JP2010527616A - マイクロ−rnaスキャホールドおよび非天然存在型マイクロ−rna - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
1264402834906_0.shtml
より入手可能)、および、他の種由来のmiR−26b、miR−196a−2、およびmiR−204が含まれるが、これらに限定されるものではない。この説明の中では、2つのmiRNAは、各配列の成熟鎖が一致またはほぼ一致する場合に、同等であると判定する。従って、「非天然存在型miR−196a−2miRNA」という用語は、(例えば、miR−196a−2または同等の配列から誘導されるmiRNAスキャホールドなどの)miR−196a−2miRNAを有し、さらに、内在性miR−196a−2の内在性成熟鎖およびスター鎖とは異なる内在性成熟鎖およびスター鎖を有する、pre−miRNAまたはpri−miRNAを意味する。従って、非天然存在型miR−196a−2miRNAは、miR−196a−2(任意の種)から誘導される幹−ループ構造を有する。このmiR−196a−2では、幹−ループ構造の幹は、成熟鎖配列がmiR−196a−2の内在性成熟鎖配列とは異なる、成熟鎖−スター鎖2本鎖を組み込んでいる。同様に、「非天然存在型miR−204 miRNA」という用語は、miR−204スキャホールド(例えば、miR−204から誘導されるmiRNAスキャホールド)およびmiR−204から誘導されない成熟鎖−スター鎖配列を有する、pre−miRNAまたはpri−miRNAを意味する。非天然存在型miR−204 miRNAは、miR−204(任意の種)から誘導される幹−ループ構造を有する。このmiR−204では、幹−ループ構造の幹は、成熟鎖配列がmiR−204の内在性成熟鎖配列とは異なる、成熟鎖−スター鎖2本鎖を組み込んでいる。
最初の一連の実施形態では、非天然存在型miRNAのmiRNAスキャホールド部分が誘導されるmiRNAとは全く異なる、別の内在性miRNAの成熟鎖配列(例えば、少なくとも60%同等から100%同等な配列)に、非天然存在型miRNAの配列が誘導されるものである。このような非天然存在型miRNAを「shMIMIC」と称することとする。このようなshMIMIC類は、第1の内在性miRNAから得られるスキャホールド、第2の内在性miRNAから得られる成熟鎖、および前記成熟鎖配列に少なくとも部分的に相補的であるスター鎖をもつ、幹−ループ構造を有する。
1.成熟鎖1位がUであるとき(上で説明したように、好適であるが必須条件ではない)、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにGが好適である。
2.成熟鎖5位がGまたはT(U)の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにT(U)またはGにそれぞれ変換することが好適である。
3.成熟鎖が5位にGまたはT以外の塩基をもつ場合、スター鎖の相対する位置は、標準的なワトソン−クリック塩基対をなすように設計することが好適である。
4.成熟鎖12位とスター鎖の相対する位置との間には、ミスマッチが形成されることが好適である。ミスマッチ形成は、スター鎖の相対する位置が成熟鎖12位と同じ塩基をもつことで達成される。
5.成熟鎖の長さが18ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟18位およびスター鎖の相対する位置に同様に適用される。特に、成熟鎖18位がGまたはT(U)の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにT(U)またはGにそれぞれ変換される。成熟鎖が18位にGまたはT(U)以外の塩基をもつ場合は、スター鎖の相対する位置は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。
6.成熟鎖の長さが19ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟19位およびスター鎖の相対する位置に、同様に適用される。特に、成熟鎖19位がGまたはT(U)の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにT(U)またはGにそれぞれ変換される。成熟鎖が19位にGまたはT(U)以外の塩基をもつ場合は、スター鎖は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。
7.成熟鎖の長さが21ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟21位およびスター鎖の相対する位置に、同様に適用される。特に、成熟鎖21位がGまたはT(U)の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにT(U)またはGにそれぞれ変換される。成熟鎖が21位にGまたはT(U)以外の塩基をもつ場合は、スター鎖は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。
また、別の一連の実施形態では、本発明のmiRNAスキャホールド類に挿入する成熟鎖配列類を合理的に設計する。miRNAの設計は、標的とする遺伝子内にある好ましい標的サイトを同定すること、および発現した分子内で構造要素が保持されるように選択した配列の周囲にあるスキャホールドを最適化することの2工程よりなる。標的サイトの同定は、いくつかの方法で行うことができる。一実施形態によれば、本発明は、1)スキャホールド中に埋め込んだ標的配列の機能にとって重要な特徴、および/または2)その機能にとって有害である特徴、を同定する方法を提供する。この方法は、(a)遺伝子を標的にするランダムに選択した配列セット(例えば、標的RNAに少なくとも部分的に相補的である成熟鎖配列類)を選択し、(b)これらの配列類を選択したスキャホールド内に組み込み、(c)スキャホールド内にある各配列の相対機能を測定し、(d)少なくとも1つの変換が機能に及ぼす影響があるかないかを測定し、および(e)工程(d)で得られた情報を用いて機能性配列類を選択するアルゴリズムを開発する、工程よりなる。
