CN111850106B - 一种通过检测rna降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法。本发明选择18S rRNA为基础，分别以44bp的短片段，149bp的中片段以及305bp长片段为靶序列设计引物。运用短中长这三种引物，进行实时荧光定量PCR(qPCR)检测。对梯度稀释的标准品进行qPCR反应，构建标准曲线。通过qPCR扩增检测得到Ct值，代入标准曲线可以对起始模版拷贝数进行定量。随着时间的增加，长片段目的序列扩增成功的概率最低，中片段次之，短片段相对稳定扩增成功概率较高。通过计算长片段与短片段起始拷贝数的比值以及中片段与短片段起始拷贝数的比值，判断人血痕样本中RNA的完整度。通过分析RNA完整度与时间的线性关系，从而为研究血痕存留时间、死亡时间以及损伤时间等提供技术手段。

Description

一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的 方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测人血痕样本中RNA降解程度的特异性引物组合及利用其检测RNA降解程度从而推断血痕形成时间的方法，属于法医学、法庭科学以及分子生物学检测技术领域。
背景技术
血痕形成时间一直是法医学领域重要的研究课题之一。在一些暴力犯罪案件的案发现场，经常可以看到血痕作为生物物证出现。通过科学解读犯罪现场出现的血痕，研究案件现场血痕的分布、形状等情况，可以罪犯行动轨迹以及动作行为，判断案件性质。血液离开人体后，就会发生降解，离开机体的时间越长，核酸等物质降解的越严重。通过检测人血痕中RNA降解程度可以为推断血痕形成时间、死亡时间以及损伤时间等问题作出贡献。
在法医学领域，研究RNA降解时序性的方法通常有两种：第一种为对某一种RNA的靶序列拷贝数进行绝对定量；第二种方式采用相对定量的方式对目的基因和内参基因拷贝数的比值进行分析，通过两种RNA拷贝数的比值推断降解程度。
但是，这两种方式都有各自的弊端。由于个体之间的差异性，即使是研究相同的基因，其在不同人血液中的含量也会有所不同。在机体死后，分析相同mRNA在不同器官组织中降解的时序性，发现它们并未遵循同一规律。即便是对同一组织器官中的mRNA降解程度进行分析，也无明显规律可循。并且，当研究者选择同一RNA为研究对象，但若选取了不同的目的序列，由于RNA片段的结构长短等性质的差异，以及外界其他因素，也会导致实验结果出现差异。通过对目的序列绝对定量，来推断RNA降解时序性的方式并不是十分理想。
第二种相对定量比值法判断降解程度的方式也存在明显弊端。例如，通过测定18SrRNA与β-actin mRNA量的比值从而推断血痕形成时间，这其中就存在一定的不合理性。虽然这两种基因都被认为是管家基因，对所有细胞来说均必不可少，但每种基因的表达都是独立调节的。因此，它们可能并不总是以固定的比率存在于细胞内。遗传、健康程度或医疗水平等变量可能会改变它们的相对起始比率，不能准确对RNA降解程度与时间的相关性作出判断。用不同种RNA量的比值来研究降解规律也不是一个完美的方案。
本发明选择18S rRNA为基础，选取44bp的短片段靶序列，149bp的中片段靶序列以及305bp长片段靶序列，针对它们分别设计三对引物。运用短中长这三种引物，对第一链cDNA实施实时荧光定量PCR(qPCR)检测。对梯度稀释的标准品进行实时荧光定量PCR反应，构建标准曲线。通过实时荧光定量PCR扩增检测得到Ct值，代入标准曲线可以对起始模版拷贝数进行定量。随着时间的增加，长片段目的序列扩增成功的概率最低，中片段次之，短片段相对稳定扩增成功概率较高。通过计算长片段与短片段起始拷贝数的比值以及中片段与短片段起始拷贝数的比值，判断人血痕样本中RNA的完整度。通过分析RNA完整度与时间的线性关系，从而为研究血痕存留时间、死亡时间以及损伤时间等法医学问题提供技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明使用三对不同引物结合实时荧光定量PCR(qPCR)扩增，对应扩增人血痕样本中的短片段、中片段和长片段。实验设计原理是随着保存时间延长，血痕中RNA逐步发生降解，长片段目的序列扩增成功的概率最低，中片段次之，短片段较为稳定扩增成功概率较高。因此在降解前期可通过扩增长片段目的序列与短片段目的序列，计算得出长片段与短片段目的序列起始拷贝数的比值，推断出人血痕RNA的完整度，构建出RNA完整度或质量情况与保存时间的对应曲线，进而推断血痕存留时间、死亡时间以及损伤时间等问题。当降解至后期，长片段降解非常严重无法成功检测时，可通过扩增中片段与短片段目的序列，计算中片段与短片段目的序列起始拷贝数的比值，进而推断血痕存留时间、死亡时间以及损伤时间等问题。
根据本发明，首先，本发明提出了一种用于法医学领域检测RNA降解程度的特异性引物组合，所述的引物组合由一对短引物、一对中引物以及一对长引物组成，其中，所述的一对短引物的核苷酸的序列如SEQ IDNO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一对中引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.3以及SEQ IDNO.4所示；所述的一对长引物的核苷酸的序列如SEQID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。
进一步的，本发明还提出了所述的特异性引物组合在检测人血痕中RNA降解程度、判断法医学中血痕形成时间中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法，包括以下步骤：
(a)从人血痕样本中提取RNA；
(b)RNA反转录得到人血痕样本cDNA；
(c)以人DNA为模板，使用本发明所述的一对短引物、一对中引物以及一对长引物分别进行PCR扩增，得到的产物分别连接到同一载体，构建标准品质粒用于实时荧光定量PCR扩增，以标准品质粒Ct值为纵坐标，起始拷贝数的对数为横坐标，制作对应的标准曲线；
