WO2016120970A1 - 核酸分離方法、及び装置 - Google Patents

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WO2016120970A1
WO2016120970A1 PCT/JP2015/052010 JP2015052010W WO2016120970A1 WO 2016120970 A1 WO2016120970 A1 WO 2016120970A1 JP 2015052010 W JP2015052010 W JP 2015052010W WO 2016120970 A1 WO2016120970 A1 WO 2016120970A1
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WO
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nucleic acid
binding
carrier
reaction
amplified
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PCT/JP2015/052010
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English (en)
French (fr)
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宮崎　充弘
基博 山崎
入江　隆史
薫 秋元
高道 村松
Original Assignee
株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid separation technique for analyzing nucleic acid mutation, polymorphism, or chemical modification.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • Such an analysis technique is called DNA or RNA (hereinafter, collectively referred to as nucleic acid) typing, and has been applied to a wide range of fields such as cancer diagnosis, infectious disease testing, and personal identification.
  • the general workflow of this analysis includes a step of collecting a biological sample from a specimen, a step of extracting a test nucleic acid from the biological sample, a step of amplifying the test nucleic acid, a step of analyzing the amplified nucleic acid, and a step of analyzing analysis data Consists of
  • the variation in the amount of amplified nucleic acid that causes the above problem is mainly due to the amount and quality of the test nucleic acid extracted in the previous nucleic acid extraction step (degradation degree, contamination of amplification inhibitors and nucleic acids of other species). ) Due to significant differences between specimens. To avoid this problem, the amount and quality of the input nucleic acid to the nucleic acid amplification process are adjusted to be equivalent between samples after further purification of the extracted test nucleic acid, further quantification and qualitative analysis. A normalizing means requiring labor is used. Therefore, there is a demand for a simpler normalization means that can reduce the inter-sample variation in the amount of nucleic acid to be tested within the preferred detection range of the analyzer.
  • an extraction apparatus equipped with a dispensing robot is used in the nucleic acid extraction process, a thermal cycler that performs PCR reaction by automatic temperature control in the nucleic acid amplification process, and a capillary electrophoresis apparatus equipped with a fluorescence detection system in the analysis process.
  • Patent Document 1 discloses a method for normalizing the amount of nucleic acids extracted from a plurality of specimens to the carrier binding ability.
  • Patent Document 2 of the present applicant discloses a biochemical liquid feeding system used in a nucleic acid analyzer.
  • Patent Document 1 in a nucleic acid extraction step, a predetermined amount of a carrier (for example, silica magnetic beads) having a surface characteristic capable of binding to a test nucleic acid is mixed with a crude extraction solution containing the test nucleic acid, and the binding ability of the carrier is mixed.
  • a method has been proposed in which the amount of nucleic acid extracted from a plurality of specimens is normalized to the carrier-binding ability by removing test nucleic acids in excess of.
  • this method requires complicated steps such as removing the supernatant, washing the carrier surface, and elution of the nucleic acid from the carrier surface after binding the test nucleic acid to the carrier surface.
  • the entire apparatus system including the elution reagent is considered to be expensive. Therefore, an apparatus that can automate the entire analysis workflow at low cost is desired.
  • nucleic acids of biological species different from the test subject are mixed in the crude extraction solution, they bind to the carrier surface without being distinguished from the test subject-derived nucleic acid, and the amount of target nucleic acid extracted from the test subject is normalized. It is possible that it will not be done. Therefore, a method capable of specifically normalizing the amount of the target test nucleic acid in the analysis workflow is desired.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid separation method for easily normalizing the inter-sample variation in the amount of a test nucleic acid in a nucleic acid typing analysis workflow within the detection dynamic range of an analyzer. And providing an apparatus.
  • a nucleic acid separation method for separating amplified nucleic acids, a binding step of binding excess amplified nucleic acid exceeding a predetermined amount to the surface of a carrier by a binding reaction, and the binding step And a supply step of supplying the amplified nucleic acid remaining in the binding reaction solution without being bound to the surface of the carrier for analysis.
  • the present invention provides a nucleic acid separation apparatus for separating amplified nucleic acids, the nucleic acid amplification mechanism for amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification reaction using a substrate as a raw material molecule, and the nucleic acid
  • a predetermined amount of carrier capable of specifically binding to both the molecular species of the amplified nucleic acid and the unreacted substrate and binding preferentially to the unreacted substrate molecule over the amplified nucleic acid molecule is A binding mechanism in which the amplified nucleic acid and / or the unreacted substrate, or one of them is bound to the surface of the carrier by a binding reaction, and after the binding step by the binding mechanism, the carrier and the binding A separation mechanism that separates the reaction solution, and a supply mechanism that supplies the amplified nucleic acid remaining in the binding reaction solution without being bound to the surface of the carrier to the analysis after
  • the variation in the amount of amplified nucleic acid between samples can be kept within a predetermined range, and the cost of the analysis workflow can be reduced.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the first half of a nucleic acid separation method according to Example 1.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing the second half of the nucleic acid separation method according to Example 1. It is a graph which shows the principle verification data of the nucleic acid separation method which concerns on Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration example of a main part of a nucleic acid separation device according to Example 3.
  • 6 is a schematic diagram illustrating an example of a liquid feeding mechanism of a nucleic acid separation device according to Example 3.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the first half of a method using magnetic beads in the nucleic acid separation apparatus according to Example 3.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the latter half of the method using magnetic beads in the nucleic acid separation apparatus according to Example 3.
  • nucleic acid analysis means analyzing mutations, polymorphisms, or chemical modifications (Epigenetic modification) in nucleic acids (test nucleic acids) extracted from various biological samples.
  • the test nucleic acid is not particularly limited as long as it is a nucleic acid to be subjected to nucleic acid analysis, and either DNA or RNA can be used.
  • genomic DNA mitochondrial DNA (mtDNA), Circulating ⁇ tum DNA (ctDNA), or RNA such as viral genomic RNA, mRNA, non-coding RNA (ncRNA), microRNA, or RNA obtained by reverse transcription And the like.
  • RNA such as viral genomic RNA, mRNA, non-coding RNA (ncRNA), microRNA, or RNA obtained by reverse transcription And the like.
  • a nucleic acid that has been pretreated such as fragmentation by restriction enzyme treatment or base conversion by bisulfite treatment can also be used as the test nucleic acid.
  • a test nucleic acid (template molecule) extracted in the previous step using a primer modified with an arbitrary ligand (a substance that specifically binds to a specific target substance) as a substrate molecule. Then, nucleic acid amplification is performed by nucleic acid amplification reaction. Thereby, the amplified nucleic acid molecule obtained has the above-mentioned ligand at its end.
  • nucleic acid amplification step when a nucleic acid amplification reaction is performed by introducing a predetermined amount of a ligand-modified primer, in the reaction solution after completion of the nucleic acid amplification reaction, an amplified nucleic acid as a molecular species having a ligand, There will be two types of unreacted ligand-modified primers. At this time, the following relational expression 1 holds for the number of molecules of these molecular species.
  • N L-Pr N L-Amp + N Unreacted L-Pr (Equation 1)
  • NL-Pr is the number of molecules of the ligand-modified primer charged in the nucleic acid amplification reaction
  • N L-Amp is the number of amplified nucleic acid molecules after the nucleic acid amplification reaction
  • N Unreacted L-Pr represents the number of molecules of the unreacted ligand-modified primer after the nucleic acid amplification reaction.
  • N L-Pr is a constant that can be defined equally for all samples, but N L-Amp is a sample due to the heterogeneity (quantity and quality variation) of the test nucleic acid. It varies significantly between.
  • a predetermined amount of carrier surface-modified with a target substance that specifically binds to the ligand is brought into contact with the nucleic acid amplification reaction solution after the reaction.
  • the predetermined amount is defined so that the total binding ability of the carrier to be in contact with the liquid is smaller than the number of input molecules of the ligand-modified primer.
  • N BC ⁇ N L-Pr .
  • N BC represents a total binding capacity of the carrier is wetted in a nucleic acid amplification reaction solution after the reaction.
  • NBC is a constant that can be defined equally for all samples.
  • a molecular species having a ligand is bound to the carrier surface.
  • both molecular species of the amplified nucleic acid and the unreacted ligand-modified primer can specifically bind to the support surface, but the unreacted ligand-modified primer binds to the support surface more preferentially than the amplified nucleic acid.
  • This is thought to be because the steric hindrance of amplified nucleic acids (usually 100-2000 base pairs of double-stranded DNA) is greater than ligand-modified primers (usually 20-30 bases of single-stranded DNA) (DynabeadsR M-270 Streptavidin Manual Publication No. MAN0008449 Rev. Date: May 2013 (Rev. 9.0)). Therefore, in the binding reaction solution in which the amplified nucleic acid molecule and the unreacted ligand-modified primer molecule coexist, The following relational expression holds.
  • K Unreacted L-Pr is the ease of binding of the unreacted ligand-modified primer to the support surface modified with the target substance
  • KL -Amp represents the ease of binding of the amplified nucleic acid to the surface of the carrier modified with the target substance.
  • K Unreacted L-Pr and K L-Amp are constants that can be defined equally for all specimens.
  • the carrier to which the ligand-containing molecular species is bound is spatially separated from the binding reaction solution by any means described below.
  • the amplified nucleic acid that is not bound to the surface of the carrier and remains in the binding reaction solution is supplied to an arbitrary analysis process described later.
  • the ratio of primer molecules changes as follows.
  • the amount of amplified nucleic acid obtained is very small (the amount corresponding to the lower limit of the preferred detection range) and the number of molecules of unreacted primer greatly exceeds the total binding capacity of the contacted carrier (N Unreacted L-Pr > N BC > N L-Amp ), since almost all of the total binding capacity is occupied by binding to unreacted primer molecules, the amplified nucleic acid molecules hardly bind to the support surface. Therefore, for specimens for which only a small amount of amplified nucleic acid was obtained, almost all of the obtained amplified nucleic acid molecules, together with a part of the unreacted primer, are contained in the binding reaction solution even after the above-mentioned contact, binding and separation steps. It remains unbound and will be supplied to the next analysis process.
  • the amount of the amplified nucleic acid obtained was an appropriate amount (amount exceeding the lower limit of the preferred detection range and lower than the upper limit), the number of unreacted primer molecules, the number of amplified nucleic acids, and the total amount of the carrier in contact with the liquid.
  • the binding capacities are almost equal (N Unreacted L-Pr ⁇ N BC ⁇ N L-Amp ), depending on the difference in ease of binding to the support surface, most of the unreacted primer and the amplified nucleic acid molecule A portion binds to the support surface.
  • a plurality of samples are processed in parallel in nucleic acid typing, and the amount of amplified nucleic acid obtained in the nucleic acid amplification step varies significantly between samples, and the variation is used in the analysis process. Even if it exceeds the preferred detection range of the device, the amount of amplified nucleic acid obtained is very small, and for samples whose amount is equivalent to the lower limit of the preferred detection range or slightly exceeding the lower limit, almost the entire amount of amplified nucleic acid is used.
  • the amplified nucleic acid For samples that can be supplied to the analysis process and the resulting amplified nucleic acid is excessive and the amount exceeds the upper limit of the preferred detection range, only the amount of the amplified nucleic acid that is less than the upper limit is supplied to the analysis process. For a sample in which the obtained amplified nucleic acid is in an appropriate amount, the amount sufficiently exceeds the lower limit of the preferred detection range, and falls below the upper limit, the amplified nucleic acid Since most of the sample can be supplied to the analysis process, it is possible to easily normalize the amount of amplified nucleic acid within the preferred detection range for all parallel-processed samples, rectify the workflow, and perform all parallel processing. High-quality analysis data can be acquired for the specimen.
  • a ligand-modified primer is used as a substrate molecule in a nucleic acid amplification reaction for amplifying a test nucleic acid (template molecule).
  • the ligand used at this time is not particularly limited as long as it can be chemically modified to the primer, but is preferably a substance that specifically binds to a specific target substance.
  • Such ligands include small molecule antigens (amino acids, peptides, proteins, lipids, sugars, nucleic acids, etc.), antibody proteins, sugar chains, enzyme substrates (amino acids, peptides, proteins, lipids, sugars, nucleic acids, etc.), vitamins (Such as biotin).
  • any known method can be used as long as it uses a primer as a reaction substrate.
  • a polymerase chain reaction (PCR), a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method, or the like that amplifies a single region or a plurality of regions of a test nucleic acid in a sequence-specific manner can be used.
  • a Multiple Displacement Amplification (MDA) method in which the entire region of the test nucleic acid is amplified in a sequence-independent manner can also be used.
  • MDA Multiple Displacement Amplification
  • a RollingRCircle Amplification (RCA) method for amplifying single-stranded or double-stranded circular DNA can also be used.
  • the primer molecule is one of the DNA-polymerase substrates in the extension reaction, and is incorporated into the amplified nucleic acid molecule during the reaction. Therefore, when a ligand-modified primer is used, the amplified nucleic acid molecule obtained has the above-mentioned ligand at its end. Therefore, as described above, when a nucleic acid amplification reaction is performed with a predetermined amount of ligand-modified primer, relational expression 1 is established for the number of molecules of the amplified nucleic acid and the unreacted ligand-modified primer.