ここで、「A」はアデニンを表し、「G」はグアニンを表し、「T」はチミンを表し、および「C」はチトシンを表す。さたに、各塩基記号に付いている番号は(例えば、A1)、標的配列の逆相補鎖におけるその塩基の位置を表す。このように、このアルゴリズムにおける逆相補鎖(RC)ヌクレオチド1は、標的RNA内のヌクレオチド19と相補的になる(図2参照)。また、miRNAスキャホールドに挿入した成熟鎖ヌクレオチド1に対し、ヌクレオチド19は標的mRNA塩基対またはゆらぎ塩基対を形成する。以下の表1に、整列させたヌクレオチド類の位置を示す。ここで、M1−M19は成熟鎖のヌクレオチド1−ヌクレオチド19であり、R1−R19は標的RNAのヌクレオチド1−ヌクレオチド19であり、ヌクレオチドS1−S19はスター鎖のヌクレオチド1−ヌクレオチド19である。
表1
条件1:標的配列のRCの1位には、CよりもTが好ましく、GおよびAはともに好ましくない。
条件2:標的配列のRCの5位には、G、CおよびAの各々よりもTが好ましい。
条件3:標的配列のRCの6位には、GおよびCの各々よりもAが好ましく、さらに、TよりGおよびCの各々が好ましい。
条件4:標的配列のRCの7位には、CおよびTの各々よりもAが好ましく、さらに、GよりCおよびTの各々が好ましい。
条件5:標的配列のRCの8位には、AおよびGの各々よりもTが好ましく、さらに、CよりAおよびGの各々が好ましい。
条件6:標的配列のRCの12位には、AおよびCの各々よりもTが好ましく、さらに、GよりAおよびCの各々が好ましい。
条件7:標的配列のRCの13位には、AおよびGの各々よりもTが好ましく、さらに、CよりAおよびGの各々が好ましい。
条件8:標的配列のRCの15位には、AおよびCの各々よりもTが好ましく、さらに、GよりAおよびCの各々が好ましい。
条件9:標的配列のRCの16位には、GよりA、C、およびTの各々が好ましい。
条件10:標的配列のRCの17位には、GよりA、C、およびTの各々が好ましい。
条件11:標的配列のRCの18位には、AおよびCの各々よりもTが好ましく、さらに、GよりAおよびCの各々が好ましい。
条件12:標的配列のRCの19位には、TよりもCが好ましく、AよりもTが好ましく、さらに、GよりもAが好ましい。
条件1:R1では、AよりもGが好ましく、UよりもAが好ましく、CよりもUが好ましい。
条件2:R2では、UおよびGの各々よりもAが好ましく、CよりUおよびGの各々が好ましい。
条件3:R3にでは、CよりU、GおよびAの各々が好ましい。
条件4:R4では、CよりU、GおよびAの各々が好ましい。
条件5:R5では、UおよびGの各々よりAが好ましく、さらに、CよりUおよびGの各々が好ましい。
条件6:R7では、UおよびCの各々よりAが好ましく、さらに、GよりUおよびCの各々が好ましい。
条件7:R8では、UおよびGの各々よりAが好ましく、さらに、CよりUおよびGの各々が好ましい。
条件8:R12はで、UおよびCの各々よりAが好ましく、さらに、GよりUおよびCの各々が好ましい。
条件9:R13では、GおよびAの各々よりUが好ましく、さらに、CよりGおよびAの各々が好ましい。
条件10:R14では、CおよびGの各々よりUが好ましく、さらに、AよりCおよびGの各々が好ましい。
条件11:R15では、C、GおよびUの各々よりAが好ましい。
条件12:R19では、GよりもAが好ましく、CおよびUの各々は好ましくない。
式2: 標的配列の逆相補配列の1−21ヌクレオチド類に関する。
ここで、「A」はアデニンを表し、「G」はグアニンを表し、「T」はチミンを表し、「C」はシトシンを表す。また、各塩基の記号に付く数字は(例えば、A1)標的mRNAの逆相補配列中の塩基の位置を表す。このように、前記アルゴリズムによる逆相補ヌクレオチド1は、標的mRNAのヌクレオチド21の相補配列である(図2参照)。下記の表2に、配列したヌクレオチドの位置を示す。ここで、M1−M21は、成熟鎖の1−21番目のヌクレオチド類であり、R1−R21は標的RNAの1−21番目のヌクレオチド類であり、ヌクレオチド類S1−S21はスター鎖の1−21番目のヌクレオチド類である。
表2
条件1:標的配列の逆相補配列1位は、T>Cであり、AおよびGの各々は好ましくない。
条件2:標的配列の逆相補配列3位は、A,T,G>C。
条件3:標的配列の逆相補配列5位は、T>G>A>C。
条件4:標的配列の逆相補配列6位は、A>G,C,T。
条件5:標的配列の逆相補配列7位は、T>A>C>G。
条件6:標的配列の逆相補配列8位は、T>A,G>C。
条件7:標的配列の逆相補配列12位は、T>A,C>G。
条件8:標的配列の逆相補配列13位は、T>A,G>C。
条件9:標的配列の逆相補配列14位は、A,G,T>C。
条件10:標的配列の逆相補配列15位は、T>A,C>G。
条件11:標的配列の逆相補配列16位は、A,T>G>C。
条件12:標的配列の逆相補配列17位は、T>,C>G。
条件13:標的配列の逆相補配列18位は、T>A,C>G。
条件14:標的配列の逆相補配列19位は、C>T>A>G。
条件15:標的配列の逆相補配列20位は、A,G,T>C。
条件16:標的配列の逆相補配列21位は、T>A,G,C。
ここで、>は他の塩基よりある塩基が好ましいことを示す。例えば、W>X、Y>ZはXおよびYの各よりもWが好ましく、ZよりもXおよびYの各々が好ましいことを示す。ある実施形態では、前記条件の1つ以上の条件または全ての条件が、成熟鎖配列類を決定するために適用される。例えば、前記条件は、(1)標的RNAの逆相補配列を決定し、(2)21ヌクレオチド部分配列(類)を決定するために前記条件から1つ以上の条件を適用することに用いられる。こうして決定した配列類は、続いて、非天然存在型miRNA−196a−2 miRNA類を生成するためにmiRNA−196a−2 miRNAスキャホールド内に導入される。好適な実施形態としては、成熟鎖1位は「T」である。
