CN108587860A - 用于筛查乳腺癌细胞的微流控芯片组合装置及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于筛查乳腺癌细胞的微流控芯片组合装置及其制备方法和应用，该组合装置由微流控芯片、抽气真空泵、注射样品泵及芯片装置盒组成。微流控芯片由芯片盖膜、芯片主板、芯片底板组成，其中，芯片主板主要包括加样柱状池、第一微流体通道、芯片表面修饰池组、芯片抗体反应池组、混匀圆形池、第二微流体通道、检测圆形池、第三微流体通道、废液圆形池、出样柱状池。这些设计有助于通过上皮细胞黏附因子将乳腺癌细胞快速、高效、可控地黏附于检测圆形池，达到筛查乳腺癌细胞的最终目的。本发明针对乳腺癌细胞具有筛查时间短、操作可控化、价格便宜、检测自动化等积极优势，以此将为我国乳腺癌的初级筛查和疾病预防奠定坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片组合装置及其制备方法和应用，特别涉及一种用 于筛查乳腺癌细胞的微流控芯片组合装置及其制备方法和应用。本发明属于医药 技术领域。
背景技术
乳腺癌(Breast cancer)是我们国家女性常见的上皮细胞恶性肿瘤之一，其 发病率、患病率、致残率、死亡率逐年增加，将严重危害我们国家女性的健康且 已经成为全球高度关注的研究热点疾病(宋小萍.乳腺癌三维缺氧模型的构建及 其EMT机制的初步探讨[D].南方医科大学，2015.)，因此，我们国家需要高度重 视女性乳腺癌的筛查工作。
乳腺癌可以通过临床医务工作者视诊、触诊、叩诊、听诊等方式进行初步的 筛查，且一般选择的时间段为女性月经结束一周后进行系统化、规范化检查，因 为这个时期乳腺不会生理性充血、腺泡不会生理性增生，即在女性月经结束一周 内不会影响检查效果。但是，常规检查往往不能区别出是乳腺纤维增生还是乳腺 癌(莫淼.上海市两项乳腺癌筛查项目的策略及成本效果分析[D].复旦大学， 2013.)，为此需要针对乳腺癌的高度表达蛋白进行初步筛查。
目前，肿瘤学术界广泛认为，乳腺癌微环境是一个复杂的综合调节系统(阎 红琳，袁修学，陈创，等.基于量子点的多分子成像技术在肿瘤微环境研究中的应 用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2017，26(1)：83-89.)，该微环境由乳腺 癌细胞自身、间质细胞、组织液等组成，尤其是乳腺癌多表现为乳腺癌的上皮细 胞黏附因子表达量明显增加，因此，临床医务工作者筛查乳腺癌可以通过检测乳 腺癌的上皮细胞黏附因子来实现。
资料显示，MDA-MB-435细胞株是乳腺癌常见的细胞类型之一，且会出现上 皮细胞黏附因子高表达(Taherian A，Li X，Liu Y，et al.Differences in integrin expressionand signaling within human breast cancer cells[J].BMC Cancer，2011，13 (11)293.)，因此，筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞可以通过检测乳腺癌的上皮 细胞黏附因子来进行。
目前，以往的筛查工作可以使用蛋白质印记、酶联免疫吸附实验进行检测乳 腺癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子，需要经过样品获取、样品稀释、 添加试剂、混匀试剂等多个步骤且同时会出现检测仪器体积庞大、检测价格昂贵、 所耗时间较长、试剂消耗量大、不能自动化检测等客观问题。同时，现有的微流 控芯片多为静电驱动、离心力驱动、泵阀驱动等，这些驱动模式需要借助很多外 在的分析设备(高菊逸.简易型微流控芯片的研制及其在临床诊断中的应用[D]. 南昌大学，2014.)，这会增加乳腺癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子的检 测难度，同时也将会无形中会增加女性乳腺癌筛查的难度，更会增加乳腺癌筛查 所需检测装置的整体占地面积。
为了有效地克服上述的不足，本发明公开了一种用于筛查乳腺癌细胞，特别 是MDA-MB-435细胞的简易型微流控芯片组合装置，这些微流控芯片组合装置 的相关设计有助于通过上皮细胞黏附因子将乳腺癌细胞快速、高效、可控地黏附 于检测圆形池，达到筛查乳腺癌细胞的最终目的，本发明针对乳腺癌细胞具有筛 查时间短、操作可控化、价格便宜、检测自动化、负压驱动装置简单等积极优势， 以此将为我国乳腺癌的初级筛查和疾病预防奠定坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于筛查乳腺癌细胞的简易型微流控芯片组合 装置及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于筛查乳腺癌细胞的简易型微流控芯片组合装置，包括微流 控芯片、抽气真空泵、注射样品泵及芯片装置盒；
其中，所述的微流控芯片位于芯片装置盒内，所述的微流控芯片由芯片盖膜、 芯片主板以及芯片底板组成，芯片盖膜以及芯片底板用于密封芯片主板，且芯片 盖膜的表面有加样柱状池口、出样柱状池口，所述的加样柱状池口、出样柱状池 口分别通过毛细连接管与注射样品泵以及抽气真空泵相连接；
其中，所述的芯片主板包括依次通过毛细管连接的加样柱状池、第一微流体 通道、混匀圆形池、第二微流体通道、检测圆形池、第三微流体通道、废液圆形 池、出样柱状池；加样柱状池的另一端通过毛细连接管与加样柱状池口连接，出 样柱状池的另一端通过毛细连接管与出样柱状池口连接；
其中，在第一微流体通道与混匀圆形池之间设置有芯片表面修饰池组以及芯 片抗体反应池组，所述的芯片表面修饰池组包括4个试剂池：①乙醇溶液试剂 池；②3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池；③乙醇溶液试剂池；以及④N-琥珀酰 亚胺试剂池；所述的芯片抗体反应池组包括6个试剂池：①乙醇溶液试剂池； ②磷酸盐缓冲液试剂池；③链霉亲和素溶液试剂池；④磷酸盐缓冲液试剂池； ⑤生物素标记乳腺癌细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池；以及⑥1w/w％ 牛血清白蛋白溶液试剂池；
其中，在加样柱状池与注射样品泵之间，第一微流体通道与混匀圆形池之间， 出样柱状池与抽气真空泵之间设置有阀门，且所述的芯片表面修饰池组以及芯片 抗体反应池组中各个池也通过阀门进行控制。
其中，优选的，所述的第一微流体通道、第二微流体通道、第三微流体通道 为具有“S”形的微流体通道。
其中，优选的，所述的混匀圆形池内有十字形混匀柱，十字形混匀柱中央是 混匀柱转动针，十字形混匀柱以混匀柱转动针为轴心在液体流动下进行旋转。
其中，优选的，所述的检测圆形池内部底面存在分布大小一致的圆形凹陷， 所述的圆形凹陷直径3μL、深度1μL，检测圆形池的圆形细胞凹陷通过过氧等离 子处理。
其中，优选的，所述的阀门为压力阀门，包括压力阀门控制杆以及压力阀门 控制压头，压力阀门控制压头位于芯片盖膜外侧，压力阀门控制压头通过压力阀 门控制杆进行控制。
其中，优选的，所述的芯片盖膜由聚倍半硅氧烷、二氧化钛混合制备而成， 所述的芯片主板由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷以及石英混合制备而成，所述 的芯片底板由聚倍半硅氧烷、二氧化钛、氧化镍以及石英混合制备而成。