  • the amplification reaction solution is brought into contact with the surface of the carrier modified with the target substance that specifically binds to the ligand.
  • the amount of the carrier used is defined so that the total binding capacity on the surface of the carrier becomes smaller than the number of molecules of the ligand-modified primer, relational expression 2 is established.
  • the target substance at this time is not particularly limited as long as it can be modified on the surface of the carrier chemically or by physical adsorption, but is preferably a substance that specifically binds to a specific ligand.
  • target substances include antibody proteins (ligands are low-molecular antigens such as amino acids, peptides, proteins, lipids, saccharides, and nucleic acids), antigen proteins (ligands are antibody proteins), lectins (ligands are sugar chains), proteins ( Examples of the ligand include amino acids, peptides, proteins, lipids, sugars, enzyme substrates such as saccharides, and vitamins).
  • the number of ligand molecules that can be bound per molecule of the target substance is constant. Therefore, it is possible to calculate the total binding capacity on the surface of the carrier and define the amount of carrier to be used in contact with the liquid.
  • the carrier at this time is not particularly limited as long as the nucleic acid amplification reaction liquid can be contacted to the surface thereof, but a carrier having a uniform surface structure and a small variation between production lots is desirable.
  • a carrier having a uniform surface structure and a small variation between production lots is desirable.
  • the carrier used in the present invention include beads, filters, sheets, and gel thin films.
  • the amplification reaction solution can be brought into contact with the bead surface by uniformly suspending the beads in the nucleic acid amplification reaction solution.
  • the material of the beads is not particularly limited, and magnetic beads or the like in which a high molecular polymer core containing a magnetizable substance is covered with a hydrophobic or hydrophilic polymer can be used.
  • the particle diameter of the beads is not particularly limited, but beads having a particle diameter of several tens of nanometers to several micrometers can be arbitrarily selected and used.
  • the surface properties of the beads are not particularly limited, but beads having various target substances described above bonded chemically or by physical adsorption to a hydrophobic (eg, tosyl group) or hydrophilic (eg, carboxyl group) surface can be arbitrarily selected. It can be selected and used.
  • a hydrophobic (eg, tosyl group) or hydrophilic (eg, carboxyl group) surface can be arbitrarily selected. It can be selected and used.
  • the amplification reaction solution can be brought into contact with the micropores in the filter by allowing the nucleic acid amplification reaction solution to penetrate into the filter.
  • the material of the filter is not particularly limited, and porous silica gel whose surface is chemically modified can be used.
  • the fine structure of the filter is not particularly limited, but a filter having an arbitrary pore size and porosity can be used.
  • the surface characteristics of the filter are not particularly limited, and a filter in which the above-described various target substances are bonded to the silica gel surface chemically or by physical adsorption can be arbitrarily selected and used.
  • the amplification reaction liquid can be brought into contact with the sheet surface by discharging the nucleic acid amplification reaction liquid onto the sheet using any means.
  • the material of the sheet is not particularly limited, and a chemically modified surface of alumina, glass, cellulose membrane, nylon membrane, or the like can be used.
  • the surface structure of the sheet is not particularly limited, but a sheet subjected to special processing to increase the surface area in contact with the liquid can be used.
  • the surface characteristics of the sheet are not particularly limited, a sheet in which the above-mentioned various target substances are chemically or physically adsorbed on the surface of the sheet material can be arbitrarily selected and used.
  • the amplification reaction liquid can be brought into contact with the network molecular structure in the gel thin film by electrophoresis of the nucleic acid amplification reaction liquid into the gel thin film.
  • the nucleic acid amplification reaction solution after completion of the reaction is contacted with the surface of the carrier modified with the target substance.
  • two molecular species having a ligand (amplified nucleic acid and unreacted ligand-modified primer) bind to the target substance on the surface of the carrier (binding step).
  • the binding conditions at this time are not particularly limited as long as the molecular species having the ligand can bind to the target substance.
  • the binding condition of the unreacted ligand-modified primer is greater than that of the amplified nucleic acid. Is preferred.
  • variable parameters in the binding step of the present invention there are physical condition parameters related to wettability such as incubation time, stirring mode and liquid volume, or chemical condition parameters related to binding reaction such as salt concentration, pH and temperature.
  • physical condition parameters related to wettability such as incubation time, stirring mode and liquid volume
  • chemical condition parameters related to binding reaction such as salt concentration, pH and temperature.
  • the carrier is separated from the binding reaction solution (separation step).
  • the separation means at this time is not particularly limited as long as it can physically separate the support and the binding reaction solution, but a means that enables almost no carrier to remain in the combined reaction solution after separation is preferable.
  • the separation means varies depending on the type of carrier used. For example, when magnetic beads are used as a carrier, magnetic beads can be attached to any inner wall of the suspension containing section by applying a magnetic force to the suspension of the magnetic beads in the binding reaction solution after the binding step. And can be separated from the binding reaction solution.
  • non-magnetic beads when used as a carrier, the non-magnetic beads are accommodated in the suspension by applying a centrifugal force to the liquid obtained by suspending the non-magnetic beads in the binding reaction solution after the above binding step. It can be collected at any location on the inner wall of the compartment and separated from the binding reaction.
  • a binding reaction solution in which beads are physically separated by such means will be referred to as a supernatant hereinafter.
  • a centrifugal reaction or vacuum pressure is applied to the filter that holds the binding reaction solution, and the binding reaction solution is allowed to flow, whereby the binding reaction with the filter is performed.
  • the liquid can be physically separated.
  • the combined reaction liquid that is physically separated from the filter by such means is hereinafter referred to as a passing liquid.
  • the sheet and the binding reaction liquid can be physically separated by moving the binding reaction liquid to another compartment using any means after the above-described binding step. it can.
  • the binding reaction solution separated from the sheet by such means is hereinafter referred to as a supernatant.
  • the gel thin film and the binding reaction liquid can be physically separated by electrophoresing the binding reaction liquid to another compartment after the above-described binding step.
  • the binding reaction liquid that is physically separated from the gel thin film by such means is hereinafter referred to as a passing liquid.
  • the amplified nucleic acid remaining in the supernatant or the passing solution is supplied to an arbitrary analysis process because it is not bound to the surface of the carrier.
  • the supply means at this time is not particularly limited as long as a part or all of the amplified nucleic acid contained in the supernatant or the passage liquid can be supplied to the subsequent analysis process, but means for controlling the supply amount of the amplified nucleic acid is available.
  • any or all of the remaining amplified nucleic acid can be supplied to the analysis process by moving only a predetermined volume of the supernatant or flow-through using any means.
  • a predetermined amount of amplified nucleic acid remaining in the supernatant or flow-through can be supplied to the analytical process using electrokinetic means.
  • the amplified nucleic acid supplied as described above can be analyzed in the analysis process. Any method, means, or apparatus may be used in the analysis process at this time, and the present invention is not limited at all by the analysis process used.
  • the supplied amplified nucleic acid can be analyzed by performing base sequence analysis or fragment analysis by capillary electrophoresis.
  • the amplified nucleic acid remaining in the binding reaction liquid (supernatant or passage liquid) after the carrier separation is supplied to the analysis process regardless of the type of the carrier used. Therefore, it is necessary to supply amplified nucleic acid bound to the carrier surface to the analysis process, which includes a washing step (washing the non-specific adsorption substance on the carrier surface) and an elution step (amplifying nucleic acid bound to the carrier surface). Elution) becomes unnecessary. Therefore, it is possible to construct a simpler workflow with fewer required steps and a lower cost workflow with less consumed reagent amount. Furthermore, since the workflow can be rectified, the entire system can be made more robust.
  • the amplified nucleic acid obtained can be detected by various means in the nucleic acid amplification reaction by using a chemically labeled substrate in addition to the ligand-modified primer.
  • the chemical label used at this time is not particularly limited as long as it is an atomic group detectable by an analyzer used in the analysis process.
  • a fluorescent label (6-FAM, HEX, Cy5, etc.), a chemiluminescent label (luciferin, etc.), Any chemical label such as an enzyme label (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) or a radioactive label (tritium, carbon 14, phosphorus 32, etc.) can be selected.
  • the substrate to be chemically labeled at this time is not particularly limited as long as it is a molecular species that is incorporated into the amplified nucleic acid during the nucleic acid amplification reaction.
  • any substrate such as a forward primer, a reverse primer, and dNTP can be selected.
  • the ligand modification and the chemical label may be applied to different primers (for example, chemical labeling for the forward primer and ligand modification for the reverse primer), or the ligand and chemical labeling for the same primer. Multiple modifications may be applied (eg, double modification of ligand and chemical label on reverse primer).
  • the chemically labeled substrate as described above is incorporated into the amplified nucleic acid by the nucleic acid amplification reaction, and the obtained amplified nucleic acid can be detected optically or using radioactivity.
  • Qualitative analysis and quantitative analysis of amplified nucleic acids can be performed using an analyzer. Based on these results, the test nucleic acid can be typed to obtain molecular level information about the derived specimen.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed using a fluorescently labeled forward primer and a ligand-modified reverse primer, and the above-described liquid contact and binding are performed using a carrier surface-modified with a target substance.
  • the amplified nucleic acid remaining in the binding reaction solution can be analyzed by fragment analysis by capillary electrophoresis.
  • a capillary electrophoresis sample can be prepared by mixing 0.5 ⁇ L of the binding reaction solution with 9.0 ⁇ L of formamide together with 0.5 ⁇ L of the size standard. .
  • the mixing ratio may be changed as appropriate, or the mixed solution may be heated and rapidly cooled (95 ° C. for 3 minutes, 4 ° C. for 5 minutes).
  • nucleic acid separation apparatus suitable for carrying out the nucleic acid analysis method as described above can be provided.
  • the nucleic acid separation apparatus includes, as its basic elements, a compartment in which a nucleic acid amplification reaction is performed to amplify a test nucleic acid using a ligand-modified primer as a substrate molecule, and a nucleic acid amplification reaction solution after completion of the nucleic acid amplification reaction.
  • a predetermined amount of a carrier that is surface-modified with a target substance that specifically binds to a ligand, a compartment in which the amplified nucleic acid and unreacted ligand-modified primer are bound to the carrier surface, and the above binding reaction After completion of the above, a compartment where the carrier and the binding reaction solution are separated and a compartment which supplies the amplified nucleic acid remaining in the binding reaction solution without being bound to the carrier surface to the analysis process after the separation step are provided.
  • the sections described above may be the same section in the apparatus, or may be a plurality of sections different from each other.
  • a predetermined amount of magnetic beads are suspended in the nucleic acid amplification reaction solution after completion of the reaction contained in the amplification reaction section, and after the binding reaction, the magnetic beads are amplified using a magnet. It can be collected at any location in the compartment.
  • the nucleic acid amplification reaction, the liquid contact process, the binding reaction, and the separation process are performed in the same section of the device. Further, after the separation step, the obtained supernatant is moved to another compartment provided near the compartment, so that the amplified nucleic acid in the supernatant can be more easily supplied to an arbitrary analyzer.
  • the nucleic acid amplification reaction solution stored in the amplification reaction section is brought into contact with a filter having a predetermined surface area provided in another section to complete the binding reaction. Thereafter, the binding reaction liquid retained by the filter is allowed to flow using centrifugal force or vacuum pressure reduction, and the passing liquid can be stored in another compartment.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the amplification reaction section, the liquid contact process and the binding reaction are performed in the section where the filter is provided, and the separation process is performed from the filter section to the passage liquid storage section.
  • the amplified nucleic acid in the liquid passing through can be easily supplied to any analyzer.
  • the nucleic acid amplification reaction solution after completion of the reaction accommodated in the amplification reaction section is brought into contact with a sheet having a predetermined surface area provided in another section to complete the binding reaction. Thereafter, the binding reaction solution overlying the sheet can be collected using any means, and the collected solution (supernatant) can be stored in another compartment.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the amplification reaction section, the liquid contact process and the binding reaction are performed in the section where the sheet is provided, and the separation process is performed in the separation liquid storage section from the sheet section.
  • the fractionated solution (supernatant) in this case is fractionated in the fractionated solution storage compartment, the amplified nucleic acid in the fractionated solution can be easily supplied to any analyzer.
  • the nucleic acid amplification reaction solution after completion of the reaction accommodated in the amplification reaction section is placed in a gel thin film having a predetermined total binding capacity provided in another section.
  • the binding reaction solution in the gel thin film is passed through electrophoresis, and the passing solution can be stored in another compartment.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed in the amplification reaction section, the liquid contact process and the binding reaction are performed in the section where the gel thin film is provided, and the separation process is performed from the gel thin film section to the passage liquid containing section.
  • the gel thin film passage liquid in this case is fractionated in the passage liquid storage compartment, the amplified nucleic acid in the passage liquid can be easily supplied to any analyzer.
  • An introduction mechanism for introducing a plurality of reagents used in the nucleic acid amplification reaction and the binding reaction into a predetermined section of the nucleic acid separation apparatus; a temperature control mechanism for controlling the temperature of the nucleic acid amplification reaction section and the binding reaction section in the apparatus; For contacting a nucleic acid amplification reaction solution with a predetermined amount of a carrier surface-modified with a target substance that specifically binds to a ligand, and carrying out a binding reaction between the amplified nucleic acid and an unreacted ligand-modified primer on the carrier surface A binding mechanism, a separation mechanism for separating the carrier in contact with the binding reaction solution, and a supply mechanism for supplying amplified nucleic acid remaining in the binding reaction solution without binding to the carrier surface to the analysis process.