(d)以反转录得到的人血痕样本cDNA为模板，使用权利要求1中所述的一对短引物、一对中引物以及一对长引物分别进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到各自的Ct值，根据标准曲线计算扩增产物的起始拷贝数，进而得到RNA完整度：
RNA完整度＝中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数；以及
RNA完整度＝长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数；
(e)判定
根据RNA完整度判定人血痕中RNA的降解程度，即长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值与中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值越小，则表示RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长。
其中，优选的，步骤(e)中人血痕样本形成天数与长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数拟合的数学方程为y＝-0.0002x+0.0217，其中y表示长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数的值，x表示血痕形成天数，长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数的值越小，则RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长；
人血痕形成时间与中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数拟合的数学方程为y＝-0.0018x+0.4198，其中y表示中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数，x表示存放天数，中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数越小，则RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长。
其中，优选的，步骤(b)中反转录的反应体系如下所示：
Figure BDA0002530605070000041
其中，优选的，步骤(b)中反转录的反应条件如下所示：
42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟，置于4℃条件下保存。
其中，优选的，步骤(c)以及步骤(d)中实时荧光定量PCR扩增的扩增体系如下所示：
Figure BDA0002530605070000042
扩增体系中引物终浓度为200nM。
其中，优选的，步骤(c)以及步骤(d)中实时荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
预变性：95℃，3分钟；变性：95℃，10秒；退火/延伸/数据采集62℃，32秒；共40个循环。相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明首次建立了一种法医学领域分析RNA完整度的方法。
2、本发明首次建立了RNA降解程度与时间的关联性，为研究法医学领域血痕形成时间问题提供一种新方法。
3、可以依据本发明方法对案件现场存留的血痕进行初步检验，判断血痕中RNA的质量，推断是否可以满足后续检验的要求。
4、本发明操作简单、结果准确、应用前景广阔，对于法医学研究领域有重要的意义。
附图说明
图1为人特异性短片段标准曲线(y＝-3.4716x+31.637)；
图2为人特异性中片段标准曲线(y＝-3.6899x+30.919)；
图3为人特异性长片段标准曲线(y＝-3.6712x+36.014)；
图4为人血痕样本RNA完整度(长/短)与时间的拟合曲线；
图5为人血痕样本RNA完整度(中/短)与时间的拟合曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1用于检测血痕样本中RNA降解程度的特异性引物的设计以及合成
引物信息如下表1所示：
表1 引物信息
Figure BDA0002530605070000051
实施例2实施例1的特异性引物组合在检测RNA完整度从而推断血痕形成时间中的应用
1、材料和方法
1.1试验材料
实验征集5名志愿者采集静脉血，使用EDTA抗凝。用冷藏箱运回实验室后，取30ul血液滴于医用纱布上，形成约一元硬币大小的血痕。待血痕干燥后装入牛皮纸信封中，置于室温(25℃，55％湿度)条件保存。于0天、10天、20天、30天、40天、50天、60天、90天时收集样本，标记时间后放入-80℃超低温冰箱保存备用。
1.2有机溶剂法提取人血痕样本RNA
具体实验步骤如下：
将裂解液(每样本500ul)吸取至离心管中，取3.6ulβ-巯基乙醇放置相同管中。将上述离心管56℃水浴加热10分钟。准备样本，剪取1cmx1cm血痕(约为总血痕大小的三分之一)放入离心管中。吸取505ul上述裂解液与β-巯基乙醇混合液，加入样本中，混匀，56℃水浴加热30分钟。将纱布放入滤篮，一起放回离心管内。高速13000rpm离心5分钟。加50ul 2M醋酸钠，之后加600ul酸性酚。颠倒混匀。高速13000rpm离心20分钟。转移上清液，丢弃其余部分。加2ul GlycoBlue carrier以及加500ul异丙醇混匀。在-20℃下静置1小时后，高速13000rpm离心20分钟。
去除上清液。加入75％乙醇+25％DEPC水溶液，颠倒混匀。高速13000rpm离心10分钟。去除全部溶液，室温下放置5分钟。将无核酸酶水60℃加热5分钟，取20ul无核酸酶水，重悬RNA沉淀，60℃孵育10分钟，混匀。
1.3去除残留DNA
