甲基丙酸酯
Figure BPA00001407137100162
向一个500mL的干燥圆底烧瓶中加入多聚甲醛(90.1g，3000.0mmol)、无水氯化锌(8.18g，60.0mmol)。将该瓶置于一个冰水浴中，并且经1小时缓慢加入丙酰氯(260.6mL，3000.0mmol)。加入之后，将该混合物在50℃在N2中搅拌18小时。将混合物蒸馏以产生所希望的作为无色油的产物212.2g。产率：58％。
实施例6：合成丙酸乙酰基硫烷基甲基酯
Figure BPA00001407137100163
向一个装配有机械搅拌器、滴液漏斗以及N2入口的2000mL的干燥三颈圆底烧瓶中加入丙酸氯甲基酯(168.0g，1370.9mmol)、无水CH2Cl2(1000mL)、以及二异丙基乙胺(194.9g，1508.0mmol)。经30分钟向在冰水浴中冷却的搅拌的溶液中缓慢加入硫代乙酸(98.0mL，1370.9mmol)。加入之后，将混合物搅拌并且缓慢地加温到室温，并且在室温下搅拌过夜。将大多数的CH2Cl2旋转蒸发。向该混合物中加入乙酸乙酯(500mL)和MTBE(500mL)的一种混合物。将混合物过滤，并且固体用乙酸乙酯(100mL)和MTBE(100mL)的混合物洗涤。将滤液浓缩并且将残余物蒸馏以产生所希望的作为黄色油的产物(169.8g)。产率：76.4％。
实施例7：合成N-甲基-N-丙酰氧基甲基硫烷基甲磺酰胺
Figure BPA00001407137100171
向一个1000mL的干燥圆底烧瓶中加入丙酸乙酰基硫烷基甲基酯(70.0g，431.5mmol)、无水CH2Cl2(600mL)。将该溶液在冰水浴中在N2中搅拌并且加入氯化硫酰(34.6mL，431.5mmol)。加入之后，移开冷却浴并且将混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物旋转蒸发以除去所有的挥发物。将残余物溶解在80mL的无水CH2Cl2中以产生溶液A。
向另一个1000mL的干燥圆底烧瓶中加入N-甲基甲磺酰胺(49.5g，453.1mmol)，分子筛(
Figure BPA00001407137100172
活化的，5.0g)，以及无水CH2Cl2(200mL)。将该溶液在冰水浴中在N2中搅拌并且加入无水吡啶(41.9mL，517.8mmol)。加入之后，经15min缓慢加入以上溶液A。然后将产生的混合物在室温下搅拌1.5小时。缓慢加入己烷(200mL)并且将产生的混合物在室温下搅拌10分钟。将混合物过滤，并且固体用乙酸乙酯∶己烷＝1∶1(80mL)的混合物洗涤。将滤液浓缩并且将残余物在柱上使用800g的硅胶以及从己烷(21)开始，之后跟随乙酸乙酯/己烷(1∶9，3l)、乙酸乙酯/己烷(2∶8，4l)以及乙酸乙酯/己烷(3∶7，2l)的顺序洗脱进行纯化。主要杂质在20％的乙酸乙酯下洗脱并且产物在30％的乙酸乙酯下洗脱。产率：74.4％。
实施例8：合成N-甲磺酰胺琥珀酰亚胺
Figure BPA00001407137100181
将80mL的无水二氯甲烷中的9.803g(60.43mmol)乙酰基硫烷基甲基物的溶液置于装备有磁力搅拌器、热电偶、氮气管线以及冷却冰浴的250mL的3-颈圆底烧瓶中。将烧瓶内含物冷却到约0℃，将总量11.33g(83.94mmol，1.38eq.)的二氯化硫酰缓慢加入该溶液中，其中的速度保持温度在0℃和5℃之间。移开冷却浴并且将反应混合物在室温下再搅拌1.5小时。将产生的黄色溶液在旋转蒸发仪上浓缩以产生作为恶臭的粘性黄色油的8.88g粗制乙酰基甲基次磺酰基氯化物。该材料被立即用于将琥珀酰亚胺进行亚磺酰化的下一步骤。
将80mL的无水二氯甲烷中的6.12g(61.76mmol，1.02eq.)的琥珀酰亚胺以及8.17g(80.73mmol，1.33eq.)的三乙胺的混合物置于装备有磁力搅拌器、热电偶、氮气管线以及冷却冰浴的250mL的3-颈圆底烧瓶中。将该混合物冷却到0℃，并且将20mL无水二氯甲烷中的粗制乙酰基甲基次磺酰基氯化物(8.88g)的溶液加入预冷却的琥珀酰亚胺和三乙胺的悬浮液中，其速度保持温度在0℃和5℃之间。加入完成之后，将冷却浴移开并且允许将产生的棕色悬浮液在室温下再搅拌2小时。将反应混合物用冷水(300mL)以及饱和NaHCO3(100mL)骤冷，并且使用二氯甲烷(3x80mL)萃取。将有机相合并，用Na2SO4干燥并且在旋转蒸发仪上浓缩以产生13g的暗色的粘性油。该材料在硅胶柱(120g)上使用具有0至30％的乙酸乙酯的EtOAc-己烷混合物作为洗脱液进行纯化以产生4.12g作为白色固体的次磺酰胺N-甲磺酰胺琥珀酰亚胺，在30％EtOAc-己烷中Rf＝0.16。产率：32％。
实施例9：合成乙基乙酰基硫烷基甲基碳酸乙酯
向100mL的干燥圆底烧瓶中加入氯甲酸氯甲基酯(12.9g，100.0mmol)、无水乙腈(300mL)。将溶液在冰水浴中搅拌，并且经20min缓慢加入无水乙醇(4.6g，100.0mmol)以及无水吡啶(23.7g，300mmol)的混合物。在添加之后，将该混合物在室温下搅拌1小时。将碘化钠(1.50g，10.0mmol)加入该反应混合物中。将混合物在冰水浴中搅拌，并且经5min加入硫代乙酸(7.6g，100mmol)。加入之后，将冷却浴移开并且将混合物在室温下搅拌过夜。将己烷(600mL)加入该反应混合物中并且过滤。将滤液浓缩并且蒸馏以产生所希望的产物。
实施例10：合成N-甲基-N-乙氧基羰基氧基甲基硫烷基甲磺酰胺
Figure BPA00001407137100191
向500mL的干燥圆底烧瓶中加入乙基乙酰基硫烷基甲基碳酸酯(8.9g，50.0mmol)、无水CH2Cl2(200mL)。将该溶液在冰水浴中在N2中搅拌并且加入氯化硫酰(4.0mL，50.0mmol)。加入之后，移开冷却浴并且将混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物旋转蒸发以除去所有的挥发物。将残余物溶解在50mL的无水CH2Cl2中以产生溶液A。
向另一个500mL的干燥圆底烧瓶中加入N-甲基甲磺酰胺(6.0g，55.0mmol)，分子筛(
Figure BPA00001407137100192
活化的，3.0g)，以及无水CH2Cl2(150mL)。将该混合物在冰水浴中在N2中搅拌并且加入无水吡啶(5.3mL，65.0mmol)。加入之后，经10分钟缓慢加入以上溶液A。然后将产生的混合物在室温下搅拌1.5小时。缓慢加入己烷(200mL)并且将产生的混合物在室温下搅拌10分钟。将混合物过滤，并且固体用乙酸乙酯∶己烷＝1∶1(60mL)的混合物洗涤。将滤液浓缩并且残余物通过硅胶柱纯化以产生所希望的产物。、
实施例11：合成乙酰基硫烷基甲基二甲基氨基甲酸酯
向100mL的干燥圆底烧瓶中加入氯甲酸氯甲基酯(12.9g，100.0mmol)、二甲胺盐酸盐(8.15g，100mmol)以及无水乙腈(300mL)。将混合物在冰水浴中搅拌，并且经30min缓慢加入N，N-二异丙胺(43.5mL，250mmol)。在添加之后，将该混合物在室温下搅拌1小时。将碘化钠(1.50g，10.0mmol)加入该反应混合物中。将混合物在冰水浴中搅拌，并且经5min加入硫代乙酸(7.6g，100mmol)。加入之后，将冷却浴移开并且将混合物在室温下搅拌过夜。将己烷(300mL)加入该反应混合物中并且过滤。将滤液浓缩并且蒸馏以产生所希望的产物。