  • the reagent introduction mechanism described above is particularly limited as long as it is a means that can introduce a predetermined volume of a specific reagent into a predetermined section of the apparatus with accuracy and precision capable of reproducibly performing a nucleic acid amplification reaction and a binding reaction. It is not a thing.
  • the temperature control mechanism described above is not particularly limited as long as it is a means capable of controlling the temperature of a predetermined section of the apparatus with accuracy and precision capable of performing the nucleic acid amplification reaction and the binding reaction with good reproducibility.
  • the above-mentioned coupling mechanism and separation mechanism are not particularly limited as long as they are means suitable for the type of carrier used.
  • the supply mechanism for supplying the amplified nucleic acid not bound to the carrier surface to the analysis process is preferably a means capable of controlling the supply amount, but is not particularly limited.
  • the reagent used in the above-described nucleic acid amplification reaction and binding reaction may be sealed in advance in a reagent compartment provided in the apparatus, or from the reagent storage container outside the apparatus by the user immediately before the start of analysis, You may make it dispense to the reagent division in an inside. In any case, it is preferable that these reagents are automatically introduced into the reaction compartment of the apparatus during analysis.
  • the washing process and the elution process are not performed regardless of the type of carrier used, so that the washing mechanism and the elution mechanism and the time required for these processes are not required.
  • the binding reaction solution (supernatant or flow-through solution) after separation of the carrier is not discarded and neither the washing reagent nor the elution reagent is used, the binding reaction solution, washing reagent, washing waste solution, elution reagent, and elution solution are accommodated. The section for doing so becomes unnecessary in the apparatus. Therefore, it is possible to adopt a smaller and lower-cost apparatus configuration, and the apparatus mechanism can be simplified, so that the entire system can be made more robust. Furthermore, since it becomes possible to shorten the Turnaround time (TAT), the analysis result of the test nucleic acid can be obtained more quickly.
  • TAT Turnaround time
  • Example 1 is an example of a nucleic acid separation method applied to DNA typing using a PCR reaction. That is, a nucleic acid separation apparatus for separating amplified nucleic acids, a nucleic acid amplification step for amplifying a test nucleic acid by a nucleic acid amplification reaction using a substrate as a raw material molecule, and both the amplified nucleic acid and an unreacted substrate after the nucleic acid amplification step.
  • a predetermined amount of a carrier capable of specifically binding to a molecular species and binding to the unreacted substrate molecule more preferentially than the amplified nucleic acid molecule is brought into contact with a nucleic acid amplification reaction solution, and the amplified nucleic acid and the unreacted substrate are contacted.
  • a binding step of binding one of them to the surface of the carrier by a binding reaction a separation step of separating the carrier and the binding reaction solution after the binding step, and a step of separating the carrier after the separation step.
  • FIG. 1A and FIG. 1B are conceptual diagrams showing DNA typing using a PCR reaction according to this example.
  • the nucleic acid separation method of this example is shown in FIG. 1A and FIG. 1B.
  • A Sample collection,
  • PCR reaction liquid and carrier surface wetted liquid Followed by binding reaction of unreacted primer and PCR product to the carrier surface,
  • e separation of carrier and binding reaction solution, supply of PCR product remaining in the supernatant to capillary electrophoresis, capillary electrophoresis, and It consists of analysis processes such as electrophoresis pattern (electropherogram) analysis.
  • electrophoresis pattern electrophoresis pattern
  • the sample 102 is collected from the subject 101.
  • various biological samples such as blood, urine, tissue, pathological section, oral epithelial cell, hair and the like can be selected according to the examination purpose.
  • various means such as an injection needle, a cotton swab, and a swab can be selected according to the type of specimen.
  • the biological sample is not particularly limited, and any sample such as tissue, blood, urine, or pathological section can be used.
  • An object cloth, paper, plastic, etc.
  • the specimen from which the biological sample is derived is not particularly limited, and any specimen such as a human, a non-human animal, a plant, a fungus, a bacterium, or a virus can be used.
  • oral epithelial cells were collected from the subject using a swab. Since the number of cells collected on the surface of the swab varies depending on the angle and strength with which the swab is pressed, the number of collected cells among a plurality of specimens often varies. In addition to the oral epithelial cells, food and beverage residues or oral bacteria are inevitably mixed, so that the quality of the obtained specimen often varies depending on the oral environment of each subject. Such non-uniformity (collection amount and quality variation) between samples varies depending on the type of sample, but is a problem in many examinations. For example, the amount of lipid contained in a blood sample may vary from day to day even in the same subject.
  • the test nucleic acid 103 is extracted from the specimen 102.
  • various nucleic acids such as genomic DNA, ctDNA, and mRNA can be selected according to the test purpose as described above.
  • extraction means various means such as physical disruption by a homogenizer or the like, chemical dissolution by a surfactant, an enzyme or the like can be used in combination depending on the type of specimen.
  • the swab head was immersed in a cell lysis solution for a certain period of time to lyse cells adhering to the surface of the swab to obtain a crude extract.
  • genomic DNA test nucleic acid
  • this crude extract inevitably contains molecular species such as RNA, protein, lipid, and sugar.
  • DNA derived from food and drink residues or oral bacteria is inevitably mixed, and since these DNAs are the same molecular species as the target DNA and are not distinguished by general nucleic acid quantification methods, accurate quantification of the target DNA is possible. It is often extremely difficult.
  • the target region of the test nucleic acid is amplified by the PCR reaction in the PCR reaction vessel 104.
  • a TH01 locus which is one of the STR markers, was amplified using a PCR reaction as a nucleic acid amplification reaction.
  • the 6-FAM forward primer (hereinafter referred to as 6-FAM primer) 110 has a sequence as a kind of substrate that complementarily binds to the vicinity of the TH01 locus region of the genomic DNA sense strand and a 6-modified group added at the 5 ′ end. It consists of FAM fluorescent dye 113.
  • a biotinylated reverse primer (hereinafter referred to as biotinylated primer) 111 is modified by adding a sequence as a kind of substrate that complementarily binds to the vicinity of the TH01 locus region of the genomic DNA antisense strand and a spacer at the 5 ′ end.
  • Biotin 114 the biotinylated primer 111 has a configuration in which one type of substrate used in the nucleic acid amplification reaction is modified with biotin 114 as a ligand.
  • another type of substrate used in the nucleic acid amplification reaction is labeled with a fluorescent dye 113, and by using this fluorescent dye 113, the obtained amplified nucleic acid can be analyzed by an optical detection means.
  • the primer set as such a substrate was mixed in a PCR reaction vessel 104 together with a crude extract containing human genomic DNA as a test nucleic acid and other necessary reagents, and a PCR reaction was started.
  • the PCR product 112 amplified during the PCR reaction has a molecular structure having 6-FAM fluorescent dye 113 at the 5 ′ end of one strand of the double strand and biotin 114 at the 5 ′ end of the other strand. It becomes like this.
  • Number of molecules of biotinylated primer charged into PCR reaction number of molecules of unreacted biotinylated primer + number of molecules of PCR product
  • the PCR reaction solution is placed on the entire surface of the carrier. Allow the liquid to contact evenly.
  • At least one of the substrates used in the nucleic acid amplification reaction is a primer modified with biotin as a ligand
  • the streptoid is a target substance that specifically binds to the ligand on the surface of the magnetic beads as a carrier. It is modified with avidin. That is, in this example, magnetic beads 115, which are magnetic beads with streptavidin functioning as a target substance bonded to the surface, were used as a carrier. Since streptavidin binds specifically and strongly to the biotin molecule as a ligand, the magnetic beads 115 can bind the unreacted biotinylated primer 111 and the PCR product 112 to the surface thereof. Further, since the magnetic beads 115 have a core in which the magnetizable material is uniformly distributed, they can be collected at any place in the container by a magnet.
  • a predetermined volume of a binding reaction buffer containing a predetermined amount of the magnetic beads was added to the PCR reaction liquid to prepare a binding reaction liquid having a composition suitable for binding biotin and streptavidin.
  • the binding reaction was then gently suspended so that the magnetic beads were evenly diffused.
  • the predetermined amount of the magnetic beads is defined so that the total binding capacity of the magnetic beads to be added is smaller than the number of molecules of the biotinylated primer charged in the PCR reaction, the following equation is established.
  • the unreacted biotinylated primer which is a single-stranded DNA of 20-25 bases, binds to the surface of the magnetic beads more preferentially than the PCR product, which is a double-stranded DNA of 150-300 base pairs. It holds.
  • the carrier and the binding reaction solution are physically separated.
  • the magnetic beads 115 are used as the carrier, the magnet 116 is brought into contact with the outer wall side surface of the PCR reaction vessel 104, and the magnetic beads 115 are collected and fixed on the inner wall side surface of the reaction vessel 104.
  • the magnetic beads 115 were physically separated from the binding reaction solution, and a supernatant 117 was obtained.
  • a part or all of the PCR product remaining in the binding reaction solution after separation is supplied to capillary electrophoresis.
  • a partial volume of the supernatant was transferred to a separate container, mixed with desalted formamide, and then subjected to a capillary electrophoresis apparatus.
  • desalted formamide any nucleic acid denaturing agent can be used.
  • PCR products in the nucleic acid denaturant are separated and detected by electrophoresis.
  • a 3500-Genetic-Analyzer was used as a capillary electrophoresis apparatus, and PCR products in desalted formamide were separated and detected.
  • the peak size and peak height of the electropherogram obtained by electrophoresis are analyzed, and the test nucleic acid is typed.
  • STR typing of human genomic DNA of the subject was performed for TH01 locus.
  • the amount of the obtained PCR product is an appropriate amount like the PCR reaction solution of subject B in (c) of FIG. 1A, the number of molecules of unreacted biotinylated primer, the number of molecules of the PCR product, and the total binding of magnetic beads.
  • unreacted biotinylated primer and PCR product are mixed according to the ease of binding to the carrier surface, as seen in the binding reaction solution of subject B shown in the enlarged view of FIG. 1B (d). Bind to the bead surface.
  • the amount of PCR product remaining in the supernatant is slightly reduced than before addition of magnetic beads.
  • PCR amplification of TH01 locus was performed in a 25 ⁇ L reaction system containing 5 ⁇ pmol of 6-FAM forward primer and 5 ⁇ pmol of biotinylated reverse primer using human genomic DNAs 1,4,8,8 ng as a template.
  • the method of this example it is possible to normalize the amount of PCR product to be subjected to capillary electrophoresis so that it can be detected in a suitable detection range (for example, 2000-10000 rfu) for all parallel-processed samples. it can. This is more preferable for size separation and optical separation of fluorescent dyes in capillary electrophoresis, and can improve inspection quality.
  • a suitable detection range for example, 2000-10000 rfu
  • Example 2 is an example in the case where there are a plurality of target regions of a test nucleic acid to be amplified by a nucleic acid amplification reaction.
  • the present invention is applied when typing a single target region.
  • the present invention is applied when a plurality of target regions are simultaneously typed by a multiplex nucleic acid amplification reaction. .
  • primers modified with different ligands and a carrier surface-modified with a corresponding target substance may be used for each target region.
  • the combination of the ligand and the target substance is not particularly limited as long as the ligand-modified nucleic acid can specifically bind to the carrier surface-modified with the target substance, but the low molecular antigen and antibody protein, sugar chain and lectin, enzyme substrate.
  • biological bonds such as vitamins and proteins, those based on chemical bonds such as ionic bonds and covalent bonds, those based on physical adsorption, and the like can be used. Thereby, as an additional effect, it is possible to independently normalize the amounts of a plurality of types of amplified nucleic acids obtained from a plurality of target regions for each region.
  • This example is an example of a pretreatment integrated nucleic acid separation device in which a container in which a reagent, a sample, beads, and the like are enclosed is attached to the main body of the device, and liquid feeding and reagent reaction are performed.
  • a container hereinafter referred to as a reagent cartridge
  • a reagent cartridge in which reagents, samples, beads, etc. are enclosed is attached to the apparatus main body, and a reagent cartridge is used by using air pressure and a thin film (hereinafter referred to as a membrane).
  • a reagent cartridge in which reagents, samples, beads, etc. are enclosed is attached to the apparatus main body, and a reagent cartridge is used by using air pressure and a thin film (hereinafter referred to as a membrane).
  • a membrane a thin film
  • FIG. 3 schematically shows a schematic configuration of a liquid feeding system used in the nucleic acid separation apparatus of this example.
  • a reagent cartridge 501 is composed of a cartridge flow path portion 502 in which reagent wells and flow paths are formed, and a membrane portion 503, and is set in a cartridge holder 504 that is an apparatus main body.
  • the cartridge holder 504 has pressurization / negative pressure ports 505 to 508 for applying air pressure to the flow path and the flow path sealing valve, and each port has a pressurization pipe control valve 509 or a negative pressure pipe control valve.
  • the pressure pump 511 and the negative pressure pump 512 are connected via the 510.