将2ul(0.1volume)TURBO DNase I加入提取出的RNA溶液中。加入1ul DNase-freeTURBO DNase I，37℃孵育20-30分钟。加3ul(0.1volume)DNase Inactivation Reagent，混匀后，室温下孵育5分钟。高速离心(13000rpm)1.5分钟后，转移上清液，扔弃其余部分，于-80℃冰箱中储存RNA。
1.4测RNA浓度
使用Qubit仪器检测通过酸性酚提取法提取出的RNA浓度。以1:199的比例将Quant-iT RNA HS Reagent和Quant-iT RNA HS Buffer混匀，形成工作液。取两个0.5ml离心管，配置校准液。向其中各加入190ul工作液。再将10ul高浓度RNA标准品以及低浓度RNA标准品加置管中，吹打混匀，形成校准液。再取出若干0.5ml离心管。每个加198ul工作液以及加入2ul待测RNA溶液。标清序号，震荡混匀。将Qubit仪器连接电源后打开，用新配置的校准液进行校准。首先插入高浓度RNA标准品校准液，按“go”键，屏幕显示检测完成后，取出高浓度校准液，插入低浓度RNA标准品校准液进行校准，屏幕显示检测完成后，即校准完毕。取出低浓度RNA校准液，插入待测样本，读取QF value(ng/ml)。将QF value代入公式：样品浓度＝QF value x(200/2)，可得样品中RNA实际浓度。
1.5RNA反转录
对从人血痕中提取到的RNA进行反转录。反应体系如下表2所示：
表2 RNA反转录扩增体系
试剂 体积
2×RT Reaction Mix(with Primer) 10μl
DEPC无核酸酶水 5μl
RNA模板 4μl
StarScript II RT Mix 1μl
总体积 20μl
反应体系加入试管后，震荡混匀。离心时注意配平。
RNA反转录反应条件如下：
42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟，置于4℃条件下保存以备后续实验。
1.6实时荧光定量PCR扩增
使用表1中的短、中、长三对引物对反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，样本中每个时间点均分别使用短、中、长三种引物进行三次扩增，得到cDNA的Ct值，用于计算RNA完整度并推测RNA降解程度。
扩增体系如下表3所示：
表3 实时荧光定量PCR扩增体系
Figure BDA0002530605070000071
Figure BDA0002530605070000081
引物最终浓度为200nM。
反应条件如下：
预变性：95℃，3分钟；变性：95℃，10秒；退火/延伸/数据采集62℃，32秒；共40个循环。
1.7标准曲线制作
1.7.1标准品质粒的制备
以人DNA为模板，使用表1中所述的一对短引物、一对中引物以及一对长引物分别进行PCR扩增，得到的产物连接到同一载体，构建标准品质粒用于qPCR扩增。
1.7.2标准曲线制作
以不同起始拷贝数的标准品质粒为模板，使用表1中的短、中、长三对引物进行qPCR扩增，以标准品质粒Ct值为纵坐标，起始拷贝数的对数为横坐标，制作对应的标准曲线，猪标准品浓度及实时荧光定量PCR扩增Ct值如下表4所示。
表4 人标准品起始拷贝数及实时荧光定量PCR扩增Ct值
起始拷贝数(copies/well) LgX 44bp 149bp 305bp
10000000 7 7.64474 5.24457 10.391
1000000 6 10.68935 8.554695 13.832
100000 5 14.27815 12.4787 17.402
10000 4 17.239 16.14135 21.8177
1000 3 21.1823 19.9765 25.0307
100 2 25.05785 23.4884 28.4867
短、中、长三对引物的标准曲线图如图1-3所示。三条标准曲线的R2分别为0.9976、0.9996和0.9984，均大于0.99。短片段的标准曲线斜率为-3.4716，中、长片段斜率分别为-3.6899和-3.6712，扩增效率较优，可以使用其对目的序列的起始拷贝数进行绝对定量。
2、结果
人血痕样本进行实时荧光定量PCR的结果(Ct值)如下表5、表6和表7所示：
表5 人血痕样本长片段目的序列Ct值
天数 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
0 20.5329 19.9608 21.7977 20.4192 21.6071
10 20.3606 20.8609 20.8367 21.2558 22.1379
20 19.502 22.0756 21.4605 20.4241 22.7015
30 20.6925 21.4038 22.8734 21.5785 22.9013
40 20.2999 20.7477 21.8028 21.8811 23.0409
50 20.3903 22.0621 21.5728 21.334 24.1063
60 20.497 21.3436 22.2878 21.6147 22.8175
90 21.0437 21.1954 21.6251 22.1195 24.1876
表6 人血痕样本中片段目的序列Ct值
天数 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
0 10.4512 11.0355 12.1207 10.2007 11.0839
10 10.7046 11.2002 10.9692 10.6525 11.1793
20 10.0653 11.8863 11.6282 10.129 11.9485
30 10.763 11.7396 14.0561 10.4952 11.8758
40 10.4282 11.0461 12.0045 10.8633 10.7593
50 10.893 12.1625 11.789 10.9419 12.1382
60 10.5891 11.1315 12.5829 10.868 11.2134
90 10.4878 10.6493 13.5514 10.8288 10.6796