条件1:R1では、U、C、およびGの各々よりもAが好ましい。
条件2:R2では、GよりもU、CおよびAの各々が好ましい。
条件3:R3では、AよりもCが好ましく、UよりもAが好ましく、CよりもUが好ま しい。
条件4:R4では、UおよびGの各々よりもAが好ましく、さらに、CよりもUおよびGの各々が好ましい。
条件5:R5では、UおよびGの各々よりもAが好ましく、さらに、CよりもUおよびGの各々が好ましい。
条件6:R6では、CよりもUおよびAの各々が好ましく、さらに、GよりもCが好ましい。
条件7:R7では、UおよびGの各々よりもAが好ましく、さらに、CよりもUおよびGの各々が好ましい。
条件8:R8では、GよりもU、CおよびAの各々が好ましい。
条件9:R9では、UおよびCの各々よりもAが好ましく、さらに、GよりもUおよびCの各々が好ましい。
条件10:R10では、UおよびGの各々よりもAが好ましく、さらに、CよりもUおよびGの各々が好ましい。
条件11:R14では、UおよびCの各々よりもAが好ましく、さらに、GよりもUおよびCの各々が好ましい。
条件12:R15では、UよりもAが好ましく、GよりもUが好ましく、CよりもGが好ましい。
条件13:R16では、C、G、およびAの各々よりもUが好ましい。
条件14:R17では、CよりもAが好ましく、UよりもCが好ましく、GよりもUが好ましい。
条件15:R19では、GよりもU、AおよびCの各々が好ましい。
条件16:R21では、GよりもAが好ましく、UおよびCの各々は好ましくない。
a.−3*(#GC)
b.少なくとも「AAAA」が1個ある場合は−100
c.少なくとも「TTTT」が1個ある場合は−100
d.少なくとも「GGGG」が1個ある場合は−100
e.少なくとも「CCCC」が1個ある場合は−100
f.2−8位中>GCの場合は−100
g.>10GCの場合は−100
ここで、「#GCの#」は標的の逆相補配列中の(または、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中の)GおよびCヌクレオチド類の数を表す。
「AAAA」は標的の逆相補配列中の全てのAを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中の「UUUU」と同じ意味を表す。
「TTTT」は標的の逆相補配列中の全てのTを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中の「AAAA」と同じ意味を表す。
「GGGG」は標的の逆相補配列中の全てのTを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中の「CCCC」と同じ意味を表す。
「CCCC」は標的の逆相補配列中の全てのTを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中の「GGGG」と同じ意味を表す。
「2−8位中>4GC」は、成熟鎖(例えば、シード領域))の2位―8位にある5個以上のGおよび/またはCヌクレオチドを表す。ここで、式2が標的RNAの傾向として表わされる場合にはR14−R20位にある、または、式1が標的RNAの傾向として表わされる場合にはR12−R18位にある、5個以上のG、CまたはGおよびCヌクレオチドと同じ意味を表す。
「>10GC」は、標的配列の逆相補配列中にある11個以上のG、CまたはGおよびCヌクレオチドを表す。ここで、式1または式2が標的RNAの傾向として表わされる場合には標的RNA中にある11個以上のG、CまたはGおよびCヌクレオチドと同じ意味を表す。
A) 標的配列の逆相補配列は、AAAA、UUUU、GGGG、およびCCCC
からなる群より選ばれるテトラヌクレオチド配列を含まない。または、同じ意味で、標的RNA配列は、AAAA、UUUU、GGGG、またはCCCCを含まない。
B) 標的配列の逆相補配列は、全体で10個以下のG+C含有量をもつ。または、同じ意味で、標的RNA配列類は、全体で11個以上のG+C含有量をもたない。
C) 成熟鎖は、シード領域に4個以下のG+C含有量をもつ。または、同じ意味で、前記成熟鎖のシード領域に相対する標的RNA配列の塩基類は、4個以下のG+C含有量をもつ。
1.成熟鎖の1位がUである場合(上記のように、これは好適ではあるが必須条件ではない)、スター鎖の相対する位置は、常にゆらぎ塩基対が形成されるようにGが好ましい。
2.成熟鎖の5位がGまたはT(U)である場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対が形成されるように、それぞれT(U)またはGに変換されることが好ましい。
3.成熟鎖が5位にGまたはT以外の基をもつ場合、スター鎖の相対する位置は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
4.成熟鎖の12位とスター鎖の相対する位置との間に、ミスマッチが形成されることが好ましい。これは、スター鎖の相対する位置に、成熟鎖の12位と同じ塩基をもつようにすることで達成できる。
5.成熟鎖が18ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の18位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の18位がGまたはT(U)である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれT(U)またはGに変換される。成熟鎖が18位にGまたはT以外の基をもつ場合、スター鎖のこの位置に相対する位置は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