其中，优选的，所述的注射样品泵包括头部、体部、尾部3部分，其中注射 样品泵头部为注射样品泵出口，注射样品泵体部表面有注射样品泵刻度值，注射 样品泵体部内侧有注射样品泵圆塞，且注射样品泵圆塞由弹性乳胶材料制备而 成，注射样品泵圆塞后面连接于注射样品泵圆塞杆，且注射样品泵圆塞杆的末端 是注射样品泵圆塞杆尾，注射样品泵圆塞杆的一侧是注射样品泵圆塞杆齿条，且 注射样品泵圆塞杆齿条与位于注射样品泵尾部的注射样品泵齿轮齿条紧密咬合， 注射样品泵齿轮齿条分布于注射样品泵齿轮表面，注射样品泵齿轮的一侧有圆形 的精密注射样品泵齿轮转动刻度线且每一个注射样品泵齿轮转动刻度线对应10 度，注射样品泵齿轮每转动10度会对应注射样品泵圆塞杆齿条移动1个齿条， 注射样品泵齿轮中央为注射样品泵齿轮圆轴，注射样品泵齿轮圆轴位于注射样品 泵齿轮固定板的一端，注射样品泵齿轮固定板包括注射样品泵齿轮左侧固定板、 注射样品泵齿轮右侧固定板且注射样品泵齿轮圆轴直接穿过注射样品泵齿轮左 侧固定板一端、注射样品泵齿轮右侧固定板一端，注射样品泵齿轮左侧固定板、 注射样品泵齿轮右侧固定板的外侧均有注射样品泵齿轮固定螺母拧紧，且注射样 品泵齿轮固定螺母包括注射样品泵齿轮左侧固定螺母、注射样品泵齿轮右侧固定 螺母，注射样品泵齿轮左侧固定板、注射样品泵齿轮右侧固定板的另一侧均固定 于注射样品泵尾部，注射样品泵齿轮圆轴连接于注射样品泵齿轮转动杆，注射样 品泵齿轮圆轴与注射样品泵齿轮转动杆成90度夹角，注射样品泵齿轮转动杆的 末端连接于注射样品泵齿轮转动杆短柱，注射样品泵齿轮转动杆与注射样品泵齿 轮转动杆短柱之间呈现90度夹角。
其中，优选的，所述的抽气真空泵包括头部、体部、尾部3部分，其中抽气 真空泵头部为抽气真空泵出口，抽气真空泵内侧有抽气真空泵圆塞，抽气真空泵 圆塞后面连接于抽气真空泵圆塞杆且其末端是抽气真空泵圆塞杆尾，抽气真空泵 圆塞杆的一侧是抽气真空泵圆塞杆齿条且其与位于抽气真空泵尾部的抽气真空 泵齿轮齿条紧密咬合，抽气真空泵齿轮齿条分布于抽气真空泵齿轮表面，抽气真 空泵齿轮中央为抽气真空泵齿轮圆轴，抽气真空泵齿轮圆轴位于抽气真空泵齿轮 固定板的一端，抽气真空泵齿轮固定板包括抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真 空泵齿轮右侧固定板且抽气真空泵齿轮圆轴直接穿过抽气真空泵齿轮左侧固定 板一端、抽气真空泵齿轮右侧固定板一端，抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真 空泵齿轮右侧固定板的外侧均有抽气真空泵齿轮固定螺母拧紧，且抽气真空泵齿 轮固定螺母包括抽气真空泵齿轮左侧固定螺母、抽气真空泵齿轮右侧固定螺母， 抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真空泵齿轮右侧固定板的另一侧均固定于抽气 真空泵尾部，抽气真空泵齿轮圆轴连接于抽气真空泵齿轮转动杆，且抽气真空泵 齿轮圆轴与抽气真空泵齿轮转动杆成90度夹角，抽气真空泵齿轮转动杆的末端 连接于抽气真空泵齿轮转动杆短柱，同时，抽气真空泵齿轮转动杆与抽气真空泵 齿轮转动杆短柱之间呈现90度夹角。
其中，优选的，所述的乳腺癌细胞为MDA-MB-435细胞。
进一步的，本发明还提出了所述的微流控芯片组合装置在制备筛查乳腺癌细 胞的仪器或设备中的用途，优选的，所述的乳腺癌细胞为MDA-MB-435细胞。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种用于筛查乳腺癌细胞的简易型微流控芯片组合装置，该微 流控芯片组合装置主要由微流控芯片、抽气真空泵、注射样品泵及芯片装置盒组 成，将可对乳腺癌细胞进行自动化筛查并可提高筛查质量、效率。
其中，优选的，微流控芯片由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、二氧化钛、 氧化镍、石英等材料制备，其长度42mm、宽度35mm、厚度8mm、透光度96％， 其放置于微流控分析仪器的芯片装置盒内，通过凹状锁形固定扣与微流控芯片槽 的凸状锁形固定扣进行紧密咬合，这些设计有利于常规制作、简单安装微流控芯 片，且为后续乳腺癌细胞的检测工作提供便利。
微流控芯片主要包括芯片盖膜、芯片主板、芯片底板3部分且依次分层排开， 其中，芯片盖膜由聚倍半硅氧烷、二氧化钛按照4：1的比例制备而成，芯片盖 膜的表面有加样柱状池口、出样柱状池口，芯片盖膜的加样柱状池口、出样柱状 池口分别与毛细连接管相连接，这些设计将会有利于对微流控芯片快速加入乳腺 癌细胞样品及其回收废液。
微流控芯片的芯片主板由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、石英按照5：2： 1的比例制备而成，芯片主板采用计算机辅助软件设计芯片基本结构图，采用激 光雕刻机为主要加工工具制备而成，这些设计有利于采用先进技术制备微流控芯 片且可减少筛查乳腺癌细胞的误差。
微流控芯片的芯片底板由聚倍半硅氧烷、二氧化钛、氧化镍、石英按照2：1： 1：1的比例制备而成，且芯片底板下方是微流控芯片槽，芯片主板与芯片盖膜、 芯片底板最终将通过210℃高温进行封接，这些设计有利于快速对微流控芯片进 行封装，确保微流控芯片的密封效果，利于后续实验的顺利开展。
微流控芯片的芯片主板是微流控芯片的主体结构，芯片主板包括加样柱状 池、第一微流体通道、芯片表面修饰池组、芯片抗体反应池组、混匀圆形池、第 二微流体通道、检测圆形池、第三微流体通道、废液圆形池、出样柱状池，这些 设计有利于应用微流控芯片对乳腺癌细胞的上皮细胞黏附因子进行表面修饰及 其抗体固定，将有助于提高乳腺癌细胞的检测效率。
加样柱状池位于微流控芯片的前方，其一端连接毛细连接管，另一端连接第 一微流体通道，第一微流体通道后面与混匀圆形池之间设计一个使用微流控分析 仪器可以开启和关闭的压力阀门，该压力阀门的基本结构包括压力阀门控制杆和 压力阀门控制压头，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆和压力阀门控制压 头可以对压力阀门这个开关进行控制，这些设计有利于随时确定是否开始进行乳 腺癌细胞的筛查工作。
第一微流体通道末端的一侧上方设有芯片表面修饰池组，另一侧上方设有芯 片抗体反应池组，第一微流体通道、芯片表面修饰池组、芯片抗体反应池组均与 混匀圆形池之间是并行连接的，这些设计非常有利于样品或试剂分别进入检测圆 形池。
微流控芯片上的芯片表面修饰池组包括4个试剂池：①乙醇溶液试剂池， 控制流速2μL/min，15min；②3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池，控制流速0.5μL/min， 60min；③乙醇溶液试剂池，控制流速3μL/min，10min；④N-琥珀酰亚胺试剂 池，控制流速1μL/min，30min。每个试剂池的容积均为30μL。乙醇溶液试剂池、 3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池、乙醇溶液试剂池、N-琥珀酰亚胺试剂池出口端均 为毛细连接管，每个试剂池均通过毛细连接管与第一微流体通道末端相连，毛细 连接管均分别设计有压力阀门，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆和压力 阀门控制压头可以对压力阀门进行控制且实现乙醇溶液、3-巯丙基三甲氧基硅烷、 乙醇溶液、N-琥珀酰亚胺依次流出，最后均进入混匀圆形池及检测圆形池内，将 检测圆形池内的圆形细胞凹陷进行表面修饰。这些设计有助于对微流控芯片内的检测圆形池进行表面修饰，同时还可以自动化控制表面修饰的基本过程，这将会 提高乳腺癌细胞的筛查效率。
