DE4006974A1 - Verfahren zur detektion von mutationen von nukleinsaeuren - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Detektion von Mutationen von Nukleinsäurefragmenten durch Analyse des durch Hybridisierung des die Mutation aufweisenden Nukleinsäurefragments (Mutante) mit dem diese Mutation nicht aufweisenden Nukleinsäurefragments (Wildtyp) gewonnenen Heteroduplexes, ein Verfahren zur Probenaufbereitung unter Verwendung eines Oligonukleo­ tids sowie dieses Oligonukleotid selbst.

Das Erscheinungsbild der belebten Natur ist auf gene­ tischer Ebene in Form der Nukleinsäuren programmiert, bestehend entweder aus RNA- oder DNA-Kettenmolekülen. Veränderungen der genetischen Information werden als Mutationen bezeichnet und sind die Basis für evolutio­ näre Entwicklungen, für genetisch bedingte Erkrankungen und andere genetisch bedingte biologische Eigenschaften eines Virus oder Organismus. Die Mehrzahl der erfolgten Mutationen ist für das System ohne erkennbare Auswir­ kung. Solche Mutationen werden als neutral bezeichnet. Seit Einführung gentechnologischer Techniken ist es möglich geworden, eine Mutation zu entdecken, ihre zeitliche Entstehung zu bestimmen und ihren Einfluß auf eine biologische Funktion zu messen.

Mit der Methode der vergleichenden Sequenzanalyse (Se­ quenzierung) von homologen Sequenzen wird eine Mutation erkennbar. Unter dem Begriff Mutation wird ein einzel­ ner Nukleotidaustausch, eine Deletion oder eine Inser­ tion einzelner bis vieler Nukleotide oder eine Umord­ nung von Kettensegmenten verstanden. Die Sequenzanalyse ist trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren nach wie vor eine aufwendige Technik, unterstützt von kostspieligen Apparaturen und für Reihenanalysen unge­ eignet. Lediglich die Suche nach an sich bekannten Mu­ tationen, wie sie für bestimmte Erberkrankungen, zum Beispiel alpha-1-Antitrypsin-Defizienz (Kidd, U.J., Wallace, R.B., Hakura, K. u. Woo, S.L.C. (1983), Nature 304, 230-234) beschrieben sind, hat sich technisch durch die Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden vereinfacht. Eine Anzahl von Fragestellungen entzieht sich jedoch nahezu vollständig dem experimentellen Zu­ griff, wie zum Beispiel die Suche nach unbekannten Mu­ tationen auf langen Gensegmenten, die nicht mit Re­ striktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) verknüpft sind, oder Reihenuntersuchungen, die für die medizi­ nische Genetik, Populationsanalysen, evolutionäre Ver­ wandtschaftsanalysen, Virusvariantenanalysen usw. von Bedeutung sind.

Nukleinsäureketten (RNA und DNA) haben die Fähigkeit, mit sogenannten Komplementärsequenzen Doppelstrangstruk­ turen auszubilden. Es entstehen dabei DNA/DNA, RNA/RNA und DNA/RNA Doppelstrangstrukturen. Eine charakteristi­ sche Eigenschaft dieser Strukturen ist ein temperatur­ abhängiges Denaturieren (Schmelzen) der Doppelstränge. Das Schmelzen geschieht in einem sehr engen Temperatur­ intervall, d. h. es denaturieren große Abschnitte der Doppelstrangstruktur in einem einstufigen Prozeß. Es handelt sich somit um hochkooperativ ablaufende physi­ kalische Reaktionen. Der Verlust der durchgängigen Dop­ pelstrangstruktur äußert sich in einer veränderten Mo­ bilität (meist ein Mobilitätsverlust) der betroffenen Nukleinsäure. Dieser Mobilitätsverlust kann in einem elektrophoretischen Trennverfahren ausgenutzt werden, um Nukleinsäuren verschiedener Schmelztemperaturen zu trennen. So wandern thermodynamisch instabilere Nukle­ insäuren langsamer und somit weniger weit als solche mit stabilen Strukturen. Das zur Trennung verwendete Medium muß dabei einen Denaturierungsgradienten auf­ weisen, beispielsweise durch steigende Konzentration eines denaturierenden Agens. Die Stabilität der inter­ nen Bereiche der Basenpaare ist abhängig vom G/C-Gehalt sowie der Sequenz. Diese Effekte sind ausführlich un­ tersucht worden (Meinkoth, S. u. Wahl, G. (1984), Ana­ lytical Biochem. 138, 267-284).