6.成熟鎖が19ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の19位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の19位がGまたはT(U)である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれT(U)またはGに変換される。成熟鎖が19位にGまたはT(U)以外の基をもつ場合、スター鎖は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
7.成熟鎖が21ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の5位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の21位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の21位がGまたはT(U)である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれT(U)またはGに変換される。成熟鎖が21位にGまたはT(U)以外の基をもつ場合、スター鎖は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
すぐ上で述べた実施形態では、例えば、特定のmiRNAスキャホールドに特有の様々な条件に合う配列について標的RNAをスキャンするためのアルゴリズムを用いている。このアルゴリズムによって決定した配列に完全に逆相補的な成熟鎖は、続いて、スキャホールドに導入される。従って、このアルゴリズムは、特定のスキャホールド内にある最も機能的と思われる配列類を選択する。一方、別の実施形態では、このようなアルゴリズムを使用することなしに標的RNA配列が選択される。このような実施形態では、選択した標的RNA配列に完全逆相補的となる成熟鎖が設計される。続いて、この成熟鎖を非天然存在型miRNAを形成するようにmiRNAスキャホールドに挿入する。標的RNA配列の完全逆相補配列となる成熟鎖の発現によって、標的RNAがRISCで切断されると、理論または作用機構に限定されることなく思われる。
本発明の非天然存在型miRNA類は、プラスミド、および外在的配列あるいはホストゲノムに挿入する配列を保持するウイルスベクターを含む様々なベクター構築系において発現することが可能である。ここで、前記非天然存在型miRNA類には、式1または式2によって成熟鎖が合理的に設計されるmiRNA、式1または式2を用いて成熟鎖が選択されないmiRNA、およびshMIMICが含まれる。例えば、(A)塩基2−塩基19が式1により決められる、またはmiRNA−196a−2以外のmiR成熟鎖から誘導される、および、(B)塩基20−塩基21が各々、miRNA−196a−2の21ヌクレオチド成熟鎖の内在性配列であるGである、21ヌクレオチド成熟鎖があるとする。この21ヌクレオチド成熟鎖を、次の配列をもつベクターインサートを生成するように、21ヌクレオチド スター鎖(TC−S1−S19)と並べて、miRNA−196a−2スキャホールドに導入してもよい。
5' TGATCTGTGGCT +[ M 1 -M 19 -GG] + GATTGAGTTTTGAAC+ [TC-S 1 -S 19 ] +AGTTACATCAGTCGGTTTTCG 3 ' 。 SEQ ID NO:24
この配列の逆相補配列は、適当なベクターにアニールおよびクローニング可能で、所望の遺伝子を長期にサイレンシングさせるなど標的RNAの機能性を低下させるために発現させることができる。ここで、21ヌクレオチドおよび22ヌクレオチド内在性miRNA−196a−2熟成鎖の両方が存在することを支持する証拠がある。従って、上記配列は、細胞内で発現する場合、21ヌクレオチド成熟鎖(M1−M19−GG)および/または21ヌクレオチド成熟鎖(M1−M19−GGG)を生成するように処理される。よって、上記配列において下線で示したGは、miRNA−196a−2スキャホールドの一部であるか、または、成熟鎖の一部であってよい。
ある実施形態では、プロモーターは組織特異的なプロモーターである。また、別の実施形態では、プロモーターはtetプロモーターまたがReoswitchTMなどの調節可能なプロモーターである。プロモーター配列は、標的にするホストから誘導されるか、または、別の生物のゲノムから採取できる。従って、例えば、プロモーターはCMV、HIV、FIV、またはRSVプロモーター配列(LTR(Long Terminal Repeat)プロモーターなど)などのウイスルプロモーターが可能である。非天然存在型miRNAをコードする配列類を、ベクター系と関連する他の要素を考慮して様々な位置に置くことができる。例えば、非天然存在型miRNAをコードする配列類を、ポリメラーゼIIプロモーターから発現され遺伝子の5’および/または3’UTR、または、遺伝子の1つ以上のイントロンに挿入される遺伝子に関連させることができる。好適な実施形態では、非天然存在型miRNAをコードする配列類は、蛍光レポーター(GFP、YFP、RFP、およびBFPなど)、酵素的レポ−ター(ルシフェラーゼなど)、または、薬物耐性マーカー(プロマイシンなど)、または、その発現が細胞の生理学的性質を著しくは変化させない他の遺伝子類を含む、マーカーおよび/または遺伝子と関連する。また、別の例では、非天然存在型miRNAの発現を、ポリメラーゼIIプロモーターから非コード配列として転写された遺伝子の発現に関連させないようにすることが可能である。また、ある例では、前記調節により、組織特異的調節可能な発現系を生成するために、調節可能なプロモーター(例えば、PTET)を組織特異的プロモーターと組み合わせるなど、上記複数の要素を組み入れることができる。
全体のゲノムDNA抽出:全HeLaゲノムDNAはDNeasy Genomic DNA単離キットを用いて抽出した。DNAの全体の完全性は、エチジウムブロミドを用いて着色した0.8%アガロースゲルで確認した。
