CN111218399A - 一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用，该芯片为凹陷阵列结构的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且微流控芯片表面涂覆0.01‑2mg/cm2的Matrigel或其相关衍生物，该胚胎培养微流控芯片有助于在体外实现单个胚胎定位和培养过程。本发明的实验证明，在Matrigel及其相关衍生物修饰的聚合物芯片中接种在原核期胚胎，可以观察到Matrigel及其相关衍生物使早期胚胎发育滞后。本发明的结果在研究早期胚胎基因表达及调控中，具有重要的理论和实践意义。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术与生殖生物学的交叉领域，具体涉及一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用。
背景技术
在哺乳动物胚胎发育过程约有30％～70％的胚胎夭折，绝大部分在胚胎发育的早期。特别是在体外培养时，早期胚胎凋亡指数更高。近年来，由于早期胚胎作为细胞形态发生和分化模型的重要性有所增加，以及发育生物学技术的日新月异，早期胚胎阶段日益受到重视，研究早期胚胎基因表达及调控，具有重要的理论和实践意义。
BD Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出的基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。然而，Matrigel在胚胎早期发育中的影响目前尚无相关报道，因此本发明结合单胚胎捕获微流控芯片，旨在公开一种涂覆有Matrigel的微流控芯片及其制备方法，采用物理沉降法将Matrigel均一地固定在芯片培养表面，用以胚胎早期发育影响研究。
发明内容
本发明涉及一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用。
一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片，该芯片为凹陷阵列结构的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且微流控芯片表面涂覆0.01-2mg/cm2的Matrigel或其相关衍生物，其凹陷结构的侧壁具有一定的倾斜角度，接种胚胎后，在倾斜侧壁的作用下，迫使细胞聚集在凹陷结构的底部，可实现快速、高效、高通量、自动捕获单胚胎并进行原位培养以及分析评价。
所制备微流控芯片的材质为聚合物材料，具体为PDMS、PMMA或PS；所述所述凹陷结构边长为100μm～400μm。
一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的制备方法，具体步骤为：
(1)“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制备；
(2)Matrigel及其相关衍生物修饰。
所述的步骤(1)“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制备；按照以下步骤进行：
(1)在玻璃或硅片基底表面旋涂200-800微米厚的SU-8光刻胶，95℃前烘2-8小时，
(2)将边长为200-400微米的正方形的阵列掩膜固定于含有光刻胶的基底表面，并置于可以调节倾斜角度以及自由旋转的平台上，
(3)紫外曝光时，可以调节平台的倾斜角度(15-75度)，同时每次曝光后平台可以以45度或90度的转角旋转后进行下一次曝光，
(4)95℃后烘10-30分钟，自然冷却后用丙二醇甲醚醋酸酯溶掉未曝光的SU-8胶，形成具有“倒金字塔”样的阵列模板，
(5)180℃坚膜2小时，最后用此模板制备不同聚合物组成的微流控芯片。
所述步骤(2)在微流控芯片上涂覆有Matrigel的制备方法为：
1)将微流控芯片在无水乙醇中浸泡15-40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；
2)将清洗好的微流控芯片放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W，进行射频放电0.5-10min；
3)在真空状态下将一定体积的蛋白浓度为9-15mg/ml Matrigel溶液涂覆在芯片表面，孵育2-6小时(37℃)或者12-24小时(4℃)；
4)弃去步骤(3)芯片表面溶液，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，即得。
一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的应用，该芯片用于滞后早期胚胎发育，具体操作步骤为：
所述单胚胎捕获步骤如下：将芯片置于真空培养箱抽真空2～8min；将单胚胎悬液覆盖芯片表面，利用负压驱动和重力作用，将单个胚胎引入单个捕获阱内；待胚胎沉降至捕获阱底部，在上面覆盖新鲜培养基，并覆盖矿物油以防止蒸发；每两天进行培养基更换，为胚胎补加营养物质，排出代谢废物；
所述微流控芯片的单个胚胎的捕获效率由胚胎密度和凹陷结构边长协同影响，所述单胚胎悬液密度为1×103个/mL～5×103个/mL；所述凹陷结构边长为100μm～400μm；
