CN117677435A - 用于测序的不含水凝胶的表面官能化 - Google Patents
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Abstract
本申请的实施方案涉及包含表面结合的叠氮基官能化有机硅烷的基底，其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。还公开了制备用于测序应用的此类基底表面的方法。
Description
技术领域
本公开涉及用于检测和/或分析生物分子(诸如核酸)的具有官能化表面的基底。
序列表的参考
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表以创建于2022年6月13日的名称为“Sequence_listing_ILLINC_564WO.txt”的文件提供，该文件大小为2.21KB。序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。
背景技术
聚合物涂覆的基底用于许多技术应用(包括DNA测序)中。在边合成边测序(SBS)中，用聚合物(诸如官能化水凝胶)涂覆固体支撑件(诸如流通池)的表面，以固定引物寡核苷酸(诸如P5/P7引物)，并且使得能够进行DNA聚类。SBS中使用的水凝胶的一个示例是聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。含有PAZAM的图案化固体支撑件可以使用各种技术(包括纳米压印光刻(NIH))制造。一些技术已经在美国公开第2013/0116153号、第2014/0079923号、第2014/0243224号和第2019/0360041号进行了描述，这些公开中的每一篇通过引用并入。
在标准图案化表面制造过程中，水凝胶凝胶材料或亲水性聚合物材料可沉积在表面上，并且可利用表面上的轮廓和间隙区域的不同疏水/亲水特性来方便地从表面的一些区域移除凝胶材料，同时将凝胶材料保留在所需的特征处。例如，水凝胶凝胶材料可保留在硅烷化孔处，并从孔周围涂覆有疏水氟化或全氟化聚合物的疏水间隙区域移除。用PAZAM层涂覆固体支撑件不仅需要制作过程中的多个步骤，而且可能具有某些非预期的后果和挑战，诸如额外的PAZAM从间隙区域的不完全剥离。
因此，需要开发用于表面官能化的替代方法。历史上，DNA聚类和SBS化学的长循环不能直接发生在固体支撑件表面上，这归因于确保硅烷层类似于所替代的聚合物并且稳定性和稳健性具有可比性的挑战。
发明内容
本公开的一些方面涉及包含表面结合的有机硅烷的基底，其中该表面结合的有机硅烷包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子上，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。
本公开的一些方面涉及包含共价连接至多个生物分子的表面结合的有机硅烷的基底，其中该表面结合的有机硅烷包含与该多个生物分子共价键合的叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。
本公开的另一方面涉及官能化基底表面的方法，该方法包括：将有机硅烷沉积到基底的表面上以形成表面结合的有机硅烷层，其中该表面结合的有机硅烷层包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子，并且其中该方法不包括在有机硅烷沉积之前或之后将水凝胶或亲水性聚合物沉积到基底的表面上。
本公开的另外的方面涉及将寡核苷酸固定至基底的方法，该方法包括：
使多个寡核苷酸与该基底的有机硅烷结合的表面接触，其中该有机硅烷包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物；以及
使该多个寡核苷酸与该有机硅烷的叠氮基反应，以将该寡核苷酸共价连接至该基底。
附图说明
图1示出了通过标准方法制备的基底表面与根据本公开的实施方案的不含聚合物的硅烷化表面之间的比较。
图2是根据本公开的一个实施方案的基底的不含聚合物的硅烷化表面的透视图。
图3示出了根据本公开的一个实施方案的制备用于测序应用的基底表面的无抛光工作流程。
图4示出了在基底的不含聚合物的叠氮基硅烷官能化玻璃或纳米压印平版印刷(NIL)聚合物树脂表面上的稳定性测试结果。
图5示出了当溶液P5引物与标准排阻扩增(ExAmp)表面聚类组合使用时的杂交聚类方案。
图6A是通过根据本公开的一个实施方案的方法制备的流通池表面的荧光图像，其中流通池表面的间隙区域在引物接枝之前被抛光。
图6B是通过根据本公开的一个实施方案的方法制备的流通池表面的荧光图像，其中流通池表面的间隙区域在引物接枝之后被抛光。
图6C是使用根据图6A的方法在循环1之后流通池表面的缩略图图像。
具体实施方式
本公开涉及制备用于捕获感兴趣的生物分子(例如核酸)的图案化表面的替代方法。在特定的实施方案中，该方法产生用于测序应用的不含聚合物的官能化表面。该方法不涉及在基底表面上使用水凝胶或亲水性聚合物涂层以促进感兴趣的生物分子的连接。在特定的实施方案中，该方法不使用聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。无PAZAM层的不含水凝胶的表面允许更简化的基底制作工艺，以及避免特别涉及PAZAM的任何问题。图1示出了根据本公开的一个实施方案的标准PAZAM涂覆的基底表面与不含PAZAM的表面的比较。
本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述主题。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其他形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其他形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
如本文所用，常见的缩写定义如下：
CVD化学气相沉积
dATP三磷酸脱氧腺苷
dCTP三磷酸脱氧胞苷
dGTP三磷酸脱氧鸟苷
dTTP三磷酸脱氧胸苷
PAZAM任何丙烯酰胺与Azapa比率的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)；
SBS边合成边测序
如本文所用，术语“连接”是指两件事情彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，分析物(诸如核酸)可以通过共价键或非共价键连接至材料(诸如凝胶或固体支撑件)上。共价键的特征在于原子之间共享电子对。非共价键是不涉及共享电子对的化学键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所用，术语“阵列”是指连接至一个或多个基底的不同探针(例如探针分子)的群体，使得这些不同探针分子可根据相对位置彼此区分。阵列可包括各自位于基底上的不同可寻址位置处的不同探针。另选地或除此之外，阵列可包括各自带有不同探针的单独基底，其中可根据基底在基底所连接至的表面上的位置或根据基底在液体中的位置来识别不同的探针。其中单独基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中包含珠粒的那些，如例如美国专利第6,355,431B1号、US2002/0102578和PCT公布第WO 00/63437号中所述的。例如，在美国专利第6,524,793号中描述了在本发明中可用于例如使用微流体设备(诸如荧光活化细胞分选器(FACS))区分液体阵列中的珠粒的示例性形式。可用于本发明的阵列的另外的示例包括但不限于美国专利第5,429,807号、第5,436,327号、第5,561,071号、第5,583,211号、第5,658,734号、第5,837,858号、第5,874,219号、第5,919,523号、第6,136,269号、第6,287,768号、第6,287,776号、第6,288,220号、第6,297,006号、第6,291,193号、第6,346,413号、第6,416,949号、第6,482,591号、第6,514,751号和第6,610,482号；WO93/17126、WO 95/11995、WO 95/35505、EP 742 287和EP 799 897中描述的那些阵列。
如本文所用，术语“共价连接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价连接的水凝胶是指与基底的官能化表面形成化学键的水凝胶，这与经由其他方式(例如，粘附或静电相互作用)连接至该表面形成比较。应当理解，共价连接到表面的聚合物也可以经由除共价连接之外的方式键合。
如本文所用，当用作动词时，术语“涂覆”旨在表示在表面上提供层或覆盖物。表面的至少一部分可提供有层或覆盖物。在一些情况下，整个表面可提供有层或覆盖物。在替代情况下，仅表面的一部分将提供有层或覆盖物。当用于描述表面与材料之间的关系时，术语“涂层”旨在表示材料作为层或覆盖物存在于表面上。该材料可以密封该表面，例如，防止液体或气体与该表面接触。然而，该材料不必形成密封。例如，该材料对于液体、气体或液体或气体中携带的一种或多种组分可以是多孔的。可涂覆表面的示例性材料包括但不限于凝胶、聚合物、有机聚合物、液体、金属、第二表面、塑料、二氧化硅或气体。
如本文所用，术语“分析物”旨在包括待检测、表征、修饰、合成等的多种分析物中的任一种。示例性分析物包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA或它们的类似物)、蛋白质、多糖、细胞、核酸、细胞器、抗体、表位、受体、配体、酶(例如，激酶、磷酸酶或聚合酶)、肽、小分子候选药物等。阵列可以包括来自分析物文库的多种不同种类。例如，种类可以是来自抗体文库的不同抗体、来自核酸文库的具有不同序列的核酸、来自蛋白质文库的具有不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子组合文库的候选药物等。