PCRは、2重ルシフェラーゼ系での試験用に様々なmiRNAを増幅するために使用した。Quiagen Tag PCR Master Mix(カタログ番号201443)を用いた10−100ng HeLaゲノムDNAおよび各プライマー10μMから、天然miRNA類を増幅した。PCRパラメーター:最初の変性を94℃で4分間、94℃で15秒間、50−60℃で30秒間、30サイクルを72℃で45秒間、最終伸長を72℃で2分間。以下の表3に増幅に用いた配列類を示した。
SpeIおよびBgIIIは、プライマー配列に組み込んだ制限領域を表す。「For」=順方向プライマー、「Rev」=逆方向プライマー。全ての配列は5’→3’方向に生成した。
自身のプロモーターおよびポリ(A)追加サイトをもつ、ヒト化ホタルルシフェラーゼ遺伝子(hluc)およびヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子(hRluc)を有する、2重ルシフェラーゼプラスミド(psiCHECKTM−2ベクター)はPromega(カタログ番号C8021)から得た。逆相補標的配列類は、hRluc遺伝子3’UTRのクローニングサイトにあるXhol−NotI制限領域の間に挿入した。挿入した配列類は、制限領域に即して挿入されるようにOperonから並べられた。Dual−GloTMルシフェラーゼアッセイシステム(Progma、カタログ番号E2980)を用い、手引書の手順を少し変えて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。細胞を分解するとき、50μLのホタルルシフェラーゼおよび50μLのウミシタケルシフェラーゼを加える前に培地を細胞からアスピレーションした。
トランスフェクションを行う1日前、HeLa細胞を、無抗体の10%ウシ胎仔血清(FBS)を加えたDulbecco修飾Eagle培地(DMEM)中で、1ウエルあたり約10,000細胞の細胞密度で96穴プレートにプレーティングした。トランスフェクション当日、適当な標的配列類を含むpsiCheck2重ルシフェラーゼプラスミド、スキャホールド構築体を発現するコントロールおよび実験用プラスミド、標的配列を標的するsiRNA類(100nM)、Lipofectamine2000などの脂質輸送試薬類の混合物を調製した。これら混合物を、当業者によく知られたトランスフェクション条件を用いて、細胞内に導入した。
実験は全てトリプリケートで行った。レセプタープラスミドに対する非特異的影響を評価するために、実験結果は全て標準化比(Rluc/Fluc)標準化として表わした。この比は、miRNAリポータープラスミド(Rluc/Fluc)miRNAを、リポータープラスミドと共移入させた非標的配列ので割って算出した、ホタツルシフェラーゼ発現に対するウミシタケルシフェラーゼ発現の比である。このレポータープラスミドから得られた最大値は配列によって変化する。1周辺の値はmiRNA機能が低いことを示すが、一方、0に近い値は低miRNA機能が高いことを示す。データは3つのウエルの平均値として報告し、誤差バーは、標準化ファクターでスケール化された、実験から得た3つの比(Rluc/Fluc)コントロールの標準偏差を示す。これらの比は標準的分布に従わないが、標準偏差値はデータの良い変化値を示すものと考える。
配列類を輸送および標的化するmiRNAスキャホールドの重要な特性は、スキャホールド内にクロ−ン配列を導入して機能性を保持する能力である。このことを実現するために、標準的な分子生物学的技術を用い、構築体の中に制限領域を組み込むために、実施例1で同定した3つの高機能性スキャホールド(miR−26b、196a2、および−204)を修飾した。その後、この修飾が成熟鎖の活性またはスター鎖活性を変化させたかどうかを測定するために、成熟標的鎖に逆相補的な配列を含む2重ルシフェラーゼレポーターを用いて、各構築体を試験した。また、miR−26bおよびmiR−204について、BlpIおよびSacI制限領域を構築体に導入するために、ヌクレオチド修飾を行った(図6a、図6b上部参照)。miR−196a−2については、天然BlpI領域が既に構築体内にあるので、第2制限領域(SacI、ScaL、およびXbaI)を合わせて試験した(図6c上部および下部参照)。
3つの好適なmiRNAスキャホールドの中で、どのスキャホールドが最も外部配列類を許容するのかを測定するために、本研究で「ウオーク」GADPH標的配列類を各スキャホールド内に埋め込み、GFPの人工イントロン内にクローニングした。ここで、ウオークは、2bpだけシフトした各配列に5’末端をもち、長さが21bpである配列類より構成される(図7a参照)。3つのベクターすべての場合において、各内在性スキャホールド類に存在する天然の2位構造(例えば、ブルジやミスマッチ構造)を保持するように、挿入を設計した。また、単純なヘパリン構造などの2次構造をもたないmiR−196a−2スキャホールドに埋め込んだ各配列によって構成される第4のウオークを、機能性における2次構造の重要性を理解するために試験した。3つのスキャホールドから得られた結果を、細胞内に等価な合成siRNAをトランスフェクションしたときに得られた結果と比較した。また、psiCheck(2重ルシフェラーゼ)レポーターに埋め込んだGAPDH標的配列を、図7bに示す。
miR−196a−2GAPDHウオークからの高機能性(>70%)配列類を、位置特異的傾向を同定するために評価した。この評価を行ったとき、直ちに、成熟鎖1位の「U」(この位置をコードするDNAでは「T」)が、外部遺伝子類を標的にする高機能性配列類に特徴的であることが明らかになった。この理由から、この条件が最適な機能性をもつのに好ましいと、先ず同定された。5位および6位には、TおよびAがそれぞれ好適であった。7位には、この位置にGをもつ配列類はほとんどなかった(図8a参照)。内在性miR−196a−2内でミスマッチする位置である12位には、「A」が少々、「T」がかなり存在した。13位にも「T」が多くあることが機能性配列類で観察された。このように、特定のヌクレオトド類について位置特異的な傾向が同定された。