表7 人血痕样本短片段目的序列Ct值
天数 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
0 11.2422 11.6027 12.2598 11.1546 11.4959
10 11.24 11.8365 11.5947 11.1774 11.7866
20 11.0011 12.0741 11.7115 10.785 11.9088
30 10.848 11.9334 13.2364 10.908 12.1176
40 10.8018 11.2976 12.0895 11.762 11.1512
50 11.0151 12.3836 12.0855 11.0756 12.5617
60 10.7903 11.3112 12.5057 11.5072 11.3187
90 10.6011 10.7006 11.5583 10.5291 10.682
根据标准曲线，代入Ct值，可得样本1、2、3、4和5在不同时间点长中短目的序列的起始拷贝数，见下表8、表9和表10。
表8 人血痕样本长片段目的序列起始拷贝数
天数 样本D 样本E 样本F 样本G 样本H
0 16478.0021 23590.6093 7453.92556 17696.01 8400.4525
10 18358.5103 13414.067 13619.2227 10471.1279 6021.68181
20 31456.6101 6261.63476 9209.48039 17641.7085 4228.61862
30 14908.3998 9542.88453 3796.42296 8552.49933 3730.56745
40 19070.9154 14401.0804 7430.12054 7074.04281 3417.81997
50 18019.6952 6314.87856 8583.12968 9969.93956 1752.04132
60 16853.2388 9910.0895 5481.33654 8360.50503 3931.88874
90 11960.9999 10875.4153 8306.14774 6091.57771 1664.94157
表9 人血痕样本中片段目的序列起始拷贝数
天数 样本D 样本E 样本F 样本G 样本H
0 352354.314 244696.872 124316.366 411971.916 237416.846
10 300819.265 220796.946 255033.003 310760.112 223695.461
20 448293.429 143897.439 169044.389 430823.151 138419.169
30 290053.866 157692.21 37154.8445 342811.317 144843.386
40 357447.961 243083.629 133665.607 272455.983 290724.341
50 267452.924 121115.6 152905.231 259414.925 122966.166
60 323301.192 230468.435 93168.1474 271658.065 218985.687
90 344398.003 311381.281 50908.9596 278385.234 305549.021
表10 人血痕样本短片段目的序列起始拷贝数
Figure BDA0002530605070000101
Figure BDA0002530605070000111
通过对不同长度大小的目的序列起始拷贝数进行比值计算，获知样本在各个时间点的完整度，见下表11。
表11 人血痕样本RNA完整度计算结果
Figure BDA0002530605070000112
对这些样本进行均值分析，获得人血痕样本中RNA完整度的均值，如下表12所示。
表12 人血痕样本RNA平均完整度计算结果
Figure BDA0002530605070000113
Figure BDA0002530605070000121
对长片段与短片段起始拷贝数与时间进行线性拟合，结果如图4。如图4所示，人血痕样本形成天数与长片段/短片段起始拷贝数的值拟合的数学方程为y＝-0.0002x+0.0217，其中y表示长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值，x表示人血痕样本形成天数，长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值越小，则RNA完整度越差，表示RNA降解越严重，血痕形成时间越久。
对中片段与短片段起始拷贝数与时间进行线性拟合，结果如下图5。如图5所示，人血痕样本形成天数与中片段/短片段起始拷贝数的值拟合的数学方程为y＝-0.0018x+0.4198，其中y表示中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数，x表示人血痕样本形成天数，中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值越小，则RNA完整度越差，表示RNA降解越严重，血痕形成时间越久。
运用SPSS 25软件对数据进行统计分析，可知数据的P值和R方，如表13所示。
表13 人血痕样本曲线拟合结果
Figure BDA0002530605070000122
如表13所示，人血痕样本长片段与短片段起始拷贝数比值的线性拟合结果中，P值为<＝0.001，具有统计学意义；R方值为0.916，|R|为0.957均远大于0.5，这说明拷贝数之比与血痕形成时间存在高度线性相关关系。中片段与短片段起始拷贝数比值的线性拟合结果中，P值为0.004，远小于0.05，具有统计学意义；R方值为0.773，|R|为0.879均大于0.5，表明存在高度相关关系。
以上结果说明RNA完整度与血痕形成时间存在高度线性关系，长片段与短片段起始拷贝数比值以及中片段与短片段起始拷贝数比值均随着时间的增加而逐渐减小。因此，可以从检测RNA完整度角度研究血痕形成时间、死亡时间以及损伤时间等问题。