如本文所用，术语“轮廓”旨在表示表面形状的局部变化。示例性轮廓包括但不限于孔、凹坑、通道、杆、柱和脊。轮廓可作为表面中的多种凹入部或表面的凸起中的任一种出现。轮廓的全部或部分可用作阵列中的特征。例如，在固体支撑件的特定平面中出现的轮廓的一部分可以用作该特定平面中的特征。在一些实施方案中，在表面上以规则或重复图案提供轮廓。
当材料在轮廓“内”时，其位于轮廓的空间中。例如，对于孔而言，材料在孔内部，而对于柱或杆而言，材料覆盖在表面的平面上方延伸的轮廓。
在一些实施方案中，当第二层被称为“覆盖”第一层时，第二层是在第一层顶部上的薄膜形式。
如本文所用，当参考核酸使用时，术语“不同”意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两种或更多种核酸可具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。另选地，两种或更多种核酸可具有沿其长度的相当大部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种核酸可具有对于两种或更多种分子不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有在两种或更多种分子上相同的通用序列部分。该术语可类似地应用于基于氨基酸序列差异可区分为彼此不同的蛋白质。
如本文所用，当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“特征”是指阵列中被配置成连接特定分析物的位置。例如，特征可以是表面上的轮廓的全部或一部分。特征可仅含有单一分析物或其可含有数种分析物的群体，任选地数种分析物可为相同种类。在一些实施方案中，特征在连接分析物之前存在于固体支撑件上。在其他实施方案中，特征通过将分析物连接至固体支撑件上而产生。
如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可以进行反应的室、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些实施方案中，室被配置用于检测在室中(例如，在与室流体接触的表面上)发生的反应。例如，室可以包括允许对室中的阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。示例性流通池包括但不限于在核苷酸测序装置中使用的那些流通池，例如用于由因美纳公司(Illumina,Inc.)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))商业化的Genome或/>平台的流通池；或用于由LifeTechnologies(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))商业化的SOLiDTM或IonTorrentTM测序平台的流通池。示例性流通池及其制造和使用方法也描述于例如WO 2014/142841A1、美国专利申请公布第2010/0111768A1号和美国专利第8,951,781号中，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“凝胶材料”旨在表示液体和气体可透过的半刚性材料。通常，凝胶材料在吸收液体时能够溶胀并且在除去液体(例如，通过干燥)时能够收缩。示例性凝胶包括但不限于具有胶体结构的那些凝胶，诸如琼脂糖；具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联的聚合物结构的那些凝胶，诸如聚丙烯酰胺、不含硅烷的丙烯酰胺(参见例如美国专利申请公开第2011/0059865A1号)、PAZAM(参见例如美国专利第9,012,022号，其通过引用并入本文)和在美国专利公开第2015/0005447号和美国申请第14/927,252号中描述的聚合物，所有专利均全文以引用方式并入。特别有用的凝胶材料将符合其所在的孔或其他轮廓的形状。一些有用的凝胶材料既可(a)符合其所在的孔或其他轮廓的形状，又可(b)具有基本上不超过其所在的孔或轮廓的体积的体积。在一些特定实施方案中，凝胶材料是聚合物水凝胶。
如本文所用，术语“间隙区域”是指基底中或表面上与基底或表面的其它区域分开的区域。例如，间隙区域可以将表面上的一个轮廓或特征与另一轮廓或特征分开。彼此分开的两个区域可以为离散的，彼此缺乏接触。在许多实施方案中，间隙区域是连续的，而轮廓或特征部是离散的，例如，就像其他连续表面中的孔的阵列的情况一样。由间隙区域提供的分离可以是部分分离或完全分离。间隙区域通常具有与表面上的轮廓或特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的轮廓可以具有量或浓度超过存在于间隙区域处的量或浓度的凝胶材料或分析物。在一些实施方案中，凝胶材料或分析物可能不存在于间隙区域处。
如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括天然存在的种类或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的骨架。类似结构可具有替代的骨架键，包括本领域已知的多种骨架键中的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如，存在于核糖核酸(RNA)中)。核酸可含有具有本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种的核苷酸。核酸可包括天然的或非天然的核苷酸。就这一点而言，天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包括在核酸或核苷酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。除非另有明确说明，否则术语“探针”或“靶”当参考核酸使用时，旨在作为本文所示的方法或组合物的上下文中核酸的语义标识符并且不一定限制核酸的结构或功能。术语“探针”和“靶”可以类似地应用于其他分析物，诸如蛋白质、小分子、细胞等。
如本文所用，术语“氟化”是指含有至少一个氟原子的分子。如本文所用，术语“全氟化”是指含有两个或更多个氟原子的分子。在一些实施方案中，全氟化分子是其中sp3-杂化碳上的氢原子被氟原子替代的含烃分子。例如，本文所述的某些全氟化聚合物含有全氟烷基或全氟亚烷基部分。
如本文所用，术语“光致抗蚀剂”及其衍生物是指用于在表面上形成图案化涂层的工艺(诸如光刻、光蚀刻或光雕刻)中的光敏材料。当暴露于特定波长的光时，光致抗蚀剂材料改变相对于显影剂溶液的溶解度。光致抗蚀剂层可以由正性(曝光区域变得可溶)或负性(曝光区域变得不可溶)光致抗蚀剂材料构成。
如本文所用，术语“节距”当参考表面上的轮廓或特征使用时，旨在指相邻特征的中心至中心间距。特征的图案可以平均节距来表征。图案可以是有序的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是随机的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一情况下，平均节距可为例如至少约10nm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、100μm或更大，或由前述两个值中的任一个值限定的范围(例如，10nm至100nm、10nm至200nm、200nm至400nm、300nm至500nm)。另选地或除此之外，平均节距可为例如至多约100μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.1μm或更小，或由前述两个值中的任一个值限定的范围。当然，特征的特定图案的平均节距可介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。
如本文所用，术语“表面”旨在表示固体支撑件或凝胶材料的外部部分或外部层。该表面可与另一种材料接触，该另一种材料诸如气体、液体、凝胶、聚合物、有机聚合物、类似或不同材料的第二表面、金属或涂层。表面或其区域可为基本上平坦的或平面的。该表面可具有表面轮廓，诸如孔、凹坑、通道、脊、凸起区域、钉、杆等。
如本文所用，术语“凹入部”是指图案化支撑件中的离散凹面特征，该离散凹面特征具有完全被图案化支撑件表面的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。
如本文所用，术语“基底”或“固体支撑件”是指不溶于水性液体的刚性基底。该基底可以为无孔的或多孔的。该基底可任选地能够吸收液体(例如，由于孔隙率)，但是通常将足够刚性，使得基底在吸收液体时不显著膨胀，并且在通过干燥移除液体时基本上不收缩。无孔固体载体一般来讲对液体或气体不可渗透。示例性固体支撑件包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(例如丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。对于一些实施方案特别有用的固体支撑件是流通池的组件或位于流通池装置内。
如本文所用，术语“孔”是指固体支撑件中的离散轮廓，该离散轮廓具有完全被表面的一个或多个空隙区域包围的表面开口。孔可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的孔的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。在一些实施方案中，孔是微孔或纳米孔。
P5和P7引物在用于测序的因美纳公司销售的商业流通池的表面上使用。合适的引物的具体示例包括P5和/或P7引物，其用于因美纳公司销售的商业流通池的表面上，以用于在HiSeqTM、HiSeqXTM、MiSeqTM、MiSeqDXTM、MiNISeqTM、NextSeqTM、NextSeqDXTM、NovaSeqTM、Genome AnalyzerTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。引物序列描述于美国专利公布第2011/0059865A1号中，该专利公布以引用方式并入本文。P5和P7引物序列包括以下：
