KR102127574B1

KR102127574B1 - 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법

Info

Publication number: KR102127574B1
Application number: KR1020180156525A
Authority: KR
Inventors: 정옥찬
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-06-29
Also published as: KR20200041760A

Abstract

본 발명은 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법에 관한 것으로, 세포가 포함된 유체가 주입되는 유입구(Inlet port)와, 상기 유입구를 통해 주입된 유체가 흐르는 미세유체 채널과, 상기 미세유체 채널을 흐르는 세포의 농축, 유체 또는 세포의 흐름을 제어하기 위한 복수개의 공압 밸브와, 상기 공압 밸브를 구동하기 위해 각각의 공압 밸브에 연결되는 공압 연결구(Pneumatic port)와, 상기 공압 밸브를 통과하면서 농축된 세포와 유체를 분리하여 배출하도록 오직 유체만 배출하는 유체 배출구(Of)와, 농축된 세포가 포함된 유체를 배출하는 세포 배출구(Oc)를 포함하는 배출구(Outlet port)를 포함함으로써, 처리 속도가 빨라 대용량 세포의 농축이 필요한 산업에 전반적으로 응용이 가능한 효과가 있다.

Description

공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법{Pneumatically-driven Cell Concentrator, Cell Concentrate Method, Method of Manufacturing Microfluidic Channel and Method of Manufacturing Pneumatic Valves}

본 발명은 공압 구동 방식의 세포 농축기에 관한 것으로, 보다 상세하게는 공압 구동 방식으로 다수의 세포를 포집 및 농축함으로써, 처리 속도가 빨라 대용량 세포의 농축이 필요한 산업에 전반적으로 응용이 가능한 공압 구동 방식의 세포 농축기, 이를 이용한 세포 농축방법, 미세유체 채널의 제조방법 및 공압 밸브의 제조방법에 관한 것이다.

미세 유체공학 및 BioMEMS 기술의 발달과 더불어, 생물학 및 세포 연구를 위한 세포를 포획하는 장치가 다양한 미세 유체 플랫폼을 이용하여 발전해왔다.

세포를 포획하는 방식은 주로 단일세포를 포획 기술로 컵 모양 구조, 이중 홈 구조, 미세 챔버 어레이, 미세 장애물, 초음파, 광학 집게(optical tweezer), 유전영동(dielectrophoresis), 자력 등의 방식이다. 이러한 대부분의 포획 방식은 처리 속도가 느리다는 단점이 있기 때문에 대용량 세포의 농축이 필요한 선박평형수 등의 유해 조류 농축을 위해 사용되기에는 제한이 있다.

근래 단순 유체의 흐름을 이용한 단일 세포 포획을 위한 공압 구동 방식의 포획에 대한 연구가 보고되었다. 그러나 이는 오직 단일 세포 포획에 관한 기술로써, 다수의 타깃 세포 및 세포를 포집 및 농축하는 연구는 전무하기 때문에, 산업적으로 응용하기에는 한계가 있다.

이에 본 출원인은 다수의 세포를 농축하기 위한 공압 구동 방식의 능동적인 농축장치를 개발하였고, 이를 완성하여 본 발명을 제안하기에 이르렀다.

[비특허문헌 1] D. D. Carlo, N. Aghdam, and Luke P. Lee, Anal. Chem., Vol. 78, pp. 4925-4930, 2006. [비특허문헌 2] M. Khabiry, B. G. Chung, M. J. Hancock, H. C. Soundararajan, Y. Du, D. Cropek, W. G. Lee, and A. Khademhosseini, Small, Vol. 5, No. 10, pp. 1186-1194, 2009. [비특허문헌 3] S. Yamamura, H. Kishi, Y. Tokimitsu, S. Kondo, R. Honda, S. R. Rao, M. Omori, E. Tamiya, and A. Muraguchi, Single-Cell Microarray for Analyzing Cellular Response, Anal. Chem., Vol. 77, pp. 8050-8056, 2005. [비특허문헌 4] L. R. Huang, E. C. Cox, R. H. Austin, J. C. Sturm, Continuous particle separation through deterministic lateral displacement, Science. Vol. 304(5673), pp. 987-90, 2004. [비특허문헌 5] F. Petersson, A. Nilsson, C. Holm, H. J*?*nsson and T. Laurell, Continuous separation of lipid particles from erythrocytes by means of laminar flow and acoustic standing wave forces. Lab Chip, Vol. 5, 20-22, 2005. [비특허문헌 6] P. L. Johansen, F. Fenaroli, L. Evensen, G. Griffiths, and G. Kostera, Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish, Nat Commun. Vol. 7, 10974, 2016.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 안출한 것으로, 작동 유체 내 세포만을 걸러내어 농축하는 Sieve 밸브, 세포를 농축하는 동안 작동 유체만을 배출하는 유체 배출 밸브, 그리고 농축된 세포를 얻기 위한 세포 포집 밸브를 포함하여 공압 구동 방식으로 다수의 세포를 포집 및 농축함으로써, 처리 속도가 빨라 대용량 세포의 농축이 필요한 산업에 전반적으로 응용이 가능한 공압 구동 방식의 세포 농축기를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 상기와 같은 세포 농축기를 이용한 세포 농축방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 세포 농축기의 미세유체 채널 및 공압 밸브를 제조하는 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 세포가 포함된 유체가 주입되는 유입구(Inlet port)와, 상기 유입구를 통해 주입된 유체가 흐르는 미세유체 채널과, 상기 미세유체 채널을 흐르는 세포의 농축, 유체 또는 세포의 흐름을 제어하기 위한 복수개의 공압 밸브와, 상기 공압 밸브를 구동하기 위해 각각의 공압 밸브에 연결되는 공압 연결구(Pneumatic port)와, 상기 공압 밸브를 통과하면서 농축된 세포와 유체를 분리하여 배출하도록 오직 유체만 배출하는 유체 배출구(Of)와, 농축된 세포가 포함된 유체를 배출하는 세포 배출구(Oc)를 포함하는 배출구(Outlet port)를 포함하는 공압 구동 방식의 세포 농축기가 제공된다.