所捕获的单个胚胎可在芯片的阵列结构中长期原位培养，可实时观察生长状态。所捕获的单细胞可在芯片大量增殖、分化以及药物刺激等生理学行为。
本发明是通过下述技术方案加以实现，其特征在于，微流控芯片表面Matrigel的密度0.01-2mg/cm2。Matrigel是通过物理沉降的方式沉积到微流控芯片胚胎培养区域表面，具有较好的稳定性和均一性。
所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育，
所述早期胚胎发育为从受精卵发育开始至囊胚形成。
所述胚胎为人和小鼠胚胎。
用于胚胎培养的涂覆有Matrigel的微流控芯片可在芯片的阵列结构中对胚胎进行原位培养，实时观察生长状态。所捕获的单细胞可在芯片大量增殖、分化以及药物刺激等生理学行为。
本发明的实验证明，在Matrigel及其相关衍生物修饰的聚合物芯片中接种在原核期胚胎，可以观察到Matrigel及其相关衍生物使早期胚胎发育滞后。本发明的结果在研究早期胚胎基因表达及调控中，具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1“倒金字塔”样凹陷三维胚胎培养芯片示意图,a)俯视图；b)侧视图
图2Matrigel修饰的微流控芯片对胚胎发育的影响
具体实施方法
一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片，如图1所示，该芯片为凹陷阵列结构的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且微流控芯片表面涂覆0.01-2mg/cm2的Matrigel或其相关衍生物，所述凹陷结构的侧壁具有一定的倾斜角度，接种胚胎后，在倾斜侧壁的作用下，迫使细胞聚集在凹陷结构的底部，可实现快速、高效、高通量、自动捕获单胚胎并进行原位培养以及分析评价。
一种“金字塔”样三维胚胎培养芯片的制备方法，利用倾斜曝光的软光刻技术制备出具有“金字塔”样结构的模板，再利用该模板制备PDMS聚合物芯片，聚合物材质也可为PDMS、PMMA及PS等。该芯片的特点在于每个凹陷结构都具有倾斜的侧壁，在其作用下迫使接种的胚胎聚集在凹陷结构的底部。
实施例1
Matrigel修饰微流控芯片的制备
1)将微流控芯片在无水乙醇中浸泡15-40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；
2)将清洗好的微流控芯片放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W，进行射频放电0.5-10min；
3)在真空状态下将一定体积的蛋白浓度为9-15mg/ml Matrigel溶液涂覆在芯片表面，孵育2-6小时(37℃)或者12-24小时(4℃)；
4)弃去步骤(3)芯片表面溶液，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，即得。
实施例2
Matrigel修饰的微流控芯片对胚胎发育的影响
实施例1制备的微流控芯片和未经Matrigel修饰的微流控芯片分别经75％乙醇浸泡，置于真空培养箱抽真空10min，随后，快速将胚胎悬液以1×103个/mL的胚胎密度加入芯片表面，利用负压驱动和重力作用，将单个胚胎引入单个捕获阱内；待胚胎沉降至捕获阱底部，在上面覆盖新鲜培养基，并覆盖矿物油以防止蒸发；每两天进行培养基更换，为胚胎补加营养物质，排出代谢废物。将上述Matrigel修饰的微流控芯片和Matrigel未修饰的的对照组微流控芯片从接种胚胎开始培养算起，每24小时观察一次胚胎发育情况包括卵裂率，胚胎的形态(如2细胞，4细胞等)情况。
结果如图2所示(第72小时的图)，Matrigel未修饰的的对照组微流控芯片上接种的胚胎已发育到4细胞阶段(分裂出4个卵裂球)，但Matrigel修饰的微流控芯片上接种的胚胎只发育到2细胞阶段(分裂出2个卵裂球)。
将明场不同时间的细胞进行计数卵裂率(卵裂球数/总培养胚胎数(总培养胚胎数为微流控芯片接种的的存活胚胎数))统计，实验重复三次，结果取平均值，如表1所示。
表1为不同阶段阳性胚胎发育状况统计
Claims (8)
1.一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片，其特征在于：该芯片为凹陷阵列结构的“倒金字塔型”或“倒V型”芯片，且微流控芯片表面涂覆0.01-2mg/cm2的Matrigel或其相关衍生物，所述凹陷结构的侧壁具有一定的倾斜角度，接种胚胎后，在倾斜侧壁的作用下，迫使细胞聚集在凹陷结构的底部，可实现快速、高效、高通量、自动捕获单胚胎并进行原位培养以及分析评价。
2.根据权利要求1所述的一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片，其特征在于：所制备微流控芯片的材质为聚合物材料，具体为PDMS、PMMA或PS；所述所述凹陷结构边长为100μm～400μm。
3.根据权利要求1所述的一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：
(1)“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制备；
(2)Matrigel及其相关衍生物修饰。
4.根据权利要求3所述的一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述“倒金字塔型”或“倒V型”芯片的制备，按照以下步骤进行：