成对末端组：
P5：成对末端5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ ID NO.1)
P7：成对末端5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.2)
单个读段组：
P5：单个读段5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO.3)
P7：单个读段5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.4)
在一些实施方案中，P5和P7引物可以在5'末端包含接头或间隔区。可以包括此类接头或间隔区，以便允许裂解，或者赋予一些其他所需的特性，例如以实现与聚合物或固体支撑件的共价连接，或用作间隔区以将裂解位点定位成与固体支撑件相距最佳距离。在某些情况下，10个至50个间隔区核苷酸可以定位于P5或P7引物与聚合物或固体支撑件的连接点之间。在一些实施方案中，使用聚T间隔区，但也可以使用其他核苷酸以及它们的组合。TET是染料标记的具有与P5/P7引物互补的序列的寡核苷酸。TET可与表面上的P5/P7引物杂交；可以洗掉过量的TET，并且可以使用扫描仪器(诸如台风扫描仪(Typhoon Scanner)(通用电气公司(General Electric)))通过荧光检测来测量连接的染料浓度。除P5/P7引物外，测序引物序列的其他非限制性示例(诸如P15/P17引物)也已公开于美国公开第2019/0352327号中。另外，引物PA、引物PB、引物PC和引物PD已公开于美国序列号63/128,663中。这些额外的测序引物包括以下：
P15：5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAT*CTACAC(SEQ.ID.NO.5)，其中T*是指烯丙基改性的T
P17引物5'→3'
YYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.6)，其中Y是经受化学裂解的二醇接头，例如通过用试剂(诸如高碘酸盐)氧化，如在美国公开第2012/0309634号中公开的，该公开的全文通过引用方式并入。
PA：5'→3'
GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG(SEQ ID NO.7)
PB：5'→3'
CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT(SEQ ID NO.8)
PC：5'→3'
ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT(SEQ ID NO.9)
PD：5'→3'
GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC(SEQ ID NO.10)
应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基或二基。例如，当取代基需要两个与分子其余部分的连接点时，应当理解，该取代基为二基。例如，被识别为需要两个连接点的烷基的取代基包括二基，诸如-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-等。其他基团命名惯例清楚地指示该基团为二基，诸如“亚烷基”或“亚烯基”。
如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”是指烷基、烯基或炔基基团中的碳原子数，或环烷基或芳基基团的环原子数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的环和芳基的环可以含有“a”至“b”个(包括端值在内)的碳原子。例如，“C1至C4烷基”基团是指具有1个至4个碳的所有烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-；C3至C4环烷基基团是指具有3至4个碳原子的所有环烷基基团，即环丙基和环丁基。类似地，“4至6元杂环基”基团是指具有4至6个总环原子的所有杂环基基团，例如氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噁唑啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉等。如果对于烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基基团没有指定“a”和“b”，则将假设这些定义中描述的最广泛范围。如本文所用，术语“C1-C6”包括C1、C2、C3、C4、C5和C6，以及由这两个数字中的任一者定义的范围。例如，C1-C6烷基包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基、C2-C6烷基、C1-C3烷基等。类似地，C2-C6烯基包括C2烯基、C3烯基、C4烯基、C5烯基和C6烯基、C2-C5烯基、C3-C4烯基等；并且C2-C6炔基包括C2炔基、C3炔基、C4炔基、C5炔基和C6炔基、C2-C5炔基、C3-C4炔基等。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可以具有1个至30个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至30”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1个至30个碳原子”意味着烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括30个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的烷基。烷基基团还可以是具有1个至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1个至6个碳原子的低级烷基。仅以举例的方式，“C1-C6烷基”表示烷基链中存在一个至六个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2个至30个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的烯基。烯基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被命名为“C2-C6烯基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-C6烯基”指示烯基链中存在两个至六个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2个至30个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“炔基”。炔基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的炔基。炔基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小炔基。炔基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被命名为“C2-C6炔基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-C6炔基”表示炔基链中存在两个至六个碳原子，即，炔基链选自由乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基组成的组。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
如本文所用，“杂烷基”是指在链骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的直链或支链烃链。杂烷基基团可以具有1个至30个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂烷基”。杂烷基基团还可以是具有1个至9个碳原子的中等大小杂烷基。杂烷基基团还可以是具有1个至4个碳原子的低级杂烷基。
如本文所用，“亚烷基”意指仅含有碳和氢的支链或直链完全饱和的双自由基化学基团，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。亚烷基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的亚烷基。亚烷基基团还可以是具有1个至9个碳原子的中等大小亚烷基。亚烷基基团还可以是具有1个至6个碳原子的低级亚烷基。
如本文所用，术语“杂亚烷基”是指其中亚烷基的一个或多个骨架原子选自除碳以外的原子(例如，氧、氮、硫、磷或它们的组合)的亚烷基链。
如本文所用，“亚烯基”是指仅含有碳和氢并且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链双自由基化学基团，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。亚烯基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的亚烯基。亚烯基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小亚烯基。亚烯基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级亚烯基。