상기 공압 밸브는 상기 미세유체 채널을 제어하는 소자로써, 작동 유체 내 세포를 걸러내어 농축하는 거름 밸브(Sieve Valve)(Vs)와, 세포가 농축되는 동안 작동 유체(Qf)를 배출하도록 제어하는 유체 제어 밸브(Vf)와, 세포 농축액(Qc)를 얻도록 제어하는 세포 포집 밸브(Vc)로 이루어질 수 있다.

여기서, 상기 거름 밸브는 외부 압축 공기를 인가 받아 변형이 가능한 밸브막(Valve diaphragm)과, 반구형 유체 챔버(Dome-shape fluid chamber)와, 상기 반구형 유체 챔버의 하단부에 형성되어 상호연결 채널(interconnection channel)과 연결하기 위한 홀을 포함할 수 있다.

상기 미세유체 채널은 상기 유입구와 연결되어 세포가 포함된 유체(Qfc)가 유입되는 상부 미세유체 채널(Microfludic channel)과, 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널과, 농축과정에서 세포가 걸러진 유체(Qf)가 흐르는 유체 채널로 구분되어 이루어지는 상호연결 채널(interconnection channel)을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 상부 미세유체 채널의 하단부에는 오직 유체만 통과할 수 있는 직각 형태의 내장형 채널이 일체로 형성되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 상부 미세유체 채널은 상기 내장형 채널을 통하여 유체가 배출되면서 세포들이 농축되도록 적어도 2번 이상의 굴곡부가 형성된 유선형 형상으로 이루어질 수 있다.

한편, 본 발명의 세포 농축기는 다층 구조를 가지며, 상기 유입구, 배출구 및 공압 연결구가 형성되어 외부 유체 연결 및 공압 연결을 위한 유체 및 공압공급 층(pneumatic supply layer)과, 상기 공압 밸브의 밸브막 형성을 위한 밸브막 층(Valve diaphragm layer)과, 상기 미세유체 채널이 형성되는 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)과, 상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층의 하부에 구비되는 추가적인 밀봉 층(Additional sealing layer)을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층은 세포가 포함된 유체의 주입 및 배출을 위한 미세유체 채널이 형성되는 상부층과, 상기 공압 밸브 간에 상호연결(interconnection) 구조를 형성하기 위한 상호연결 채널이 형성되는 하부층으로 이루어질 수 있다.

한편, 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 세포가 포함된 유체가 유입구(inlet port)를 통하여 유입되는 단계와, 밸브막(Valve diaphragm)이 구비된 거름 밸브에 외부 압축 공기(Compressed air)를 인가하면, 상기 밸브막(Valve diaphragm)이 변형하게 되어 미세유체 채널과 반구형 유체 챔버가 연결되는 경사면에 형성된 유체 채널의 출구면이 좁아지면서 세포는 차단되고, 유체는 배출될 수 있는 면(Sieve surface)이 생성되는 단계와, 오직 유체만 흘려보내는 유체 제어 밸브(Vf)를 OFF하고, 세포 농축액(Qc)를 얻도록 농축된 세포가 포함된 유체가 흘러가는 통로를 제어하는 세포 포집 밸브(Vc)를 ON으로 각각 제어함으로써, 세포를 농축하는 단계와, 상기 거름 밸브(Vs)에 인가되었던 외부 압축공기를 해제(OFF)하고, 동시에 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널을 개방 및 유체(Qf)의 채널을 차단하기 위하여 세포 포집 밸브(Vc)를 OFF, 유체 제어 밸브(Vf)를 ON으로 제어함으로써, 농축된 세포를 외부로 배출하는 단계를 포함하여 진행되는 공압 구동 방식의 세포 농축기를 이용한 세포 농축방법이 제공된다.

본 발명은 세포가 농축되는 동안에 내장형 채널(Embedded Channel)을 통하여 유체를 배출함으로써, 세포가 변형되어 채널을 막는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 세포 농축방법은 세포의 크기에 따라 거름 밸브(Vs)에 인가하는 압력을 제어함으로써, 밸브막의 변형을 통제하고, 다양한 크기의 세포를 농축할 수 있다.