实施例12：合成N-甲基-N-二甲基氨基甲酰氧基甲基硫烷基甲磺酰胺
Figure BPA00001407137100201
向500mL的干燥圆底烧瓶中加入乙基乙酰基硫烷基甲基二甲基氨基甲酸酯(8.9g，50.0mmol)、无水CH2Cl2(200mL)。将该溶液在冰水浴中在N2中搅拌并且加入氯化硫酰(4.0mL，50.0mmol)。加入之后，移开冷却浴并且将混合物在室温下搅拌1.5小时。将混合物旋转蒸发以除去所有的挥发物。将残余物溶解在50mL的无水CH2Cl2中以产生溶液A。
向另一个500mL的干燥圆底烧瓶中加入N-甲基甲磺酰胺(6.0g，55.0mmol)，分子筛(
Figure BPA00001407137100202
活化的，3.0g)，以及无水CH2Cl2(150mL)。将该混合物在冰水浴中在N2中搅拌并且加入无水吡啶(5.3mL，65.0mmol)。加入之后，在10min内缓慢加入以上溶液A。然后将产生的混合物在室温下搅拌1.5小时。缓慢加入己烷(100mL)并且将产生的混合物在室温下搅拌10分钟。将混合物过滤，并且固体用乙酸乙酯∶己烷＝1∶1(60mL)的混合物洗涤。将滤液浓缩并且残余物通过硅胶柱纯化以产生所希望的产物。
实施例13：通分离中间体H-膦酸酯来合成完全保护的二核苷酸硫代磷 酸酯
Figure BPA00001407137100211
实施例13-1.将1.86g(2.62mmol，1.15eq.)的H-膦酸酯1以及0.78g(2.28mmol)的3’-位保护的脱氧-胸苷2的混合物与无水吡啶(3x 25mL)进行共蒸发。将油状残余物溶解在10mL的无水吡啶中并且在氩气气氛中冷却到约0℃。通过注射器滴加入总量0.56g(4.66mmol，2eq.)的新戊酰氯，并且允许将产生的混合物加温到环境温度。将反应再搅拌15min，并且然后使用50g冰以及100mL的稀释的饱和NaHCO3(80mL水以及20mL的碳酸氢钠)骤冷。有机材料使用二氯甲烷(2x80mL)萃取并且萃取物用冷水(70mL)、饱和碳酸氢钠(30mL)以及盐水(10mL)的混合物洗涤。有机相使用无水硫酸钠干燥并且在旋转蒸发仪上浓缩以产生6.74g作为澄清的油的粗品3。31P(162MHz，CDCl3，δ)：8.58(s)以及7.06(s)。
将粗品H-膦酸酯3(6.74g)在20mL无水吡啶中的溶液在氩气气氛中冷却到约0℃。将总量1.21g(5.43mmol，2.3eq.)的试剂4滴加到反应中并且5min后还向该烧瓶中加入0.502g(3.88mmol，1.7eq.)的二异丙基乙胺。允许反应加温到环境温度，并且再搅拌1小时之后将其用稀释的冷的碳酸氢钠溶液(100mL)骤冷。有机产物用二氯甲烷(2x80mL)萃取，用水(100mL)洗涤并且用硫酸钠干燥。将有机相在旋转蒸发仪上浓缩以产生5.02g的作为黄色油的粗品5(通过HPLC约为90％纯的)。31P(162MHz，CDCl3，δ)：26.77(s)以及26.67(s)。
实施例13-2.通过模拟方法A，通过H-膦酸酯1(1.49g，2.1mmol，1.08eq.)与3’-位保护的脱氧胸苷2((0.66g，1.94mmol)在0.49g(4.06mmol，2eq.)新戊酰氯在20mL无水吡啶中的存在下的反应而获得一种中间体H-膦酸酯3。反应混合物用冷水/水性NaHCO3/盐水冷却之后，将中间体3通过用二氯甲烷(3x30mL)萃取进行分离。有机萃取物用水(50mL)、水性NaHCO3(20mL)以及盐水(10mL)洗涤。用Na2SO4(约1min)干燥之后，将有机相浓缩到原始体积的约1/4，冷却到0℃，并且将S-转移试剂4(0.96g，4.3mmol，2.2eq.)加入3中，随后加入二异丙基乙胺(0.45g，3.48mmol，1.8eq.)。在室温下再搅拌1小时后，将反应如方法A中所描述的进行骤冷。有机相在旋转蒸发仪上的浓缩产生了3.55g的粗品5，为澄清的黄色油，其中HPLC纯度为91％。
实施例14：制备DMTr-Ap(s)T-Lev
通过与吡啶共蒸发使三乙铵6-N-(苯甲酰基)-5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2’-去氧腺苷-3’H-膦酸酯(4.94g，6.0mmol)以及3’-O-乙酰丙酰基胸苷(3’-O-levulinyl thymidine)(1.70g，5.0mmol)为无水的，用无水吡啶(12.5mL)稀释并且在N2中在0℃下搅拌。随后，经2min缓慢加入新戊酰氯(1.24mL，10.0mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌5min并且在二氯甲烷(100mL)和1.25N的乙酸钠-乙酸缓冲液(2x100mL)之间分配。该缓冲液是通过将190mL的1.25N水性乙酸钠溶液与10mL的1.25N水性乙酸溶液混合而制成的。将有机层干燥(Na2SO4)并且浓缩。残余物与50mL的甲苯共蒸发，溶解在无水二氯甲烷(25mL)中，在N2中在0℃下用N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(2.05g，9.0mmol)在无水二氯甲烷(1.0mL)中的溶液进行处理，之后跟随加入N，N-二异丙基乙胺(0.87mL，5.0mmol)。在环境温度下搅拌30min之后，经10min加入溶液A(MTBE∶己烷＝1∶2，37.5mL)，接着加入硅藻土(7.5g)。将混合物搅拌并且经30min加入额外部分的A(37.5mL)。继续再搅拌30min，并且将混合物过滤。将固体用溶液A与CH2Cl2以5∶1(60mL)的比率制得的溶剂的混合物洗涤。然后将固体用二氯甲烷(4x40mL)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩。将残余物溶解在乙腈(20mL)中并且在冰水浴中搅拌，并且经20min加入冷水(14mL)。将底层在二氯甲烷(100mL)和水性(1∶1)盐水溶液(60mL)之间分配。将有机层干燥(Na2SO4)并且浓缩以产生作为白色固体的产物(5.7g)。产率：97％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝26.7，26.3。
实施例15：制备DMTr-Gp(H)：