如本文所用，“亚炔基”是指仅含有碳和氢并且含有至少一个碳-碳三键的直链或支链双自由基化学基团，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。亚炔基基团可以是具有10个至30个碳原子的较大大小的亚炔基。亚炔基基团还可以是具有2个至9个碳原子的中等大小亚炔基。亚炔基基团还可以是具有2个至6个碳原子的低级亚炔基。
术语“芳族”是指具有共轭π电子体系的环或环系，并且包括碳环芳族基团(例如，苯基)和杂环芳族基团(例如，吡啶)这两者。该术语包括单环基团或稠环多环(即，共用相邻原子对的环)基团，前提条件是整个环系是芳族的。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C6-C10芳基”、“C6或C10芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。
如本文所用，“亚芳基”是指仅含有碳和氢的芳环或环系，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。
如本文所用，“杂亚芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子的芳环或环系，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。
如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。杂原子可以存在于环系中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环元(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环基”。杂环基基团也可以是具有3个至10个环元的中等大小杂环基。杂环基基团也可以是具有3个至6个环元的杂环基。杂环基基团可以被命名为“3至6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的示例包括但不限于氮杂环庚烯基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。
如本文所用，“杂亚环基”意指含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系，其经由两个连接点与分子的其余部分连接。
如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“碳环基”。碳环基基团也可以是具有3至10个碳原子的中等大小碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被命名为“C3-C6碳环基”或类似的名称。碳环基环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。
如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，“亚环烷基”意指经由两个连接点与分子的其余部分连接的完全饱和的碳环或环系。
如本文所用的术语“叠氮基”是指-N3基团。
当基团被描述为“任选地取代的”时，其可以是未取代的或取代的。同样，当基团被描述为“取代的”时，取代基可以选自所指示的取代基中的一者或多者。如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，该取代基独立地选自：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C7碳环基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、C3-C7碳环基-C1-C6-烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基-C1-C6-烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、(芳基)C1-C6烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、(5-10元杂芳基)C1-C6烷基(任选地被卤代基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、卤代基、-CN、羟基、C1-C6烷氧基、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、-O(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基；(C1-C6卤代烷氧基)C1-C6烷基；-O(C1-C6卤代烷氧基)C1-C6烷基；芳氧基、巯基(氢硫基)、卤代(C1-C6)烷基(例如，-CF3)、卤代(C1-C6)烷氧基(例如，-OCF3)、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基、-SO3H、磺酸根、硫酸根、亚磺基、-OSO2C1-4烷基、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。
根据上述定义，可理解本文所述的和在权利要求中列举的实施方案。
不含水凝胶的基底
本公开的一些方面涉及包含表面结合的有机硅烷的基底，其中该表面结合的有机硅烷包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子上，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。
在一些实施方案中，接头部分包括疏水区域和亲水区域。图2是根据本公开的一个实施方案的基底的不含水凝胶的硅烷化表面的透视图，其中叠氮基所连接的接头部分的至少一部分包含疏水区域和亲水区域。在一些此类实施方案中，接头的亲水区域可包含一个或多个氧乙烯单元。在一些此类实施方案中，接头的疏水区域可包含脂族碳(诸如C1-C30亚烷基、C2-C30亚烯基或C2-C30亚炔基)，其为直链或支链。在一些实施方案中，表面结合的有机硅烷形成缩合有机硅烷层，或至少部分交联或交联的硅烷层。在一些此类实施方案中，硅烷层具有一定程度的分子间交联，这可提供防止无意水解的保护。例如，疏水区域可用作抗水解的保护层，而亲水区域提供具有更少非特异性结合的更高扩增效率的所需条件。在一些实施方案中，可通过使用湿化学将有机硅烷引入到表面而不是气相硅烷沉积来实现或控制交联度。在其他实施方案中，可通过在有机硅烷的亲水区域中引入化学官能团以允许分子间相互作用来实现或控制交联度。在一些实施方案中，至少部分交联的或交联的硅烷层提供增强的表面稳定性。
在一些实施方案中，表面结合的有机硅烷包括多种结构：
其中接头包括任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基、任选取代的杂亚芳基、任选取代的杂亚环基或它们的组合。在一些此类实施方案中，接头包括亚烷基或-(CH2CH2O)m-或它们的组合，其中m为整数1至10。在一个实施方案中，接头部分包括直链C11亚烷基。如此处所绘示，波浪线与-O连接(即)是指该氧原子可以连接至表面上，或者连接至另一个硅原子上。换句话说，表面结合的有机硅烷可具有与表面的单氧或双氧键。
在一些实施方案中，表面结合的有机硅烷与多个生物分子共价连接。在一些此类实施方案中，多个生物分子包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽、氨基酸或蛋白质或它们的组合。在一些实施方案中，多个生物分子中的每个生物分子包含可与有机硅烷的叠氮基反应以形成共价键合的官能团。例如，生物分子可包含炔基基团，并且表面结合的有机硅烷的叠氮基与生物分子的炔基基团形成三唑部分：
其中星号*指示有机硅烷与生物分子的其余部分的连接点。在一些其他实施方案中，生物分子可以用可与有机硅烷的叠氮基反应的其他官能团官能化，该官能团例如卤素、羟基、羧基、环氧基、环炔烃部分(诸如二苯并环辛炔基团(DBCO)或双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN))、环烯烃(诸如降冰片烯)、杂环烯烃或杂环炔烃(诸如DBCO-胺)、乙烯基、丙烯酰基、氮烯、醛、肼基、碳烯、异氰酸酯或马来酰亚胺或它们的组合。
在一些其他实施方案中，表面结合的含叠氮基的有机硅烷通过第二接头部分共价连接至多个生物分子上。在一些此类实施方案中，本文所述的有机硅烷的叠氮基将首先与双官能接头组分的第一官能团反应，然后生物分子通过与双官能接头组分的第二官能团反应而共价键合至第二接头部分。另选地，生物分子通过与双官能接头组分的第一官能团反应而共价键合至双官能接头，然后双官能接头的第二官能团加上生物分子与有机硅烷的叠氮基反应，以将生物分子共价连接至表面上。类似于本文所述的叠氮基有机硅烷的接头部分，第二接头部分也可含有亲水区域和/或疏水区域。第二接头部分的疏水区域可包含脂族碳(诸如C1-C30亚烷基、C2-C30亚烯基或C2-C30亚炔基)，其为直链或支链。第二接头部分的亲水区域可包含一个或多个氧乙烯单元(也称为PEG单元)。
在一些实施方案中，本文所述的接头部分还可以含有支链结构，其中一个接头部分与多个叠氮基连接。在一些其他实施方案中，本文所述的接头部分可与一个或多个接头部分(各自连接至不同的硅原子，例如双足硅烷结构)会聚，并且叠氮基共价键合至两个或更多个接头部分的会聚位置。
