CN112795675B - 一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种双通道探针法荧光定量PCR实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法；包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；所述实验组还包含ΔCT=CT长‑CT短；ΔCT与大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT‑2.164±b，b为≤10任一实数。ΔCT≥检测限值1.5时，判定样品受到紫外照射；ΔCT<检测限值1.5时，判定样品未受到紫外照射。本发明具有安全、迅速、灵敏和高效的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种双通道探针法荧光定量PCR实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法。
背景技术
大肠杆菌是人和许多动物肠道中数量最多的一种细菌，在一定条件下可引起肠道外感染，是条件致病菌。大肠杆菌对热有较强的抵抗力，在温度较低粪便中也可存活较长的时间，在自然界的水中可存活数周至数月，该菌对抗生素敏感，但易耐药。紫外线（UV）照射能破坏细菌DNA的双螺旋结构，影响其复制和转录功能，起到对细菌灭活的作用；通过紫外照射灭活环境中的大肠杆菌可以防止食品和环境污染，阻止疾病传播。除此之外，紫外线（UV）照射可以引起基因突变，同样可以用于优良大肠杆菌有益菌种选育，期间也需要对菌种的照射效果进行评价。
发明人发现的：目前还没有报道实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法。现有技术中彗星电泳检测法，可用于检测真核细胞的DNA损伤，但需经过凝胶制备、电泳、染色以及图像采集等过程，操作复杂，且实验用的染料多为强诱变剂溴化乙锭，会对操作人员健康造成威胁；常用的基于抗体免疫检测嘧啶二聚体的方法检测，如ELISA以及免疫印迹等，但这些方法的技能要求较高，耗时长，无法对大肠杆菌紫外照射效果进行快速检测，因而市场上急需一种进行实时快速检测的方法；常用技术中平板培养法是通过将大肠杆菌样品在固体培养基平板上进行培养，将未经过紫外照射的大肠杆菌作为对照组，将经过紫外照射的大肠杆菌作为实验组，经过紫外照射的实验组大肠杆菌平板上菌落减少；该方法需要对大肠杆菌进行培养，耗时24-48h，无法达到快速检测的目的。
发明内容
为解决背景技术中提及的至少一个问题，本发明基于双通道探针法荧光定量PCR技术提供一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，我们提出的方法针对大肠杆菌紫外照射效果具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测紫外照射对大肠杆菌杀菌率。
一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
不同紫外照射条件处理所述大肠杆菌样品的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT值。
所述检测方法包括以下反应步骤：
步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
步骤2，定量取得一定体积V所述大肠杆菌培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得若干份一定体积V所述大肠杆菌培养液分别作为第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间t；
步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；
步骤4，将所述第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板，依次分别加入第一、第二、第三......和第N独立的PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；
步骤5，使用所述荧光定量测量采集所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值；所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值均同时包含所述CT长与所述CT短；
步骤6，所述第一、第二、第三......和第N实验组的CT差值计算方法为所述ΔCT=CT长-CT短；
步骤7，根据所述ΔCT判断所述第一、第二、第三......和第N实验组大肠杆菌紫外照射效果。
所述PCR扩增反应体系组成包括，1×Taq buffer、1-5mM的镁离子盐、0.05-0.4μM的第一探针、0.05-0.4 μM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.1-0.4μM的短片段引物对P1、0.1-0.4μM的长片段引物对P2、0.2-2U的DNA聚合酶及灭菌水；和/或，所述N为≥2自然数。
所述第一探针特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。
所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射。
所述检测方法，还包括PCR扩增步骤：
a.将所述PCR扩增反应体系加入对应的PCR反应模板后放入PCR仪，分别独立在94℃环境下预变性5min；
b.将a运行结束后产物依次在94℃环境下变性10秒，在60℃退火30秒，在72℃环境下延伸45秒；