向通过与吡啶(500mL)共蒸发而使得无水的亚磷酸(78.7g，960.0mmol)中加入2’-脱氧-6-O-(2，5-二氯苯基)-5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2-N-异丁酰基鸟嘌呤核苷(62.8g，80.0mmol)并且通过与吡啶共蒸发使该混合物再次为无水的。将残余物使用无水吡啶(480mL)以及在10℃下经30min加入的新戊酰氯(64.0mL，520.0mmol)进行处理。将反应混合物在室温下搅拌6小时并且浓缩。将残余物溶解在800mL的二氯甲烷中并且顺序地用冷水(800mL)、三乙铵碳酸氢盐(2.0N，400mL×2)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在80mL的二氯甲烷中并且经20min在搅拌下加入溶液A(MTBE∶己烷＝1∶2，360mL)接着加入硅藻土(80g)。随后，经30min缓慢加入另外的溶液A(360mL)。将混合物过滤并且固体用MTBE(300mL)洗涤。然后固体用二氯甲烷(200mLx4)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩以产生作为白色泡沫的产物(70.4g)。产率：93％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝2.71。
实施例16：制备DMTr-Gp(s)T-OH
通过与吡啶共蒸发使三乙铵2’-脱氧-6-O-(2，5-二氯苯基)-5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2-N-异丁酰基鸟嘌呤核苷-3’H-膦酸酯(54.9g，58.0mmol)以及3’-O-乙酰丙酰基-4-O-苯基胸苷(20.1g，48.3mmol)无水并且用无水吡啶(121mL)稀释。将该溶液在N2中在0℃下使用新戊酰氯(11.8mL，96.6mmol)经5min进行处理。再搅拌5min后，加入N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(22.0g，96.6mmol)在无水二氯甲烷(20mL)中的溶液，接着加入N，N-二异丙基乙胺(8.4mL，48.3mmol)。允许将反应混合物在环境温度下搅拌30min，并且用600mL的二氯甲烷稀释。将有机层顺序地用冷水(600mL)、以及饱和碳酸氢钠(500mL×2)洗涤、将其干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在97mL的二氯甲烷中并且经20min在搅拌下加入溶液A(MTBE∶己烷＝1∶2，194mL)接着加入硅藻土(73g)并且经30min加入另外部分的溶液A(194mL)。再搅拌30min后，将混合物过滤。该固体用MTBE∶己烷＝4∶1(200mL)洗涤并且用二氯甲烷(150mL×4)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩以产生作为黄色泡沫的产物(68.1g)，31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝26.9，26.2。该产物不经进一步纯化而用于下一步骤。在0℃向以上产物(64g)在117mL的二氯甲烷中的搅拌的溶液中加入吡啶∶乙酸∶肼一水合物＝37.5mL∶25.0mL∶2.5mL(51.6mmol)的冷却的混合物。在0℃下搅拌1小时之后，将反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释并且用冷水(500mL)洗涤。水层用二氯甲烷(100mL)反萃取。将合并的二氯甲烷萃取液干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在235mL乙腈中并且在冰水浴中搅拌，并且用经30min逐渐加入的冷水(188mL)进行处理。将底部有机层分离，用200mL的二氯甲烷稀释并且干燥(无水Na2SO4)。浓缩之后，将残余物溶解在94mL的二氯甲烷中并且在搅拌下用经20min加入的溶液A(MTBE∶己烷＝1∶2，94mL)、硅藻土(70g)以及经30min再次加入的溶液A(94mL)顺序地进行处理。将混合物过滤并且将该固体用MTBE∶己烷＝4∶1(300mL)洗涤并且用二氯甲烷(150mL×4)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩以产生作为黄色泡沫的产物(52g)。产率：87％。该产物被直接用于下一步骤。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝28.1，25.3。
实施例17：制备HO-Gp(s)A-Lev
通过与吡啶共蒸发使三乙铵2’-脱氧-6-O-(2，5-二氯苯基)-5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-2-N-异丁酰基鸟嘌呤核苷-3’H-膦酸酯(45.4g，48.0mmol)以及2’-脱氧-3’-O-乙酰丙酰基-6-N-苯甲酰基腺苷(18.1g，40.0mmol)无水。将残余物用无水吡啶(100mL)稀释，并且将产生的溶液在N2中在0℃下用新戊酰氯(9.9mL，80.0mmol)经10min进行处理。将反应混合物在0℃再搅拌5min，并且用N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(18.2g，80.0mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液进行处理，接着加入N，N-二异丙基乙胺(7.0mL，40.0mmol)。在环境温度下搅拌30min之后，将反应混合物用600mL的二氯甲烷稀释并且顺序地用冷水(600mL)、以及饱和碳酸氢钠(300mL×2)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在80mL的二氯甲烷中并且经20min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶2，160mL)、接着用硅藻土(60g)以及经30min用另外部分的溶液A(160mL)顺序地进行处理。搅拌30min后，将混合物过滤。该固体用MTBE∶己烷＝4∶1(200mL)洗涤并且用二氯甲烷(150mL×4)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩。将残余物溶解在160mL乙腈中并且在冰水浴中搅拌，并且经30min用冷水(112mL)处理。将底部有机层分离并且在二氯甲烷(320mL)和水(320mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为黄色泡沫的产物(64.1g)。该产物不经进一步纯化而用于下一步骤。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝26.2，26.0。