在一些实施方案中，生物分子包含寡核苷酸。在一些此类实施方案中，多个生物分子是寡核苷酸，各自包含间隔区和用于与模板多核苷酸杂交的衔接子序列。在一些此类实施方案中，表面结合的有机硅烷与第一多个第一寡核苷酸和第二多个第二寡核苷酸共价连接。如上所讨论的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的示例可包括用于现有SBS过程的引物。合适的引物的具体示例包括P5和/或P7引物，其用于因美纳公司销售的商业流通池的表面上，以用于在HiSeqTM、HiSeqXTM、MiSeqTM、MiSeqDXTM、MiNISeqTM、NextSeqTM、NextSeqDXTM、NovaSeqTM、Genome AnalyzerTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。引物序列描述于美国专利公布第2011/0059865A1号，该专利公布以引用方式并入。在一些实施方案中，P5引物包括AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(SEQ ID No.1)、AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQID NO.5)或AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID No.3)的5'至3'寡核苷酸序列。P7引物包括CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID No.2)或CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.4)的5'至3'的寡核苷酸序列。在一些进一步的实施方案中，第一寡核苷酸包括P5引物序列。在一些进一步的实施方案中，第二寡核苷酸包括P7引物序列。在进一步的实施方案中，模板多核苷酸的一部分包括与如上公开的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸对应或互补的核苷酸序列，如上公开的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可具有例如与P5或P7引物序列对应或互补的序列。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸的间隔区包含10个至50个核苷酸、脂族烃链、PEG(即，-(CH2CH2O)n-，其中n是整数1至10)或它们的组合。在进一步的实施方案中，间隔区包含10个至50个T核苷酸、C1-10亚烷基或它们的组合。在具体示例中，间隔区可包含10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个T核苷酸和C1亚烷基、C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基、C6亚烷基。在一个示例中，间隔区包含30个T核苷酸和C3亚烷基。
作为非限制性示例，如本文所述用于测序应用的基底可包括在前述SBS平台或其他平台中的任一种中使用的基底。作为非限制性示例，这种基底可以是流通池。如本文所用，术语“流通池”旨在表示具有其中可以进行反应的室(即，流动通道)、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，室使得能够检测在室中发生的反应或信号。例如，室可以包括允许对室中的阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。如本文所用，“流动通道”或“流动通道区”可以是限定在两个粘结部件之间的区域，该区域可以选择性地接收液体样品。在一些示例中，流动通道可限定在图案化支撑件与盖之间，因此可与限定在图案化支撑件中的一个或多个凹入部流体连通。在其他示例中，流动通道可限定在非图案化支撑件与盖之间。在一些实施方案中，基底是包含孔(例如，纳米孔)的阵列的图案化基底。在此类实施方案中，图案化纳米孔被间隙区域分开，并且其中多个生物分子存在于图案化纳米孔内部。
术语流通池“支撑件”或“基底”是指可在其上添加表面化学物质的支撑件或基底。术语“图案化基底”是指凹入部限定在其中或在其上的支撑件。术语“非图案化基底”是指基本上平面的支撑件。基底在本文中也可称为“支撑件”、“图案化支撑件”或“非图案化支撑件”。支撑件可以是晶片、面板、矩形片材、管芯或任何其他合适的构型。支撑件通常为刚性的并且不溶于水性液体。支撑件可对用于修饰凹入部的化学物质呈惰性。例如，支撑件可以对用于形成聚合物涂层、将引物连接至诸如已沉积的聚合物涂层等的化学物质呈惰性。合适的支撑件的示例包括环氧硅氧烷、玻璃及改性或功能化的玻璃、多面体寡聚倍半硅氧烷(POSS)及其衍生物、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自科慕公司(Chemours)的)、环状烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自瑞翁株式会社(Zeon)的/>)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(TaO5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HaO2)、碳、金属、无机玻璃等。支撑件还可以是玻璃或硅或硅基聚合物(诸如POSS材料)，任选地在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。POSS材料可以是Kejagoas等人，微电子工程(Microelectronic Engineering)86(2009)776-668中所公开的POSS，该文献全文以引用方式并入。在一些实施方案中，基底或固体支撑件包括玻璃、改性或功能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性的硅、碳、金属、无机玻璃和光纤束。在特定实施方案中，基底是流通池、纳米粒子或珠粒，包括但不限于球形二氧化硅珠粒、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、基于镉的点和无镉点，或17/130,494中公开的珠粒。
在一个示例中，凹入部可以是孔，使得图案化基底在其表面上包括孔阵列。孔可以是微孔或纳米孔。每个孔的尺寸可通过其体积、孔开口面积、深度和/或直径来表征。
每个孔可以具有能够限制流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池的下游使用所期望的通量(例如复用度)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以为至少约1×10-3μm3、约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3、约100μm3或更大。另选地或除此之外，体积可以是至多约1×104μm3、约1×103μm3、约100μm3、约10μm3、约1μm3、约0.1μm3或更小。表面上每个孔开口所占据的面积可基于与上述孔体积类似的标准来选择。例如，每个孔开口在表面上的面积可以为至少约1×10-3μm2、约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、约10μm2、约100μm2或更大。另选地或除此之外，面积可以为至多约1×103μm2、约100μm2、约10μm2、约1μm2、约0.1μm2、约1×10-2μm2或更小。每个孔开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。每个孔的深度可以为至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个孔14'的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个孔的直径可以为至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。另选地或除此之外，直径可以为至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小(例如，约50nm)。直径可以为约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约900nm、约950nm、约1μm、约1.25μm、约1.5μm、约1.74μm、约2μm、约2.25μm、约2.5μm、约2.75μm、约3μm、约3.25μm、约3.5μm、约3.75μm、约4μm、约4.25μm、约4.5μm、约4.75μm、约5μm、约5.25μm、约5.5μm、约5.75μm、约6μm、约6.25μm、约6.5μm、约6.75μm、约7μm、约7.25μm、约7.5μm、约7.75μm、约8μm、约8.25μm、约8.5μm、约8.75μm、约9μm、约9.25μm、约9.5μm或约9.75μm。每个孔的直径可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。如本文所用的术语的纳米孔旨在表示具有最大直径为约1μm或更小的圆形开口的孔。
在本文所述的基底的任何实施方案中，基底不含或基本上不含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
本公开的一些另外的方面涉及包含共价连接至多个生物分子的表面结合的有机硅烷的基底，其中该表面结合的有机硅烷包含与该多个生物分子共价键合的叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。在一些实施方案中，生物分子是寡核苷酸。在进一步的实施方案中，多个生物分子包括寡核苷酸，例如，第一多个第一寡核苷酸和第二多个第二寡核苷酸。在进一步的实施方案中，第一寡核苷酸包含本文所述的P5引物序列。在一些进一步的实施方案中，第二寡核苷酸包含本文所述的P7引物序列。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸还可包含如本文所述的间隔区。在另外的实施方案中，基底还包含与第一多个第一寡核苷酸的至少一部分和/或第二多个第二寡核苷酸的至少一部分杂交的多个模板多核苷酸。模板多核苷酸包括与如上公开的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸对应或互补的核苷酸序列，如上公开的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸具有例如与P5或P7引物序列对应或互补的序列。在一些进一步的实施方案中，基底包含扩增的模板多核苷酸或其互补体(“簇”)。