  • the output of each pneumatic piping control valve is controlled by a valve control controller 513.
  • FIG. 4 shows a liquid feeding method using air pressure and a membrane, which is realized in the configuration of the nucleic acid separation apparatus of this example.
  • FIG. 6A shows a state where the reagent cartridge 602 is installed in the cartridge holder 601. A reagent or sample 604 is sealed in the inlet well 603, and the membrane 605 is driven by applying air pressure to the flow path sealing valve of the cartridge holder 504, whereby the reagent in the inlet well 603 is passed through the flow path 606. To feed the outlet well 607.
  • the flow path 606 is formed in the cartridge holder 601, but may be formed in the reagent cartridge 602.
  • the flow path inlet sealing valve 608 is opened by air pressure, and at the same time, the inside of the flow path 606 is made negative pressure, whereby the membrane 605 swells, The reagent in the inlet well is taken into the channel 606.
  • the flow path inlet sealing valve 608 is closed and the flow path outlet sealing valve 609 is opened as shown in FIG.
  • the inside of the flow path 606 is set to a positive pressure, so that the membrane 605 returns to its original state, and the reagent can be sent to the outlet well 607 as shown in FIG.
  • FIG. 5A and FIG. 5B show an apparatus operation flow in the case where magnetic beads are used as a carrier in the structure of the apparatus of this example.
  • a cross section taken along a dotted line A-A ′ shown on the left side is shown on the right side.
  • (A) of FIG. 5A is a figure which shows the apparatus structure at the time of a flow start.
  • a PCR reagent 701 containing a biotinylated primer is sealed in the inlet well
  • a bead solution 703 including magnetic beads 702 and a binding reaction buffer is sealed in the outlet well
  • a nucleic acid denaturing reagent 705 is sealed in the electrophoresis reagent well 704.
  • a sample is injected into another well connected to the inlet well, and the sample is fed to the inlet well at the start of the PCR reaction and mixed with the PCR reagent 701.
  • the channel 706 also functions as a reagent reaction tank, and the PCR reaction and the binding reaction described below are performed in this section.
  • a temperature control mechanism 707 is used in order to control the temperature when the reagent reaction is performed in the flow path 706, a temperature control mechanism 707 is used.
  • a magnet 708 is used to collect and fix the magnetic beads 702 on the inner wall of the flow path 706.
  • an electromagnetic force may be used as an assembly fixing mechanism of the magnetic beads 702.
  • a structure such as a filter having a pore structure may be used as the assembly and fixing mechanism. In this case, the non-magnetic beads can be stopped on the structure.
  • the PCR reagent 701 in the inlet well is taken into the channel 706.
  • temperature control is performed by the temperature control mechanism 707, and a PCR reaction is performed.
  • a biotin-labeled PCR product is synthesized in the channel 706.
  • the bead solution 703 is taken into the channel 706 from the outlet well, and the solution is repeatedly sent as many times as necessary between the inlet well, the channel and the outlet well.
  • the magnetic beads 702 are uniformly suspended in the solution mixture (binding reaction solution).
  • the unreacted biotinylated primer and the PCR product bind to the surface of the magnetic bead 702 depending on the amount of the obtained PCR product and the difference in ease of binding to the bead surface.
  • the magnetic beads 702 are collectively fixed to the inner wall of the channel 706 as shown in FIG. 5B (e). In the supernatant separated at this time, the PCR product normalized so that a peak within a suitable detection range can be obtained when it is applied to the detection apparatus remains.
  • the supernatant is fed to the outlet well as shown in FIG. 5B (f). Finally, as shown in FIG. 5B (g), a predetermined volume of the supernatant is taken into the electrophoresis reagent well 704, and the supernatant and the nucleic acid denaturing reagent 705 are mixed.
  • a partition such as a well and a flow path for accommodating a binding reaction solution, a cleaning reagent, a cleaning waste solution, an eluting reagent, and an eluting solution is not necessary.
  • the magnetic bead suspension operation and the subsequent bead assembly fixing operation can be performed only once.
  • high-quality analysis data can be acquired for all parallel-processed samples in one batch process.
  • This example is an example of an apparatus to which the method of the present invention is applied when simultaneously typing a plurality of target regions by a multiplex nucleic acid amplification reaction.
  • the above-described effects can be obtained by using the same apparatus configuration and operation flow as in the third embodiment. Further, for each target region, primers modified with different ligands and a carrier surface-modified with a corresponding target substance may be used. Thereby, as an additional effect, it is possible to independently normalize the amounts of a plurality of types of amplified nucleic acids obtained from a plurality of target regions for each region.
  • the extracted test nucleic acid is purified or quantitatively qualitatively analyzed, or after the extracted test nucleic acid is bound to the carrier surface.
  • the workflow of nucleic acid typing can be rectified, and high-quality analysis data can be quickly obtained for a plurality of samples processed in parallel.
  • a low-cost apparatus can link a series of steps of nucleic acid extraction, nucleic acid amplification, and amplified nucleic acid analysis in a workflow to automate a series of steps.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for better understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

Abstract

　核酸増幅反応を用いて被検核酸を解析する際、増幅核酸量の検体間ばらつきを、簡便な方法により分析装置の検出ダイナミックレンジ以内に低減させる。基質を原料分子とする核酸増幅反応により被検核酸を増幅させる工程で得られる、増幅核酸及び未反応基質の両分子種に特異的に結合可能で、かつ前記増幅核酸分子よりも前記未反応基質分子に優位に結合する所定量の担体である磁気ビーズ１１５を、反応終了後の増幅反応液に接液させる。このとき、結合反応により、前記増幅核酸及び前記未反応基質、あるいはそのいずれか一方を磁気ビーズ１１５の表面に結合させる。結合反応後、磁石１１６を用いて磁気ビーズ１１５と結合反応液を分離させ、得られた上清１１７を分析する。

Description

核酸分離方法、及び装置
　本発明は、核酸の変異や多型、あるいは化学修飾を解析するための核酸分離技術に関する。
　組織、血液、尿あるいは病理切片など種々の生体試料から抽出したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）あるいはリボ核酸（ＲＮＡ）の変異や多型、あるいは化学修飾を解析することより、それらの由来検体についての分子レベルでの診断、あるいは同定やプロファイリングが可能となる。このような解析技術はＤＮＡあるいはＲＮＡ(以下、核酸と総称する)タイピングと呼ばれ、ガン診断、感染症検査、個人鑑定など幅広い分野に応用されている。この解析の一般的ワークフローは、検体から生体試料を採取する工程、生体試料から被検核酸を抽出する工程、被検核酸を増幅する工程、増幅核酸を分析する工程、並びに分析データを解析する工程から構成される。