Führt die Mutation nun zu hinreichend großen Verände­ rungen in dem entsprechenden Bereich, so wird die mu­ tierte Nukleinsäure ein anderes Schmelzverhalten auf­ weisen als die nicht mutierte. Häufig ist eine Mutation nur durch den Austausch eines Basenpaares gegen ein anderes Basenpaar gekennzeichnet (Transversion oder Transition). Daher ist der mutierte Nukleinsäurestrang in sich recht stabil und schmilzt in der Regel bei ähn­ lichen Temperaturen wie die nicht mutierte Form, so daß eine Diskriminierung nicht möglich ist. Solche Mutatio­ nen werden jedoch sichtbar, indem die mutierte Nuklein­ säure mit einer Nukleinsäure, welche diese Mutation nicht aufweist (Wildtyp), in vergleichbaren Konzentra­ tionen gemischt, bis einschließlich der Strangtrennung denaturiert und danach wieder renaturiert wird. Dadurch entstehen alle Kombinationen der entsprechenden Nukle­ insäure-Einzelstränge, unter anderem auch sogenannte Heteroduplices aus mutiertem Einzelstrang und nicht mu­ tiertem Einzelstrang. Da in den Heteroduplices nun dem jeweiligen Nukleotid an der Stelle der Mutation das komplementäre Nukleotid fehlt, kommt es an diesen Po­ sitionen zu merklichen Destabilisierungen in den benach­ barten Doppelhelix-Regionen. Die Heteroduplices werden dementsprechend eher aufschmelzen als die Duplices des Wildtyps oder der Mutante.

Nachteilig an den bislang bestehenden Verfahren sind die relativ umständliche Handhabung sowie die nicht immer sicher zu gewährleistende Aufspürung der vermute­ ten Mutationen. Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist somit die Verbesserung der Auf­ spürung von Mutationen in Nukleinsäuren. Die Verbesse­ rung soll in einer bestimmten Ausführungsform auch eine einfachere und sicherere Probenvorbereitung gewährlei­ sten.

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1. Die Unteransprüche 2 bis 13 sind bevorzugte Ausführungs­ formen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das in den Patentansprüchen 14 bis 18 beanspruchte Oligonukleotid wird vorzugsweise als sogenannter Primer zum Start der polymerase chain reaction (PCR) verwendet (Saiki et al. (1985), Science 230, 1530-1534). Eine besondere Ausge­ staltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in den Patentansprüchen 20 bis 24 beschrieben. Die Patentan­ sprüche 25 bis 32 betreffen die Verwendung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens. Die Ansprüche 32 und 33 betref­ fen bevorzugte Mittel zur Durchführung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens.

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.

Das für die Mutationsanalyse in Frage kommende Nuklein­ säurefragment wird zunächst auf eine passende Größe geschnitten. Dabei wird die Mutation in einen thermo­ dynamisch labilen Bereich gelegt. Dieser Bereich kann entweder experimentell oder auch durch Berechnung er­ mittelt werden. Gegebenenfalls kann das Nukleinsäure­ fragment durch PCR (polymerase chain reaction) amplifi­ ziert werden. Dabei wird vorzugsweise die thermodyna­ misch stabilere Region so stabilisiert, daß sie unter maximal denaturierenden Bedingungen des analytischen Experimentes noch stabil bleibt. Das Nukleinsäurefrag­ ment schmilzt dann nicht bis zur vollständigen Strang­ trennung auf, sondern bildet eine Y-förmige Struktur geringer elektrophoretischer Mobilität aus. Insbesonde­ re kann diese Stabilisierung durch Anfügung einer Re­ gion aus stabilisierenden G/C-Nukleotiden oder ungela­ denen Nukleotiden herbeigeführt werden. Der stabilisie­ rende Einfluß von mehr als 40 G/C-Basenpaaren wurde bereits von Myers, R.M. et al. beschrieben. Überraschen­ derweise hat sich jedoch gezeigt, daß bereits 20 bis 30 G/C-Basenpaare zur Stabilisierung ausreichend sind, insbesondere wenn als Analysetechnik die Temperaturgra­ dienten-Gelelektrophorese, wie in der deutschen Patent­ anmeldung P 39 27 467.5 vorgeschlagen, verwendet wird. Auch die Methode der DE-OS 36 22 591 kann Verwendung finden.