또한, 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 반구형 유체챔버를 만들기 위한 제1 몰드에 액체 수지를 소정 두께로 도포하는 제1 단계와, 상기 제1 단계에서 상기 액체 수지가 도포된 제1 몰드를 경화하는 제2 단계와, 직각 형태의 내장형 채널을 형성하기 위한 제2 몰드에 액체 수지를 소정 두께로 도포하는 제3 단계와, 상기 제3 단계에서 상기 액체 수지가 도포된 제2 몰드를 경화하는 제4 단계와, 제2 단계에서 경화된 제1 경화수지에서 제1 몰드를 제거하여 공기 공동(air cavity)이 형성된 제1 경화수지를 제4 단계에서 경화된 제2 경화수지에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제5 단계와, 제2 경화수지에서 제2 몰드를 제거하고 본딩된 경화수지를 유리 기판(Glass substrate)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제6 단계와, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)의 하부층 제작을 위한 제3 몰드에 액체 수지를 도포한 후 상기 경화수지를 정렬하는 제7 단계와, 제7 단계의 액체 수지를 경화하는 제8 단계와, 닫힌 공간인 공기 공동(air cavity) 내부의 공기가 팽창하게 되어, 수지 막이 부풀어 오르게 되면서 변형된 역상이 액체 수지에 복제되는 제9 단계와, 상기 수지 막의 변형의 역상이 복제되면서 경화되어 직각 형태의 내장형 채널이 형성된 미세유체 채널이 완성되는 제10 단계로 이루어지는 공압 구동 방식의 세포 농축기 미세유체 채널의 제조방법이 제공된다.

또한, 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 반구형 유체챔버를 만들기 위한 제1 몰드에 액체 수지를 소정 두께로 도포하는 제Ⅰ 단계와, 상기 제Ⅰ 단계에서 상기 액체 수지가 도포된 제1 몰드를 경화하는 제Ⅱ 단계와, 제2 몰드에 액체 수지를 소정 두께로 도포하는 제Ⅲ 단계와, 상기 제Ⅲ 단계에서 상기 액체 수지가 도포된 제2 몰드를 경화하는 제Ⅳ 단계와, 제Ⅱ 단계에서 경화된 제1 경화수지를 제Ⅳ 단계에서 경화된 제2 경화수지에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩한 후 유리 기판(Glass substrate)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제Ⅴ 단계와, 제Ⅴ 단계의 액체 수지를 경화하는 제Ⅵ 단계와, 닫힌 공간인 공기 공동(air cavity) 내부의 공기가 팽창하게 되어, 수지 막이 부풀어 오르게 되면서 변형된 역상이 액체 수지에 복제되어 하부 미세 유체 채널 네트워크 층 제작을 위한 몰드 구조와 맞닿게 되어 관통형 구조가 형성되는 제Ⅶ 단계와, 상기 관통형 구조가 경화되어 공압 밸브 구조가 완성되는 제Ⅷ 단계를 포함하는 공압 구동 방식의 세포 농축기 공압 밸브의 제조방법이 제공된다.

이상에서 살펴본 본 발명에 의하면, 작동 유체 내 세포만을 걸러내어 농축하는 Sieve 밸브, 세포를 농축하는 동안 작동 유체만을 배출하는 유체 배출 밸브, 그리고 농축된 세포를 얻기 위한 세포 포집 밸브를 포함하여 공압 구동 방식으로 다수의 세포를 포집 및 농축함으로써, 처리 속도가 빨라 대용량 세포의 농축이 필요한 산업에 전반적으로 응용이 가능한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 공압 구동 방식의 세포 농축기를 도시한 전체 사시도이다.
도 2는 본 발명의 공압 구동 방식의 세포 농축기를 도시한 분해 사시도이다.
도 3은 본 발명에서 유체 및 공압공급 층을 도시한 평면도이다.
도 4는 본 발명에서 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층을 도시한 평면도이다.
도 5는 도 4의 네트워크 층을 상부층과 하부층으로 구분한 평면도이다.
도 6은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브의 구조를 도시한 사시도이다.
도 7은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브에 유입된 세포의 농축을 도시한 사시도이다.
도 8은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브에서 농축된 세포의 배출을 도시한 사시도이다.
도 9는 본 발명의 미세유체 채널의 제조방법을 도시한 공정도이다.
도 10은 본 발명의 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer) 공압 밸브의 제조방법을 도시한 공정도이다.
도 11은 본 발명의 세포 농축을 위한 농축기의 현미경 사진이다.
도 12는 도 11의 사진에서 세포 포집 채널(Particle collection channel)의 A-A 단면을 나타내는 SEM 사진이다.
도 13은 도 11의 사진에서 세포 포집을 위한 반구형 거름 밸브(Sieve Valve)의 B-B 단면을 나타내는 SEM 사진이다.
도 14는 본 발명의 공압 밸브 동작에 따른 2개의 배출구(outlet port)에서 측정한 유량 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 세포 농축 원리 검증 시험으로서, (a) 초기 상태, (b) 농축 과정, (c) 배출 후를 나타내는 사진이다.

이하에서는 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

도 1은 본 발명의 공압 구동 방식의 세포 농축기를 도시한 전체 사시도이고, 도 2는 본 발명의 공압 구동 방식의 세포 농축기를 도시한 분해 사시도이고, 도 3은 본 발명에서 유체 및 공압공급 층을 도시한 평면도이고, 도 4는 본 발명에서 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층을 도시한 평면도이다.

본 발명의 공압 구동 방식의 세포 농축기는 도 1에 도시한 바와 같이, 세포가 포함된 유체가 주입되는 유입구(Inlet port)(12)와, 상기 유입구(12)를 통해 주입된 유체가 흐르는 미세유체 채널(32)과, 상기 미세유체 채널(32)을 흐르는 세포의 농축, 유체 또는 세포의 흐름을 제어하기 위한 복수개의 공압 밸브(50)(54)(56)와, 상기 공압 밸브(50)(54)(56)를 구동하기 위해 각각의 공압 밸브(50)(54)(56)에 연결되는 공압 연결구(Pneumatic port)(16)(17)(18)와, 상기 공압 밸브를 통과하면서 농축된 세포와 유체를 분리하여 배출하도록 오직 유체만 배출하는 유체 배출구(Of)(14)와, 농축된 세포가 포함된 유체를 배출하는 세포 배출구(Oc)(15)를 포함하는 배출구(Outlet port)(14)(15)를 포함한다.