c.重复b中操作32次，在72℃环境下延伸5min，得到所需PCR扩增反应产物。
一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，公开一种大肠杆菌ATCC 25922的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`HEX-CAGCGCCGAGGTGAGATTGTCCAACAGT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`6-FAM-TAGCTGTACCACGCGCCTGCTTTC-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'- AGAGAGATATTGACCCCTTTG -3'，
5'- ACCTGCATCGTGCCAGTATG -3'；
长片段引物对序列P2，5'-CTTCTCGATCTCTTTCGCGGTTTC -3'，
5'-AACCGTAACAACTGCTGAGTCTTG-3'。
一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，公开一种大肠杆菌K12的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`6-FAM-CTGCTCACCGACAAAGCTGATCTCT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`VIC-CCTGAAAGCCCAACAGGAAATAACCTCG-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'-GCATTATCCAGCACGTTG -3'，
5'- GCAAAGGGGTCAATATCTCTC -3'；
长片段引物对序列P2，5'- ATGTACTTGCTCAGCCGTC -3'，
5'- ACCTGATGTACGTAATAAACCGT -3'。
一种判定紫外照射大肠杆菌杀菌率及杀灭对数值与双通道探针法荧光定量PCR技术测量ΔCT关系的方法，用于判定所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在关系，K=2.156×ΔCT-2.164，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
所述ΔCT为不同紫外照射条件处理所述大肠杆菌样品测量值且满足ΔCT=CT长-CT短；所述大肠杆菌杀菌率及杀灭对数根据《GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准》和中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版内方法进行测量；
包含以下步骤：
A、取等量一定浓度的大肠杆菌样品M份，分别均匀涂抹到面积为25平方厘米无菌材料上；所述M为≥1任一正自然数；
B、将所述M个样品用强度为一定强度的紫外线分别处理L秒，并分别标记为样品1、样品2.......和样品M；所述L为0或任一正实数；所述紫外线强度为0-10000微瓦/平方厘米任一强度；
C、对所述M个样品分别采样，并对采样液进行稀释一定倍数，然后取等体积采样液分别均匀涂抹到LB固体培养基上，于合适温度培养箱过夜培养，对不同紫外处理时间的大肠杆菌培养样品菌落进行计数，通过计算得出不同紫外剂量对大肠杆菌的杀菌率和杀灭对数值；所述稀释倍数取一到一百万任一数值；杀菌前前大肠杆菌数量为X0，杀菌后大肠杆菌数量为Xt，则杀菌率R=（X0-Xt）/X0；杀灭对数K=lgX0-lgXt=lg(X0/Xt)；
D、对所述B步中紫外线处理后的各样品，同时进行所述步骤1-所述步骤6反应步骤测量所述各样品ΔCT；
E、根据C、D步所述各样品ΔCT和杀灭对数值K进行数据拟合，得反应ΔCT和杀灭对数值K对应关系的拟合函数或曲线。
有益效果包括:
本发明基于双通道探针法荧光定量PCR技术提供一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过大量实验建立了检测大肠杆菌是否受过一定强度紫外照射的标准，荧光定量PCR中DNA长片段和短片段的CT差值为ΔCT（ΔCT = CT长-CT短），当ΔCT大肠＜1.5，则判定待测大肠杆菌未受过紫外照射；当ΔCT大肠≥1.5，则判定待测大肠杆菌受过紫外照射；并同时得到所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164。
整个检测流程不需要经过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳等需要用到毒性较大药品的操作，进一步保证操作人员的安全。
从取样开始，整个实验操作只需要1-2个小时，相比于其他检测方法极大地缩短了检测时间，可对大肠杆菌是否受过紫外照射进行实时快速检测。
本申请方案可通过计算△CT用于反映紫外线对大肠杆菌的杀菌率/杀灭对数，相比于传统的平板培养法，极大地降低了时间成本。
附图说明
图1 快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法流程图；
图2A 紫外处理0秒的大肠杆菌样品（稀释十万倍）平板图；
图2B 紫外处理1秒的大肠杆菌样品（稀释10倍）平板图；
图2C 紫外处理2秒的大肠杆菌样品平板图；
图2D 紫外处理3秒的大肠杆菌样品平板图；
图2E 紫外处理4秒的大肠杆菌样品平板图；
图3 大肠杆菌ATCC 25922待测样本双通道荧光定量PCR扩增曲线；
图4大肠杆菌K12待测样本双通道荧光定量PCR扩增曲线；
图5 未经紫外照射大肠杆菌样本△CT正态分布曲线；
图6 经不同强度紫外照射的大肠杆菌样本双通道荧光定量PCR扩增曲线；