Will man bestimmte Nukleinsäurefragmente durch Amplifi­ zierungsreaktionen wie der sogenannten PCR (polymerase chain reaction) vervielfältigen, werden dazu Oligo­ nukleotide als sogenannte Primer verwendet. Diese Pri­ mer werden so gewählt, daß sie in der Lage sind, mit einem Teil der zu untersuchenden Nukleinsäure zu hybri­ disieren. Vorteilhafterweise sollen die Sonden mit den endständigen Regionen dieser zu untersuchenden Nuklein­ säuren hybridisieren. Des weiteren ist es wünschens­ wert, die Primer mit Restriktionsschnittstellen zu ver­ sehen, um die amplifizierten Segmente in Vektoren ein­ bauen zu können. In einer weiteren bevorzugten Ausfüh­ rungsform weisen die Primer endständig chemische Grup­ pen auf, die als Affinitätsliganden dienen können. In Abb. 1 ist ein besonders bevorzugtes Oligonukleo­ tid schematisch dargestellt, welches als Primer in ei­ ner PCR Verwendung finden kann. Der Primer Hnp1 besteht aus einer hybridisierenden Sequenz 1, welche etwa 18 bis 25 Nukleotide aufweist. Zum freien Ende schließt sich eine G/C-Box aus vorzugsweise 20 bis 30 Nukleoti­ den an, gefolgt von einer Restriktionsschnittstelle sowie einer oder mehreren chemischen Gruppen, die als Affinitätsliganden dienen können. Der Primer p2 besteht ebenfalls aus einer hybridisierenden Sequenz 2, einer A/T-reichen Box mit 0 bis 20 Nukleotiden Länge und ei­ ner Restriktionsschnittstelle R2. Im Falle der Mutan­ tenanalyse innerhalb hochpolymorpher Regionen ist es empfehlenswert, die Größe der Regionen C, D (Abb. 1) so klein wie möglich, im Extremfall auf 0 Nukleotide zu halten, um nur eine polymorphe Position zu erfassen. Dies sei an einem Beispiel der Sondenkonstruktion zum Nachweis der β-Globin Thalassämie "Yugo" (IVS-1-6, T-C) exemplarisch ausgeführt.

Ein wichtiger Typ einer β-Globin Thalassämie ist die Splicing-Mutante (IVS-1-6, T-C) auf dem β-Globin Locus. Diese Mutation verhindert das korrekte Splicing zwi­ schen Exon 1 und Exon 2. Die Umgebung des mutierten Genortes IVS-1-6 ist in Abb. 2 wiedergegeben. Es wird ein Ausschnitt des humanen βgb-Locus 62 200 bis 62 350 (GenBank-Sequenz HUM HBB PREMRNA) mit intron-Mu­ tante IVS-1-6 und den erfindungsgemäß verwendeten Pri­ mern gezeigt.