이와 같은 본 발명의 세포 농축기는 도 2에서 보는 바와 같이, 다층 구조를 가지는 것에 특징이 있으며, 본 발명에서의 실시예는 4개의 층이 결합되어 세포 농축기를 구성한다.

본 발명의 세포 농축기는 크게 유체 및 공압공급 층(pneumatic supply layer)(10)과, 밸브막 층(Valve diaphragm layer)(20)과, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)(30)과, 상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(30)의 하부에 구비되는 추가적인 밀봉 층(Additional sealing layer)(40)을 포함한다.

여기서, 각각의 층은 본 발명의 구성요소들을 포함하는데, 상기 유체 및 공압공급 층(pneumatic supply layer)(10)은 상기 유입구(12), 배출구(14)(15) 및 공압 연결구(17)(18)가 형성되어 외부 유체 연결 및 공압 연결을 할 수 있도록 한다.

상기 밸브막 층(Valve diaphragm layer)(20)은 상기 공압 밸브(50)(54)(56)의 밸브막 형성을 위한 층이며, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)(30)은 상기 미세유체 채널(32)을 형성하기 위한 층이다.

본 발명에서의 공압 밸브는 상기 미세유체 채널(32)을 제어하는 소자로써, 작동 유체 내 세포를 걸러내어 농축하는 거름 밸브(Sieve Valve)(Vs)(50)와, 세포가 농축되는 동안 작동 유체(Qf)를 배출하도록 제어하는 유체 제어 밸브(Vf)(56)와, 세포 농축액(Qc)를 얻도록 제어하는 세포 포집 밸브(Vc)(54)로 이루어진다.

상기 3개의 밸브는 각각의 미세유체 채널(32)(34)을 제어하며, 작동 유체 내 세포를 걸러내어 농축하는 거름 밸브(Sieve Valve)(Vs)(50)와, 세포가 농축되는 동안 작동 유체(Qf)를 배출하도록 제어하는 밸브(Vf)(56), 그리고 세포 농축액(Qc)를 얻도록 제어하는 밸브(Vc)(54)를 활용하여 유입된 세포의 농축 및 배출한다.

상기 미세유체 채널(32)은 상기 유입구(12)와 연결되어 세포가 포함된 유체(Qfc)가 유입되는 상부 미세유체 채널(Microfludic channel)(32)과, 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널(34b)과, 농축과정에서 세포가 걸러진 유체(Qf)가 흐르는 유체 채널(34a)로 구분되어 이루어지는 상호연결 채널(interconnection channel)(34)로 이루어진다.

본 발명에 있어서, 상기 상부 미세유체 채널(32)의 하단부에는 오직 유체만 흐를 수 있는 내장형 채널(embedded channel)(32a)이 일체로 형성되는데, 상기 내장형 채널(32a)은 도 6에서 보는 바와 같이, 직각 형태를 이루며, 상기 내장형 채널(32a)을 통하여 유체가 배출되면서 세포들이 농축된다.

또한, 상부 미세유체 채널(32)은 상기 내장형 채널(32a)을 통하여 유체가 배출되면서 세포들이 농축되도록 적어도 2번 이상의 굴곡부가 형성된 유선형 형상으로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 유체의 주입 및 배출을 위한 1개의 유입구(Inlet port)(12)와 2개의 배출구(Outlet port)(14)(15)를 구성하며, 오직 유체만 배출하는 유체 배출구(Of)(14)와 농축된 세포가 포함된 유체가 배출되는 배출구(Oc)(15)가 각각 존재한다.

여기서, 상기 거름 밸브(50)는 외부 압축 공기를 인가 받아 변형이 가능한 밸브막(Valve diaphragm)(20)을 포함하는데, 도 6에서 보는 바와 같이, 반구형 유체 챔버(Dome-shape fluid chamber)(52)의 하단부에 상호연결 채널(interconnection channel)(34)과 연결하기 위한 홀(52a)을 포함하여 구성된다.

농축 원리

도 6은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브의 구조를 도시한 사시도로서, 본 발명의 핵심 요소인 세포 농축기의 Sieve 밸브 및 유체 채널 네트워크의 구조를 나타낸다. 거름 밸브(Vs)는 외부 압축 공기를 인가 받아 변형이 가능한 밸브막 (Valve diaphragm)(20), 그리고 반구형 유체 챔버(Dome-shape fluid chamber)(52)로 구성된다. 더불어, 같은 평면상에 제작되는 일반적인 공압 밸브구조와는 달리, 본 발명에서는 세포가 포함된 유체(Qfc)가 유입되는 상부 미세유체 채널(Microfludic channel)(32), 상부에서 채널이 세포변형에 의하여 채널이 막히는 것을 방지하기 위한 오직 유체만 흐를 수 있는 내장형 채널(embedded channel)(32a), 그리고 하부에 형성된 2개의 채널(interconnection channel), 즉 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널(34b) 및 농축과정에서 세포가 걸러진 유체(Qf)가 흐르는 채널(34a)로 구성된다. 상부 및 하부에 위치한 3개의 유체 채널은 반구형 유체 챔버(Dome-shape fluid chamber) 제작 과정에서 동시에 제작하여 공정의 효율성을 높인다.