图7 不同紫外处理大肠杆菌样品ΔCT与杀灭对数值的对应关系拟合曲线。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护范围。
本实施方式公开了一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
在不同紫外照射条件下处理所述大肠杆菌样品，该样品的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT值。
所述检测方法包括以下反应步骤：
步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
步骤2，定量取得一定体积V所述大肠杆菌培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得若干份一定体积V所述大肠杆菌培养液分别作为第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间t；
步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；
步骤4，将所述第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板，依次分别加入第一、第二、第三......和第N独立的PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；
步骤5，使用所述荧光定量测量采集所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值；所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值均同时包含所述CT长与所述CT短；
步骤6，所述第一、第二、第三......和第N实验组的CT差值计算方法为所述ΔCT=CT长-CT短；
步骤7，根据所述ΔCT判断所述第一、第二、第三......和第N实验组大肠杆菌紫外照射效果。
所述PCR扩增反应体系组成包括，1×Taq buffer、1-5mM的镁离子盐、0.05-0.4μM的第一探针、0.05-0.4μM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.1-0.4 μM的短片段引物对P1、0.1-0.4μM的长片段引物对P2、0.2-2U的DNA聚合酶及灭菌水；和/或，所述N为≥2自然数。
所述第一探针特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。
所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射。
所述检测方法，还包括PCR扩增步骤：
a.将所述PCR扩增反应体系加入对应的PCR反应模板后放入PCR仪，分别独立在94℃环境下预变性5min；
b.将a运行结束后产物依次在94℃环境下变性10秒，在60℃退火30秒，在72℃环境下延伸45秒；
c.重复b中操作32次，在72℃环境下延伸5min，得到所需PCR扩增反应产物。
本文引用《GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准》和中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版中紫外线表面消毒效果评价方法与标准内容并与双通道探针法荧光定量PCR技术结合：
A、取等量的大肠杆菌样品（2.5亿cfu/样品）5份，分别均匀涂抹到面积为25平方厘米的无菌卡片上。
B、将5个样品用强度为2500微瓦/平方厘米的紫外线分别处理0秒、1秒、2秒、3秒和4秒，并分别标记为样品1、样品2、样品3、样品4和样品5。
C、对5个样品分别采样，并对采样液进行稀释，样品1稀释十万倍，样品2稀释10倍，样品3、4和5不稀释，然后取等体积（10μl）采样液分别均匀涂抹到LB固体培养基上，于37℃培养箱过夜培养。
同时，以5个样品的采样液为模板，分别加到PCR反应体系中，同时扩增长短片段，采集双通道探针荧光信号，每个反应重复三次。
本文公开了一种大肠杆菌ATCC 25922的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`HEX-CAGCGCCGAGGTGAGATTGTCCAACAGT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`6-FAM-TAGCTGTACCACGCGCCTGCTTTC-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'- AGAGAGATATTGACCCCTTTG -3'，
5'- ACCTGCATCGTGCCAGTATG -3'；
长片段引物对序列P2，5'-CTTCTCGATCTCTTTCGCGGTTTC -3'，
5'-AACCGTAACAACTGCTGAGTCTTG-3'。
本文公开了一种大肠杆菌K12的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`6-FAM-CTGCTCACCGACAAAGCTGATCTCT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`VIC-CCTGAAAGCCCAACAGGAAATAACCTCG-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'-GCATTATCCAGCACGTTG -3'，
5'- GCAAAGGGGTCAATATCTCTC -3'；
长片段引物对序列P2，5'- ATGTACTTGCTCAGCCGTC -3'，
5'- ACCTGATGTACGTAATAAACCGT -3'。