(1)在玻璃或硅片基底表面旋涂200-800微米厚的SU-8光刻胶，95℃前烘2-8小时，
(2)将边长为200-400微米的正方形的阵列掩膜固定于含有光刻胶的基底表面，并置于可以调节倾斜角度以及自由旋转的平台上，
(3)紫外曝光时，可以调节平台的倾斜角度(15-75度)，同时每次曝光后平台可以以45度或90度的转角旋转后进行下一次曝光，
(4)95℃后烘10-30分钟，自然冷却后用丙二醇甲醚醋酸酯溶掉未曝光的SU-8胶，形成具有“倒金字塔”样的阵列模板，
(5)180℃坚膜2小时，最后用此模板制备不同聚合物组成的微流控芯片。
5.根据权利要求3所述的一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的制备方法，其特征在于：步骤(2)Matrigel及其相关衍生物修饰，按照以下步骤进行：
1)将微流控芯片在无水乙醇中浸泡15-40min，用去离子水冲洗，真空干燥，备用；
2)将清洗好的微流控芯片放入等离子发生器中，抽真空至0-1Pa，通入氧气至10-200Pa，调整放电功率在5-300W，进行射频放电0.5-10min；
3)在真空状态下将一定体积的蛋白浓度为9-15mg/ml Matrigel溶液涂覆在芯片表面，孵育2-6小时(37℃)或者12-24小时(4℃)；
4)弃去步骤(3)芯片表面溶液，并用无菌去离子水冲洗3遍，干燥，封装，即得。
6.根据权利要求1所述的一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的应用，其特征在于：该芯片用于滞后早期胚胎发育，具体操作步骤为：
微流控芯片经75％乙醇浸泡，置于真空培养箱抽真空10min，随后，快速将胚胎悬液以1×103个/mL的胚胎密度加入芯片表面，利用负压驱动和重力作用，将单个胚胎引入单个捕获阱内；待胚胎沉降至捕获阱底部凹陷，在上面覆盖新鲜培养基，并覆盖矿物油以防止蒸发；每两天进行培养基更换，为胚胎补加营养物质，排出代谢废物；
将微流控芯片从接种胚胎开始培养算起，每24小时观察一次胚胎发育情况包括卵裂率，胚胎的形态情况。
7.根据权利要求6所述的Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的应用，其特征在于：所述抑制胚胎发育为滞后早期胚胎发育。
8.根据权利要求6所述的Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片的应用，其特征在于：所述胚胎为人或小鼠胚胎。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201811406573.9A CN111218399A (zh) | 2018-11-23 | 2018-11-23 | 一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用 |
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| CN201811406573.9A CN111218399A (zh) | 2018-11-23 | 2018-11-23 | 一种Matrigel及其相关衍生物修饰的微流控芯片及其应用 |
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| CN (1) | CN111218399A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120011609A (ko) * | 2010-07-29 | 2012-02-08 | 고려대학교 산학협력단 | 마이크로유체 어레이 플랫폼 및 이의 제조방법 |
| CN103502426A (zh) * | 2011-02-28 | 2014-01-08 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 细胞培养系统 |
| CN106811411A (zh) * | 2015-12-01 | 2017-06-09 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于微流控芯片的人心脏模型的建立方法 |
| CN108795751A (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种“漏斗”样三维细胞聚集培养芯片及其制备方法 |
| CN108795752A (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-13 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种“金字塔”样三维细胞聚集培养芯片及其制备方法 |
-
2018
- 2018-11-23 CN CN201811406573.9A patent/CN111218399A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 孙芳园等: "小鼠胚胎体外培养方法的改良", 《解剖学报》 * |
| 陈忠尧等: "外环境因素对体细胞重编程诱导多能干细胞的影响", 《中国组织工程研究》 * |
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