도 7은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브에 유입된 세포의 농축을 도시한 사시도로서, 세포 농축시 유체 밸브(Vf), 세포 밸브(Vc) 및 Sieve 밸브(Vs)를 활용한 유입된 유체(Qfc) 내 세포의 농축과 작동 유체만을 배출하는 과정을 나타낸다.

이와 같은 본 발명에서, 세포가 포함된 유체 혼합물이 유입구(inlet port)(12)를 통하여 세포 농축기로 유입되었을 때, 밸브막(Valve diaphragm)이 구비된 거름 밸브(50)에 외부 압축 공기(Compressed air)를 인가하여 Sieve 밸브를 구동하고, 오직 유체만 흘려보내는 유체 제어 밸브(Vf)를 OFF하고, 세포 농축액(Qc)를 얻도록 농축된 세포가 포함된 유체가 흘러가는 통로를 제어하는 세포 포집 밸브(Vc)를 ON으로 각각 제어함으로써, 세포를 농축하게 된다.

이때, 밸브막(Valve diaphragm)이 구비된 거름 밸브에 외부 압축 공기(Compressed air)를 인가하면, 밸브막(Valve diaphragm)(20)이 도 7에서와 같이, 변형하게 되어 미세 유체 채널과 반구형 유체 챔버가 연결되는 경사면에 형성된 유체 채널의 출구면이 좁아지게 된다. 즉, 세포는 차단되지만, 유체는 배출될 수 있는 면(Sieve surface)이 생성되어, 세포만 농축되게 된다. 이때 오직 유체만 흐를 수 있는 내장형 채널(embedded channel)(32a)을 통하여 지속적인 유체 배출이 있기 때문에 세포가 변형되어 채널을 막는 것을 방지한다. 또한, 세포의 크기에 따라 Vs에 인가하는 압력을 제어함으로써, 밸브막의 변형을 통제하고, 다양한 크기의 세포를 농축할 수 있다.

반구형 유체 챔버(52)의 곡면이 밸브막(20)의 변형된 형태로부터 복제되었기 때문에, 낮은 압력에서 효율적으로 밸브막(20)의 변형을 제어할 수 있다. 세포 농축을 위한 밸브, Vs를 구동함과 동시에 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널의 차단 및 농축과정에서 세포가 걸리진 유체(Qf)만 흐르는 채널의 차단및 농축과정에서 세포가 걸리진 유체(Qf)만 흐르는 채널을 개방하기 위한 Vp 및 Vf를 각각 제어함으로써, 세포 농축 작업이 수행된다.

도 8은 본 발명의 세포 농축을 위한 거름 밸브에서 농축된 세포의 배출을 도시한 사시도로서, 농축된 세포의 배출과정이다. 세포 농축을 위한 거름 밸브(Vs)에 인가되었던 외부 압축공기를 해제(OFF)하고, 동시에 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널을 개방 및 유체(Qf)의 채널을 차단하기 위하여 세포 포집 밸브(Vc)를 OFF, 유체 제어 밸브(Vf)를 ON으로 제어함으로써, 농축된 세포를 외부로 배출하게 된다.

도 5는 도 4의 네트워크 층을 상부층과 하부층으로 구분한 평면도로서, 상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(30)은 세포가 포함된 유체의 주입 및 배출을 위한 상부 미세유체 채널(32)이 형성되는 상부층(30a)과, 상기 공압 밸브 간에 상호연결(interconnection) 구조를 형성하기 위한 상호연결 채널(34a)(34b)이 형성되는 하부층(30b)으로 이루어질 수 있다.

이와 같은 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(30)은 2개의 SU-8 몰드 구조를 활용하고, 본 발명에서 제안하는 공정으로 세포가 포함된 유체의 주입과 유체 및 세포를 각각 배출하기 위하여 3차원 연결 구조를 제작한다.

도 9는 본 발명의 미세유체 채널의 제조방법을 도시한 공정도이고, 도 10은 본 발명의 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer) 공압 밸브의 제조방법을 도시한 공정도이다.

먼저, 미세유체 채널의 제조방법은 반구형 유체챔버를 만들기 위한 제1 몰드(110)에 액체 수지(112)를 소정 두께로 도포하는 제1 단계와, 상기 제1 단계에서 상기 액체 수지(112)가 도포된 제1 몰드를 경화하는 제2 단계와, 직각 형태의 내장형 채널을 형성하기 위한 제2 몰드에 액체 수지를 소정 두께로 도포하는 제3 단계와, 상기 제3 단계에서 상기 액체 수지(114)가 도포된 제2 몰드를 경화하는 제4 단계와, 제2 단계에서 경화된 제1 경화수지(112a)에서 제1 몰드를 제거하여 공기 공동(air cavity)(115)이 형성된 제1 경화수지(112a)를 제4 단계에서 경화된 제2 경화수지(114a)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제5 단계와, 제2 경화수지(114a)에서 제2 몰드를 제거하고 본딩된 경화수지(118)를 유리 기판(Glass substrate)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제6 단계와, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)의 하부층 제작을 위한 제3 몰드에 액체 수지(117)를 도포한 후 상기 경화수지(118)를 정렬하는 제7 단계와, 제7 단계의 액체 수지를 경화하는 제8 단계와, 닫힌 공간인 공기 공동(air cavity)(115) 내부의 공기가 팽창하게 되어, 수지 막이 부풀어 오르게 되면서 변형된 역상이 액체 수지(117)에 복제되는 제9 단계와, 상기 수지 막의 변형의 역상이 복제되면서 경화되어 직각 형태의 내장형 채널이 형성된 미세유체 채널(117a)이 완성되는 제10 단계로 이루어진다.