微流控芯片的芯片抗体反应池组包括6个试剂池：①乙醇溶液试剂池，控 制流速2μL/min，15min；②磷酸盐缓冲液试剂池，控制流速3μL/min，10min； ③链霉亲和素溶液试剂池，控制流速0.5μL/min，60min，4℃；④磷酸盐缓冲 液试剂池，控制流速3μL/min，10min；⑤生物素标记乳腺癌MDA-MB-435细胞 的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池，控制流速1μL/min，30min；⑥1w/w％牛 血清白蛋白溶液试剂池，控制流速2μL/min，15min。每个试剂池的容积为30μL。 乙醇溶液试剂池、磷酸盐缓冲液试剂池、链霉亲和素溶液试剂池、磷酸盐缓冲液 试剂池、生物素标记乳腺癌细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池、1w/w％ 牛血清白蛋白溶液试剂池均通过毛细连接管与第一微流体通道末端相连且毛细 连接管均设计有压力阀门，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆和压力阀门 控制压头可以对压力阀门进行控制，将实现乙醇溶液、磷酸盐缓冲液、链霉亲和 素溶液、磷酸盐缓冲液、生物素标记乳腺癌细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液、 1％牛血清白蛋白溶液依次流出，最后均进入混匀圆形池及检测圆形池内，将检测 圆形池内的圆形细胞凹陷进行抗体固定。这些设计有助于对微流控芯片内的检测 圆形池进行抗体固定，所需要抗体固定的蛋白为上皮细胞黏附因子抗体，其将会 与细胞的上皮细胞黏附因子结合，形成抗原抗体复合物，最终有助于筛查乳腺癌 细胞，以提高乳腺癌细胞的富集效率。
混匀圆形池容积为700μL且混匀圆形池内有可以转动的十字形混匀柱，十字 形混匀柱中央是混匀柱转动针，十字形混匀柱会以混匀柱转动针为轴心进行旋 转，十字形混匀柱的转速动力来自于液体自身流动的力量，混匀圆形池的后面是 第二微流体通道，这些设计有助于将所加的样品或试剂分别进行充分混匀，利于 后续实验的开展。
第二微流体通道的后面是检测圆形池且检测圆形池的容积为500μL，即检测 圆形池容积小于混匀圆形池容积，检测圆形池可以通过荧光显微镜观察经过荧光 染色标记的靶点细胞即乳腺癌细胞，检测圆形池内部底面存在分布均匀一致的圆 形细胞凹陷，这些圆形细胞凹陷直径3μL、深度1μL且每一个圆形细胞凹陷均可 以部分容纳1个乳腺癌细胞。这些设计可将细胞固定于检测圆形池的细胞凹陷内， 利于荧光显微镜观察细胞。同时，预先在检测圆形池的圆形细胞凹陷内已经通过 过氧等离子处理，可以使圆形细胞凹陷表面产生大量的羟基，羟基将会攻击3- 巯丙基三甲氧基硅烷，促使3-巯丙基三甲氧基硅烷的正电性的硅与羟基形成共价 键，将会利于微流控芯片的表面修饰过程。
检测圆形池的后面是第三微流体通道，第三微流体通道的后面是废液圆形池 且废液圆形池的容积为1500μL，废液圆形池的后面直接连接出样柱状池，这些 设计有助于回收反应废液。
加样柱状池与出样柱状池结构一样且加样柱状池与出样柱状池的容积均为 10μL。加样柱状池一端与第一微流体通道相连接，另一端连接于毛细连接管且毛 细连接管上有1个压力阀门，该压力阀门的基本结构均包括压力阀门控制杆、压 力阀门控制压头，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆和压力阀门控制压头 可以对压力阀门进行控制且有利于实现压力阀门对注射样品泵内的样品进行控 制，这些设计有助于对加样进行控制，以决定对微流控芯片何时加样。
注射样品泵由氧化镍、石英、聚倍半硅氧烷混匀材料按照2：1：2的比例制 备而成，注射样品泵下方有注射样品泵三角固定支架进行固定，注射样品泵三角 固定支架平放于实验操作平台上。注射样品泵包括头部、体部、尾部3部分，注 射样品泵体部表面有注射样品泵刻度值且其最大值为350μL，这些设计有助于对 微流控芯片进行泵阀式加药且保证加药过程的自动化、可控化、匀速化，以有效 提高乳腺癌细胞的筛查效率。
出样柱状池一端连接于废液圆形池且出样柱状池另一端连接于毛细连接管， 毛细连接管上有1个可以调控的压力阀门，这些设计有助于对微流控芯片控制抽 气，以决定何时对微流控芯片进行抽气并为微流控芯片提供液体流动的动力。
抽气真空泵由二氧化钛、氧化镍按照3：1的比例制备而成，抽气真空泵下 方有抽气真空泵三角固定支架进行固定，抽气真空泵三角固定支架平放于实验操 作平台上。抽气真空泵包括头部、体部、尾部3部分，这些设计有利于对微流控 芯片提供原动力，同时保证抽气过程的自动化、可控化。
最后，本发明微流控芯片组合装置的相关设计，将有助于通过上皮细胞黏附 因子将乳腺癌细胞快速、高效、可控地黏附于检测圆形池圆形细胞凹陷，达到筛 查乳腺癌细胞的最终目的，本发明针对乳腺癌细胞具有筛查时间短、操作可控化、 价格便宜、检测自动化、负压驱动装置简单等积极优势。
附图说明
图1是芯片装置盒的结构示意图；
图2是微流控芯片的结构示意图；
图3是芯片主板的结构示意图；
图4是抽气真空泵的结构示意图；
图5是注射样品泵的结构示意图；
图6是芯片表面修饰池组与芯片抗体反应池组的结构示意图；
图7是混匀圆形池与检测圆形池的结构示意图；
图8是抽气真空泵齿轮侧面与注射样品泵齿轮侧面的结构示意图；
图9是注射样品泵齿轮正面的结构示意图；
图10是压力阀门17、3.6、3.5结构示意图；
图11是压力阀门a、13.7、13.8结构示意图；
图12是压力阀门13.9、3.7、3.8结构示意图；
图13是压力阀门13.12、13.11、13.10结构示意图；
图14是压力阀门10结构示意图；
图15是筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞实验结果；
图16是筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞实验结果。
附图标记说明：
0-微流控芯片、1-加样柱状池、2-第一微流体通道、3-芯片表面修饰池组、13- 芯片抗体反应池组、4-混匀圆形池、4.1-十字形混匀柱、4.2-混匀柱转动针、5-第 二微流体通道、6-检测圆形池、6.1-圆形细胞凹陷7-第三微流体通道、8-废液圆形 池、9-出样柱状池，14-抽气真空泵、14.1-抽气真空泵出口、14.3-抽气真空泵圆塞、 14.4-抽气真空泵圆塞杆、14.5-抽气真空泵圆塞杆齿条、14.6-抽气真空泵齿轮齿条、 14.7-抽气真空泵齿轮、14.8-抽气真空泵齿轮圆轴、14.9-抽气真空泵齿轮固定板、 14.91-抽气真空泵齿轮左侧固定板、14.92-抽气真空泵齿轮右侧固定板、14.10-抽 气真空泵圆塞杆尾、14.131-抽气真空泵齿轮左侧固定螺母、14.132-抽气真空泵齿 轮右侧固定螺母、12，18-快速接头、19-芯片盖膜、20-芯片底板、21-芯片主板、 22-微流控芯片槽、23-微流控芯片盖、24-芯片装置盒、23.1，23.2-凹状锁形固定 扣、22.1，22.2-凸状锁形固定扣、19.1-加样柱状池口、19.2-出样柱状池口、16， 11，3.9，3.10，3.11，3.12，13.13，13.14，13.15，13.16，13.17，13.18-毛细连接管、12，18-快速接头、14.1-抽气真空泵出口、15.1-注射样品泵出口、a、10、17， 3.5，3.6，3.7，3.8，13.7，13.8，13.9，13.10，13.11，13.12-压力阀门、a1，10.1， 17.1，3.51，3.61，3.71，3.81，13.71，13.81，13.91，13.101，13.111，13.121-压 力阀门控制杆、a11，10.11，17.11，3.511，3.611，3.711，3.811，13.711，13.811， 13.911，13.1011，13.1111，13.1211-压力阀门控制压头、3.1-乙醇溶液试剂池、3.2- (3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池)、3.3-乙醇溶液试剂池、3.4-(N-琥珀酰亚胺试 剂池)；15-注射样品泵、15.1-注射样品泵出口，15.2-注射样品泵刻度值，15.3- 注射样品泵圆塞，15.4-注射样品泵圆塞杆，15.5-注射样品泵圆塞杆齿条，15.6- 注射样品泵齿轮齿条，15.7-注射样品泵齿轮、15.8-注射样品泵齿轮圆轴、15.9- 注射样品泵齿轮固定板、15.10-注射样品泵圆塞杆尾，15.11-注射样品泵齿轮转动 杆，15.12-注射样品泵齿轮转动杆短柱、15.14-注射样品泵三角固定支架、15.15-注射样品泵齿轮转动刻度线、15.91-注射样品泵齿轮左侧固定板、15.92-注射样品 泵齿轮右侧固定板、15.131-注射样品泵齿轮左侧固定螺母、15.132-注射样品泵齿 轮右侧固定螺母、25-实验操作平台。