根据中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版，设杀菌前大肠杆菌数量为X0，杀菌后大肠杆菌数量为Xt，则杀菌率R=（X0-Xt）/X0。杀灭对数值是将杀菌前后大肠杆菌数取对数之后相减所得到的数值，杀灭对数K=lgX0-lgXt=lg(X0/Xt)，杀菌率R=[1-10(-K)]×100%，杀灭对数值K=-log10（1-R）。
实验结果：对不同紫外处理时间的大肠杆菌培养样品菌落进行计数，如图2A至图2E所示，通过计算得出不同紫外剂量对大肠杆菌的杀菌率和杀灭对数值以及对应的荧光定量PCR检测值ΔCT之间的关系，见表1。
ΔCT值与杀灭对数值存在一定的正相关性，对数据进行拟合，得到杀灭对数值K=2.156×ΔCT-2.164，其相应拟合曲线见图7。因此，当知道大肠杆菌样品的ΔCT，根据公式：杀灭对数值K=2.156×ΔCT-2.164以及杀菌率=[1-10(-R)]×100%，便可计算出大肠杆菌样品的杀菌率。
表1 不同紫外处理大肠杆菌样品的ΔCT与杀灭对数值的关系
一些可选的实施例，整个检测流程不需要经过琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳等需要用到毒性较大药品的操作，进一步保证操作人员的安全。
一些可选的实施例，整个实验操作只需要1-2个小时，相比于其他检测方法极大地缩短了检测时间，可对大肠杆菌是否受过紫外照射进行实时快速检测。
一些可选的实施例，本申请方案可通过计算△CT用于反映紫外线对大肠杆菌的消杀率/灭菌对数，相比于传统的平板培养法，极大地降低了时间成本。
在已经公开的实施例基础上，本文还公开一种确定所述样本ΔCT值判定标准的实验例，用于对所述判定标准“待测组ΔCT≥1.5，认为大肠杆菌样品受过紫外照射；ΔCT＜1.5则判定大肠杆菌样品未经过紫外照射”来源进行分析和验证，具体步骤如下：
A、用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
B、取所述大肠杆菌样品72份，不做紫外照射处理；
C、取各待测样本，经过核酸抽提纯化，获得DNA；
D、取等量各待测样本DNA，作为荧光定量PCR的模板；
E、将步骤D中的模板加到PCR反应体系中，同时扩增长短片段，采集双通道探针荧光信号；
F、计算72份未经紫外照射大肠杆菌样本长短片段的CT差值(ΔCT)，并根据ΔCT结果作正态分布曲线图（图5），从图5可以看出，未经紫外照射大肠杆菌的ΔCT值的平均值和标准偏差为0.64±0.37，实验数据分布在-0.4～1.4的范围内。当紫外剂量≥500毫焦耳/平方厘米时，检测得到的样本ΔCT≥1.5，与未经紫外处理的样本可以区分开来。因此，在紫外剂量≥500毫焦耳/平方厘米情况下，如果待测组ΔCT≥1.5，认为大肠杆菌样品受过紫外照射；ΔCT＜1.5则判定大肠杆菌样品未经过紫外照射。
实施例1
在已经公开的实施例基础上，本发明优选地公开一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法的实施例，具体操作如下：
本实施方式公开了一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
在不同紫外照射条件下处理所述大肠杆菌样品，该样品的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光定量PCR中长片段与短片段的CT值差。
所述检测方法包括以下反应步骤：
步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
步骤2，定量取得一定体积V所述大肠杆菌培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得若干份一定体积V所述大肠杆菌培养液分别作为第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间t；
步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；
步骤4，将所述第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板，依次分别加入第一、第二、第三......和第N独立的PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；
步骤5，使用所述荧光定量PCR仪采集所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值；所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值均同时包含所述CT长与所述CT短；
步骤6，所述第一、第二、第三......和第N实验组的CT差值计算方法为所述ΔCT=CT长-CT短；根据所述ΔCT判断所述第一、第二、第三......和第N实验组大肠杆菌紫外照射效果。
所述PCR扩增反应体系组成包括，1×Taq buffer、1mM的镁离子盐、0.05μM的第一探针、0.05μM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.1μM的短片段引物对P1、0.1μM的长片段引物对P2、0.2U的DNA聚合酶及灭菌水；所述N为10。
所述第一探针特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。
所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射。
所述检测方法，还包括PCR扩增步骤：
a.将所述PCR扩增反应体系加入对应的PCR反应模板后放入PCR仪，分别独立在94℃环境下预变性5min；