序列表
<110> 中国政法大学
<120> 一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
ttaacgagga tccattggag gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
gcggctgctg gcaccagact tg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
cggagaggga gcctgagaa 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
gatttaaagt ggactcattc c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
aagctcgtag ttggatcttg g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
cggtccaaga atttcacctc t 21

Claims (7)

1.特异性引物组合在检测人血痕中RNA降解程度、判断法医学中血痕形成时间中的应用，所述的引物组合由一对短引物、一对中引物以及一对长引物组成，其中，所述的一对短引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一对中引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；所述的一对长引物的核苷酸的序列如SEQ IDNO.5以及SEQ ID NO.6所示。
2.一种通过检测RNA降解程度判断法医学中血痕形成时间的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)从人血痕样本中提取RNA；
(b)RNA反转录得到人血痕样本cDNA；
(c)以人DNA为模板，使用一对短引物、一对中引物以及一对长引物分别进行PCR扩增，得到的产物分别连接到同一载体，构建标准品质粒用于实时荧光定量PCR扩增，以标准品质粒Ct值为纵坐标，起始拷贝数的对数为横坐标，制作对应的标准曲线；
所述的一对短引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一对中引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；所述的一对长引物的核苷酸的序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示；
(d)以反转录得到的人血痕样本cDNA为模板，使用所述的一对短引物、一对中引物以及一对长引物分别进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到各自的Ct值，根据标准曲线计算扩增产物的起始拷贝数，进而得到RNA完整度：
RNA完整度＝中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数；以及
RNA完整度＝长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数；
(e)判定
根据RNA完整度判定人血痕中RNA的降解程度，即长片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值与中片段起始拷贝数/短片段起始拷贝数的值越小，则表示RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(e)中人血痕样本形成天数与长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数拟合的数学方程为y＝-0.0002x+0.0217，其中y表示长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数的值，x表示血痕形成天数，长片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数的值越小，则RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长；
人血痕形成时间与中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数拟合的数学方程为y＝-0.0018x+0.4198，其中y表示中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数，x表示存放天数，中片段目的序列起始拷贝数/短片段目的序列起始拷贝数越小，则RNA完整度越差，RNA降解程度越严重，人血痕样本形成的天数越长。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中反转录的反应体系如下所示：
Figure FDA0003816220650000021
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中反转录的反应条件如下所示：
42℃孵育30分钟，85℃加热5分钟，置于4℃条件下保存。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)以及步骤(d)中实时荧光定量PCR扩增的扩增体系如下所示：
Figure FDA0003816220650000022
扩增体系中引物终浓度为200nM。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)以及步骤(d)中实时荧光定量PCR扩增的反应条件如下：
预变性：95℃，3分钟；变性：95℃，10秒；退火/延伸/数据采集62℃，32秒；共40个循环。
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