可将模板多核苷酸作为从样品中获得模板多核苷酸的过程的一部分来处理。处理部分可包括将多核苷酸或寡核苷酸序列添加到诸如模板的5'末端、3'末端或两端以帮助进行亚序列SBS处理。模板多核苷酸可具有适于在SBS过程中获得测序信息的任何给定长度。例如，模板多核苷酸可以是长度约50个核苷酸、长度约75个核苷酸、长度约100个核苷酸、长度约125个核苷酸、长度约150个核苷酸、长度约175个核苷酸、长度约200个核苷酸、长度约225个核苷酸、长度约250个核苷酸、长度约275个核苷酸、长度约300个核苷酸、长度约325个核苷酸、长度约350个核苷酸、长度约375个核苷酸、长度约400个核苷酸、长度约425个核苷酸、长度约450个核苷酸、长度约475个核苷酸或长度约500个核苷酸。
不含水凝胶的表面的制备
本公开的另一方面涉及官能化基底表面的方法，该方法包括：将有机硅烷沉积到基底的表面上以形成表面结合的有机硅烷层，其中该表面结合的有机硅烷层包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至有机硅烷的硅原子。在一些此类实施方案中，该方法不包括在有机硅烷沉积之前或之后将水凝胶或亲水性聚合物沉积到基底的表面。在一些此类实施方案中，通过湿化学将有机硅烷沉积到基底的表面上。例如，将有机硅烷溶解在溶剂或溶剂混合物中，并将表面浸入溶剂或溶剂混合物中。在一些此类实施方案中，通过化学气相沉积(CVD)将有机硅烷沉积到表面上。湿化学的使用允许硅烷层的一定程度的分子间交联，这可以改善表面稳定性、模板扩增效率和表面与SBS化学的相容性。
在本文所述方法的一些实施方案中，基底的表面是包含间隙区域和纳米孔的图案化表面，其中纳米孔被间隙区域分开，如本文所述。在一些实施方案中，接头部分包含如本文所述的疏水区域和亲水区域。在一些此类实施方案中，接头的亲水区域可包含一个或多个氧乙烯单元。在一些此类实施方案中，接头的疏水区域可包含脂族碳(诸如C1-C30亚烷基、C2-C30亚烯基或C2-C30亚炔基)，其为直链或支链。在一些实施方案中，本文所述的方法提供缩合有机硅烷层，或至少部分交联或交联的硅烷层。在一些实施方案中，表面结合的有机硅烷包括多种结构：
其中接头包括任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基、任选取代的杂亚芳基或任选取代的杂亚环基或它们的组合。在一些此类实施方案中，接头部分包含亚烷基或-(CH2CH2O)m-或它们的组合，其中m为整数1至10。在一个实施方案中，接头部分包括直链C11亚烷基。
在一些实施方案中，该方法还包括在有机硅烷层上接枝多个生物分子。在一些此类实施方案中，多个生物分子包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽、氨基酸或蛋白质或它们的组合。生物分子可包含允许与有机硅烷的叠氮基共价键合的官能团，例如，生物分子的官能团可包括炔烃部分、环炔烃部分(诸如二苯并环辛炔基团(DBCO)或双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN))、环烯烃(诸如降冰片烯)、杂环烯烃或杂环炔烃(诸如DBCO-胺)、乙烯基、丙烯酰基、氮烯、醛、肼基、碳烯、异氰酸酯或马来酰亚胺或它们的组合。在一个实施方案中，多个寡核苷酸的每个寡核苷酸包含炔基基团，并且有机硅烷的叠氮基与寡核苷酸的炔基基团形成三唑部分。在进一步的实施方案中，生物分子是多种寡核苷酸。在一些此类实施方案中，寡核苷酸各自包含间隔区和用于与模板多核苷酸杂交的衔接子序列。在一些进一步的实施方案中，多个寡核苷酸包含如本文所述的第一多种第一寡核苷酸和第二多种第二寡核苷酸。在进一步的实施方案中，第一寡核苷酸包含本文所述的P5引物序列。在一些进一步的实施方案中，第二寡核苷酸包含本文所述的P7引物序列。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸还可包含如本文所述的间隔区。在一些实施方案中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸的间隔区包含10个至50个核苷酸、脂族烃链、PEG(即，-(CH2CH2O)n-，其中n是整数1至10)或它们的组合。在进一步的实施方案中，间隔区包含10个至50个T核苷酸、C1-10亚烷基或它们的组合。在具体示例中，间隔区可包含10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个T核苷酸和C1亚烷基、C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基、C6亚烷基。在一个示例中，间隔区包含30个T核苷酸和C3亚烷基。
在一些实施方案中，方法可包括在接枝生物分子之前将本文所述的双官能接头组分连接至叠氮基。因此，表面结合的含叠氮基的有机硅烷通过第二接头部分共价连接至每个生物分子。另选地，首先通过使双官能接头组分的第一官能团与生物分子的官能团反应而将双官能接头组分共价连接至每个生物分子上，然后通过使双官能接头组分的其余官能团与表面结合的有机硅烷的叠氮基反应而将生物分子接枝在表面上。
在一些实施方案中，该方法还包括从间隙区域移除有机硅烷层，使得在接枝寡核苷酸之前有机硅烷仅存在于纳米孔内部。在一些其他实施方案中，在接枝多个寡核苷酸的之后，从间隙区域移除有机硅烷和寡核苷酸。在接枝生物分子之前或之后从表面移除有机硅烷可以通过抛光步骤实现。
作为涉及抛光步骤以从图案化表面的间隙区域移除有机硅烷层的方法的替代方法，图3示出了用于产生图案化表面的剥离图案化工作流程。首先，诸如铝(Al)的牺牲层或光致抗蚀剂301被选择性地沉积在表面的间隙区域上。然后，将如本文所述的有机硅烷(例如，叠氮基硅烷302)沉积在基底的整个表面上，包括纳米孔300和间隙区域两者。第三，剥离间隙区域上的牺牲层(包括沉积在牺牲层顶部上的有机硅烷)，在纳米孔300中留下剩余的叠氮基硅烷302，用于与寡核苷酸303(例如，P5/P7引物)反应，以及下游应用，诸如聚类测序。可用于该无抛光工作流程中的基底类型不限于NIL或玻璃基底。也可使用含有其他材料的表面，该材料诸如多面体寡聚倍半硅氧烷(POSS)及其衍生物、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自科慕的)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自瑞翁株式会社的)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
本公开的另外的方面涉及将寡核苷酸固定至基底的方法，该方法包括：
使多个寡核苷酸与如本文所述的基底(例如，包含由间隙区域分开的多个纳米孔的图案化基底)的有机硅烷结合的表面接触，其中该有机硅烷包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至该有机硅烷的硅原子，并且其中该基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物；以及
使该多个寡核苷酸与该有机硅烷的该叠氮基反应，以将该寡核苷酸共价连接至该基底。
在一些实施方案中，多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸包含间隔区和与模板多核苷酸序列的至少一部分互补的衔接子序列。在一些此类实施方案中，多个寡核苷酸包含如本文所述的第一多种第一寡核苷酸和第二多种第二寡核苷酸。在进一步的实施方案中，第一寡核苷酸包含本文所述的间隔区和P5引物序列。在一些进一步的实施方案中，第二寡核苷酸包含本文所述的间隔区和P7引物序列。在一些实施方案中，第一或第二多个寡核苷酸的间隔区包含10个至50个核苷酸、脂族烃链或它们的组合。在进一步的实施方案中，间隔区包含10个至50个T核苷酸、C1-10亚烷基或它们的组合。在具体示例中，间隔区可包含10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个T核苷酸和C1亚烷基、C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基、C6亚烷基。在一个示例中，间隔区包含30个T核苷酸和C3亚烷基。在本文所述的寡核苷酸(例如，引物)的间隔区的任何实施方案中，间隔区长度为至少7个核苷酸。在进一步的实施方案中，间隔区长度为至少10个、15个、20个、25个或30个核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸的浓度为约1μM至约100μM、约2μM至约50μM、约5μM至约25μM或约10μM(接枝浓度)。
在一些实施方案中，该方法还包括使固定的寡核苷酸与多种模板多核苷酸接触；以及使该模板多核苷酸扩增。在一些实施方案中，扩增方法包括因美纳的ExAmp(排阻扩增)。排阻扩增允许在簇生成期间同时接种(DNA链在纳米孔中的着陆)和扩增，这降低了多个文库片段在单个簇中扩增的机会。扩增过程也被称为聚类过程。对于聚类程序，可诸如在样品制备期间对模板多核苷酸进行修饰，以在其3'末端和5'末端中的一者或两者处包括一个或多个核苷酸序列。例如，每个模板在3'末端包含能够与第一寡核苷酸杂交的序列并且在5'末端包含能够与第二寡核苷酸杂交的互补序列。然后可在基底表面上合成模板核苷酸和与模板核苷酸互补的核苷酸序列的一个或多个拷贝，从而形成簇。在一些此类实施方案中，此类聚类可导致形成单克隆簇。使用第一寡核苷酸和第二寡核苷酸扩增多个不同的模板多核苷酸产生多核苷酸的聚类阵列。
在一些实施方案中，扩增方法包括在ExAmp期间将游离的第一寡核苷酸的溶液流至寡核苷酸接枝表面上。在一些进一步的实施方案中，溶液中第一寡核苷酸的浓度为约1μM至约100μM、约2μM至约50μM、约5μM至约25μM或约10μM(接枝浓度)。
在一些实施方案中，基底包括流通池。在其他实施方案中，基底是纳米颗粒或珠粒，然后在颗粒上发生SBS。
在本文所述方法的任何实施方案中，该方法不包括将水凝胶或亲水性聚合物沉积至表面以促进感兴趣的生物分子(例如，寡核苷酸引物)的捕获。