b.将a运行结束后产物依次在94℃环境下变性10秒，在60℃退火30秒，在72℃环境下延伸45秒；
c.重复b中操作32次，在72℃环境下延伸5min，得到所需PCR扩增反应产物。
在一些可选的实施例，第一实验组三次测量ΔCT<1.5；第二、第三......和第十实验组分别各自三次测量ΔCT>1.5；所述实验结果在理论预测范围内，以上所述证明实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测大肠杆菌是否受到紫外照射。
根据已经公开的方法，引用《GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准》和中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版中紫外线表面消毒效果评价方法与标准内容并与双通道探针法荧光定量PCR技术结合，对所述实验组ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K进行验证：
在一些可选的实施例，第一实验组、第二、第三......和第十实验组分别各自三次测量ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K均落入公式K=2.156×ΔCT-2.164。
实施例2
在已经公开的实施例基础上，本发明优选地公开一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法的实施例，具体操作如下：
本实施方式公开了一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
在不同紫外照射条件下处理所述大肠杆菌样品，该样品的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT值；
所述检测方法包括以下反应步骤：
步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
步骤2，定量取得一定体积V所述大肠杆菌培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得若干份一定体积V所述大肠杆菌培养液分别作为第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间t；
步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；
步骤4，将所述第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板，依次分别加入第一、第二、第三......和第N独立的PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；
步骤5，使用所述荧光定量测量采集所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值；所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值均同时包含所述CT长与所述CT短；
步骤6，所述第一、第二、第三......和第N实验组的CT差值计算方法为所述ΔCT=CT长-CT短；根据所述ΔCT判断所述第一、第二、第三......和第N实验组大肠杆菌紫外照射效果。
所述PCR扩增反应体系组成包括，1×Taq bμffer、5mM的镁离子盐、0.4μM的第一探针、0.4μM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.4 μM的短片段引物对P1、0.1-0.4μM的长片段引物对P2、2U的DNA聚合酶及灭菌水；所述N为20。
所述第一探针特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。
所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射。
所述检测方法，还包括PCR扩增步骤：
a.将所述PCR扩增反应体系加入对应的PCR反应模板后放入PCR仪，分别独立在94℃环境下预变性5min；
b.将a运行结束后产物依次在94℃环境下变性10秒，在60℃退火30秒，在72℃环境下延伸45秒；
c.重复b中操作32次，在72℃环境下延伸5min，得到所需PCR扩增反应产物。
在一些可选的实施例，第一实验组三次测量ΔCT<1.5；第二、第三......和第十实验组分别各自三次测量ΔCT>1.5；所述实验结果在理论预测范围内，以上所述证明实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法方法具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测大肠杆菌是否受到紫外照射。
根据已经公开的方法，引用《GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准》和中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版中紫外线表面消毒效果评价方法与标准内容并与双通道探针法荧光定量PCR技术结合，对所述实验组ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K进行验证：
在一些可选的实施例，第一实验组、第二、第三......和第十实验组分别各自三次测量ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K均落入公式K=2.156×ΔCT-2.164包含范围。
实施例3
在已经公开的实施例的基础上，本发明优选地公开一种实时快速检测大肠杆菌ATCC 25922是否经过紫外照射实施例，具体步骤如下：