　DNAあるいはRNAタイピングを迅速かつ低コストで実施するためには、複数検体を上記ワークフローで並列処理できることが重要である。しかしながら、複数検体を並列処理するとき、核酸増幅工程で得られる増幅核酸量の検体間ばらつきが、次の分析工程で用いる分析装置の好適検出レンジを超える場合が多く、ときには検出可能レンジ（ダイナミックレンジ）を超える場合さえもあるので、一回の処理では並列処理した全検体について高品質な分析データが得られないという問題が起こる。この問題のために低品質な分析データが得られた検体や、分析データが得られなかった検体については、核酸増幅工程におけるパラメータの変更（例えば、インプットする被検核酸量を減らす、あるいは増幅サイクル数を減らすなど）を行ったうえで再処理を行う必要がある。そのため、再処理が不要な整流化されたワークフローが望まれている。
　上記問題の原因である増幅核酸量の検体間ばらつきは主に、前の核酸抽出工程で抽出された被検核酸の量、及び質（分解程度、増幅阻害物質や他生物種の核酸の混入程度)が検体間で著しく異なるために生じる。この問題を回避するため、抽出した被検核酸の精製、さらに定量及び定性分析を別途行ったうえで、核酸増幅工程へのインプット核酸の量及び質を検体間で等価になるように調整するという労力を要する正規化手段が用いられる。そのため、被検核酸量の検体間ばらつきを、分析装置の好適検出レンジ以内に低減せしめる、より簡便な正規化手段が望まれている。
　また、上記ワークフローの各工程を連結して一連自動化することも、DNAあるいはRNAタイピングを迅速かつ低コストで実施するために重要である。しかしながら、現状では、工程ごとに異なった自動化装置が用いられている。例えば、核酸抽出工程では分注ロボットを搭載した抽出装置、核酸増幅工程では自動温度制御によりPCR反応を行うサーマルサイクラ、分析工程では蛍光検出系を備えたキャピラリ電気泳動装置がそれぞれ用いられている。これは、前述したように、各工程で得られるアウトプット、つまり抽出核酸及び増幅核酸の量または質が検体間で異なるため、一連自動化すると、並列処理した全検体について分析データ品質を担保できないためである。そのため、全ての並列処理検体について高品質分析データを得ることが可能な一連自動化装置が望まれている。
　このような核酸解析技術に関する先行技術としては、複数検体の抽出核酸量を担体結合能に正規化する方法を開示する特許文献１がある。また、核酸解析装置で用いられる生化学用送液システムを開示する、本件出願人の特許文献２などがある。
特表２００３－５０７０４９号公報 特開２０１４－１６３７１３号公報
　現在、上述したような正規化手段として、被検核酸量の検体間ばらつきを分析装置の検出ダイナミックレンジ以内に低減せしめる、より簡便な手段が望まれている。特許文献１では、核酸抽出工程において、被検核酸を含む粗抽出溶液に、被検核酸と結合可能な表面特性を有する所定量の担体（例えば、シリカ磁気ビーズ）を混合し、担体の結合能を超える被検核酸を除去することにより、複数検体の抽出核酸量を担体結合能に正規化する方法が提案されている。しかし、この方法では、被検核酸を担体表面に結合させた後、上清の除去、担体表面の洗浄、担体表面からの核酸の溶出といった煩雑な工程が必要であり、自動化にあたっては、洗浄試薬及び溶出試薬を含めた装置システム全体が高コスト化してしまうと考えられる。そのため、解析ワークフロー全体を低コストで自動化することが可能な装置が望まれる。さらに、粗抽出溶液中に被験者とは異なる生物種の核酸が混入した場合、それらが被験者由来の核酸と区別されず担体表面に結合してしまい、目的とする被験者由来の抽出核酸量が正規化されないことも考えられる。そのため、解析ワークフローにおいて、目的とする被検核酸の量を特異的に正規化することが可能な方法が望まれる。
　本発明の目的は、上記の課題を解決するため、核酸タイピングの解析ワークフローにおける被検核酸量の検体間ばらつきを、分析装置の検出ダイナミックレンジ以内に低コストかつ簡便に正規化する、核酸分離方法、及び装置を提供することにある。
　上記目的を達成するために、本発明においては、増幅核酸を分離する核酸分離方法であって、所定量を超える余剰の増幅核酸を結合反応により担体の表面に結合させる結合工程と、前記結合工程後、前記担体の表面に結合せず結合反応液中に残存する前記増幅核酸を分析に供給する供給工程と、を含む核酸分離方法を提供する。
　また、上記の目的を達成するため、本発明においては、増幅核酸を分離する核酸分離装置であって、基質を原料分子とする核酸増幅反応により被検核酸を増幅させる核酸増幅機構と、前記核酸増幅機構による核酸増幅工程後、増幅核酸及び未反応基質の両分子種に特異的に結合可能で、かつ前記増幅核酸分子よりも前記未反応基質分子に優位に結合する所定量の担体を、核酸増幅反応液に接液させ、前記増幅核酸及び前記未反応基質、あるいはそのいずれか一方を結合反応により前記担体の表面に結合させる結合機構と、前記結合機構による結合工程後、前記担体と前記結合反応液を分離させる分離機構と、前記分離機構による分離工程後、前記担体の表面に結合せず結合反応液中に残存する前記増幅核酸を分析に供給する供給機構と、を備える核酸分離装置を提供する。
　本発明によれば、増幅核酸量の検体間ばらつきを所定のレンジ以内にし、解析ワークフローの低コスト化を実現することができる。
実施例１に係る核酸分離方法の前半を示す概念図である。 実施例１に係る核酸分離方法の後半を示す概念図である。 実施例１に係る核酸分離方法の原理検証データを示すグラフ図である。 実施例１に係る核酸分離方法の原理検証データを示す図である。 実施例３に係る核酸分離装置の要部の一構成例を示す図である。 実施例３に係る核酸分離装置の送液機構の一例を示す模式図である。 実施例３に係る核酸分離装置において磁気ビーズを用いる方法の前半を示す模式図である。 実施例３に係る核酸分離装置において磁気ビーズを用いる方法の後半を示す模式図である。
　以下、種々の核酸分離方法、装置の実施形態を説明するに先立ち、本発明の方法、装置の基本概念・原理の説明を行う。なお、本明細書において、「核酸解析」とは、種々の生体試料から抽出した核酸（被検核酸）における変異や多型、あるいは化学修飾（Epigenetic modifications ）を解析することを意味する。この被検核酸は、核酸解析を行おうとする核酸であれば特に限定されるものではなく、DNA、RNAいずれでも用いることができる。具体的には、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA（mtDNA）、Circulating tumor DNA （ctDNA）といったDNA、あるいはウイルスゲノムRNA、mRNA、non-coding RNA (ncRNA)、microRNAといったRNA、あるいは逆転写反応によりRNAから得られるcDNAなどが挙げられる。また、制限酵素処理による断片化、Bisulfite処理による塩基変換といった前処理を行った核酸も被検核酸として用いることができる。
　本発明では、核酸増幅工程において、任意のリガンド（特定のターゲット物質に特異的に結合する物質）で修飾されたプライマを基質分子として用いて、前工程で抽出された被検核酸（鋳型分子）から核酸増幅反応により核酸増幅を行う。これにより、得られる増幅核酸分子はその末端に上記のリガンドを有するようになる。
　この核酸増幅工程にあって、所定量のリガンド修飾プライマを投入して核酸増幅反応を行うと、核酸増幅反応が終了した後の反応溶液中には、リガンドを有する分子種として、増幅核酸と、未反応のリガンド修飾プライマの二種類が存在することになる。このとき、これらの分子種の分子数について次の関係式１が成立する。
　　NL-Pr = NL-Amp + NUnreacted L-Pr　………（式１）
  ここで、NL-Prは、核酸増幅反応に投入したリガンド修飾プライマの分子数、
  NL-Ampは、核酸増幅反応後の増幅核酸の分子数、
  NUnreacted L-Prは、核酸増幅反応後の未反応リガンド修飾プライマの分子数を表す。
　複数検体を並列処理する場合、NL-Prは全検体について等しく定義可能な定数であるが、NL-Ampは、被検核酸の不均一性（量および質のばらつき）のために、検体間で著しくばらつく。
　上述の核酸増幅工程に続いて、リガンドに特異的に結合するターゲット物質で表面修飾されている所定量の担体を、反応後の核酸増幅反応液に接液させる。ただし、接液させる担体の総結合能がリガンド修飾プライマの投入分子数より小さくなるように、上記所定量を定義する。このとき、用いた担体について次の関係式が成立する。
　　　NBC < NL-Pr　　　　　　　　　………（式２）
  ここで、NBCは反応後の核酸増幅反応液に接液させた担体の総結合能を表す。
　複数検体を並列処理する場合、NBCは全検体について等しく定義可能な定数である。
　上述の接液工程に続いて、担体表面にリガンドを有する分子種を結合させる。このとき、増幅核酸、及び未反応リガンド修飾プライマの両分子種が、担体表面に特異的に結合可能であるが、増幅核酸よりも未反応リガンド修飾プライマが優位に担体表面に結合する。これは、増幅核酸（通常、100～2000塩基対の二本鎖DNA）の立体障害性が、リガンド修飾プライマ（通常、20～30塩基の一本鎖DNA）よりも大きいためと考えられる（DynabeadsR M-270 Streptavidinマニュアル　Publication No. MAN0008449 Rev. Date: May 2013 (Rev. 9.0)）。よって、増幅核酸分子と未反応リガンド修飾プライマ分子が共存する結合反応液において、
次の関係式が成立する。
　　　KUnreacted L-Pr > KL-Amp　　　　………（式３）
  ここで、KUnreacted L-Prは、未反応リガンド修飾プライマの、ターゲット物質修飾された担体表面への結合のしやすさ、
  KL-Ampは、増幅核酸の、ターゲット物質修飾された担体表面への結合のしやすさを表す。
　複数検体を並列処理する場合、KUnreacted L-Pr及びKL-Ampは全検体について等しく定義可能な定数である。
　上述の結合工程に続いて、後述する任意の手段により、リガンドを有する分子種が結合した担体を、上記結合反応液から空間的に分離させる。上述の分離工程に続いて、最後に、担体表面に結合せず結合反応液に残存している増幅核酸を、後述する任意の分析プロセスに供給する。
　以上に述べた本発明の基本的な実施工程では、関係式１、２及び３から明らかなように、得られた増幅核酸量の多少により、担体表面に結合する増幅核酸分子と未反応リガンド修飾プライマ分子の比率が次のように変化する。
　例えば、得られた増幅核酸量が微量（好適検出レンジの下限相当の量）で、未反応プライマの分子数が接液させた担体の総結合能を大きく超えるとき（NUnreacted L-Pr > NBC > NL-Amp）は、総結合能のほぼ全てが未反応プライマ分子との結合で占められるため、増幅核酸分子は担体表面にほとんど結合しない。そのため、微量の増幅核酸しか得られなかった検体については、上述の接液、結合、分離工程後も、得られた増幅核酸分子のほぼ全てが、未反応プライマの一部分と共に、結合反応液中に未結合のまま残存し、次の分析プロセスに供給されることになる。
　反対に、得られた増幅核酸量が過剰（好適検出レンジの上限相当を超える量）で、未反応プライマの分子数が接液させた担体の総結合能を大きく下回るとき（NUnreacted L-Pr < NBC < NL-Amp）は、総結合能の一部分は未反応プライマ分子との結合で占められるが、残りの大部分の結合能に相当する増幅核酸分子が担体表面に結合する。そのため、過剰の増幅核酸が得られてしまった検体については、上述の接液、結合、分離工程後は、得られた増幅核酸分子の一部分のみが結合反応液中に未結合のまま残存し、次の分析プロセスに供給されることになる。
　また、得られた増幅核酸量が適量（好適検出レンジの下限相当を超え、かつ上限相当を下回る量）で、未反応プライマの分子数、増幅核酸の分子数、及び接液させた担体の総結合能がほぼ等しいとき（NUnreacted L-Pr ≒ NBC ≒ NL-Amp）は、担体表面への結合のしやすさの差に応じて、未反応プライマの大部分、及び増幅核酸分子の一部分が担体表面に結合する。そのため、中程度の増幅核酸が得られた検体については、上述の接液、結合、分離工程後は、得られた増幅核酸分子の大部分が、未反応プライマの一部分と共に、結合反応液中に未結合のまま残存し、次の分析プロセスに供給されることになる。
　したがって、以上に述べた本発明の基本工程によれば、核酸タイピングにおいて複数検体を並列処理し、核酸増幅工程で得られた増幅核酸量が検体間で著しくばらつき、そのばらつきが分析プロセスで用いる分析装置の好適検出レンジを超える場合であっても、得られた増幅核酸が微量で、その量が好適検出レンジの下限相当、あるいは下限相当をわずかに超える検体については、その増幅核酸のほぼ全量を分析プロセスに供給することができ、得られた増幅核酸が過剰で、その量が好適検出レンジの上限相当を超える検体については、その増幅核酸のうち上限相当未満の量だけを分析プロセスに供給し、得られた増幅核酸が適量で、その量が好適検出レンジの下限相当を十分に超え、かつ上限相当を下回る検体については、その増幅核酸の大部分を分析プロセスに供給することができるので、全ての並列処理検体について、それらの増幅核酸量を好適検出レンジ以内に簡便に正規化することが可能となり、ワークフローを整流化し、全ての並列処理検体について高品質な分析データを取得することができる。
　以上、その基本工程を説明した本発明では、被検核酸(鋳型分子)を増幅させる核酸増幅反応において、リガンド修飾されたプライマを基質分子として用いる。このときに用いるリガンドは、プライマに化学的に修飾できるものであれば特に限定されないが、特定のターゲット物質に特異的に結合する物質であることが好ましい。そのようなリガンドとしては、低分子抗原（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖類、核酸など）、抗体タンパク質、糖鎖、酵素基質（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖類、核酸など）、ビタミン類（ビオチンなど）、等が挙げられる。
　また、本発明における核酸増幅反応は、反応基質としてプライマを用いるものであれば公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、被検核酸の単一あるいは複数の領域を配列特異的に増幅させる、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）やLoop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法などを用いることができる。また、被検核酸の全領域を配列非依存的に増幅させるMultiple Displacement Amplification（MDA）法も用いることができる。また、一本鎖あるいは二本鎖の環状DNAを増幅させるRolling Circle Amplification（RCA）法も用いることができる。
　上記のいずれの核酸増幅反応においても、プライマ分子は、伸長反応におけるDNA Polymeraseの基質の1つであり、反応中に増幅核酸分子に取り込まれることになる。そのため、リガンド修飾したプライマを用いると、得られる増幅核酸分子はその末端に上記のリガンドを有するようになる。したがって、既に述べた通り、所定量のリガンド修飾プライマを投入して核酸増幅反応を行うと、増幅核酸及び未反応リガンド修飾プライマの分子数について関係式１が成立する。