测序应用
一些实施方案涉及使用通过本文所述的方法制备的具有图案化表面的基底来检测分析物的方法。在一些实施方案中，分析物选自核酸、多核苷酸、蛋白质、抗体、抗体的表位、酶、细胞、细胞核、细胞器或小分子药物。在一个实施方案中，分析物是多核苷酸。在一个实施方案中，检测包括确定多核苷酸的核苷酸序列。
使用核酸的一些实施方案可包括在基底上扩增核酸的步骤。许多不同的DNA扩增技术可与本文所述的基底结合使用。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多置换扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。在特定的实施方案中，用于扩增的一种或多种寡核苷酸引物可以连接至基底上(例如经由叠氮基硅烷层)。在PCR实施方案中，用于扩增的引物中的一者或两者可以连接至基底。利用两种连接的引物的形式通常被称为桥扩增，因为双链扩增子在两个连接的侧接已被拷贝的模板序列的引物之间形成桥样结构。可用于桥扩增的示例性试剂和条件描述于例如美国专利第5641658号、美国专利公布第2002/0055100号、美国专利第7,115,400号、美国专利公布第2004/0096853号；美国专利公布第2004/0002090号；美国专利公布第2007/0128624号；美国专利公布第2008/0009420号，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文中。
PCR扩增也可以用连接至基底的一种扩增引物和溶液中的第二引物进行。使用一种连接的引物和可溶性引物的组合的示例性形式是乳液PCR，如例如在Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145或美国专利公开第2005/0130173号或第2005/0064460号中描述，这些专利中的每一篇以引用方式并入本文中。乳液PCR是该形式的示例，并且应当理解，为了本文所述方法的目的，乳液的使用是任选的，并且实际上几个实施方案不使用乳液。此外，引物不需要如在ePCR参考文献中所述直接连接至基质或固体支撑件上，而是可以如本文所述连接至凝胶或聚合物涂层上。
RCA技术可以被修改以用于本公开的方法。可以用于RCA反应的示例性组分和RCA产生扩增子的原理描述于例如Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)和US2007/0099208 A1，这些文献中的每一篇以引用方式并入本文中。用于RCA的引物可以在溶液中或连接至凝胶或聚合物涂层。
MDA技术可以被修改以用于本公开的方法。MDA的一些基本原理和有用条件描述于例如Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)；Lage等人，Genome Research13:294-307(2003)；Walker等人，病毒检测的分子方法(Molecular Methods for VirusDetection)，美国学术出版社(Academic Press,Inc.),1995；Walker等人，Nucl.AcidsRes，第20卷：第1691-1696页(1992年)；US 5,455,166、US 5,130,238以及US 6,214,587，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文中。用于MDA的引物可以在溶液中或连接至凝胶或聚合物涂层。
在特定的实施方案中，可以使用上述示例的扩增技术的组合。例如，RCA和MDA可以组合使用，其中RCA用于在溶液中生成多联体扩增子(例如使用溶液相引物)。然后扩增子可以使用连接至基底(例如，经由凝胶或聚合物涂层)的引物来用作MDA的模板。在该示例中，在组合的RCA和MDA步骤后产生的扩增子将连接至基底。
含有核酸阵列的本公开的基底可用于多种目的中的任一种目的。核酸的特别所需的用途是用作与具有互补序列的靶核酸杂交的捕获探针。靶核酸一旦与捕获探针杂交就可被检测到，例如，经由募集到捕获探针的标记。经由与捕获探针杂交来检测靶核酸的方法在本领域中是已知的，并且包括例如在美国专利第7,582,420号、第6,890,741号、第6,913,884号或第6,355,431号；或美国专利公布第2005/0053980A1号、第2009/0186349A1号或第2005/0181440A1号中描述的那些方法方法，这些专利中的每一篇通过引用并入本文中。例如，通过捕获探针与携带标记的靶探针的杂交，可以将标记募集至捕获探针。在另一个示例中，可通过使靶探针与捕获探针杂交来将标记募集至捕获探针，使得捕获探针可通过连接至标记的寡核苷酸(例如，经由连接酶活性)或通过添加标记的核苷酸(例如，经由聚合酶活性)来延伸。
在一些实施方案中，本文所述的基底可用于确定多核苷酸的核苷酸序列。在此类实施方案中，该方法可包括以下步骤：(a)在聚合酶(例如，DNA聚合酶)的存在下，使基底连接的多核苷酸/拷贝多核苷酸复合物与一种或多种不同类型的核苷酸接触；(b)将一种类型的核苷酸掺入到所述拷贝多核苷酸链中以形成延伸的拷贝多核苷酸；(c)对一个或多个延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；其中重复步骤(a)至步骤(c)，从而确定基底连接的多核苷酸的序列。
核酸测序可用于通过本领域已知的各种方法确定多核苷酸的核苷酸序列。在一种优选的方法中，利用边合成边测序(SBS)来确定连接至基底表面的多核苷酸的核苷酸序列(例如，经由本文所述的聚合物涂层中的任何一种聚合物涂层)。在这种方法中，向与多核苷酸聚合酶相关的模板多核苷酸提供一个或多个核苷酸。多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸掺入到与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。从与模板多核苷酸的一部分或与共价结合在模板多核苷酸的一端的通用或非可变核酸的一部分互补的寡核苷酸引物开始合成。当针对模板多核苷酸掺入核苷酸时，产生可检测的信号，该信号允许确定在测序过程的每个步骤期间已掺入哪个核苷酸。以此方式，可产生与模板多核苷酸的至少一部分互补的核酸序列，从而允许确定模板多核苷酸的至少一部分的核苷酸序列。
流通池提供用于容纳阵列的方便形式，该阵列通过本公开的方法产生并且经受涉及循环中重复递送试剂的边合成边测序(SBS)或其他检测技术。例如，为了开始第一SBS循环，一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以流入/通过容纳通过本文所述方法制得的核酸阵列的流通池。可以检测其中引物延伸引起标记的核苷酸掺入的那些阵列位点。任选地，核苷酸还可以包括一旦将核苷酸添加到引物就终止进一步的引物延伸的可逆终止属性。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物，使得后续的延伸直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以将解封闭试剂递送到流通池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在各个递送步骤之间进行。然后可以重复该循环n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适于与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台描述于例如Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281和US2008/0108082，这些文献中的每一篇的全文均以引用方式并入本文中。
在采用流通池的上述方法的一些实施方案中，在单个流动步骤期间在流通池中仅存在单一类型的核苷酸。在此类实施方案中，核苷酸可以选自由dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物组成的组。在采用流通池的上述方法的其他实施方案中，在单个流动步骤期间在流通池中存在多种不同类型的核苷酸。在此类方法中，核苷酸可以选自dATP、dCTP、dGTP、dTTP及其类似物。
通过检测在多核苷酸模板处或附近产生的信号来实现对于连接至存在于流通池中的基底表面上的聚合物涂层上的一个或多个多核苷酸在每个流动步骤期间掺入的一个或多个核苷酸的确定。在上述方法的一些实施方案中，可检测信号包括光学信号。在其他实施方案中，可检测信号包括非光学信号。在此类实施方案中，非光学信号包括在一个或多个多核苷酸模板处或附近的pH的变化。
本文已就核酸举例说明了本公开的基底的应用和用途。然而，应当理解，其他分析物可以连接至本文所述的基底上并进行分析。一种或多种分析物可存在于本公开的基底中或基底上。本公开的基底特别可用于检测分析物，或用于与分析物进行合成反应。因此，待检测、表征、修饰、合成等的多种分析物中的任一种分析物可存在于本文所述的基质中或基质上。示例性分析物包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA或它们的类似物)、蛋白质、多糖、细胞、抗体、表位、受体、配体、酶(例如，激酶、磷酸酶或聚合酶)、小分子候选药物等。基底可包括来自分析物文库的多种不同种类。例如，种类可以是来自抗体文库的不同抗体、来自核酸文库的具有不同序列的核酸、来自蛋白质文库的具有不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子组合文库的候选药物等。