A、随机取4份大肠杆菌ATCC 25922样本作为待测样本，编号为样本1-4，其中待测样品1和3经过紫外照射处理；待测样品2和4未经过紫外照射处理；
B、取各待测样本，经过核酸抽提纯化，获得DNA；
C、取等量各待测样本DNA，作为荧光定量PCR的模板；
D、将步骤C中的模板加到PCR反应体系中，同时扩增长短片段，采集双通道探针荧光信号，每个反应重复三次；
大肠杆菌ATCC 25922的引物和探针序列如下，
探针1序列：5`HEX-CAGCGCCGAGGTGAGATTGTCCAACAGT-3`BHQ1
探针2序列：5`6-FAM-TAGCTGTACCACGCGCCTGCTTTC-3`BHQ1
短片段引物对序列：5'- AGAGAGATATTGACCCCTTTG -3'
5'- ACCTGCATCGTGCCAGTATG -3'
长片段引物对序列：5'-CTTCTCGATCTCTTTCGCGGTTTC -3'
5'-AACCGTAACAACTGCTGAGTCTTG-3'
F、实验结果：获得4份待测样本的双通道扩增结果（实线为短片扩增曲线；虚线为长片段扩增曲线），图3；计算各待测样本的CT差值为：ΔCT = CT长-CT短，如表2所示，根据检测限值1.5，待测样本2和样本4的△CT＜检测限值1.5，判定样本未经过紫外照射；样本1和样本3的△CT＞检测限值1.5，判定样本经过紫外照射，判定结果均符合实际设定，说明所述判定方法具有合理性。
表2大肠杆菌ATCC 25922样本的检测结果
实施例4
在已经公开的实施例基础上，本发明优选地公开一种实时快速检测大肠杆菌K12是否经过紫外照射实施例，具体步骤如下：
A、随机取4份大肠杆菌K12样本作为待测样本，编号为样本1-4，其中待测样品1和2经过紫外照射处理；待测样品3和4未经过紫外照射处理；
B、取各待测样本，经过核酸抽提纯化，获得DNA；
C、取等量各待测样本DNA，作为荧光定量PCR的模板；
D、将步骤C中的模板加到PCR反应体系中，同时扩增长短片段，采集双通道探针荧光信号，每个反应重复三次；
大肠杆菌K12的引物和探针序列如下，
探针1序列：5`6-FAM-CTGCTCACCGACAAAGCTGATCTCT-3`BHQ1
探针2序列：5`VIC-CCTGAAAGCCCAACAGGAAATAACCTCG-3`BHQ1
短片段引物对序列：5'-GCATTATCCAGCACGTTG -3'
5'- GCAAAGGGGTCAATATCTCTC -3'
长片段引物对序列：5'- ATGTACTTGCTCAGCCGTC -3'
5'- ACCTGATGTACGTAATAAACCGT -3'
F、实验结果：获得4份待测样本的双通道扩增结果（实线为短片扩增曲线；虚线为长片段扩增曲线），图4；计算各待测样本的CT差值为：ΔCT = CT长-CT短，如表3所示，根据检测限值1.5，待测样本3和样本4的△CT＜检测限值1.5，判定样本未经过紫外照射；待测样本1和样本2的△CT＞检测限值1.5，判定样本经过紫外照射，判定结果均符合实际设定，说明所述判定方法具有合理性。
表3大肠杆菌K12样本的检测结果
实施例5
在已经公开的实施例基础上，本发明优选地公开一种实时快速检测大肠杆菌经过紫外照射实施例，用于验证紫外照射后大肠杆菌长短片段的CT差值变化，具体步骤如下：
A、取大肠杆菌样品10份，用不同剂量的紫外照射处理；
B、取各待测样本，经过核酸抽提纯化，获得DNA；
C、取等量各待测样本DNA，作为荧光定量PCR的模板。
D、将步骤C中的模板加到PCR反应体系中，同时扩增长短片段，采集双通道探针荧光信号，每个反应重复三次；
E、实验结果：图6为10份经过不同强度紫外照射处理样本的双通道扩增结果，图6对应的长短片段的CT值见表4，从表4可以看出，紫外照射后大肠杆菌样本的ΔCT均大于1.5，符合“所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射”的判定标准。同时，如图7所示，杀灭对数值K与ΔCT关系，均落入公式K=2.156×ΔCT-2.164包含范围。
表4经过紫外照射大肠杆菌样本的CT值检测结果
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (8)
1.一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，其特征在于，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
在不同紫外照射条件下处理所述若干实验组的大肠杆菌样品，所述实验组的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT差值；包括大肠杆菌ATCC 25922的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`HEX-CAGCGCCGAGGTGAGATTGTCCAACAGT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`6-FAM-TAGCTGTACCACGCGCCTGCTTTC-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'- AGAGAGATATTGACCCCTTTG -3'，
5'- ACCTGCATCGTGCCAGTATG -3'；
长片段引物对序列P2，5'-CTTCTCGATCTCTTTCGCGGTTTC -3'，
5'-AACCGTAACAACTGCTGAGTCTTG-3'。
2.一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，其特征在于，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