　本発明では、核酸増幅反応の終了後、リガンドに特異的に結合するターゲット物質で修飾された担体表面に、増幅反応液を接液させる。このとき、既に述べた通り、担体表面の総結合能がリガンド修飾プライマの投入分子数より小さくなるように担体の使用量を定義するので、関係式２が成立する。
　このときのターゲット物質は、化学的にあるいは物理吸着により担体表面に修飾できるものであれば特に限定されないが、特定のリガンドに特異的に結合する物質であることが好ましい。そのようなターゲット物質としては、抗体タンパク質（リガンドはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖類、核酸などの低分子抗原）、抗原タンパク質（リガンドは抗体タンパク質）、レクチン（リガンドは糖鎖）、タンパク質（リガンドはアミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、糖類、核酸などの酵素基質、あるいはビタミン類）などが挙げられる。また、特定のリガンドとターゲット物質の組み合わせにおいて、ターゲット物質1分子当たりに結合可能なリガンドの分子数は一定である。そのため、担体表面の総結合能を算出し、接液させる担体の使用量を定義することが可能である。
　また、このときの担体は、その表面に核酸増幅反応液を接液させることが可能なものであれば特に限定されないが、表面構造が均一で、かつ製造ロット間のばらつきが小さいものが望ましい。加えて、その表面に上述のターゲット物質を均一に再現性よく修飾可能なものが望ましい。このような担体を用いることにより、所定量の担体の総結合能をより正確に算出できる。
　本発明において使用する担体は、具体的には、ビーズ、フィルタ、シート、ゲル薄膜などが挙げられる。例えば担体としてビーズを用いる場合には、核酸増幅反応液中にビーズを均一に懸濁させることにより、ビーズ表面に増幅反応液を接液させることができる。ビーズの材料は特に限定されないが、可磁化物質を含んだ高分子ポリマーコアを疎水性あるいは親水性ポリマーで覆った、磁気ビーズなどを用いることができる。ビーズの粒径は特に限定されないが、数十ナノメートルから数マイクロメートルの粒径のビーズを任意に選択して用いることができる。ビーズの表面特性は特に限定されないが、疎水性（例えばトシル基）あるいは親水性（例えばカルボキシル基）の表面に、上述した種々のターゲット物質を化学的にあるいは物理吸着により結合させたビーズを任意に選択して用いることができる。
　また、例えば担体としてフィルタを用いる場合には、核酸増幅反応液をフィルタ内部に浸透させることにより、フィルタ内部の微細孔に増幅反応液を接液させることができる。フィルタの材料は特に限定されないが、化学的に表面改変した多孔性シリカゲルなどを用いることができる。フィルタの微細構造は特に限定されないが、任意のポアサイズ及び空隙率を有したフィルタを用いることができる。フィルタの表面特性は特に限定されないが、シリカゲル表面に、上述した種々のターゲット物質を化学的にあるいは物理吸着により結合させたフィルタを任意に選択して用いることができる。
　また、例えば担体としてシートを用いる場合には、任意の手段を用いて核酸増幅反応液をシート上に吐出させることにより、シート表面に増幅反応液を接液させることができる。シートの材料は特に限定されないが、アルミナ、ガラス、セルロースメンブレン、ナイロンメンブレンなどを化学的に表面改変したものを用いることができる。シートの表面構造は特に限定されないが、接液する表面積を増やすために特殊加工を施したものを用いることができる。シートの表面特性は特に限定されないが、上記シート材料の表面に、上述した種々のターゲット物質を化学的にあるいは物理吸着により結合させたシートを任意に選択して用いることができる。
　また、例えば担体としてゲル薄膜を用いる場合には、核酸増幅反応液をゲル薄膜中に電気泳動させることにより、ゲル薄膜中の網目分子構造に増幅反応液を接液させることができる。
　更に、本発明では、上述のように、反応終了後の核酸増幅反応液を、ターゲット物質で修飾した担体表面に接液させる。次いで、リガンドを有する2つの分子種（増幅核酸と未反応リガンド修飾プライマ）が、担体表面のターゲット物質に結合する（結合工程）。このときの結合条件は、リガンドを有する分子種がターゲット物質と結合できる条件であれば特に限定されないが、未反応リガンド修飾プライマの結合のしやすさが、増幅核酸のそれよりもより大きくなる条件が好ましい。
　本発明の結合工程における可変パラメータとしては、インキュベーション時間、撹拌様式、液容量といった接液性に関する物理的条件パラメータ、または塩濃度、pH、温度といった結合反応に関する化学的条件パラメータなどが挙げられる。これらのパラメータのいくつかを変更する、例えばインキュベーション時間をより短く設定する、塩濃度をより低くするといったことにより、本発明の基本工程の結合工程において、未反応リガンド修飾プライマが増幅核酸に対してより優位に担体表面へ結合できるようになると考えられる。ただし、このようなより適正化したパラメータを用いることは本発明を実施するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
　本発明では、リガンドを有する分子種を担体表面へ結合させた後、担体を結合反応液から分離させる（分離工程）。このときの分離手段は、担体と結合反応液を物理的に分離できる手段であれば特に限定されないが、分離後の結合反応液に担体がほとんど残存しないことを可能にする手段が好ましい。分離手段は、用いる担体の種類によって異なる。例えば担体として磁気ビーズを用いる場合には、上記の結合工程後、結合反応液に磁気ビーズを懸濁させた液に磁力を作用させることにより、磁気ビーズを、懸濁液収容区画の内壁の任意の位置に集め、結合反応液から分離させることができる。また、担体として非磁気ビーズを用いる場合には、上記の結合工程後、結合反応液に非磁気ビーズを懸濁させた液に遠心力を作用させることにより、非磁気ビーズを、懸濁液収容区画の内壁の任意の位置に集め、結合反応液から分離させることができる。なお、このような手段によってビーズが物理的に分離された結合反応液を、以下上清と呼ぶことにする。
　また、例えば担体としてフィルタを用いる場合は、上記の結合工程後、結合反応液を保持するフィルタに遠心力、あるいはバキュームによる減圧を作用させ、結合反応液を通液させることにより、フィルタと結合反応液を物理的に分離させることができる。なお、このような手段によってフィルタから物理的に分離される結合反応液を、以下通過液と呼ぶことにする。
　また、例えば担体としてシートを用いる場合には、上記の結合工程後、任意の手段を用いて結合反応液を別の区画に移動させることにより、シートと結合反応液を物理的に分離させることができる。なお、このような手段によってシートから分離される結合反応液を、以下上清と呼ぶことにする。
　また、例えば担体としてゲル薄膜を用いる場合には、上記の結合工程後、結合反応液を別の区画に電気的に泳動させることにより、ゲル薄膜と結合反応液を物理的に分離させることができる。なお、このような手段によってゲル薄膜から物理的に分離される結合反応液を、以下通過液と呼ぶことにする。
　更にまた本発明では、結合反応に続いて担体と結合反応液を分離させた後、担体表面に結合しなかったために上清あるいは通過液に残存する増幅核酸を任意の分析プロセスに供給する。このときの供給手段は、上清あるいは通過液に含まれる増幅核酸の一部あるいは全部を、後続の分析プロセスへ供給できる手段であれば特に限定されないが、増幅核酸の供給量を制御できる手段が好ましい。例えば、任意の手段を用いて、上清あるいは通過液の所定容量だけを移動させることによって、残存する増幅核酸の一部あるいは全部を分析プロセスに供給することができる。また例えば、動電学的（electrokinetic）な手段を用いて、上清あるいは通過液に残存する増幅核酸の所定量を分析プロセスに供給することができる。
　なお、上述のように供給された増幅核酸を分析プロセスにおいて分析することができる。このときの分析プロセスではいかなる方法、手段、装置を用いてもよく、用いる分析プロセスによって本発明は一切限定されない。例えば、キャピラリ電気泳動による塩基配列解析あるいはフラグメント解析などを行うことにより、供給された増幅核酸を分析することができる。
　以上に述べたように、本発明の核酸分離方法によれば、用いる担体の種類によらず、担体分離後の結合反応液（上清あるいは通過液）に残存する増幅核酸を分析プロセスに供給するので、担体表面に結合した増幅核酸を分析プロセスに供給する場合には必要となる、洗浄工程（担体表面の非特異的吸着物質を洗浄する）、および溶出工程（担体表面に結合した増幅核酸を溶出させる）が不要となる。したがって、必要工程数が少ないより簡便な、かつ消費試薬量が少ないより低コストのワークフローを構築することが可能になる。さらに、ワークフローを整流化できるので、システム全体をよりロバストにすることが可能になる。
　本発明では、核酸増幅反応において、リガンド修飾されたプライマに加えて、化学標識を施した基質を用いることにより、得られた増幅核酸を様々な手段により検出することが可能になる。
　このときに用いる化学標識は、分析プロセスで用いる分析装置で検出可能な原子団であれば特に限定されず、例えば蛍光標識（６－ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ５など）、化学発光標識（ルシフェリンなど）、酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、あるいは放射性標識（トリチウム、炭素１４、リン３２など）など任意の化学標識を選択することができる。また、このときに化学標識を施す基質は、核酸増幅反応中に増幅核酸に取り込まれる分子種であれば特に限定されず、例えばフォワードプライマ、リバースプライマ、dNTPなど任意の基質を選択することができる。なお、プライマに標識を施す場合、リガンド修飾と化学標識を異なるプライマに施してもよいし（例えば、フォワードプライマに化学標識、リバースプライマにリガンド修飾）、同一プライマに対してリガンドと化学標識の二重修飾を施してもよい（例えば、リバースプライマにリガンドと化学標識の二重修飾）。
　上記のような化学標識基質は核酸増幅反応により増幅核酸に取り込まれ、得られた増幅核酸は光学的に、あるいは放射活性を利用して検出することが可能になるので、分析プロセスにおいて、任意の分析装置を用いて増幅核酸の定性解析や定量解析を行うことができる。それらの結果に基づき被検核酸のタイピングを行い、由来検体についての分子レベルの情報を得ることができる。
　例えば、本発明の好適な一実施形態では、蛍光標識したフォワードプライマ、及びリガンド修飾したリバースプライマを用いて核酸増幅反応を行い、ターゲット物質で表面修飾した担体を用いて、上述した接液、結合、分離工程を行った後、結合反応液中に残存する増幅核酸をキャピラリ電気泳動によるフラグメント解析で分析することができる。
　このとき、上記結合反応液からキャピラリ電気泳動サンプルを調製する工程が追加で必要になる場合が多いが、その工程で用いる方法は、高品質なエレクトロフェログラム（キャピラリ電気泳動データ）が得られる方法であれば特に限定されない。例えば、結合反応液中の増幅核酸（二本鎖DNA）を変性させるために、結合反応液0.5 μLを、サイズスタンダード0.5 μLと共に、ホルムアミド9.0 μLと混合することにより、キャピラリ電気泳動サンプルを調製できる。また、例えば、上記の混合比を適宜変更してもよいし、上記混合液の加熱急冷（95 °C 3分、4 °C 5分）を行ってもよい。
最後に、得られたエレクトロフェログラムを解析することにより、被検核酸の高精度タイピングを行うことができる。
　また本発明によれば、上述したような核酸分析方法を実施するために好適な核酸分離装置を提供することができる。
　本発明に係る核酸分離装置は、その基本要素として、リガンド修飾されたプライマを基質分子として被検核酸を増幅させる核酸増幅反応が行われる区画と、上記核酸増幅反応の終了後、核酸増幅反応液と、リガンドに特異的に結合するターゲット物質で表面修飾されている所定量の担体とが接液し、増幅核酸及び未反応リガンド修飾プライマの担体表面への結合が行われる区画と、上記結合反応の終了後、担体と結合反応液の分離が行われる区画と、上記分離工程後、担体表面に結合せず結合反応液中に残存する増幅核酸を分析プロセスに供給する区画と、を備える。
　上述の区画は、装置において同一の区画であってもよいし、あるいは互いに異なった複数の区画であってもよい。例えば担体として磁気ビーズを用いる場合、増幅反応区画に収容されている反応終了後の核酸増幅反応液に、所定量の磁気ビーズを懸濁させ、結合反応後、磁石を用いて磁気ビーズを増幅反応区画の任意の位置に集めることができる。この場合、核酸増幅反応、接液工程、結合反応、分離工程がデバイスの同一区画で行われることになる。また、分離工程後、得られた上清を上記区画の近くに設けた別の区画に移動させることによって、上清中の増幅核酸をより容易に任意の分析装置に供給することができる。
　また、例えば担体としてフィルタを用いる場合、増幅反応区画に収容されている反応終了後の核酸増幅反応液を、別の区画に設けられている、所定表面積を有するフィルタに接液させ、結合反応終了後、フィルタが保持している結合反応液を、遠心力あるいはバキュームによる減圧を用いて通液させ、その通過液をさらに別の区画に収容することができる。この場合、核酸増幅反応は増幅反応区画で、接液工程および結合反応はフィルタが設けられている区画で、分離工程は上記フィルタ区画から通過液収容区画で、それぞれ行われることになる。また、この場合のフィルタ通過液は通過液収容区画に分画されているので、通過液中の増幅核酸は容易に任意の分析装置に供給することができる。
　また、例えば担体としてシートを用いる場合、増幅反応区画に収容されている反応終了後の核酸増幅反応液を、別の区画に設けられている、所定表面積を有するシートに接液させ、結合反応終了後、任意の手段を用いて、シートに上層されている結合反応液を分取し、その分取液（上清）をさらに別の区画に収容することができる。この場合、核酸増幅反応は増幅反応区画で、接液工程および結合反応はシートが設けられている区画で、分離工程は上記シート区画から分取液収容区画で、それぞれ行われることになる。また、この場合の分取液（上清）は分取液収容区画に分画されているので、分取液中の増幅核酸は容易に任意の分析装置に供給することができる。
　また、例えば担体としてゲル薄膜を用いる場合には、増幅反応区画に収容されている反応終了後の核酸増幅反応液を、別の区画に設けられている、所定の総結合能を有するゲル薄膜中に電気泳動させ、結合反応終了後、ゲル薄膜中の結合反応液を電気泳動により通液させ、その通過液をさらに別の区画に収容することができる。この場合、核酸増幅反応は増幅反応区画で、接液工程および結合反応はゲル薄膜が設けられている区画で、分離工程は上記ゲル薄膜区画から通過液収容区画で、それぞれ行われることになる。また、この場合のゲル薄膜通過液は通過液収容区画に分画されているので、通過液中の増幅核酸は容易に任意の分析装置に供給することができる。
　また、本発明に係る核酸分離装置の好適な一実施形態では、