在一些实施方案中，分析物可被分布到基底上的特征，使得它们可被单独地分辨。例如，每个分析物的单个分子可存在于每个特征处。另选地，分析物可作为集落或群体存在，使得个别分子不一定被分辨。就仅含有单一种类的分析物而言，集落或群体可以是均质的(尽管为多拷贝)。以核酸为作为示例，基底上的每个特征可包括核酸的集落或群体，并且集落或群体中的每个核酸可具有相同的核苷酸序列(单链或双链)。此类集落可通过如本文先前所述的簇扩增或桥扩增产生。靶序列的多个重复可存在于单个核酸分子中，诸如使用滚环扩增程序产生的多联体。因此，基底上的特征可以含有分析物的单个种类的多个拷贝。另选地，特征处的分析物的集落或群体可包括两种或更多种不同种类。例如，基底上的一个或多个孔可各自含有具有两种或更多种不同核酸种类(即，具有不同序列的核酸分子)的混合集落。混合集落中的两种或更多种核酸种类可以以不可忽略的量存在，例如，允许在混合集落中检测多于一种核酸。
实施例
在以下实施例中更详细地公开了附加的实施方案，这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。
实施例1.不含水凝胶的有机硅烷表面的制备
在该实施例中，用11-叠氮基十一烷基三甲氧基硅烷(C11-叠氮基)处理NIL和玻璃基底。特别地，将基底浸入乙醇中约1％至20％的C11-叠氮基硅烷中达不同的时间，该时间取决于C11-叠氮基硅烷溶液的浓度。当C11-叠氮基硅烷溶液具有较高浓度(诸如20％)时，仅将基底浸入硅烷溶液中约5分钟。当C11-叠氮基硅烷溶液具有较低浓度(诸如1％至5％)时，则将基底浸入硅烷溶液中过夜。将各自含有30个T加上3个碳间隔区(T30-SPC3)间隔区的炔官能化的P5和P7引物经由点击化学以10μM的接枝浓度接枝。通过应激测试后和应激测试前染料标记的互补寡核苷酸(CFR)的杂交来评价稳定性。所谓的应激测试涉及在HT1和HT2缓冲液中重复流动以及几个高达96℃和冷却至40℃的温度循环。如图4所示，y轴是染料标记的QC寡聚物在应激测试后和应激测试前的荧光强度比。观察到与纯玻璃表面相比，叠氮基硅烷化的NIL表面具有更好的稳定性，因为当在NIL基底上以不同浓度处理硅烷时，荧光比的值高于1。
实施例2.在不含水凝胶的表面上的引物接枝
因美纳的标准ExAmp聚类方法利用具有6个T作为间隔区的P5和P7引物的菌苔(lawn)，用于在PAZAM涂覆的基底上进行DNA扩增。然而，该方法导致如直接在本文所述的非PAZAM基底上的极低的聚类/测序强度。此处，已经开发了一种新颖杂交聚类方法，并在图5中示出。接枝到叠氮基-硅烷化表面上的第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物(即P5和P7)各自含有T30-SPC3间隔区。特别地，流通池的菌苔首先用T30-SPC3-P5和T30-SPC3-P7引物固定。此外，将10μM游离P5引物(无间隔区)添加到含有用于基于ExAmp的扩增的聚合酶的ExAmp缓冲溶液中以增强扩增功效。“ExAmp”表面聚类是重组酶聚合酶DNA扩增方法，其应用酶制剂进行扩增。T30-SPC3间隔区提供了菌苔P5和P7引物的灵活杂交/延伸，并且还提供了一定程度的刚性。
为了仅从纳米孔获得测序信号，在DNA聚类之前进行抛光步骤。已经测试了两种不同的处理方法：(1)在接枝之前在间隙区域处抛光有机硅烷层；(2)在接枝之后在间隙区域处抛光引物/有机硅烷层。图6A和图6B是共聚焦显微镜下的荧光图像，分别显示在处理方法(1)和(2)之后，DNA簇仅存在于纳米孔中，其中荧光信号来自染料标记的SBS3引物的杂交。图6C是测序循环1后流通池表面的缩略图图像，示出了DNA簇在基底表面上的存在，其中该表面是通过在引物接枝之前在间隙区域处抛光有机硅烷层而制备。
Claims (32)
1.一种基底，所述基底包含共价连接至多个生物分子的表面结合的有机硅烷，其中所述表面结合的有机硅烷包含与所述多个生物分子共价键合的叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至所述有机硅烷的硅原子，并且其中所述基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物。
2.根据权利要求1所述的基底，其中所述接头部分包括疏水区域和亲水区域。
3.根据权利要求1或2所述的基底，所述表面结合的有机硅烷包括多种结构：
其中所述接头包括任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基、任选取代的杂亚芳基、或任选取代的杂亚环基、或它们的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基底，其中所述接头部分包含亚烷基或-(CH2CH2O)m-、或它们的组合，其中m为整数1至10。
5.根据权利要求4所述的基底，其中所述接头部分包含直链C11亚烷基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基底，所述多个生物分子中的每个生物分子包含炔基基团、DBCO部分或BCN部分，并且所述表面结合的有机硅烷的所述叠氮基与所述生物分子形成三唑部分。
7.根据权利要求6所述的基底，其中所述多个生物分子包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽、氨基酸、或蛋白质、或它们的组合。
8.根据权利要求7所述的基底，其中所述多个生物分子是寡核苷酸，其各自包含间隔区和用于与模板多核苷酸杂交的衔接子序列。
9.根据权利要求8所述的基底，其中所述间隔区包含10个至50个T核苷酸、C1-10亚烷基、PEG、或它们的组合。
10.根据权利要求9所述的基底，其中所述间隔区包含30个T核苷酸和C3亚烷基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的基底，其中所述基底不含或基本上不含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的基底，其中所述基底包括玻璃、改性或功能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性的硅、碳、金属、无机玻璃、和光纤束。
13.根据权利要求12所述的基底，其中所述基底是流通池、纳米颗粒或珠粒。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的基底，其中所述基底包括由间隙区域分开的图案化纳米孔，并且其中所述多个生物分子存在于所述图案化纳米孔内部。
15.一种官能化基底的表面的方法，所述方法包括：
将有机硅烷沉积到所述基底的所述表面上以形成表面结合的有机硅烷层，其中所述表面结合的有机硅烷层包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至所述有机硅烷的硅原子，并且其中所述方法不包括在所述有机硅烷沉积之前或之后将水凝胶或亲水性聚合物沉积到所述基底的所述表面上。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述基底的所述表面是包括间隙区域和纳米孔的图案化表面。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括在所述有机硅烷层上接枝多个寡核苷酸。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在接枝所述多个寡核苷酸之前从所述间隙区域移除所述有机硅烷。
19.根据权利要求17所述的方法，其中在接枝所述多个寡核苷酸之后从所述间隙区域移除所述有机硅烷和寡核苷酸。
20.一种将寡核苷酸固定到基底上的方法，所述方法包括：
使多个寡核苷酸与所述基底的有机硅烷结合的表面接触，其中所述有机硅烷包含叠氮基，每个叠氮基通过接头部分连接至所述有机硅烷的硅原子，并且其中所述基底不含或基本上不含水凝胶或亲水性聚合物；以及
使所述多个寡核苷酸与所述有机硅烷的所述叠氮基反应，以将所述寡核苷酸共价连接至所述基底。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述基底包括纳米颗粒或珠粒。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述基底包括多个由间隙区域分开的纳米孔。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括从所述表面的所述间隙区域移除所述寡核苷酸，使得所述寡核苷酸仅存在于所述纳米孔内部。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸包含炔基基团、DBCO部分或BCN部分，并且所述有机硅烷的所述叠氮基与所述寡核苷酸形成三唑部分。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸包含间隔区和与模板多核苷酸序列的至少一部分互补的衔接子序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述间隔区包含10个至50个T核苷酸、C1-10亚烷基或它们的组合。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述间隔区包含30个T核苷酸和C3亚烷基。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述固定的寡核苷酸与多个模板多核苷酸接触；以及使所述模板多核苷酸扩增。
29.根据权利要求15至27中任一项所述的方法，其中所述接头部分包括疏水区域和亲水区域。
30.根据权利要求15至28中任一项所述的方法，所述接头部分包括任选取代的亚烷基、任选取代的亚烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的杂亚烷基、任选取代的亚芳基、任选取代的亚环烷基、任选取代的杂亚芳基、或任选取代的杂亚环基、或它们的组合。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述接头部分包含亚烷基或-(CH2CH2O)m-、或它们的组合，其中m为整数1至10。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述接头部分包含直链C11亚烷基。
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