구체적으로, 본 발명에서 미세유체 채널은 (1) 돔형 유체챔버를 만들기 위한 SU-8 mold에 액체 PDMS를 80㎛ 도포하고, (2) (1)과정의 PDMS가 도포된 SU-8 mold 를 90℃에서 30분간 경화, (3) (1)과는 다른 SU-8에 액체 PDMS를 80㎛ 두께로 도포, (4) (3)과정의 PDMS가 도포된 SU-8 mold 를 90℃에서 30분간 경화, (5) (2)과정에서 경화된 PDMS를 (4)의 과정에서 경화된 PDMS에 상압 플라즈마를 이용하여 bonding, (6) bonding된 PDMS를 가로 및 세로, 각각 18 mm의 Glass substrate에 상압 플라즈마를 이용하여 bonding, (7) 하부 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer) 제작을 위한 SU-8 mold에 액체 PDMS를 0.3 mL 도포한 후 (6)과정의 PDMS mold를 정렬, (8) (7) 과정을 130℃에서 30분간 경화, (9) 닫힌 공간인 air cavity 내부의 공기가 팽창하게 되어, PDMS 막이 부풀어 오르게 되는데, PDMS 막의 변형의 역상이 액상 PDMS에 복제, (10) 제작이 완료된 구조의 형상을 나타낸다.

또한, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer) 공압 밸브는 반구형 유체챔버를 만들기 위한 제1 몰드(210)에 액체 수지(212)를 소정 두께로 도포하는 제Ⅰ 단계와, 상기 제Ⅰ 단계에서 상기 액체 수지(212)가 도포된 제1 몰드를 경화하는 제Ⅱ 단계와, 제2 몰드에 액체 수지(214)를 소정 두께로 도포하는 제Ⅲ 단계와, 상기 제Ⅲ 단계에서 상기 액체 수지(214)가 도포된 제2 몰드를 경화하는 제Ⅳ 단계와, 제Ⅱ 단계에서 경화된 제1 경화수지(212a)를 제Ⅳ 단계에서 경화된 제2 경화수지(214a)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩한 후 유리 기판(Glass substrate)에 상압 플라즈마를 이용하여 본딩하는 제Ⅴ 단계와, 제Ⅴ 단계의 액체 수지를 경화하는 제Ⅵ 단계와, 닫힌 공간인 공기 공동(air cavity)(215) 내부의 공기가 팽창하게 되어, 수지 막이 부풀어 오르게 되면서 변형된 역상이 액체 수지에 복제되어 하부 미세 유체 채널 네트워크 층 제작을 위한 몰드 구조와 맞닿게 되어 관통형 구조가 형성되는 제Ⅶ 단계와, 상기 관통형 구조가 경화되어 공압 밸브(217a) 구조가 완성되는 제Ⅷ 단계를 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer) 밸브의 제조는 (I) 돔형 유체챔버를 만들기 위한 SU-8 mold에 액체 PDMS를 80㎛ 도포, (II) (I)과정의 PDMS가 도포된 SU-8 mold 를 90℃에서 30분간 경화, (III) (I)과는 다른 SU-8에 액체 PDMS를 80㎛ 두께로 도포, (IV) (III)과정의 PDMS가 도포된 SU-8 mold 를 90℃에서 30분간 경화, (V) (II)과정에서 경화된 PDMS를 (IV)과정에서 경화된 PMDS에 상압 플라즈마를 이용하여 bonding한 후 다시 가로세로 18 mm의 Glass substrate에 상압 플라즈마를 이용하여 bonding, (VI) 130℃에서 30분간 경화, (VII)닫힌 공간인 air cavity 내부의 공기가 팽창되어, PDMS 막이 부풀어 오르게 되는데, PDMS 막의 변형의 역상이 액상 PDMS에 복제, 이때 하부 미세 유체 채널 네트워크 층 제작을 위한 SU-8 mold구조와 맞닿게 되어 관통형 구조가 형성, (VIII) 제작이 완료된 구조의 형상이다.

이와 같은 본 발명의 미세유체 채널, 내장형 채널(Embedded channel), 반구형 유체 챔버, 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)은 2개의 SU-8 몰드를 활용하여 각각 반구형 유체 챔버(Half-Spherical dome shape fluid chamber) 구조 형성 및 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)을 제작한다.

나머지 3개의 PDMS층의 제작방법은 다음과 같다. 외부 유체 및 공압 연결을 위한 층(Fluid & pneumatic supply layer)은 SU-8 mold에 10 mL의 액체 PDMS를 도포 및 경화하여 제작하였다. 그리고 밸브막 (Valve diaphragm layer)은 4 inch 실리콘 wafer 상에 80 ㎛ 두께로 액체 PDMS를 도포 및 경화하여 제작하였다. 추가적인 sealing layer인 경우, 4 inch 실리콘 wafer 상에 10 mL의 액체 PDMS를 도포 및 경화하여 제작하였다. 모든 공정의 경화 조건은 hot plate를 활용하여 90 ℃에서 30분간 경화시켰다. 도 2의 모든 구성품이 제작이 완료되면, 상압 플라즈마를 활용하여 순차적 bonding을 수행하여 플랫폼을 완성한다.