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的对骨质疏松症的预防和 治疗作用的优点和特点。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入 本发明的保护范围内。
如图1-14所示的，本发明公开了一种用于筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞的 简易型微流控芯片组合装置，该微流控芯片组合装置主要由微流控芯片0、抽气 真空泵14、注射样品泵15及芯片装置盒24组成。
其中，微流控芯片0由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、二氧化钛、氧化镍、 石英等材料制备而成，且微流控芯片0为长方形立体结构，微流控芯片0长度 42mm、宽度35mm、厚度8mm且微流控芯片0的整体透光度为96％，微流控芯 片0放置于微流控分析仪器的芯片装置盒24内，芯片装置盒24分为微流控芯片 槽22及微流控芯片盖23，芯片装置盒24的微流控芯片盖23通过凹状锁形固定 扣23.1、23.2与微流控芯片槽22的凸状锁形固定扣22.1、22.2分别进行紧密咬 合(图1)。
抽气真空泵14由二氧化钛、氧化镍按照3：1的比例制备而成，抽气真空泵 14下方有抽气真空泵三角固定支架14.14进行固定，抽气真空泵三角固定支架 14.14平放于实验操作平台25上(图4)。
注射样品泵15由氧化镍、石英、聚倍半硅氧烷混匀材料按照2：1：2的比 例制备而成，注射样品泵15下方有注射样品泵三角固定支架15.14进行固定，注 射样品泵三角固定支架15.14平放于实验操作平台25上(图5)。
微流控芯片0包括芯片盖膜19、芯片主板21、芯片底板20，芯片盖膜19、 芯片底板20用于密封芯片主板21，其中微流控芯片0的芯片盖膜19由聚倍半硅 氧烷、二氧化钛按照4：1的比例制备而成，且芯片盖膜19的表面有加样柱状池 口19.1、出样柱状池口19.2，芯片盖膜19的加样柱状池口19.1、出样柱状池口 19.2分别与毛细连接管16、11相连接(图2)。
微流控芯片0的芯片主板21由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷、石英按照5： 2：1的比例制备而成，芯片主板21采用计算机辅助软件设计芯片基本结构图且 采用激光雕刻机为主要加工工具制备而成。
微流控芯片0的芯片底板20由聚倍半硅氧烷、二氧化钛、氧化镍、石英按 照2：1：1：1的比例制备而成，且芯片底板20下方是芯片装置盒24的微流控 芯片槽22，芯片主板21与芯片盖膜19、芯片底板20最终将通过210℃高温进行 封接。
微流控芯片0的芯片主板21是微流控芯片0的主体结构，芯片主板21包括 加样柱状池1、第一微流体通道2、芯片表面修饰池组3、芯片抗体反应池组13、 混匀圆形池4、第二微流体通道5、检测圆形池6、第三微流体通道7、废液圆形 池8、出样柱状池9(图3)。
其中，加样柱状池1位于微流控芯片0的前方，且加样柱状池1为圆柱形结 构，加样柱状池1一端连接毛细连接管16，毛细连接管16的一端连接于加样柱 状池1，另一端是快速接头18，快速接头18连接于注射样品泵15的注射样品泵 出口15.1。加样柱状池1的另一端连接第一微流体通道2，第一微流体通道2一 端连接加样柱状池1，另一端连接混匀圆形池4，毛细连接管16上设计一个使用 微流控分析仪器可以开启和关闭的压力阀门17，该压力阀门17的基本结构均包 括压力阀门控制杆17.1、压力阀门控制压头17.11，压力阀门控制压头17.11位于 芯片盖膜19的外侧，压力阀门控制杆17.1下方是压力阀门控制压头17.11，通过 微流控分析仪器控制压力阀门控制杆17.1和压力阀门控制压头17.11可以对压力 阀门17这个开关进行控制，进而实现对注射样品泵15内的样品进行控制。当压 力阀门控制杆17.1控制压力阀门控制压头17.11向下运动时，使得芯片盖膜19 发生形变，进而挤压下方的毛细连接管16，使得液体无法通过，当压力阀门控制 杆17.1控制压力阀门控制压头17.11向上运动时，芯片盖膜19的形变恢复，下 方的毛细连接管16恢复原有形状，使得液体可以通过。本发明中其余压力阀门 的工作原理均与上述相同。
第一微流体通道2的末端与混匀圆形池4之间设置有芯片表面修饰池组3以 及芯片抗体反应池组13，芯片表面修饰池组3、芯片抗体反应池组13与第一微 流体通道2、混匀圆形池4之间是并行连接的。
微流控芯片0上的芯片表面修饰池组3包括4个试剂池：①乙醇溶液试剂 池3.1，控制流速2μL/min，15min；②3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池3.2，控制流 速0.5μL/min，60min；③乙醇溶液试剂池3.3，控制流速3μL/min，10min；④N- 琥珀酰亚胺试剂池3.4，控制流速1μL/min，30min。每个试剂池的容积均为30μL。 乙醇溶液试剂池3.1、3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池3.2、乙醇溶液试剂池3.3、 N-琥珀酰亚胺试剂池3.4出口端均为毛细连接管3.9、3.10、3.11、3.12，试剂池 分别通过毛细连接管3.9、3.10、3.11、3.12与第一微流体通道2末端相连，毛细 连接管3.9、3.10、3.11、3.12均分别设计有压力阀门3.5、3.6、3.7、3.8，这些位 于毛细连接管上的4个压力阀门的基本结构均包括压力阀门控制杆3.51、3.61、 3.71、3.81、压力阀门控制压头3.511、3.611、3.711、3.811，压力阀门控制杆3.51、 3.61、3.71、3.81，下方是压力阀门控制压头3.511、3.611、3.711、3.811，压力阀 门控制压头3.511、3.611、3.711、3.811通过位于微流控芯片盖23上的压力阀门 控制杆3.51、3.61、3.71、3.81进行控制，通过微流控分析仪器控制压力阀门控 制杆3.51、3.61、3.71、3.81和压力阀门控制压头3.511、3.611、3.711、3.811可 以对压力阀门3.5、3.6、3.7、3.8进行控制，将实现乙醇溶液、3-巯丙基三甲氧基 硅烷、乙醇溶液、N-琥珀酰亚胺依次流出，最后均进入混匀圆形池4及检测圆形 池6内，将检测圆形池6内的圆形细胞凹陷6.1进行表面修饰(图6)。