向以上产物(64.0g)在120mL的二氯甲烷中的0℃的搅拌溶液中加入吡咯(13.9mL，200.0mmol)，接着经20min加入二氯乙酸(16.5mL，200.0mmol)。在0℃下搅拌1小时之后，将反应混合物使用饱和碳酸氢钠(200mL)骤冷。水层用二氯甲烷(60mL×2)萃取并且将合并的二氯甲烷萃取液干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在80mL的二氯甲烷中并且经15min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，100mL)、硅藻土(60g)以及经30min用另外部分的溶液A(100mL)顺序地进行处理。将混合物过滤，固体用MTBE(150mL×2)洗涤并且用二氯甲烷(200mL×4)萃取。将二氯甲烷滤液浓缩，溶解在160mL乙腈中，在冰水浴中搅拌，并且经20min用冷水(144mL)处理。将底部有机层在二氯甲烷(320mL)和水性(1∶1)盐水溶液(320mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为灰白色固体的产物(40.5g)。产率：92％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝26.4，26.2。
实施例18：制备DMTr-Gp(s)Tp(H)
通过与吡啶(182mL)蒸发使亚磷酸(29.8g，364.0mmol)无水。向该残余物中加入DMTr-Gp(s)T-OH(33.0g，26.0mmol)并且通过与吡啶蒸发再次使该混合物无水。将混合物用无水吡啶(130mL)稀释并且在10℃下用经30min加入的新戊酰氯(24.0mL，195.0mmol)处理。将混合物在室温下搅拌16小时，将其浓缩并且将残余物溶解在400mL二氯甲烷中。将溶液顺序地用冷水(400mL)以及三乙铵碳酸氢盐(2.0N，200mL×3)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。与150mL的甲苯共蒸发之后，将残余物溶解在52mL的二氯甲烷中，并且经20min使用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，78mL)、硅藻土(39g)以及经30min使用另外部分的溶液A(78mL)顺序地进行处理。将混合物过滤并且固体用由溶液A与CH2Cl2以5∶1(180mL)的比率制得的溶剂混合物进行洗涤。固体用二氯甲烷(150mL×4)萃取，将滤液浓缩以产生作为灰白色泡沫的产物(33.1g)。产率：89％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝26.9，25.4，3.0，2.9。
实施例19：制备DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-OH
通过与吡啶蒸发使DMTr-Gp(s)Tp(H)的三乙铵盐(28.6g，20.0mmol)与HO-Gp(s)A-Lev(16.9g，15.4mmol)混合物是无水的。将残余物用无水吡啶(62.0mL)稀释，并且在N2中在0℃下用新戊酰氯(4.8mL，38.5mmol)经5min进行处理。在0℃下再搅拌10min后，加入N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(7.0g，30.8mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液，接着加入N，N-二异丙基乙胺(2.7mL，15.4mmol)。在环境温度下搅拌1小时之后，将反应混合物用450mL的二氯甲烷稀释并且顺序地用冷水(450mL)以及饱和碳酸氢钠(300mL×2)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。与100mL的甲苯共蒸发之后，将残余物溶解在62mL的二氯甲烷中，并且经20min使用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，124mL)、接着用硅藻土(46.2g)以及经30min使用另外部分的溶液A(124mL)顺序地进行处理。搅拌30min之后，将混合物过滤，将固体用A∶CH2Cl2＝6∶1(140mL)洗涤。然后固体用二氯甲烷(150mL x 4)洗涤。将二氯甲烷滤液浓缩。将残余物溶解在123mL乙腈中并且经20min用冷水(86mL)处理同时在冰水浴中搅拌。将底部有机层在二氯甲烷(300mL)和水性(1∶1)盐水溶液(200mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为黄色泡沫的产物DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(43.4g)。该产物不经进一步纯化而用于下一步骤。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.9-25.8(m)。
向0℃下的在38.0mL的二氯甲烷中的DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(38.0g)的搅拌溶液中加入吡啶∶乙酸∶肼一水合物＝14.3mL∶9.5mL∶0.95mL(19.5mmol)的冷却的混合物。在0℃下搅拌40min之后，将反应混合物用二氯甲烷(450mL)稀释并且用冷水(300mL×2)以及盐水(150mL)洗涤。将二氯甲烷干燥(Na2SO4)并且浓缩。与100mL的甲苯共蒸发之后，将残余物溶解在60mL的二氯甲烷中，经20min在搅拌下加入溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，90mL)，接着加入硅藻土(45
g)。将混合物搅拌并且经30min加入更多的溶液A(90mL)。将混合物过滤并且固体用溶液A与CH2Cl2以5∶1(150mL)的比率制得的溶剂混合物洗涤。将固体用二氯甲烷(150mL×4)萃取，将萃取液浓缩并且残余物用短的硅胶柱使用乙腈(0-80％)在乙酸乙酯中的梯度进行纯化。将产物部分浓缩以产生作为黄色泡沫的产物(26.9g)。产率：82％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.6-26.0(m)。
实施例20：制备HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev
向0℃下的、DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(7.2g，2.84mmol)在14mL二氯甲烷中的溶液中加入吡咯(2.0mL，28.4mmol)接着经3min加入二氯乙酸(2.34mL，28.4mmol)。在0℃下搅拌30min之后，将反应混合物用14mL的二氯甲烷稀释，接着缓慢加入饱和碳酸氢钠(50mL)。水层用二氯甲烷(40mL)萃取并且将合并的二氯甲烷萃取液干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在30mL的二氯甲烷中并且用溶液A(MTBE∶己烷＝2∶1，45.0mL)、硅藻土(9.0g)以及再次经30min的另外部分的溶液A(45.0mL)顺序地进行处理。将混合物过滤，固体用MTBE(40mL×2)洗涤并且用二氯甲烷(50mL×4)萃取。将二氯甲烷萃取液浓缩，将残余物溶解在28.4mL的乙腈中并且经20min在冰浴中用冷水(28.4mL)处理同时进行搅拌。将有机层用二氯甲烷(80mL)稀释、将其干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为灰白色固体的产物(5.7g)。产率：95％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.4-26.2(m)。