核酸増幅反応および結合反応で用いる複数の試薬を上記核酸分離装置の所定区画に導入するための導入機構と、装置における核酸増幅反応区画および結合反応区画の温度を制御するための温度制御機構と、核酸増幅反応液と、リガンドに特異的に結合するターゲット物質で表面修飾されている所定量の担体とを接液させ、増幅核酸及び未反応リガンド修飾プライマの担体表面への結合反応を行うための結合機構と、結合反応液に接液している担体を分離させるための分離機構と、担体表面に結合せず結合反応液に残存する増幅核酸を分析プロセスに供給するための供給機構、とを備える。
　上述の試薬導入機構は、核酸増幅反応および結合反応を再現よく行うことができる正確度と精度をもって、装置の所定区画に、所定容量の特定の試薬を導入できる手段であれば、特に限定されるものではない。
また、上述の温度制御機構は、核酸増幅反応および結合反応を再現よく行うことができる正確度と精度をもって、装置の所定区画の温度を制御できる手段であれば、特に限定されるものではない。また、上述の結合機構、分離機構は、用いる担体の種類に適した手段であれば、特に限定されるものではない。また、担体表面に結合しなかった増幅核酸を分析プロセスに供給する供給機構は、供給量を制御できる手段が好ましいが、特に限定されるものではない。
　また、上述の核酸増幅反応および結合反応で用いる試薬は、装置に設けた試薬区画にあらかじめ封入させておいてもよいし、あるいは、解析開始直前にユーザにより、装置外部の試薬保管容器から、装置内の試薬区画へ分注させるようにしてもよい。いずれの場合も、それらの試薬は、解析実行中に自動的に装置の反応区画へ導入されるようにすることが好ましい。
　以上のように、本発明に係る核酸分離装置では、用いる担体の種類によらず、洗浄工程および溶出工程を行わないので、洗浄機構および溶出機構、それらの工程に要する時間が不要となる。加えて、担体分離後の結合反応液（上清あるいは通過液）を廃棄せず、また洗浄試薬および溶出試薬も使用しないため、結合反応液、洗浄試薬、洗浄廃液、溶出試薬、溶出液を収容するための区画が装置において不要となる。したがって、より小型で低コストの装置構成を採用することが可能になり、また、装置機構を単純化できるので、システム全体をよりロバストにすることができる。さらに、Turnaround time （TAT）を短縮することが可能となるので、より迅速に被検核酸の解析結果を得ることができる。
　以下、上述した本発明の基本概念・原理に基づく各種の実施例を、図面を参照しながら説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一実施形態に過ぎず、何ら本発明を限定するものではない。
　実施例１は、PCR反応を用いたDNAタイピングに適用した核酸分離方法の実施例である。すなわち、増幅核酸を分離する核酸分離装置であって、基質を原料分子とする核酸増幅反応により被検核酸を増幅させる核酸増幅工程と、前記核酸増幅工程の後、増幅核酸及び未反応基質の両分子種に特異的に結合可能で、かつ前記増幅核酸分子よりも前記未反応基質分子に優位に結合する所定量の担体を、核酸増幅反応液に接液させ、前記増幅核酸及び前記未反応基質、あるいはそのいずれか一方を結合反応により前記担体の表面に結合させる結合工程と、前記結合工程の後、前記担体と前記結合反応液を分離させる分離工程と、前記分離工程の後、前記担体の表面に結合せず結合反応液中に残存する前記増幅核酸を分析に供給する供給工程と、を含む核酸分離方法、及び装置の実施例である。
　図１Ａ、図１Ｂは、本実施例に係るPCR反応を用いたDNAタイピングを示す概念図である。本実施例の核酸分離方法は、図１Ａ、図１Ｂに示された、（a）検体採集、（b）核酸抽出、（c）PCR反応、（d）PCR反応液と担体表面との接液、続いて未反応プライマ及びPCR産物の担体表面への結合反応、（e）担体と結合反応液の分離、更には上清に残存するPCR産物のキャピラリ電気泳動への供給、キャピラリ電気泳動、及び電気泳動パターン（エレクトロフェログラム）解析などの分析プロセスから構成される。以下、各工程（a）～（e）、及び後続の分析プロセスを順に説明する。
　まず、検体採集工程（a）では、被検者１０１から検体１０２を採集する。検体としては、血液、尿、組織、病理切片、口腔上皮細胞、毛髪など種々の生体試料を、検査目的に応じて選択できる。また、採集手段としては、注射針、綿棒やスワブなど種々の手段を検体の種類に応じて選択できる。
　すなわち、生体試料は特に限定されるものではなく、組織、血液、尿あるいは病理切片などの任意の試料を用いることができる。また、血液などの体液が付着した物体（布、紙、プラスチックなど）も試料として用いることができる。生体試料の由来となる検体も特に限定されるものではなく、ヒト、ヒト以外の動物、植物、菌類、バクテリア、ウイルスなど任意の検体を用いることができる。
　ここでは、スワブを使用して、被検者から口腔上皮細胞を採集した。スワブ表面に採集される細胞数はスワブを押し付ける角度や強さに依存して変動するため、複数検体間の採集細胞数がばらつくことが多い。また、口腔上皮細胞以外に飲食物残渣あるいは口腔内細菌が不可避的に混入するため、各被検者の口腔内環境に依存して、得られる検体の質がばらつくことが多い。このような検体間の不均一性（採集量、及び質のばらつき）は、検体の種類により程度の差はあるが、多くの検査において問題となる。例えば、血液検体中に含まれる脂質量は、同一被験者においても日々変動することがある。
　核酸抽出工程（b）では、上記検体１０２から被検核酸１０３を抽出する。被検核酸としては、先に説明した通り、ゲノムＤＮＡ、ctDNA、ｍＲＮＡなど種々の核酸を検査目的に応じて選択できる。抽出手段としては、ホモジナイザー等による物理的破砕、界面活性剤や酵素等による化学的溶解などの種々の手段を、検体の種類に応じて組み合わせて使用できる。ここでは、スワブヘッドを細胞溶解液に一定時間浸漬することにより、スワブ表面に付着している細胞を溶解させ、粗抽出液を得た。この粗抽出液には、目的とする被験者の口腔上皮細胞のゲノムＤＮＡ（被検核酸）の他に、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、糖などの分子種が不可避的に含まれる。また、飲食物残渣あるいは口腔内細菌由来のＤＮＡも不可避的に混入し、これらのＤＮＡは目的ＤＮＡと同じ分子種であり、一般的な核酸定量法では区別されないため、目的ＤＮＡの正確な定量が極めて困難になる場合が多い。
　PCR反応工程(c)では、ＰＣＲ反応容器１０４内のPCR反応により、被検核酸のターゲット領域を増幅する。本実施例では、核酸増幅反応としてＰＣＲ反応を用いて、ＳＴＲマーカの１つであるＴＨ０１ローカスを増幅した。６‐ＦＡＭフォワードプライマ（以下、６‐ＦＡＭプライマ）１１０は、ゲノムＤＮＡセンス鎖のＴＨ０１ローカス領域近傍に相補的に結合する基質の１種としての配列と、５’末端に修飾付加された６－ＦＡＭ蛍光色素１１３から構成される。ビオチン化リバースプライマ（以下、ビオチン化プライマ）１１１は、ゲノムＤＮＡアンチセンス鎖のＴＨ０１ローカス領域近傍に相補的に結合する基質の１種としての配列と、５’末端にスペーサを介して修飾付加されたビオチン１１４から構成される。すなわち、ビオチン化プライマ１１１は、核酸増幅反応で用いる基質の１種が、リガンドであるビオチン１１４で修飾された構成を有する。また、核酸増幅反応で用いる基質の他の１種が、蛍光色素１１３で標識され、この蛍光色素１１３を用いることにより、得られた増幅核酸を光学的検出手段により分析することが可能となる。
　このような基質としてのプライマセットを、被検核酸であるヒトゲノムＤＮＡを含む粗抽出液、及びその他の必要試薬と共に、ＰＣＲ反応容器１０４において混合し、ＰＣＲ反応を開始した。ＰＣＲ反応中に増幅されたＰＣＲ産物１１２は、２本鎖の一方の鎖の５’末端に６－ＦＡＭ蛍光色素１１３を、もう一方の鎖の５’末端にはビオチン１１４を有する分子構造を有するようになる。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液中に含まれる２種のビオチン化分子、すなわちＰＣＲ産物及び未反応基質である未反応ビオチン化プライマについて、上述した関係式１に基づき、次式が成り立つ。
　ＰＣＲ反応に投入したビオチン化プライマの分子数
＝未反応ビオチン化プライマの分子数＋ＰＣＲ産物の分子数
　PCR反応液と担体表面との接液工程（ｄ）では、PCR反応液を担体の全表面に均一に接液させる。
　本実施例では、核酸増幅反応で用いる基質の少なくとも１種が、リガンドであるビオチンで修飾されたプライマであり、担体としての磁気ビーズの表面が当該リガンドと特異的に結合するターゲット物質であるストレプトアビジンで修飾されている。すなわち、本実施例では、ターゲット物質として機能するストレプトアビジンを表面に結合させた、磁性を帯びたビーズである磁気ビーズ１１５を担体として使用した。ストレプトアビジンはリガンドであるビオチン分子と特異的かつ強力に結合するため、磁気ビーズ１１５は未反応ビオチン化プライマ１１１及びＰＣＲ産物１１２をその表面に結合させることができる。また、磁気ビーズ１１５は可磁化物質が一様に分布したコアを有するため、磁石により容器内の任意の場所に集めることができる。
　反応終了後のPCR反応液に、所定量の上記磁気ビーズを含む、所定容量の結合反応緩衝液を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの結合に適した組成の結合反応液を調製した。次いで、磁気ビーズが均一に拡散するように、結合反応液を穏やかに懸濁した。このとき、添加する磁気ビーズの総結合能が、PCR反応に投入したビオチン化プライマの分子数より小さくなるように、磁気ビーズの上記所定量を規定するので、次式が成り立つ。
　反応後のPCR反応液に添加する磁気ビーズの総結合能
<ＰＣＲ反応に投入したビオチン化プライマの分子数
　接液工程に続く結合反応工程（ｄ）では、PCR反応液に含まれるビオチン化分子を担体表面に結合させる。ここでは、上記結合反応液を5分ごとに懸濁させながら、15分間室温でインキュベートし、反応終了後のPCR反応液に含まれる未反応ビオチン化プライマ及びPCR産物を磁気ビーズ表面に結合させた。このとき、20-25塩基の一本鎖ＤＮＡである未反応ビオチン化プライマは、150-300塩基対の二本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ産物よりも優位に磁気ビーズ表面に結合するので、次式が成り立つ。
　未反応ビオチン化プライマの、ストレプトアビジン修飾された磁気ビーズ表面への結合のしやすさ
>ＰＣＲ産物の、ストレプトアビジン修飾された磁気ビーズ表面への結合のしやすさ
　担体と結合反応液の分離工程（e）では、担体と結合反応液を物理的に分離させる。ここでは担体として磁気ビーズ１１５を用いたので、磁石１１６をＰＣＲ反応容器１０４の外壁側面に接触させ、反応容器１０４の内壁側面に磁気ビーズ１１５を集めて固定させた。これにより、磁気ビーズ１１５を結合反応液から物理的に分離させ、上清１１７を得た。
　PCR産物のキャピラリ電気泳動への供給工程では、分離後の結合反応液に残存するPCR産物の一部または全部をキャピラリ電気泳動へ供給する。ここでは、上清の一部容量を別容器へ移し、脱塩ホルムアミドと混合させた後、キャピラリ電気泳動装置に供した。なお、脱塩ホルムアミドの他に、任意の核酸変性剤を用いることができる。
　キャピラリ電気泳動工程では、核酸変性剤中のPCR産物を電気泳動により分離検出する。ここではキャピラリ電気泳動装置として3500 Genetic Analyzerを使用し、脱塩ホルムアミド中のPCR産物を分離検出した。
　エレクトロフェログラム解析工程では、電気泳動により得られたエレクトロフェログラムのピークサイズやピーク高さ等を解析し、被検核酸のタイピングを行う。ここでは、ＴＨ０１ローカスについて、被験者のヒトゲノムDNAのSTRタイピングを行った。
　次に、本実施例のPCR反応を用いたDNAタイピングである核酸分離方法により、複数検体を並列処理し、ＰＣＲ産物量が検体間で著しくばらつく場合であっても、後の分析プロセスに供給されるＰＣＲ産物量は、分析装置の好適検出レンジ以内になるように正規化される原理を説明する。
　（１）図１Ａの（ｃ）における被験者ＡのPCR反応液のように、得られたＰＣＲ産物量が微量で、未反応ビオチン化プライマの分子数が磁気ビーズ総結合能を大きく超えるときは、未反応ビオチン化プライマが極めて優位に磁気ビーズ１１５表面に結合するため、図１Ｂの（ｄ）における被験者Ａの結合反応液に見るように、ＰＣＲ産物はビーズ表面にほとんど結合しない。その結果、上清１１７中に残存するＰＣＲ産物量は、磁気ビーズ１１５添加前とほとんど同じである。
　（２）反対に、図１Ａの（ｃ）における被験者ＣのPCR反応液のように、得られたＰＣＲ産物量が過剰で、未反応ビオチン化プライマの分子数が磁気ビーズ総結合能を大きく下回るときは、図１Ｂの（ｄ）における被験者Ｃの結合反応液に見るように、全ての未反応ビオチン化プライマがビーズ表面に結合し、加えてＰＣＲ産物の一部もビーズ表面に結合する。その結果、上清中に残存するＰＣＲ産物量は、磁気ビーズ１１５添加前よりも減少する。
　（３）図１Ａの（ｃ）における被験者ＢのPCR反応液のように、得られたＰＣＲ産物量が適量で、未反応ビオチン化プライマの分子数、PCR産物の分子数、および磁気ビーズ総結合能がほぼ等しいときは、図１Ｂの（ｄ）の拡大図に示す被験者Ｂの結合反応液に見るように、担体表面への結合のしやすさに応じて未反応ビオチン化プライマとＰＣＲ産物がビーズ表面に結合する。その結果、上清中に残存するＰＣＲ産物量は、磁気ビーズ添加前よりもわずかに減少する。
　すなわち、以上説明した本実施例の方法により、複数検体を並列処理し、ＰＣＲ反応工程後の反応容器中に含まれるＰＣＲ産物量が検体間で著しくばらつく場合であっても、磁気ビーズ分離工程後の上清には、全ての並列処理検体について、一定量以下のＰＣＲ産物１１２が残存することになる。
　以上に説明した本実施例の核酸分離方法を検証すべく、次のような実験を行った。ヒトゲノムＤＮＡ 1, 4, 8 ngを鋳型として、6-FAMフォワードプライマ5 pmol、及びビオチン化リバースプライマ5 pmolを含む25 μLの反応系で、TH01ローカスのＰＣＲ増幅を行った。
　ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液5 μLと、磁気ビーズ（DynabeadsR M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific Inc.）25 μgを含む結合緩衝液5 μLを混合し、15分間インキュベートした。次いで、磁石を用いて磁気ビーズをＰＣＲ容器側面に集めた後、上清溶液2 μLとホルムアミド10 μLを混合し、キャピラリ電気泳動に供した。対照として、ＰＣＲ反応液1 μLをホルムアミド10 μLと混合し、同様にキャピラリ電気泳動に供した。その結果、本実施例に示す方法によれば、図２Ａおよび図２Ｂに示す様に、PCR産物量は、キャピラリ電気泳動装置の好適検出レンジ上限（10,000 rfu）以下に正規化されることを検証できた。
　以上のように、本実施例の方法によれば、得られたPCR産物量の検体間ばらつきがキャピラリ電気泳動装置の検出ダイナミックレンジを超える場合であっても、1回のバッチ処理で、全ての並列処理検体について意味のあるデータを取得することができるので、検査効率を向上させることが可能となる。