微流控芯片0的芯片抗体反应池组13包括6个试剂池：①乙醇溶液试剂池 13.1，控制流速2μL/min，15min；②磷酸盐缓冲液试剂池13.2，控制流速3μL/min， 10min；③链霉亲和素溶液试剂池13.3，控制流速0.5μL/min，60min，4℃；④磷 酸盐缓冲液试剂池13.4，控制流速3μL/min，10min；⑤生物素标记乳腺癌 MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池13.5，控制流速1μL/min， 30min；⑥1％牛血清白蛋白溶液试剂池13.6，控制流速2μL/min，15min。每个 试剂池的容积均为30μL。乙醇溶液试剂池13.1、磷酸盐缓冲液试剂池13.2、链 霉亲和素溶液试剂池13.3、磷酸盐缓冲液试剂池13.4、生物素标记乳腺癌 MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池13.5、1w/w％牛血清白蛋 白溶液试剂池13.6分别通过毛细连接管13.13、13.14、13.15、13.16、13.17、13.18 与第一微流体通道2末端相连，且毛细连接管13.13、13.14、13.15、13.16、13.17、13.18均设计有压力阀门13.7、13.8、13.9、13.10、13.11、13.12，这些位于毛细 连接管13.13、13.14、13.15、13.16、13.17、13.18的6个压力阀门13.7、13.8、 13.9、13.10、13.11、13.12基本结构均包括压力阀门控制杆13.71、13.81、13.91、 13.101、13.111、13.121、压力阀门控制压头13.711、13.811、13.911、13.1011、 13.1111、13.1211，压力阀门控制杆13.71、13.81、13.91、13.101、13.111、13.121， 下方是压力阀门控制压头13.711、13.811、13.911、13.1011、13.1111、13.1211， 压力阀门控制压头13.711、13.811、13.911、13.1011、13.1111、13.1211通过微流控芯片盖23上的压力阀门控制杆13.71、13.81、13.91、13.101、13.111、13.121 进行控制，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆13.71、13.81、13.91、13.101、 13.111、13.121和压力阀门控制压头13.711、13.811、13.911、13.1011、13.1111、 13.1211可以对压力阀门13.7、13.8、13.9、13.10、13.11、13.12进行控制，将实 现乙醇溶液、磷酸盐缓冲液、链霉亲和素溶液、磷酸盐缓冲液、生物素标记乳腺 癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液、1％牛血清白蛋白溶液依次 流出，最后均进入混匀圆形池4及检测圆形池6内，将检测圆形池6内的圆形细 胞凹陷6.1进行抗体固定(图6，图7，图10-13)。
混匀圆形池4容积为700μL，且混匀圆形池4内有可以转动的十字形混匀柱 4.1，十字形混匀柱4.1中央是混匀柱转动针4.2，十字形混匀柱4.1会以混匀柱转 动针4.2为轴心进行旋转，十字形混匀柱4.1的转速动力来自于液体自身流动的 力量，混匀圆形池4的后面是第二微流体通道5(图7)。
第二微流体通道5的后面是检测圆形池6且检测圆形池6的容积为500μL， 即检测圆形池6容积小于混匀圆形池4容积，检测圆形池6可以通过荧光显微镜 观察经过荧光染色标记的靶点细胞即乳腺癌MDA-MB-435细胞，检测圆形池6 内部底面存在分布均匀一致的圆形细胞凹陷6.1，这些圆形细胞凹陷6.1直径3μL、 深度1μL且每一个圆形细胞凹陷6.1均可以部分容纳1个乳腺癌细胞。检测圆形 池6的圆形细胞凹陷6.1均通过过氧等离子处理，可以使圆形细胞凹陷6.1表面 产生大量的羟基，羟基将会攻击3-巯丙基三甲氧基硅烷，促使3-巯丙基三甲氧基 硅烷的正电性的硅与羟基形成共价键，将会利于微流控芯片的表面修饰过程。
检测圆形池6后面是第三微流体通道7，第三微流体通道7的后面是废液圆 形池8，且废液圆形池8的容积为1500μL，废液圆形池8后面直接连接出样柱状 池9。
第一微流体通道2、第二微流体通道5、第三微流体通道7的结构一样(“S” 形)，且第一微流体通道2、第二微流体通道5、第三微流体通道7的深度均为 50μm、宽度均为60μm，混匀圆形池4、检测圆形池6、废液圆形池8的容积依次 为700μL、500μL、1500μL，加样柱状池1与出样柱状池9结构一样，加样柱状 池1与出样柱状池9的容积均为10μL。
注射样品泵15包括头部、体部、尾部3部分，其中注射样品泵15头部为注 射样品泵出口15.1，注射样品泵15体部表面有注射样品泵刻度值15.2，且注射 样品泵刻度值15.2最大值为350μL，注射样品泵15体部内侧有注射样品泵圆塞 15.3，注射样品泵圆塞15.3由弹性乳胶材料制备而成，注射样品泵圆塞15.3后面 连接于注射样品泵圆塞杆15.4，注射样品泵圆塞杆15.4的末端是注射样品泵圆塞 杆尾15.10，注射样品泵圆塞杆15.4的一侧是注射样品泵圆塞杆齿条15.5，注射 样品泵圆塞杆齿条15.5与位于注射样品泵15尾部的注射样品泵齿轮齿条15.6紧 密咬合，注射样品泵齿轮齿条15.6分布于注射样品泵齿轮15.7表面，注射样品 泵齿轮15.7的一侧有圆形的精密注射样品泵齿轮转动刻度线15.15且每一个注射 样品泵齿轮转动刻度线15.15对应10度，注射样品泵齿轮15.7每转动10度会对 应注射样品泵圆塞杆齿条15.5移动1个齿条，注射样品泵齿轮15.7中央为注射 样品泵齿轮圆轴15.8，注射样品泵齿轮圆轴15.8位于注射样品泵齿轮固定板15.9 的一端，注射样品泵齿轮固定板15.9包括注射样品泵齿轮左侧固定板15.91、注 射样品泵齿轮右侧固定板15.92且注射样品泵齿轮圆轴15.8直接穿过注射样品泵 齿轮左侧固定板15.91一端、注射样品泵齿轮右侧固定板15.92一端，注射样品 泵齿轮左侧固定板15.91、注射样品泵齿轮右侧固定板15.92的外侧均有注射样品 泵齿轮固定螺母拧紧且注射样品泵齿轮固定螺母包括注射样品泵齿轮左侧固定 螺母15.131、注射样品泵齿轮右侧固定螺母15.132，注射样品泵齿轮左侧固定板 15.91、注射样品泵齿轮右侧固定板15.92的另一侧均固定于注射样品泵15尾部，注射样品泵齿轮圆轴15.8连接于注射样品泵齿轮转动杆15.11，注射样品泵齿轮 圆轴15.8与注射样品泵齿轮转动杆15.11成90度夹角，注射样品泵齿轮转动杆 15.11的末端连接于注射样品泵齿轮转动杆短柱15.12，注射样品泵齿轮转动杆 15.11与注射样品泵齿轮转动杆短柱15.12之间呈现90度夹角(图5，图8-9)。
出样柱状池9一端连接于废液圆形池8且出样柱状池9另一端连接于毛细连 接管11，毛细连接管11上有1个可以调控的压力阀门10，该压力阀门的基本结 构均包括压力阀门控制杆10.1、压力阀门控制压头10.11，压力阀门控制杆10.1 下方是压力阀门控制压头10.11，压力阀门控制压头10.11通过微流控芯片盖23 上的压力阀门控制杆10.1进行控制，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆 10.1和压力阀门控制压头10.11可以对压力阀门10进行控制且实现对抽气真空泵 14内的气体进行控制(图14)。
毛细连接管11的一端连接于出样柱状池9且毛细连接管11的另一端是快速 接头12，快速接头12连接于抽气真空泵14的抽气真空泵出口14.1。