实施例21：制备DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(H)
将亚磷酸(4.7g，57.3mmol)与吡啶(29mL)蒸发并且与DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-OH(8.7g，3.58mmol)混合。通过蒸发掉加入的吡啶使该混合物无水并且用无水吡啶(29.0mL)稀释。在10℃下，经5min向该搅拌过的混合物中加入新戊酰氯(3.75mL，30.4mmol)。将该混合物在室温下搅拌6小时并且浓缩。将残余物溶解在200mL的二氯甲烷中并且顺序地用冷水(100mL)以及三乙铵碳酸氢盐(2.0N，100mL×3)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为灰白色泡沫的产物(9.15g)。产率：98％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.5-25.8(m)，2.9，2.8。
实施例22：制备HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev
使DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(H)(10.1g，3.9mmol)的三乙铵盐以及HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(6.7g，3.0mmol)的混合物与吡啶蒸发而使其无水并且用无水吡啶(15.0mL)稀释。将新戊酰氯(1.1mL，9.0mmol)经2min在0℃下于搅拌下缓慢加入该混合物中。将混合物在环境温度下搅拌30min，再冷却到0℃，并且用N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(1.70g，7.5mmol)在无水二氯甲烷(2.0mL)中的溶液进行处理，接着加入N，N-二异丙基乙胺(0.78mL，4.5mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌1小时，并且用300mL的二氯甲烷稀释。将有机层顺序地用冷水(300mL)以及饱和碳酸氢钠(200mL)洗涤、将其干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷中(24mL)并且顺序地经10min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，48mL)、硅藻土(18g)以及经30min用另外部分的溶液A(48mL)进行处理。搅拌30min之后，将混合物过滤并且将该固体用MTBE∶己烷＝2∶1(60mL)洗涤并且用二氯甲烷(50mL×4)萃取。将二氯甲烷萃取液浓缩；将残余物溶解在乙腈(48mL)中并且经20min用冷水(34mL)处理同时在冰浴中搅拌。将底部层在二氯甲烷(150mL)和水性(1∶1)盐水溶液(160mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为灰色固体的产物(11.7g)，31P NMR (CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.7-25.8(m)。该产物不经进一步纯化而直接用于下一步骤。
向0℃下的以上产物(11.2g)在18mL二氯甲烷的搅拌溶液中加入吡咯(2.85mL，41.1mmol)，接着经5min加入二氯乙酸(3.2mL，38.4mmol)。在0℃下搅拌40min之后，将反应混合物通过缓慢加入饱和碳酸氢钠(40mL)而骤冷。将混合物用20mL的二氯甲烷稀释，将水层分离并且用二氯甲烷(40mL)萃取并且将合并的二氯甲烷萃取液干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在28mL的二氯甲烷中并且经10min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，28mL)、硅藻土(16.8g)以及经20min用另外部分的溶液A(28mL)顺序地进行处理。将混合物过滤，将固体用溶液A(40mL)以及MTBE(40mL)洗涤并且用二氯甲烷(4×50mL)萃取。将二氯甲烷萃取液合并并且用一个短硅胶柱纯化。该柱用二氯甲烷洗脱。浓缩之后，获得了作为灰色固体的产物(8.7g)。产率：66％。31PNMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.8-26.3(m)。
实施例23：制备
HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(SEQ.ID NO：1)
使DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(H)(6.85g，2.64mmol)的三乙铵盐以及HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(8.2g，1.81mmol)的混合物与吡啶蒸发而使其无水。向该残余物中加入无水吡啶(14mL)，将产生的溶液在N2中于0℃下搅拌并且用经3min加入的新戊酰氯(0.8mL，6.48mmol)洗涤。移开冷却浴并且将混合物在环境温度下搅拌30min。将混合物冷却到0℃，并且加入N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(1.23g，5.40mmol)在无水二氯甲烷(20mL)中的溶液，接着加入N，N-二异丙基乙胺(0.56mL，3.24mmol)。在环境温度下搅拌1小时之后，将反应混合物用250mL的二氯甲烷稀释并且用冷的半饱和碳酸氢钠(250mL)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物与50mL的甲苯共蒸发，溶解在43mL的二氯甲烷中，并且经20min使用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，43mL)、硅藻土(19.4g)以及经30min使用另外部分的溶液A(43mL)顺序地进行处理。搅拌30min之后，将混合物过滤并且将固体用溶液A与CH2Cl2以4∶1(100mL×2)的比率制得的混合物洗涤。将固体用二氯甲烷(100mL×4)萃取，并且将萃取液进行浓缩。将残余物溶解在65mL乙腈中并且用经20min加入的冷水(46mL)处理。将底部有机层在二氯甲烷(200mL)和水性(1∶1)盐水溶液(200mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为黄色泡沫的产物(12.8g)。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝30.0-24.8(m)。