在不同紫外照射条件下处理所述若干实验组的大肠杆菌样品，所述实验组的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；
所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT差值；包括大肠杆菌K12的引物和探针序列如下，
第一探针序列，5`6-FAM-CTGCTCACCGACAAAGCTGATCTCT-3`BHQ1；
第二探针序列，5`VIC-CCTGAAAGCCCAACAGGAAATAACCTCG-3`BHQ1；
短片段引物对序列P1，5'-GCATTATCCAGCACGTTG -3'，
5'- GCAAAGGGGTCAATATCTCTC -3'；
长片段引物对序列P2，5'- ATGTACTTGCTCAGCCGTC -3'，
5'- ACCTGATGTACGTAATAAACCGT -3'。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述不同紫外照射条件处理所述大肠杆菌样品的ΔCT=CT长-CT短，包括以下反应步骤：
步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；
步骤2，定量取得一定体积所述大肠杆菌培养液分别作为第一培养液、第二培养液、第三培养液.......和第N培养液；其中所述第一培养液不做额外处理；所述第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间；
步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；
步骤4，将所述第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板，依次分别加入第一、第二、第三......和第N独立的PCR扩增反应体系中进行PCR扩增反应；所述PCR扩增反应体系内同时进行长片段和短片段的扩增；
步骤5，采集所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值；所述第一、第二、第三......和第N实验组中的荧光信号CT值均同时包含所述CT长与所述CT短；
步骤6，所述第一、第二、第三......和第N实验组的CT差值计算方法为所述ΔCT=CT长-CT短；
步骤7，根据所述ΔCT判断所述第一、第二、第三......和第N实验组大肠杆菌紫外照射效果。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系组成包括，1×Taqbuffer、1-5mM的镁离子盐、0.05-0.4μM的第一探针、0.05-0.4μM的第二探针、0.2mM的dNTPs、0.1-0.4μM的短片段引物对P1、0.1-0.4μM的长片段引物对P2、0.2-2U的DNA聚合酶及灭菌水；和/或，所述N为≥2自然数。
5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述第一探针序列特异性作用于所述短片段引物对P1所扩增的片段；所述第二探针序列特异性作用于所述长片段引物对P2所扩增的片段。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述ΔCT≥1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组受到紫外照射；当ΔCT<1.5时，确定所述第一、第二、第三......和第N实验组未受到紫外照射。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，包括PCR扩增步骤：
a.将所述PCR扩增反应体系加入对应的PCR反应模板后放入PCR仪，分别独立在94℃环境下预变性5min；
b.将a运行结束后产物依次在94℃环境下变性10秒，在60℃退火30秒，在72℃环境下延伸45秒；
c.重复b中操作32次，在72℃环境下延伸5min，得到所需PCR扩增反应产物。
8.一种判定紫外照射大肠杆菌杀菌率及杀灭对数与双通道探针法荧光定量PCR技术测量ΔCT关系的方法，用于判定权利要求1或2所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在关系，K=2.156×ΔCT-2.164，其特征在于，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；
所述ΔCT为不同紫外照射条件处理所述若干实验组的大肠杆菌样品测量值且满足ΔCT=CT长-CT短；
包含以下步骤：
A、取等量一定浓度的大肠杆菌样品M份，分别均匀涂抹到面积为25平方厘米无菌材料上；所述M为≥1任一正自然数；
B、将所述M个样品用一定强度的紫外线分别处理L秒，并分别标记为样品1、样品2.......和样品M；所述L为0或任一正实数；所述紫外线强度为0-10000微瓦/平方厘米任一强度；
C、对所述M个样品分别采样，并对采样液稀释一定倍数，然后取等体积采样液分别均匀涂抹到LB固体培养基上，于合适温度培养箱过夜培养，对不同紫外处理时间的大肠杆菌培养样品菌落进行计数，通过计算得出不同紫外剂量对大肠杆菌的杀菌率和杀灭对数值；所述稀释倍数取一到一百万任一数值；杀菌前大肠杆菌数量为X0，杀菌后大肠杆菌数量为Xt，则杀菌率R=（X0-Xt）/X0；杀灭对数值K=lgX0-lgXt=lg(X0/Xt)；
D、对所述B步中紫外线处理后的各样品，同时进行权利要求3所述步骤3-所述步骤6反应步骤测量所述各样品的ΔCT；
E、根据C、D步所述各样品ΔCT和杀灭对数值K进行数据拟合，得反应ΔCT和杀灭对数值K对应关系的拟合函数或曲线。
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