抽气真空泵14包括头部、体部、尾部3部分，其中抽气真空泵14头部为抽 气真空泵出口14.1，抽气真空泵14体部内侧有抽气真空泵圆塞14.3且抽气真空 泵圆塞14.3由弹性乳胶材料制备而成，抽气真空泵圆塞14.3后面连接于抽气真 空泵圆塞杆14.4且抽气真空泵圆塞杆14.4的末端是抽气真空泵圆塞杆尾14.10， 抽气真空泵圆塞杆14.4的一侧是抽气真空泵圆塞杆齿条14.5且抽气真空泵圆塞 杆齿条14.5与位于抽气真空泵14尾部的抽气真空泵齿轮齿条14.6紧密咬合，抽 气真空泵齿轮齿条14.6分布于抽气真空泵齿轮14.7表面，抽气真空泵齿轮14.7 中央为抽气真空泵齿轮圆轴14.8，抽气真空泵齿轮圆轴14.8位于抽气真空泵齿轮 固定板14.9的一端，抽气真空泵齿轮固定板14.9包括抽气真空泵齿轮左侧固定 板14.91、抽气真空泵齿轮右侧固定板14.92且抽气真空泵齿轮圆轴14.8直接穿 过抽气真空泵齿轮左侧固定板14.91一端、抽气真空泵齿轮右侧固定板14.92一 端，抽气真空泵齿轮左侧固定板14.91、抽气真空泵齿轮右侧固定板14.92的外侧 均有抽气真空泵齿轮固定螺母拧紧，抽气真空泵齿轮固定螺母包括抽气真空泵齿 轮左侧固定螺母14.131、抽气真空泵齿轮右侧固定螺母14.132，抽气真空泵齿轮 左侧固定板14.91、抽气真空泵齿轮右侧固定板14.92的另一侧均固定于抽气真空 泵14尾部，抽气真空泵齿轮圆轴14.8连接于抽气真空泵齿轮转动杆14.11且抽 气真空泵齿轮圆轴14.8与抽气真空泵齿轮转动杆14.11成90度夹角，抽气真空 泵齿轮转动杆14.11的末端连接于抽气真空泵齿轮转动杆短柱14.12且抽气真空 泵齿轮转动杆14.11与抽气真空泵齿轮转动杆短柱14.12之间呈现90度夹角(图4，图8)。
使用具体流程如下：
在本发明中，一种用于筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞的简易型微流控芯片 组合装置主要由微流控芯片0、抽气真空泵14、注射样品泵15及芯片装置盒24 组成，微流控芯片0主要包括芯片盖膜19、芯片主板21、芯片底板20且依次分 层排开。其中，芯片主板21采用计算机辅助软件设计芯片基本结构图且采用激 光雕刻机为主要加工工具制备而成，芯片主板21主要包括加样柱状池1、第一微 流体通道2、芯片表面修饰池组3、芯片抗体反应池组13、混匀圆形池4、第二 微流体通道5、检测圆形池6、第三微流体通道7、废液圆形池8、出样柱状池9。 这些设计有助于通过上皮细胞黏附因子将乳腺癌MDA-MB-435细胞快速、高效、可控地黏附于检测圆形池，达到筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞的最终目的。本 发明针对乳腺癌MDA-MB-435细胞具有筛查时间短、操作可控化、价格便宜、 检测自动化等积极优势，以此将为我国乳腺癌的初级筛查和疾病预防奠定坚实的 基础。
本发明最终目的是筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞，主要选择乳腺癌 MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子与简易型微流控芯片组合装置内的上皮 细胞黏附因子抗体高效、快速结合后，可将已经进行荧光染色标记的乳腺癌 MDA-MB-435细胞固定于简易型微流控芯片组合装置内，使用荧光显微镜观察已 经进行荧光染色标记的乳腺癌MDA-MB-435细胞，以此计算乳腺癌 MDA-MB-435细胞的数量，最终可以通过富集率有效地评价乳腺癌MDA-MB-435 细胞的综合筛查水平。
检测方案如下：
(一)筛查乳腺癌MDA-MB-435细胞
1.样品处理
选择乳腺癌MDA-MB-435细胞为研究对象，使用DMEM高糖培养基，在 37℃、5％CO2培养箱内培养乳腺癌MDA-MB-435细胞，平均每2天换液1次， 待乳腺癌MDA-MB-435细胞进入对数生长期后，使用胰蛋白酶消化液进行消化 细胞，收集乳腺癌MDA-MB-435细胞，使用磷酸盐缓冲液洗涤乳腺癌 MDA-MB-435细胞，使用SYBR Green I荧光染料进行荧光染色，荧光染色后使 用磷酸盐缓冲液稀释乳腺癌MDA-MB-435细胞，并配制成1×103/mL的细胞悬液备用。
2.表面修饰
实验人员需要将8个简易型微流控芯片组合装置组装好，同时，启动微流控 分析仪器，通过微流控分析仪器控制压力阀门控制杆17.1和压力阀门控制压头17.11对压力阀门17这个开关进行关闭。通过微流控分析仪器控制压力阀门控制 杆a1和压力阀门控制压头a11对压力阀门a这个开关进行关闭。通过控制压力阀 门控制杆10.1和压力阀门控制压头10.11对压力阀门10这个开关进行开启。微 流控芯片0的动力来源于抽气真空泵14，可通过微流控分析仪器转动抽气真空泵 14的抽气真空泵齿轮转动杆短柱14.12来实现。
实验人员需要使用微流控分析仪器依次开启微流控芯片0上芯片表面修饰池 组3的压力阀门3.5、3.6、3.7、3.8，将会促使芯片表面修饰池组3的试剂池3.1、 3.2、3.3、3.4依次开放，包括：①乙醇溶液试剂池3.1，控制流速2μL/min，15min； ②3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池3.2，控制流速0.5μL/min，60min；③乙醇溶液 试剂池3.3，控制流速3μL/min，10min；④N-琥珀酰亚胺试剂池3.4，控制流速 1μL/min，30min，乙醇溶液、3-巯丙基三甲氧基硅烷、乙醇溶液、N-琥珀酰亚胺 会依次通过混匀圆形池4十字形混匀柱4.1分别混匀，同时保证液体依次分别流 出，进入检测圆形池6的圆形细胞凹陷6.1内，检测圆形池6的圆形细胞凹陷6.1 表面已经产生大量的羟基，羟基将会攻击3-巯丙基三甲氧基硅烷，促使3-巯丙基 三甲氧基硅烷的正电性的硅与羟基形成共价键，将会完成对微流控芯片0上检测 圆形池6的圆形细胞凹陷6.1表面修饰过程，以增加上皮细胞黏附因子抗体的结 合效率。
3.抗体固定
实验人员需要通过微流控分析仪器依次开启微流控芯片0上芯片抗体反应池 组13的压力阀门13.7、13.8、13.9、13.10、13.11、13.12，会促使6个试剂池13.1、 13.2、13.3、13.4、13.5、13.6依次流出液体，包括：①乙醇溶液试剂池13.1， 控制流速2μL/min，15min；②磷酸盐缓冲液试剂池13.2，控制流速3μL/min， 10min；③链霉亲和素溶液试剂池13.3，控制流速0.5μL/min，60min，4℃；④磷 酸盐缓冲液试剂池13.4，控制流速3μL/min，10min；⑤生物素标记乳腺癌 MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池13.5，控制流速1μL/min， 30min；⑥1％牛血清白蛋白溶液试剂池13.6，控制流速2μL/min，15min。这将 会促使乙醇溶液、磷酸盐缓冲液、链霉亲和素溶液、磷酸盐缓冲液、生物素标记 乳腺癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液、1％牛血清白蛋白溶液 依次流出，最后均进入混匀圆形池4及检测圆形池6内，将检测圆形池6内圆形 细胞凹陷6.1已经进行表面修饰的地方进行抗体固定。
4.筛查细胞