向0℃下的以上产物(12.8g)在20mL二氯甲烷中的搅拌的溶液中加入吡咯(2.64mL，38.0mmol)，接着加入二氯乙酸(3.0mL，36.0mmol)。在0℃下搅拌30min之后，将反应混合物用200mL的二氯甲烷稀释，接着缓慢加入饱和碳酸氢钠(100mL)。将有机层分离、将其干燥(Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在40mL的二氯甲烷中并且经10min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，40mL)、硅藻土(20g)以及用经20min加入的另外部分的溶液A(80mL)顺序地进行处理。将混合物过滤并且将固体用从溶液A与CH2Cl2以5∶1(120mL)的比率制得的溶剂混合物进行洗涤。将固体用二氯甲烷(100mL×4)萃取，并且将萃取液进行浓缩。将残余物溶解在70mL乙腈中并且用经30min加入的冷水(49mL)进行处理。将底部有机层在二氯甲烷(150mL)和水性(1∶1)盐水溶液(150mL)之间分配。将有机层干燥(Na2SO4)并且浓缩以产生作为灰白色固体的产物(9.2g)。产率：75％。该产物被直接用于下一步骤。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.7-26.4(m)。
实施例24：制备
Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)T p(s)Gp(s)A-Lev：(SEQ.ID NO：2)
使DMTr-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(H)(3.64g，1.4mmol)的三乙铵盐以及HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)Ap(s)Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(6.1g，0.89mmol)的混合物与吡啶蒸发而使其无水。将残余物用无水吡啶(10mL)稀释，并且在N2中在0℃下用经3min缓慢加入的新戊酰氯(0.37mL，3.0mmol)进行处理。移开冷却浴并且将混合物在环境温度下搅拌1小时。将混合物冷却到0℃，加入N-丙酰氧基甲硫基-N-甲基甲磺酰胺(568.3mg，2.5mmol)在无水二氯甲烷(1.0mL)中的溶液，接着加入N，N-二异丙基乙胺(0.26mL，1.5mmol)。在环境温度下搅拌1小时之后，将反应混合物用120mL的二氯甲烷稀释并且顺序地用冷水(120mL)以及半饱和的碳酸氢钠(120mL)洗涤。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在32mL的二氯甲烷中并且经20min用溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，32mL)、硅藻土(16.0g)以及用经30min加入的另外部分的溶液A(64mL)顺序地进行处理。搅拌30min之后，将混合物过滤并且固体用溶液A与CH2Cl2以5∶1(60mL)的比率制得的溶剂混合物洗涤。将固体用二氯甲烷(80mL×4)萃取，并且将萃取液进行浓缩。将残余物溶解在40mL乙腈中并且在搅拌下用经20min加入的冷水(28mL)处理。将底部有机层在二氯甲烷(150mL)和水性(1∶1)盐水溶液(150mL)之间分配。将有机层干燥(Na2SO4)并且浓缩以产生作为黄色固体的产物(6.92g)。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.6-26.3(m)。该产物不经另外的纯化而用于下一步骤。
向在0℃下的以上产物(6.92g)在10mL二氯甲烷中的搅拌的溶液中加入吡咯(1.74mL，25.0mmol)，接着经2min加入二氯乙酸(2.0mL，24.0mmol)。在0℃下再搅拌30min之后，将反应混合物用100mL的二氯甲烷稀释，接着缓慢加入饱和碳酸氢钠(50mL)。将有机层分离并且水层用50mL的二氯甲烷萃取。将合并的CH2Cl2萃取液干燥(无水Na2SO4)并且浓缩。将残余物溶解在32mL的二氯甲烷中并且用经10min加入的溶液A(MTBE∶己烷＝1∶1，32mL)、硅藻土(16g)以及用经30min加入的另外部分的溶液A(64mL)顺序地进行处理。将混合物过滤并且固体用溶液A与CH2Cl2以5∶1(90mL)的比率制得的溶剂混合物洗涤。将固体用二氯甲烷(80mL×4)萃取，并且将萃取液进行浓缩。将残余物溶解在40mL乙腈中并且用经10min加入的冷水(28mL)处理同时将混合物在冰水浴中搅拌。将底部有机层在二氯甲烷(100mL)和水性(1∶1)盐水溶液(100mL)之间分配。将有机层干燥(无水Na2SO4)并且浓缩以产生作为黄色固体的产物(5.8g)。产率：71％。31P NMR(CDCl3，121.5MHz)：δ＝27.7-26.3(m)。
实施例25：5’-OH完全保护的寡核苷酸硫代磷酸酯 HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev的完全脱保护
通过将所加入的吡啶蒸发而使完全保护的四聚物HO-Gp(s)Tp(s)Gp(s)A-Lev(1.38g，0.62mmol)无水。向该残余物中加入1，2，4-三唑(192.7mg，2.79mmol)、
Figure BPA00001407137100311
的分子筛(1.5g)以及无水吡啶(6.0mL)。将该混合物搅拌并且在N2中冷却到0℃，并且加入叔丁铵(1.95mL，18.6mmol)。然后将产生的混合物在室温下搅拌4小时。将混合物过滤并且将分子筛用吡啶(5mL×2)洗涤。将合并的滤液浓缩至干燥。向该残余物中加入吡啶-2-乙醛肟(909mg，7.44mmol)，接着加入无水乙腈(10mL)。将混合物搅拌并且冷却到0℃，并且加入1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(1.67mL，11.2mmol)。在室温下搅拌15小时之后，经10min缓慢加入MTBE(50mL)。再搅拌20min之后，将顶部的澄清溶液倒出并且将残余物用乙酸乙酯(20mL)漂洗。将残余物蒸发以除去残余溶剂并且将其溶解在28％的氨水(10.0mL)以及2-巯基乙醇(0.5mL)的混合物中。将产生的混合物在55℃下加热15小时。冷却下来之后，将混合物经10min滴加到异丙醇∶THF＝1∶3(80mL)的搅拌的混合物中。再搅拌20min之后，将顶部的澄清溶液倒出并且将残余物用THF(20mL)漂洗。将残余物用反相C18色谱法纯化。将获得的产物施用到一个Amberlite
Figure BPA00001407137100312