　さらに、本実施例の方法によれば、全ての並列処理検体について、キャピラリ電気泳動に供するPCR産物量を、好適検出レンジ（例えば、2000-10000 rfu）で検出されるように正規化することができる。このことは、キャピラリ電気泳動においてサイズ分離、及び蛍光色素の光学分離を行う上でより好ましく、検査品質を向上させることが可能となる。
　実施例２は、核酸増幅反応により増幅される被検核酸のターゲット領域が複数の場合についての実施例である。実施例１では、単一ターゲット領域をタイピングする場合に本発明を適用して説明したが、実施例２では、マルチプレックス核酸増幅反応により複数のターゲット領域を同時にタイピングする場合に本発明を適用する。
　この場合、各ターゲット領域に対して、互いに異なるリガンドを修飾したプライマと、それに対応するターゲット物質で表面修飾された担体を使用してもよい。リガンドとターゲット物質の組み合わせとしては、ターゲット物質で表面修飾された担体にリガンド修飾核酸が特異的に結合できるものであれば特に限定されないが、低分子抗原と抗体タンパク質、糖鎖とレクチン、酵素基質とタンパク質、ビタミンとタンパク質といった生物学的結合によるものの他に、イオン結合、共有結合といった化学的結合によるもの、あるいは物理的吸着によるもの、などを用いることができる。これにより、追加の効果として、複数のターゲット領域から得られた複数種の増幅核酸の量を、領域ごとに独立に正規化することが可能となる。
　本実施例は、試薬やサンプル、ビーズ等が封入された容器を装置本体に取り付け、送液、及び試薬反応を行う前処理一体型の核酸分離装置の実施例である。本核酸分離装置においては、試薬やサンプル、ビーズ等が封入された容器（以下、試薬カートリッジと呼ぶ）が装置本体に取り付けられ、空気圧と薄膜フィルム（以下、メンブレンと呼ぶ）を用いることで試薬カートリッジ内での送液、及び試薬反応を行う。なお、本実施例の構成が適用される装置の送液システムの具体な構成例は、本出願人が先に出願した特許文献２に開示されている。
　図３に、本実施例の核酸分離装置で用いる送液システムの概略構成を模式的に示す。図３において、試薬カートリッジ５０１は、試薬ウェルや流路が形成されたカートリッジ流路部５０２とメンブレン部５０３から成り、装置本体であるカートリッジホルダ５０４にセットされる。カートリッジホルダ５０４は流路及び流路封止弁へ空気圧を印加するための加圧・負圧ポート５０５～５０８を有しており、各ポートは加圧配管制御バルブ５０９、あるいは負圧配管制御バルブ５１０を介して、加圧ポンプ５１１及び負圧ポンプ５１２に接続されている。各空気圧配管制御バルブの出力はバルブ制御用コントローラ５１３によって制御される。
　続いて、図４に、本実施例の核酸分離装置の構成において実現される、空気圧とメンブレンを用いた送液方法を示す。同図の（a）はカートリッジホルダ６０１に試薬カートリッジ６０２を設置した状態である。入口ウェル６０３には試薬またはサンプル６０４が封入されており、カートリッジホルダ５０４の流路封止弁に空気圧を印加することによりメンブレン６０５を駆動させることで、入口ウェル６０３内の試薬を流路６０６経由で出口ウェル６０７へ送液する。図４では、流路６０６はカートリッジホルダ６０１に形成されているが、試薬カートリッジ６０２に形成されていても良い。
　具体的な送液手順としては、まず同図の（ｂ）に示すように、流路入口封止弁６０８を空気圧によって開き、同時に流路６０６内を陰圧にすることでメンブレン６０５が膨らみ、入口ウェル内の試薬を流路６０６内に取り込む。次に同図の（ｃ）のように流路入口封止弁６０８を閉じ、流路出口封止弁６０９を開く。同時に流路６０６内を陽圧にすることでメンブレン６０５が元に戻り、同図の（ｄ）のように試薬を出口ウェル６０７へ送液することができる。
　次に、図５Ａ、図５Ｂに本実施例の装置の構成で、担体として磁気ビーズを用いる場合の装置動作フローを示す。図５Ａ、図５Ｂの各段において、左側に示す点線Ａ－Ａ’における断面を右側に示している。図５Ａの（a）は、フロー開始時の装置構成を示す図である。入口ウェルにはビオチン化プライマを含むＰＣＲ試薬７０１が、出口ウェルには磁気ビーズ７０２及び結合反応緩衝液から成るビーズ溶液７０３が、電気泳動試薬ウェル７０４には核酸変性試薬７０５が、それぞれ封入されている。また、図示を省略したが、入口ウェルに接続された別ウェルにはサンプルが注入されており、ＰＣＲ反応開始時には入口ウェルに当該サンプルが送液され、ＰＣＲ試薬７０１と混合される。
　流路７０６は本実施例においては試薬の反応槽としての機能も兼ね、下述するPCR反応と結合反応はこの区画で行われる。ただし、反応槽として別のウェルや流路などの区画を設けても良い。流路７０６内で試薬反応を行う際の温度を制御するためには温度制御機構７０７を用いる。流路７０６の内壁に磁気ビーズ７０２を集合固定するためには磁石７０８を用いる。磁気ビーズ７０２の集合固定機構としては他に、電磁力を用いたものでも良い。また、磁気ビーズ７０２の代わりに非磁気ビーズを用いる場合は、その集合固定機構として、細孔構造を有するフィルタなどの構造体を用いてもよい。この場合、非磁気ビーズを当該構造体上にせき止めることができる。
　まず、図５Ａの（ｂ）に示すように、入口ウェル中のＰＣＲ試薬７０１を流路７０６内に取り込む。次いで、図５Ａの（ｃ）に示すように、温度制御機構７０７による温度制御を行い、ＰＣＲ反応を実行する。その結果、ビオチン標識ＰＣＲ産物が流路７０６内に合成される。
　その後、図５Ａの（ｄ）に示すように、出口ウェルからビーズ溶液７０３を流路７０６内に取り込み、入口ウェル‐流路‐出口ウェルで送液を必要回数繰返すことにより、ＰＣＲ反応液とビーズ溶液の混合液（結合反応液）中に磁気ビーズ７０２を均一に懸濁させる。このとき、前述したように、未反応ビオチン化プライマとPCR産物が、得られたＰＣＲ産物量の多少、及びビーズ表面への結合のしやすさの差に応じて、磁気ビーズ７０２表面に結合する。次いで、磁石７０８を流路７０６の外壁に近接させることで、図５Ｂの（ｅ）に示すように、磁気ビーズ７０２が流路７０６の内壁に集合固定される。このときに分離された上清には、検出装置に供した際に好適検出レンジ以内のピークが得られるように正規化されたＰＣＲ産物が残存している。
　磁気ビーズを集合固定した状態で、図５Ｂの（ｆ）に示すように、上清を出口ウェルに送液する。最後に、図５Ｂの（ｇ）に示すように、所定容量の上清を電気泳動試薬ウェル７０４に取り込ませ、上清と核酸変性試薬７０５を混合させる。
　以上のように、本実施例による装置構成によれば、結合反応液、洗浄試薬、洗浄廃液、溶出試薬、溶出液を収容するためのウェルや流路などの区画が不要となる。また、磁気ビーズの懸濁動作と、これに続くビーズ集合固定動作を１度のみで済ませることができる。さらに、上述したように、検出装置に供するPCR産物量の検体間ばらつきを、検出ダイナミックレンジ、あるいは好適検出レンジ以内に正規化することができる。したがって、核酸タイピングのワークフローを、低コストで単一装置上に一連自動化することが可能となる。さらに、1回のバッチ処理で、全ての並列処理検体について高品質な分析データを取得することが可能になる。
　本実施例は、マルチプレックス核酸増幅反応により複数のターゲット領域を同時にタイピングする場合に、本発明の方法を適用した装置の実施例である。
　この場合も、実施例３と同様の装置構成、動作フローを用いることで、上述した効果を得ることができる。また、各ターゲット領域に対して、互いに異なるリガンドを修飾したプライマと、それに対応するターゲット物質で表面修飾された担体を使用してもよい。これにより、追加の効果として、複数のターゲット領域から得られた複数種の増幅核酸の量を、領域ごとに独立に正規化することが可能となる。
　以上に詳述した通り、本発明の核酸分離方法、及び装置によれば、抽出された被検核酸の精製や定量定性分析、あるいは抽出された被検核酸を担体表面に結合させた後の上清除去、担体表面洗浄、結合した核酸の溶出といった煩雑な工程を不要としながらも、増幅核酸量の検体間ばらつきを分析装置の検出可能レンジ、あるいは好適検出レンジ以内に、簡便に正規化することができる。これにより、核酸タイピングのワークフローを整流化し、並列処理した複数検体について高品質な分析データを迅速に得ることができる。また、低コストの装置により、ワークフローにおける核酸抽出、核酸増幅、増幅核酸分析の各工程を連結して一連自動化することができる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１０１　被験者
１０２　検体
１０３　被検核酸
１０４　ＰＣＲ反応容器
１１０　６‐ＦＡＭプライマ
１１１　ビオチン化プライマ
１１２　ＰＣＲ産物
１１３　６－ＦＡＭ蛍光色素
１１４　ビオチン
１１５　磁気ビーズ
１１６　磁石
１１７　上清
５０１　試薬カートリッジ
５０２　カートリッジ流路部
５０３　メンブレン部
５０４　カートリッジホルダ
５０５　流路加圧ポート
５０６　流路封止弁加圧ポート
５０７　流路負圧ポート
５０８　流路封止弁負圧ポート
５０９　加圧配管制御バルブ
５１０　負圧配管制御バルブ
５１１　加圧ポンプ
５１２　負圧ポンプ
５１３　バルブ制御用コントローラ
６０１　カートリッジホルダ
６０２　試薬カートリッジ
６０３　入口ウェル
６０４　試薬
６０５　メンブレン
６０６　流路
６０７　出口ウェル
６０８　流路入口封止弁
６０９　流路出口封止弁
７０１　ＰＣＲ試薬
７０２　磁気ビーズ
７０３　ビーズ溶液
７０４　電気泳動試薬ウェル
７０５　核酸変性試薬
７０６　流路
７０７　温度制御機構
７０８　磁石

Claims (15)

  1. 増幅核酸を分離する核酸分離方法であって、
    所定量を超える余剰の増幅核酸を結合反応により担体の表面に結合させる結合工程と、
    前記結合工程後、前記担体の表面に結合せず結合反応液中に残存する前記増幅核酸を分析に供給する供給工程と、を含む、
    ことを特徴とする核酸分離方法。
  2. 前記結合工程は、
    基質を原料分子とする核酸増幅反応により被検核酸を増幅させる核酸増幅工程で得られる、前記増幅核酸及び未反応基質の両分子種に特異的に結合可能で、かつ前記増幅核酸分子よりも前記未反応基質分子に優位に結合する所定量の前記担体を、
    核酸増幅工程後の増幅反応液に接液させ、
    前記増幅核酸及び前記未反応基質、あるいはそのいずれか一方を結合反応により前記担体の表面に結合させる工程であり、
    前記供給工程は、
    前記結合工程後、前記担体と前記結合反応液を分離させる分離工程を含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分離方法。
  3. 前記担体が、ビーズ、フィルタ、シート、ゲル薄膜からなる群より選択される少なくとも１種である、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  4. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種がリガンドで修飾され、かつ前記担体の表面が当該リガンドと特異的に結合するターゲット物質で修飾されている、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  5. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種が、光学的にあるいは放射活性により検出可能な化学標識を施されている、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  6. 前記核酸増幅反応により増幅させる被検核酸のターゲット領域が、単一領域、複数領域、全領域からなる群より選択される少なくとも1種である、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  7. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Multiple Displacement Amplification（MDA）法、Rolling Circle Amplification（RCA）法からなる群より選択される少なくとも1種である、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  8. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種がビオチン修飾されたプライマであり、かつ前記担体がストレプトアビジンで表面修飾された磁気ビーズである、
    ことを特徴とする請求項２に記載の核酸分離方法。
  9. 増幅核酸を分離する核酸分離装置であって、
    基質を原料分子とする核酸増幅反応により被検核酸を増幅させる核酸増幅機構、
    前記核酸増幅機構による核酸増幅工程後、増幅核酸及び未反応基質の両分子種に特異的に結合可能で、かつ前記増幅核酸分子よりも前記未反応基質分子に優位に結合する所定量の担体を、核酸増幅反応液に接液させ、前記増幅核酸及び前記未反応基質、あるいはそのいずれか一方を結合反応により前記担体の表面に結合させる結合機構、
    前記結合機構による結合工程後、前記担体と前記結合反応液を分離させる分離機構、
    前記分離機構による分離工程後、前記担体の表面に結合せず結合反応液中に残存する前記増幅核酸を分析に供給する供給機構と、を備える、
    ことを特徴とする核酸分離装置。
  10. 前記担体が、ビーズ、フィルタ、シート、ゲル薄膜からなる群より選択される少なくとも１種である、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。
  11. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種がリガンドで修飾され、かつ前記担体の表面が当該リガンドと特異的に結合するターゲット物質で修飾されている、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。
  12. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種が、光学的にあるいは放射活性により検出可能な化学標識を施されている、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。
  13. 前記核酸増幅反応により増幅させる被検核酸のターゲット領域が、単一領域、複数領域、全領域からなる群より選択される少なくとも1種である、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。
  14. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）法、Multiple Displacement Amplification（MDA）法、Rolling Circle Amplification（RCA）法からなる群より選択される少なくとも1種である、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。　
  15. 前記核酸増幅反応で用いる前記基質の少なくとも１種がビオチン修飾されたプライマであり、かつ前記担体がストレプトアビジンで表面修飾された磁気ビーズである、
    ことを特徴とする請求項９に記載の核酸分離装置。
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