实验人员需要通过微流控分析仪器开启微流控芯片0上压力阀门17及压力 阀门a，使用注射样品泵抽取1×103/mL初始浓度(入口细胞浓度)的乳腺癌 MDA-MB-435细胞悬液。通过微流控分析仪器缓慢匀速(1.5μL/min，100min) 转动转动注射样品泵齿轮转动杆短柱15.12来提供动力，乳腺癌MDA-MB-435 细胞悬液将通过注射样品泵15、注射样品泵出口15.1、毛细连接管16、加样柱 状池1、第一微流体通道2、混匀圆形池4、第二微流体通道5、检测圆形池6， 在检测圆形池6的圆形细胞凹陷6.1内，促使乳腺癌MDA-MB-435表面的上皮细 胞黏附因子与检测圆形池6内圆形细胞凹陷6.1上的上皮细胞黏附因子抗体结合， 则已经进行荧光染色的乳腺癌MDA-MB-435就会停留在检测圆形池6的圆形细 胞凹陷6.1内，通过荧光显微镜计算乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液的最终浓度(出 口细胞浓度)。
5.计算筛查率
乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液初始浓度为1×103/mL(入口细胞浓度)，在检 测圆形池6内通过计算的乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液最终浓度(出口细胞浓 度)。计算公式如下：筛查率＝(入口细胞浓度-出口细胞浓度)/入口细胞浓度 ×100％。
6.结果判定
本次实验主要选择8个简易型微流控芯片组合装置开展实验，在注射样品泵 缓慢匀速(1.5μL/min，100min)进样后，入口细胞浓度分别为1×103/mL、1×103/mL、 1×103/mL、1×103/mL、1×103/mL、1×103/mL、1×103/mL、1×103/mL，出口细胞浓 度分别为0.1215×103/mL、0.0813×103/mL、0.1128×103/mL、0.1345×103/mL、 0.0867×103/mL、0.0953×103/mL、0.1024×103/mL、0.0616×103/mL，计算后筛查率 分别为87.85％、91.87％、88.72％、86.55％、91.33％、90.47％、89.76％、93.84％， 取得平均值，最终获得乳腺癌MDA-MB-435细胞的筛查率为(90.05±2.34)％(见 图15)。
综上所述，本发明专利简易型微流控芯片组合装置对乳腺癌MDA-MB-435 细胞进行检测，最终获得乳腺癌MDA-MB-435细胞的筛查率为(90.05±2.34)％。
(二)筛查模拟肿瘤患者外周血乳腺癌MDA-MB-435细胞
1.样品处理
本实验选择经过黑龙江中医药大学体检正常健康人群为研究对象，采血后经 过EDTA抗凝处理，获得正常健康血液样本。
乳腺癌MDA-MB-435细胞使用DMEM高糖培养基，在37℃、5％CO2培养 箱内培养乳腺癌MDA-MB-435细胞，每2天换液1次，待乳腺癌MDA-MB-435 细胞进入对数生长期后，使用胰蛋白酶消化液进行消化细胞，收集乳腺癌 MDA-MB-435细胞，使用磷酸盐缓冲液洗涤乳腺癌MDA-MB-435细胞，使用 SYBR Green I荧光染料进行荧光染色，荧光染色后使用磷酸盐缓冲液稀释乳腺癌 MDA-MB-435细胞。
将荧光染色的乳腺癌MDA-MB-435细胞与正常健康血液样本混匀，获得 1×102/mL的模拟肿瘤患者外周血乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液备用。
2.表面修饰
实验人员需要将8个简易型微流控芯片组合装置组装好，同时，启动微流控 分析仪器，关闭压力阀门17与压力阀门a，开启压力阀门10。通过微流控分析 仪器转动抽气真空泵14的抽气真空泵齿轮转动杆短柱14.12来提供动力。
通过微流控分析仪器依次开启微流控芯片0上芯片表面修饰池组3的压力阀 门3.5、3.6、3.7、3.8，促使芯片表面修饰池组3的试剂池(3.1、3.2、3.3、3.4) 分别开放，包括：①乙醇溶液试剂池3.1，控制流速2μL/min，15min；②3-巯丙 基三甲氧基硅烷试剂池3.2，控制流速0.5μL/min，60min；③乙醇溶液试剂池3.3， 控制流速3μL/min，10min；④N-琥珀酰亚胺试剂池3.4，控制流速1μL/min，30min， 将会依次开放，液体会通过混匀圆形池4十字形混匀柱4.1后分别混匀，促使乙 醇溶液、3-巯丙基三甲氧基硅烷、乙醇溶液、N-琥珀酰亚胺依次流出，进入检测 圆形池6的圆形细胞凹陷6.1内，将会完成对微流控芯片0上检测圆形池6的圆 形细胞凹陷6.1表面修饰过程，以增加上皮细胞黏附因子抗体的结合效率。
3.抗体固定
通过微流控分析仪器依次开启微流控芯片0上芯片抗体反应池组13的压力 阀门13.7、13.8、13.9、13.10、13.11、13.12，会促使6个试剂池(13.1、13.2、 13.3、13.4、13.5、13.6)依次流出液体，包括：①乙醇溶液试剂池13.1，控制 流速2μL/min，15min；②磷酸盐缓冲液试剂池13.2，控制流速3μL/min，10min； ③链霉亲和素溶液试剂池13.3，控制流速0.5μL/min，60min，4℃；④磷酸盐 缓冲液试剂池13.4，控制流速3μL/min，10min；⑤生物素标记乳腺癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池13.5，控制流速1μL/min，30min；⑥1％牛血清白蛋白溶液试剂池13.6，控制流速2μL/min，15min。将会 促使乙醇溶液、磷酸盐缓冲液、链霉亲和素溶液、磷酸盐缓冲液、生物素标记乳 腺癌MDA-MB-435细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液、1％牛血清白蛋白溶液依 次流出，最后均进入混匀圆形池4及检测圆形池6内，将检测圆形池6内的圆形 细胞凹陷6.1进行抗体固定。
4.筛查细胞
通过微流控分析仪器开启微流控芯片0上压力阀门17及压力阀门a。使用注 射样品泵抽取1×102/mL初始浓度(入口细胞浓度)的乳腺癌MDA-MB-435细胞 悬液。通过微流控分析仪器缓慢匀速(1.5μL/min，100min)转动转动注射样品泵 齿轮转动杆短柱15.12来提供动力，乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液将通过注射样 品泵15、注射样品泵出口15.1、毛细连接管16、加样柱状池1、第一微流体通道 2、混匀圆形池4、第二微流体通道5、检测圆形池6，在检测圆形池6的圆形细 胞凹陷6.1内.通过荧光显微镜计算乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液的最终浓度(出 口细胞浓度)。
5.计算筛查率
乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液初始浓度为1×102/mL(入口细胞浓度)，在检 测圆形池6内通过计算的乳腺癌MDA-MB-435细胞悬液最终浓度(出口细胞浓 度)。计算公式如下：筛查率＝(入口细胞浓度-出口细胞浓度)/入口细胞浓度 ×100％。
6.结果判定
本次实验主要选择8个简易型微流控芯片组合装置开展实验，在注射样品泵 缓慢匀速(1.5μL/min，100min)进样后，入口细胞浓度分别为1×102/mL、1×102/mL、 1×102/mL、1×102/mL、1×102/mL、1×102/mL、1×102/mL、1×102/mL，出口细胞浓 度分别为0.1021×102/mL、0.1423×102/mL、0.0958×102/mL、0.1524×102/mL、 0.0847×102/mL、0.0947×102/mL、0.1198×102/mL、0.1365×102/mL，计算后乳腺癌 MDA-MB-435细胞筛查率分别为89.79％、85.77％、90.42％、84.76％、91.53％、 90.53％、88.02％、86.35％，取得平均值，最终获得乳腺癌MDA-MB-435细胞的 筛查率为(88.40±2.53)％。(见图16)
综上所述，本发明专利简易型微流控芯片组合装置对模拟肿瘤患者外周血乳 腺癌MDA-MB-435细胞进行检测，最终获得模拟肿瘤患者外周血乳腺癌 MDA-MB-435细胞的筛查率为(88.40±2.53)％。
(三)对比分析
本实验采用SPSS19.0软件分析实验数据，实验数据用x±s表示，P<0.05表 示差异有统计学意义。需要将乳腺癌MDA-MB-435细胞的筛查率为 (90.05±2.34)％与模拟肿瘤患者外周血乳腺癌MDA-MB-435细胞的筛查率为 (88.40±2.53)％进行分析，经过统计分析后，经过正态性检验分析可见，数据呈 现正态性分布，之后两组之间进行比较，可见P＝0.196889，P＞0.05，表明乳腺 癌MDA-MB-435细胞的筛查率与模拟肿瘤患者外周血乳腺癌MDA-MB-435细胞 的筛查率无明显差异，提示，本发明专利不会受到血液红细胞、白细胞、血小板 及血清蛋白的干扰，适合于乳腺癌MDA-MB-435细胞的初级筛查。
Claims (10)
1.一种用于筛查乳腺癌细胞的简易型微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的该微流控芯片组合装置包括微流控芯片、抽气真空泵、注射样品泵及芯片装置盒；
其中，所述的微流控芯片位于所述的芯片装置盒内，所述的微流控芯片由芯片盖膜、芯片主板以及芯片底板组成，芯片盖膜以及芯片底板用于密封芯片主板，且芯片盖膜的表面有加样柱状池口、出样柱状池口，所述的加样柱状池口、出样柱状池口分别通过毛细连接管与注射样品泵以及抽气真空泵相连接；
其中，所述的芯片主板包括依次通过毛细连接管连接的加样柱状池、第一微流体通道、混匀圆形池、第二微流体通道、检测圆形池、第三微流体通道、废液圆形池、出样柱状池；加样柱状池的另一端通过毛细连接管与加样柱状池口连接，出样柱状池的另一端通过毛细连接管与出样柱状池口连接；
其中，在第一微流体通道与混匀圆形池之间设置有芯片表面修饰池组以及芯片抗体反应池组，所述的芯片表面修饰池组包括4个试剂池：①乙醇溶液试剂池；②3-巯丙基三甲氧基硅烷试剂池；③乙醇溶液试剂池；以及④N-琥珀酰亚胺试剂池；所述的芯片抗体反应池组包括6个试剂池：①乙醇溶液试剂池；②磷酸盐缓冲液试剂池；③链霉亲和素溶液试剂池；④磷酸盐缓冲液试剂池；⑤生物素标记乳腺癌细胞的上皮细胞黏附因子抗体溶液试剂池；以及⑥1w/w％牛血清白蛋白溶液试剂池；
其中，在加样柱状池与注射样品泵之间，第一微流体通道与混匀圆形池之间，出样柱状池与抽气真空泵之间设置有阀门，且所述的芯片表面修饰池组以及芯片抗体反应池组中各个试剂池也通过阀门进行控制。
2.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的第一微流体通道、第二微流体通道、第三微流体通道为具有“S”形的微流体通道。
3.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的混匀圆形池内有十字形混匀柱，十字形混匀柱中央是混匀柱转动针，十字形混匀柱以混匀柱转动针为轴心在液体流动下进行旋转。
4.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的检测圆形池内部底面存在分布大小一致的圆形凹陷，所述的圆形凹陷直径3μL、深度1μL，检测圆形池的圆形细胞凹陷通过过氧等离子处理。
5.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的阀门为压力阀门，包括压力阀门控制杆以及压力阀门控制压头，压力阀门控制压头位于芯片盖膜外侧，压力阀门控制压头通过压力阀门控制杆进行控制。
6.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的芯片盖膜由聚倍半硅氧烷、二氧化钛混合制备而成，所述的芯片主板由聚二甲基硅氧烷、聚倍半硅氧烷以及石英混合制备而成，所述的芯片底板由聚倍半硅氧烷、二氧化钛、氧化镍以及石英混合制备而成。
7.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的注射样品泵包括头部、体部、尾部3部分，其中注射样品泵头部为注射样品泵出口，注射样品泵体部表面有注射样品泵刻度值，注射样品泵体部内侧有注射样品泵圆塞，且注射样品泵圆塞由弹性乳胶材料制备而成，注射样品泵圆塞后面连接于注射样品泵圆塞杆，且注射样品泵圆塞杆的末端是注射样品泵圆塞杆尾，注射样品泵圆塞杆的一侧是注射样品泵圆塞杆齿条，且注射样品泵圆塞杆齿条与位于注射样品泵尾部的注射样品泵齿轮齿条紧密咬合，注射样品泵齿轮齿条分布于注射样品泵齿轮表面，注射样品泵齿轮的一侧有圆形的精密注射样品泵齿轮转动刻度线且每一个注射样品泵齿轮转动刻度线对应10度，注射样品泵齿轮每转动10度会对应注射样品泵圆塞杆齿条移动1个齿条，注射样品泵齿轮中央为注射样品泵齿轮圆轴，注射样品泵齿轮圆轴位于注射样品泵齿轮固定板的一端，注射样品泵齿轮固定板包括注射样品泵齿轮左侧固定板、注射样品泵齿轮右侧固定板且注射样品泵齿轮圆轴直接穿过注射样品泵齿轮左侧固定板一端、注射样品泵齿轮右侧固定板一端，注射样品泵齿轮左侧固定板、注射样品泵齿轮右侧固定板的外侧均有注射样品泵齿轮固定螺母拧紧，且注射样品泵齿轮固定螺母包括注射样品泵齿轮左侧固定螺母、注射样品泵齿轮右侧固定螺母，注射样品泵齿轮左侧固定板、注射样品泵齿轮右侧固定板的另一侧均固定于注射样品泵尾部，注射样品泵齿轮圆轴连接于注射样品泵齿轮转动杆，注射样品泵齿轮圆轴与注射样品泵齿轮转动杆成90度夹角，注射样品泵齿轮转动杆的末端连接于注射样品泵齿轮转动杆短柱，注射样品泵齿轮转动杆与注射样品泵齿轮转动杆短柱之间呈现90度夹角。
8.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的抽气真空泵包括头部、体部、尾部3部分，其中抽气真空泵头部为抽气真空泵出口，抽气真空泵内侧有抽气真空泵圆塞，抽气真空泵圆塞后面连接于抽气真空泵圆塞杆且其末端是抽气真空泵圆塞杆尾，抽气真空泵圆塞杆的一侧是抽气真空泵圆塞杆齿条且其与位于抽气真空泵尾部的抽气真空泵齿轮齿条紧密咬合，抽气真空泵齿轮齿条分布于抽气真空泵齿轮表面，抽气真空泵齿轮中央为抽气真空泵齿轮圆轴，抽气真空泵齿轮圆轴位于抽气真空泵齿轮固定板的一端，抽气真空泵齿轮固定板包括抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真空泵齿轮右侧固定板且抽气真空泵齿轮圆轴直接穿过抽气真空泵齿轮左侧固定板一端、抽气真空泵齿轮右侧固定板一端，抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真空泵齿轮右侧固定板的外侧均有抽气真空泵齿轮固定螺母拧紧，且抽气真空泵齿轮固定螺母包括抽气真空泵齿轮左侧固定螺母、抽气真空泵齿轮右侧固定螺母，抽气真空泵齿轮左侧固定板、抽气真空泵齿轮右侧固定板的另一侧均固定于抽气真空泵尾部，抽气真空泵齿轮圆轴连接于抽气真空泵齿轮转动杆，且抽气真空泵齿轮圆轴与抽气真空泵齿轮转动杆成90度夹角，抽气真空泵齿轮转动杆的末端连接于抽气真空泵齿轮转动杆短柱，同时，抽气真空泵齿轮转动杆与抽气真空泵齿轮转动杆短柱之间呈现90度夹角。
9.如权利要求1所述的微流控芯片组合装置，其特征在于，所述的乳腺癌细胞为MDA-MB-435细胞。
10.权利要求1-9任一项所述的微流控芯片组合装置在制备筛查乳腺癌细胞的仪器或设备中的用途，优选的，所述的乳腺癌细胞为MDA-MB-435细胞。
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