 IR-120(加)离子交换树脂(钠形式)的柱(8cm×3cm直径)中。该柱用水洗脱，并且将所希望的部分合并并且冻干以产生钠形式的完全脱保护的寡核苷酸硫代磷酸酯产物，为684mg的白色固体。产率：83％。31P NMR(D2O，121.5MHz)：δ＝55.4-54.6(m)。
实施例26：合成以下方案中所示的完全保护的二核苷酸硫代磷酸酯
Figure BPA00001407137100313
将三乙铵5’-O-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-胸苷-3’-H-膦酸酯(425.9mg，0.6mmol)、3’-O-乙酰丙酰基胸苷(170.2mg，0.5mmol)以及干的吡啶(10.0mL)的溶液旋转蒸发至干燥。将残余物再溶解在10mL的吡啶中并且再次旋转蒸发至干燥。向该残余物中加入分子筛(300mg，活化的，
Figure BPA00001407137100321
)以及无水吡啶(5.0mL)。将混合物在N2中在室温下搅拌，加入新戊酰氯(0.22mL，1.75mmol)。在室温下搅拌5min之后，加入N-甲基-N-丙酰氧基甲基硫烷基甲磺酰胺(284.1mg，1.25mmol)在CH2Cl2(1.0mL)中的溶液接着加入DIPEA(0.17mL，2.0mmol)。将产生的混合物在室温下搅拌30min。加入乙酸乙酯(30mL)。将混合物过滤并且将滤液用水(15mL)、半饱和的水性碳酸氢钠(15mL×2)以及盐水(15mL)洗涤。将有机层干燥并且蒸发以产生1.21g的浅黄色油。将该粗品用硅胶层析法(EtOAc/丙酮)纯化以产生作为无色泡沫的产物(389mg)。产率：74.4％。
Figure IPA00001407136600011

Claims (49)

1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)
Figure FPA00001407137000011
其中A是成对取代的亚烷基基团，优选CH2，X和Y独立地选自S和O，并且R0是选自下组，该组由以下各项组成：任选取代的碳键合的有机残基，例如特别是任选取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和/或Ry是选自H以及有机残基并且至少Rx是非H取代基。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中R选自：亚甲基酰氧基基团、亚甲基碳酸酯基团以及亚甲基氨基甲酸酯基团。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合化学式-CH2-O-C(O)-R0，其中R0是C1-C20的、饱和的、不饱和的、杂环的或芳香族的烃残基。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合具有化学式-CH2-O-C(O)-NRxRy的亚甲基氨基甲酸酯基团，其中Rx和Ry独立地选自烷基或(杂)芳基，优选地Rx和Ry是烷基或者Rx和Ry一起形成3至8元环，任选地包含选自O、N和S的附加的环杂原子。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合具有化学式-CH2-O-C(O)ORx的亚甲基碳酸酯基团，其中Rx选自任选取代的烷基、环烷基以及(杂)芳基基团。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的寡核苷酸，其中Rx选自：低级烷基或环烷基(C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，该寡核苷酸包括2至30个核苷酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，该寡核苷酸包括选自以下各项的核苷：核糖核苷、2’-脱氧核糖核苷、2’-取代的核糖核苷、2’-4’-锁-核糖核苷、3’-氨基-核糖核苷、3’-氨基-2’-脱氧核糖核苷。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸，作为药物前体。
10.一种用于生产具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸的方法，该方法包括：(a)提供根据权利要求1至8中任一项所述的第一寡核苷酸并且(b)从所述第一寡核苷酸切除至少一个R基团以生产所述具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该R基团是通过使该第一寡核苷酸与碱在溶液中进行反应而切除的，该碱优选地选自：烷基、环烷基以及芳香胺，更优选地选自：伯或仲烷基胺，最优选地选自正丙基以及叔丁基胺。
12.根据权利要求10所述的方法，其中该碱是受阻的伯胺。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中该切除是在空间受阻的碱以及激活剂的存在下进行的，该激活剂总体上是N-杂芳香族的碱。
14.根据权利要求24所述的方法，其中该第一碱是烷基伯胺，其中烷基基团具有选自C1至C20直链或支链烷基的多个相同或不同的取代基。根据权利要求24所述的方法，其中该第一碱是芳基伯胺，其中芳基基团在2和/或6位上包括直链或支链的烷基或芳基基团。
15.根据权利要求24或25所述的方法，其中该激活剂是1，2，4-三唑或其他三唑以及四唑衍生物。
16.一种用于将根据权利要求24至26中任一项所述的寡核苷酸进行脱保护的方法，其中该空间受阻的碱是叔丁基胺。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，进一步包括将所述具有至少一个硫代磷酸酯连键的第二寡核苷酸进行纯化。
18.根据权利要求17所述的方法，该方法包括至少使该第二寡核苷酸进行沉淀。
19.根据权利要求17或18所述的方法，进一步包括将该第二寡核苷酸用溶剂进行萃取。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的方法，该方法包括将该第二寡核苷酸溶解在极性有机溶剂中，该溶剂优先选自：二氯甲烷、氯仿、乙腈、丙酮以及吡啶。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所使用的溶剂体积的范围是约0.5(n+1)mL至约2.0(n+1)mL，优选为约1.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中将该第二寡核苷酸的溶液使用非极性有机溶剂进行处理直至该溶液变浑浊，该溶剂优先选自：烃类、醚溶剂以及它们的混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所使用的溶剂体积的范围是约1(n+1)mL至约4(n+1)mL，优选为约2.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中将该浑浊的溶液使用沉淀助剂进行处理。