miR−196a−2スキャホールドに挿入する外部配列類を用いて効果的に標的化できる標的サイトを同定できるアルゴリズムを開発するために、先の実施例で得られた結果を使用した(式1、式2および関連する記載内容参照)。miR−196a−2アルゴリズムおよびsiRNAを設計するのに用いられたアルゴリズムを用いて(米項特許出願第2005/0255487号明細書参照(出願番号10/940892、2004年9月14日出願)、CDC2遺伝子内に同定された標的サイトを並べて比較した結果、ほとんど重なり合わない異なる配列類をこれら2つのアルゴリズムが同定することが分かった(図9a参照)。
表4
表5.miR−196a−2スキャホールドにクローニングした成熟miRNA配列類のリスト
Claims (54)
- 第1の内在性miRNAから誘導されるスキャホールド、
第2の内在性miRNAから誘導される成熟鎖、および
前記熟成鎖の配列に少なくとも一部相補的であるスター鎖配列からなる、幹−ループ構造を有する非天然存在型miRNA。 - 幹−ループ構造をもつ核酸からなる非天然存在型miRNAであって、
前記幹−ループ構造の幹は成熟鎖−スター鎖2本鎖を組み込み、
前記成熟鎖の配列は第1の内在性miRNAから誘導され、
前記スター鎖の配列は前記成熟鎖に少なくとも一部相補的であり、および
前記幹−ループ構造の残りの部分は第2の内在性miRNAから誘導される配列を有することを特徴とする非天然存在型miRNA。 - 幹−ループ構造をもつ核酸からなる非天然存在型miR−196a−2miRNAであって、
前記幹−ループ構造の幹は成熟鎖−スター鎖2本鎖を組み込み、
前記成熟鎖の配列は成熟内在性miRNAから誘導されるが、miR−196a−2の内在性成熟鎖の配列とは全く異なり、および
前記スター鎖は前記成熟鎖に少なくとも一部相補的であることを特徴とする非天然存在型miR−196a−2miRNA。 - 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖が少なくとも1つのU−Gゆらぎ塩基対を有することを特徴とする、請求項3に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−196a−2から誘導される幹の配列と同じであることを特徴とする、請求項3または請求項4のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−196a−2の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの置換を有することを特徴とする、請求項3または請求項4のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−196a−2の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの削除を有することを特徴とする、請求項3または請求項4のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−196a−2の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの追加を有することを特徴とする、請求項3または請求項4のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−196a−2から誘導されるループの配列と同じであることを特徴とする請求項3乃至請求項8のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−196a−2のループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの置換を有することを特徴とする請求項3乃至請求項8のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−196a−2のループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの削除を有することを特徴とする請求項3乃至請求項8のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−196a−2のループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの追加を有することを特徴とする請求項3乃至請求項8のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 長さにおいて5個のヌクレオチド乃至150個のヌクレオチドをもつ5’フランキングヌクレオチド配列をさらに有する、請求項3乃至請求項12のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 長さにおいて5個のヌクレオチド乃至150個のヌクレオチドをもつ3’フランキングヌクレオチド配列をさらに有する、請求項3乃至請求項13のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記5’フランキングヌクレオチド配列が内在性miR−196a−2から誘導されることを特徴とする請求項13に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記3’フランキングヌクレオチド配列が内在性miR−196a−2から誘導されることを特徴とする請求項14に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記5’フランキングヌクレオチド配列が1つ以上の制限領域を有することを特徴とする請求項13に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