시제품

도 11은 본 발명의 세포 농축을 위한 농축기의 현미경 사진이고, 도 12는 도 11의 사진에서 세포 포집 채널(Particle collection channel)의 A-A 단면을 나타내는 SEM 사진이고, 도 13은 도 11의 사진에서 세포 포집을 위한 반구형 거름 밸브(Sieve Valve)의 B-B 단면을 나타내는 SEM 사진이다.

도 12는 Cell collection channel (세포 포집 채널)로써, Sieve 밸브 동작 후 세포를 농축하면서 Only fluid channel을 통하여 유체를 배출하는 구조이다. Inlet port channel과 outlet port channel은 Sieve valve 구조 중 dome shape fluid chamber 제작시 동시에 형성되기 때문에 직각 단면이 아닌, 곡면 단면을 갖게 되며, 유체 챔버의 상부와 연결된다(도 13).

사진에서, 1 : 유입구와 연결된 유체 채널, 2 : 유체만 통과 할 수 있는 직각 유체 채널, 3 : 농축 밸브 하부에 위치한 유체 챔버, 4 : interconnection channel과 연결을 위한 hole, 5 : interconnection channel이다.

[표 1]은 주요 구성 요소 명칭 및 SEM을 활용하여 세부 구조의 크기를 나타낸다.

	명칭	W or D (μm)	H (μm)	R (μm)
1	유입구와 연결된 유체채널	342	41	496.84
2	유체만 통과 할 수 있는 직각 유체 채널	24	5.35
3	농축 밸브 하부에 위치한 유체 챔버	840	165	979.12
4	interconnection channel과 연결을 위한 홀	400(D)
5	interconnection channel	100	40

(W : Width, D : Diameter, H : Height, R : Radius of curvature)

농축 시험

도 14는 본 발명의 공압 밸브 동작에 따른 2개의 배출구(outlet port)에서 측정한 유량 측정 결과를 나타내는 그래프로서, [표 2]와 같이 밸브를 동작하였을 경우, 세포 농축기의 2개의 Outlet port에서 유량 센서를 활용하여 유량을 측정한 결과이다. 노트북 컴퓨터를 활용한 Labview 프로그램으로 솔레노이드 밸브를 제어함으로써, 3개의 밸브에 각각 개별적 외부 압축 공기를 인가하였다. 기초 실험시, 유체에 세포가 혼합되어 있을 경우, 유량 센서 동작이 힘들기 때문에, 순수한 물을 사용하여 시험을 수행하였다.

Sample loading을 위한 상태, a state인 경우, 모든 Valve를 OFF 한 상태(1 Signal)이기 때문에, 2개의 Outlet port에서 유량이 측정된다. 세포 농축을 위한 Sieve Valve (V1)를 작동할 경우 (1 signal & b state ), Sieve 밸브막의 변형으로 Sieve valve chamber로 유입되는 유체 통로가 줄어들기 때문에, 유량이 다소 줄어들게 된다. 이 상태에서 세포 배출을 위한 밸브, 즉 Vc에 공압을 인가할 경우 (3 signal), 세포 배출을 위한 통로가 완벽하게 차단되기 때문에 유입된 모든 유체가 유체 배출을 위한 outlet port로 흐르게 되어, Qf만 측정되고, Qc인 경우에는 0에 근접한 결과를 얻게 된다 (c state). 이와 반대의 경우, Qc만 얻을 수 있게 되고, Qf는 측정이 되지 않는 d state를 구현할 수 있다.

본 실험을 통하여 Sieve 밸브 및 2개의 유체 통로 제어를 위한 Valve가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있다.

[표 2]은 도 3의 조건의 따른 세포 농축 시험을 위한 공압 밸브 조건을 나타낸다.

Platform Operation			Valve Operation
Platform Operation			Signal	Sieve	Fluid	Particle
state	Operation	Flowrate	Signal	Vs	Vf	Vp
a	Sample loading	Q_f, Q_c	4	OFF	OFF	OFF
b	Only sieving	Q_f, Q_c	1	ON	OFF	OFF
c	Sieving / Wasting	Q_f	2	ON	OFF	ON
d	Sieving / Collecting	Q_c	3	ON	ON	OFF

세포 농축 원리 검증

도 15는 본 발명의 세포 농축 원리 검증 시험으로서, (a) 초기 상태, (b) 농축 과정, (c) 배출 후를 나타내는 사진이다.

본 발명에서 제시한 농축 원리를 증명하기 위해 [표 2]의 구동 조건과 같이 실험을 하였다. 본 실험에서는 직경이 약 10 μm인 Heterocapsa triquetra를 사용하였다. 초기 유체(fluid)를 흘려주어 칩 내부에 존재하는 유체 채널을 젖은 상태로 만든 후, 각 outlet port에 1 meter의 튜브를 연결했다. 60 cm H2O의 수두차를 이용하여 세포가 혼합된 유체를 플랫폼 내부로 주입한다 (a). Sieve valve 구동 및 세포와 분리된 유체만을 배출하는 밸브를 열고, 세포 배출을 위한 밸브를 닫을 경우, 세포가 농축 채널에 농축된다(b). 농축 후, 유체 배출 밸브를 닫고, 세포 배출 밸브를 개방할 경우 농축된 세포의 배출하게 된다(c). 3 개의 밸브에 인가한 압력은 16 kPa이다. 사진으로 예측하여 약 4200개의 세포가 농축된 것으로 예측된다.