25.根据权利要求23所述的方法，其中该沉淀助剂是选自多种惰性多孔固体，这些固体优先选自：硅藻土、木炭、木纤维素、以及色谱固定相例如硅胶或氧化铝。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中该沉淀助剂所使用的量值范围是约0.25(n+1)g至约1.5(n+1)g，优选为约0.75(n+1)g，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，加入该沉淀助剂之后，将该混合物使用第二部分的非极性有机溶剂进行处理，其中所述部分的体积的范围总体上是约1(n+1)mL至约4(n+1)mL，优选为约2.0(n+1)mL，其中n是硫代磷酸酯三酯连键的毫摩尔数。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中将在该沉淀步骤中获得的固体材料过滤掉并且洗涤。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中使用溶剂从含寡核苷酸的所述沉淀中萃取该寡核苷酸。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该溶剂包括极性有机溶剂与水性介质的混合物，该极性有机溶剂优先选自乙腈、丙酮、THF、DMF、DMSO以及吡啶，该水性介质优选为水，并且其中极性有机溶剂/水性介质的体积比优选是约0.5至约1.5，更优选约0.7。
31.根据权利要求10所述的方法，其中该R基团在人体或动物体内被切除，该R基团优先选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基氨基甲酸酯基团或亚甲基碳酸酯基团。
32.一种具有化学式R”-S-R的硫化剂，其中R符合以下化学式(I)
Figure FPA00001407137000041
其中A是成对取代的亚烷基基团，优选CH2，X和Y独立地选自S和O，并且R0是选自下组，该组由以下各项组成：任选取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和/或Ry是选自H以及有机残基并且至少Rx是非H取代基。
33.根据权利要求32所述的硫化剂，其中R是选自：亚甲基酰氧基基团、亚甲基氨基甲酸酯基团、或亚甲基碳酸酯基团，并且R”是离去基团。
34.根据权利要求32或33中任一项所述的硫化剂，其中R是如权利要求1至6中任一项中所描述的。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(II)
Figure FPA00001407137000042
其中RA和RB是彼此相同或不同的并且RA和RB中至少一个是选自取代的磺酰基或酰基基团，所述RA和RB任选地一起形成环状取代基。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的硫化剂，其中R”是磺酰胺基团，优选N-取代的N烷基磺酰基。
37.根据权利要求36所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(III)
Figure FPA00001407137000043
其中R1、R3和R4独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，优选直链或支链的烷基或环烷基。
38.根据权利要求32至35中任一项所述的硫化剂，其中R”是二羧基酰胺。
39.根据权利要求38所述的硫化剂，该硫化剂符合以下化学式(IV)
Figure FPA00001407137000051
其中Z是选自下组的基团，该组为：-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH2-O-CH2-、
Figure FPA00001407137000052
优选地Z是
Figure FPA00001407137000053
基团。
40.一种用于合成寡核苷酸的方法，该方法包括使用根据权利要求32至39中任一项所述的硫化剂来硫化所述寡核苷酸的前体的至少一个磷核苷酸间连键。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该磷核苷酸间连键是H-膦酸酯二酯键。
42.根据权利要求41所述的方法，该方法进一步包括通过将H-膦酸酯单酯盐与具有游离羟基的受保护的核苷或寡核苷酸相偶联以形成该H-膦酸酯二酯键。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中该偶联是在溶液相中进行的。
44.一种用于合成根据权利要求32至37中任一项所述的硫化剂的方法，该方法包括：(a)使磺酰卤素，优选磺酰氯，与具有化学式R-S-C(O)-R2的硫缩醛进行反应，其中R是如在权利要求1至6中所述的，并且R2是有机残基，该有机残基优先选自C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，以产生具有化学式R-S-W的中间产物，其中W是卤素，优选Cl；并且(b)使所述中间产物与N-磺酰化合物或N-酰基化合物进行反应。
45.根据权利要求44所述的方法，其中该硫缩醛具有化学式R1-C(O)-O-CH2-S-C(O)-R2，其中R1和R2独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基，并且使所述硫缩醛与磺酰氯进行反应以产生具有化学式R1-C(O)-O-CH2-S-Cl的中间产物，其中R1独立地是C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中在步骤(b)中使该中间产物与具有化学式R3-S(O)2-NH-R4的N-磺酰基化合物进行反应，其中R3和R4独立地是有机残基，优选C1-C20的、任选地不饱和的或芳香族的烃残基。
47.根据权利要求44或45所述的方法，其中在步骤(b)中使该中间产物与具有化学式
Figure FPA00001407137000061
的N-酰基化合物进行反应，其中Z是选自下组的基团，该组为：-CH2-CH-、-CH＝CH-、-CH2-O-CH2-、
Figure FPA00001407137000062
优选地Z是
Figure FPA00001407137000063
基团。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中R1是选自：低级烷基或环烷基(C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团，更优选乙基基团。
49.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中R2、R3和R4是选自：低级烷基或环烷基(C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基团，更优选甲基基团。
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