記3’フランキングヌクレオチド配列が1つ以上の制限領域を有することを特徴とする請求項14に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖が、長さにおいて19個のヌクレオチド乃至25個のヌクレオチドであることを特徴とする請求項3乃至請求項19のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖が、長さにおいて19個のヌクレオチド乃至23個のヌクレオチドであることを特徴とする請求項3乃至請求項20のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖の1位にあるヌクレオチドがUであることを特徴とする請求項3乃至請求項21のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 前記成熟鎖の12位にあるヌクレオチドが前記スター鎖上相対する位置にあるヌクレオチドと塩基対を形成しないことを特徴とする請求項3乃至請求項22のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 請求項3乃至請求項23のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAであって、
hsa-let-7a-l, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsalet7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-l, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g, hsa-let-7i, hsa-mir-1-1, hsa-mir-1-2, hsa-mir-7-1, hsa-mir-7-2, hsa-mir-7-3, hsa-mir-91, hsa-mir-92, hsa-mir-93, hsa-mir-10a, hsa-mir-10b, hsa-mir-15a, hsa-mir-15b, hsa-mir-161, hsa-mir-162, hsa-mir-17, hsa-mir-18a, hsa-mir-18b, hsa-mir-19a, hsa-mir-19b-l, hsa-mir-19b-2, hsa-mir-20a, hsa-mir-20b, hsa-mir-21, hsa-mir-22, hsa-mir-23a, hsa-mir-23b, hsa-mir-24-1, hsa-mir-24-2, hsa-mir-25, hsa-mir-26a-l, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26b, hsa-mir-27a, hsa-mir-27b, hsa-mir-28, hsa-mir-29a, hsa-mir-29b-l, hsa-mir-29b-2, hsa-mir-29c, hsa-mir-30a, hsa-mir-30b, hsa-mir-30c-l, hsa-mir-30c-2, hsa-mir-30d, hsa-mir-30e, hsa-mir-31, hsa-mir-32, hsa-mir-33a, hsa-mir-33b, hsa-mir-34a, hsa-mir-34b, hsa-mir-34c, hsa-mir-92a-l, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-92-b, hsa-mir-93, hsa-mir-95, hsa-mir-96, hsa-mir-98, hsa-mir-99a, hsa-mir-99b, hsa-mir-100, hsa-mir-101-1, hsa-mir-101-2, hsa-mir-103-1, 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前記幹−ループ構造の幹は成熟鎖−スター鎖2本鎖を組み込み、
前記成熟鎖の配列は第1の内在性miRNAから誘導され、
前記スター鎖の配列は成熟内在性miRNAの配列とほぼ同等であるが、miR−204の内在性成熟鎖の配列とは全く異なるものであり、および
前記スター鎖は前記成熟鎖に少なくとも一部相補的であることを特徴とする非天然存在型miR−204miRNA。 - 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−204から誘導される幹の配列と同じであることを特徴とする、請求項25に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−204の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの置換を有することを特徴とする、請求項25に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−204の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの削除を有することを特徴とする、請求項25に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記成熟鎖−スター鎖2本鎖のいずれか一方の上にある前記幹の配列が、内在性miR−204の幹の配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの追加を有することを特徴とする、請求項25に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−204から誘導されるループの配列と同じであることを特徴とする請求項25乃至請求項29のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−204から誘導されるループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの置換を有することを特徴とする請求項25乃至請求項29のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−204から誘導されるループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの削除を有することを特徴とする請求項25乃至請求項29のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記ループの配列が、内在性miR−204から誘導されるループの配列に呼応した少なくとも1つのヌクレオチドの追加を有することを特徴とする請求項25乃至請求項29のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 長さにおいて5個のヌクレオチド乃至150個のヌクレオチドをもつ5’フランキングヌクレオチド配列をさらに有する、請求項25乃至請求項33のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 長さにおいて5個のヌクレオチド乃至150個のヌクレオチドをもつ3’フランキングヌクレオチド配列をさらに有する、請求項25乃至請求項33のいずれか1項に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記5’フランキングヌクレオチド配列が内在性miR−204から誘導されることを特徴とする請求項34に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記3’フランキングヌクレオチド配列が内在性miR−204から誘導されることを特徴とする請求項35に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記5’フランキングヌクレオチド配列が1つ以上の制限領域を有することを特徴とする請求項34に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記3’フランキングヌクレオチド配列が1つ以上の制限領域を有することを特徴とする請求項35に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 前記成熟鎖が成熟内在性miR−204以外の成熟内在性miRNAの配列を有することを特徴とする請求項40に記載の非天然存在型miR−204miRNA。
- 成熟内在性miRNAにほぼ同等である成熟miRNAを生成するように細胞内で処理可能である非天然存在型miR−196a−2miRNAであって、前記成熟内在性miRNAの配列が内在性miR−196a−2成熟miRNAの配列とは異なることを特徴とする非天然存在型miR−196a−2miRNA。
- 成熟内在性miRNAを生成するように細胞内で処理可能である非天然存在型miR−204miRNAであって、前記成熟内在性miRNAの配列が内在性miR−204成熟miRNAの配列とは異なることを特徴とする非天然存在型miR−204miRNA。
- 請求項1乃至請求項43のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAを有する細胞。
- 細胞内の標的RNA機能を低下させる方法であって、前記方法は、
前記細胞を請求項1乃至請求項44のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAを発現することができるベクターに接触させる工程を有し、前記非天然存在型miRNAは内在性miRNAにほぼ同等なmiRNAを生成するように前記細胞内で処理されることを特徴とする、細胞内の標的RNA機能を低下させる方法。 - 請求項45に記載の方法であって、前記ベクターは、人工イントロンをもつレポーター遺伝子と操作的に結合できるプロモーターを有し、および、前記人工イントロン内部に前記非天然存在型miRNAが位置することを特徴とする方法。
- 請求項45に記載の方法であって、前記ベクターは、3’非翻訳領域(UTR)をもつレポーター遺伝子と操作的に結合できるプロモーターを有し、および、前記3’UTR内部に前記非天然存在型miRNAが位置することを特徴とする方法。
- 前記細胞は生物の体内に位置することを特徴とする請求項45に記載の方法
- 請求項1乃至請求項48のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAをコードするヌクレオチド配列を有するリコンビナント発現ベクター。
- 前記ベクターは人工イントロンを有するレポーター遺伝子と、操作的に結合できるプロモーターを有し、および、前記人工イントロン内部に前記非天然存在型miRNAが位置することを特徴とする請求項49に記載のリコンビナント発現ベクター。
- 前記ベクターは3’非翻訳領域(UTR)をもつレポーター遺伝子と、操作的に結合できるプロモーターを有し、および、前記3’UTR内部に前記非天然存在型miRNAが位置することを特徴とする請求項49に記載のリコンビナント発現ベクター。
- 前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項49に記載のリコンビナント発現ベクター。
- 請求項1乃至請求項52のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAを有し、さらに、少なくとも1つの薬学的に許容されるキャリアーを有する薬学的組成物。
- 遺伝子が不適当に発現することを特徴とする病気を治療する医薬品の製造に、請求項1乃至請求項53のいずれか1項に記載の非天然存在型miRNAを使用する方法であって、前記遺伝子が前記非天然存在型miRNAによって標的にされることを特徴とする方法。
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