본 연구에서 제안한 구조를 활용하여 성공적으로 세포를 농축할 수 있었다.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

10: 유체 및 공압공급 층(pneumatic supply layer)
12: 유입구(Inlet port) 14: 유체 배출구(Of)
15: 세포 배출구(Oc)
16, 17, 18: 공압 연결구(Pneumatic port)
20: 밸브막 층(Valve diaphragm layer)
30: 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer)
32: 미세유체 채널 34: 상호연결 채널
40: 추가적인 밀봉 층(Additional sealing layer)
50: 거름 밸브(Sieve Valve)(Vs)(50)
54: 세포 포집 밸브(Vc)
56: 유체 제어 밸브(Vf)

Claims

세포가 포함된 유체가 주입되는 유입구(Inlet port);
상기 유입구와 연결되어 세포가 포함된 유체(Qfc)가 유입되는 상부 미세유체 채널(Microfludic channel)과, 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널과 농축과정에서 세포가 걸러진 유체(Qf)가 흐르는 유체 채널로 구분되어 이루어지는 상호연결 채널(interconnection channel)을 포함하는 미세유체 채널;
상기 미세유체 채널을 흐르는 세포의 농축, 유체 또는 세포의 흐름을 제어하기 위한 복수개의 공압 밸브;
상기 공압 밸브를 구동하기 위해 각각의 공압 밸브에 연결되는 공압 연결구(Pneumatic port); 및
상기 공압 밸브를 통과하면서 농축된 세포와 유체를 분리하여 배출하도록 오직 유체만 배출하는 유체 배출구(Of)와, 농축된 세포가 포함된 유체를 배출하는 세포 배출구(Oc)를 포함하는 배출구(Outlet port);
를 포함하며,
상기 상부 미세유체 채널의 하단부에는 오직 유체만 통과할 수 있는 직각 형태의 내장형 채널이 일체로 형성되는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
청구항 1에 있어서,
상기 공압 밸브는 상기 미세유체 채널을 제어하는 소자로써, 작동 유체 내 세포를 걸러내어 농축하는 거름 밸브(Sieve Valve)(Vs);
세포가 농축되는 동안 작동 유체(Qf)를 배출하도록 제어하는 유체 제어 밸브(Vf); 및
세포 농축액(Qc)를 얻도록 제어하는 세포 포집 밸브(Vc);
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
청구항 2에 있어서,
상기 거름 밸브는 외부 압축 공기를 인가 받아 변형이 가능한 밸브막 (Valve diaphragm);
반구형 유체 챔버(Dome-shape fluid chamber); 및
상기 반구형 유체 챔버의 하단부에 형성되어 상호연결 채널(interconnection channel)과 연결하기 위한 홀을 포함하는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
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청구항 1에 있어서,
상기 상부 미세유체 채널은 상기 내장형 채널을 통하여 유체가 배출되면서 세포들이 농축되도록 적어도 2번 이상의 굴곡부가 형성된 유선형 형상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
청구항 1에 있어서,
세포 농축기는 다층 구조를 가지며,
상기 유입구, 배출구 및 공압 연결구가 형성되어 외부 유체 연결 및 공압 연결을 위한 유체 및 공압공급 층(pneumatic supply layer);
상기 공압 밸브의 밸브막 형성을 위한 밸브막 층(Valve diaphragm layer);
상기 미세유체 채널이 형성되는 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층(3-dimensional channel network layer); 및
상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층의 하부에 구비되는 추가적인 밀봉 층(Additional sealing layer);
을 포함하는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
청구항 7에 있어서,
상기 3차원 미세 유체 채널 네트워크 층은 세포가 포함된 유체의 주입 및 배출을 위한 미세유체 채널이 형성되는 상부층과,
상기 공압 밸브 간에 상호연결(interconnection) 구조를 형성하기 위한 상호연결 채널이 형성되는 하부층으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기.
세포가 포함된 유체가 유입구(inlet port)를 통하여 유입되는 단계;
밸브막(Valve diaphragm)이 구비된 거름 밸브에 외부 압축 공기(Compressed air)를 인가하면, 상기 밸브막(Valve diaphragm)이 변형하게 되어 미세유체 채널과 반구형 유체 챔버가 연결되는 경사면에 형성된 유체 채널의 출구면이 좁아지면서 세포는 차단되고, 유체는 배출될 수 있는 면(Sieve surface)이 생성되는 단계;
오직 유체만 흘려보내는 유체 제어 밸브(Vf)를 OFF하고, 세포 농축액(Qc)를 얻도록 농축된 세포가 포함된 유체가 흘러가는 통로를 제어하는 세포 포집 밸브(Vc)를 ON으로 각각 제어함으로써, 세포를 농축하는 단계; 및
상기 거름 밸브(Vs)에 인가되었던 외부 압축공기를 해제(OFF)하고, 동시에 농축된 세포(Qc)가 흐르는 채널을 개방 및 유체(Qf)의 채널을 차단하기 위하여 세포 포집 밸브(Vc)를 OFF, 유체 제어 밸브(Vf)를 ON으로 제어함으로써, 농축된 세포를 외부로 배출하는 단계;
를 포함하며,
세포가 농축되는 동안에 내장형 채널(Embedded Channel)을 통하여 유체를 배출함으로써, 세포가 변형되어 채널을 막는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기를 이용한 세포 농축방법.
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청구항 9에 있어서,
세포의 크기에 따라 거름 밸브(Vs)에 인가하는 압력을 제어함으로써, 밸브막의 변형을 통제하고, 다양한 크기의 세포를 농축하는 것을 특징으로 하는 공압 구동 방식의 세포 농축기를 이용한 세포 농축방법.
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