Abb. 3 zeigt das berechnete Schmelzverhalten die­ ser Nukleinsäure, erhalten unter Anwendung des von Ger­ hard Steger et al. entwickelten Rechenschemas (Steger, G., Po, T., Kaper, J. u. Riesner, D. (1987), Nucleic Acids Res. 15, 5085-5103). Das in Abb. 2 wieder­ gegebene Segment schließt die intron 1-β⁺-Mutation IVS-1-6 ein. Die Numerierung korrespondiert mit der GenBank Sequenz HUM HBB PREMRNA. Die optimale Sonde für denaturierende Gele basiert auf dem amplifizierten Seg­ ment 62233-62340. Der Primer 1a* ist mit einem sogenann­ ten G/C-Schwanz konstruiert. BamH1- und EcoR1-Restrik­ tionsschnittstellen wurden zur Integration in den Vek­ tor pBR322 gewählt. Die Berechnungen für die verschie­ denen DNA-Denaturierungszustände von β-Globin-Segmenten bei verschiedenen Temperaturen für 1 M NaCl sind gra­ phisch dargestellt. Das in Abb. 3 dargestellte Schmelzdiagramm ist wie folgt zu verstehen: Auf der Abszisse ist die Position der Nukleinsäuren angegeben, während die Ordinate die Wahrscheinlichkeit der Strang­ öffnung repräsentiert, bezogen auf die spezifische Nu­ kleotidposition. Die dritte Achse des dreidimensionalen Diagramms entspricht einer Temperaturachse, wobei zu beachten ist, daß die Schmelztemperaturen ebenfalls abhängig sind von der Ionenstärke des Mediums. Die Wahr­ scheinlichkeit für den geöffneten Zustand eines Basen­ paares ist in Schritten von 0,5°C berechnet. Die drei­ dimensionale Zeichnung illustriert das sequentielle Denaturierungsverhalten verschiedener kooperativ dena­ turierender Regionen. Wie in Abb. 4 dargestellt, erniedrigt ein interner Loop von der Größe eines Basen­ paares bei Position 62302 die Schmelztemperatur der Region mit der geringsten Stabilität.

Die Abb. 5 betrifft die Berechnung der temperatur­ abhängigen Schmelzkurve in integrierter Form (5a) und in der differentiellen Form (5b), wobei das Symbol (+) den Kurvenverlauf des Wildtyp-Homoduplex und (*) den Kurvenverlauf des Heteroduplex (Mv) als A/C-Fehlpaarung bedeuten.

Die Abb. 5a zeigt die theoretisch abgeleitete op­ tische Schmelzkurve des Nukleinsäuredoppelstrangs so­ wohl des Homo- als auch des Heteroduplexes (A/C). Abb. 5b zeigt die erste Ableitung der in Abb. 5a berechneten Schmelzkurve. Es ist erkennbar, daß der Heteroduplex (+++) im Bereich der thermodynamisch labi­ len Region infolge der Mutation deutlich stärker desta­ bilisiert ist als der Homoduplex (***) aufgrund des in sogenannten Mismatches hervorgehobenen internen Loops. In diesem Fall beträgt die Schmelzpunkterniedrigung dieser thermodynamisch instabilen Region etwa 4°C ge­ genüber dem Homoduplex.

Die Abb. 6 zeigt die Analyse des amplifizierten Mutanten-Segments mit Primer 1a*, Primer 1b gemäß Abb. 2 und des amplifizierten Wildtyp-Segments auf der senkrechten Temperaturgradienten-Gelelektrophorese mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60°C. Die äquimolar gemischten Fragmente wurden nach Denaturie­ rung/Renaturierung aufgetragen. Die Heteroduplices (Mv, Vm) und die Homoduplices (Vv, Mm) werden aufgespalten gemäß der schematischen Darstellung. Eine homozygote DNA-Sonde vom Wildtyp wurde PCR-amplifiziert unter Ein­ satz der Primer 1a* wie oben beschrieben. Das Fragment wurde zwischen die BamH1-/EcoR1-Stelle von pBR322 inte­ griert. Eine DNA-Probe der homozygoten Mutante IVS-1-6 wurde amplifiziert mit BamH1 und EcoR1 geschnitten, denaturiert und hybridisiert mit einem klonierten BamH1-/EcoR1-Fragment der Wildtyp gb-Sequenz. Die re­ sultierenden Homoduplices (2) und Heteroduplices (2) sind als vier unterschiedliche Banden repräsentiert. Die Y-förmigen Konformationen wurden stabilisiert durch den Einsatz der G/C-reichen Oligonukleotid-Kette am stabilsten Ende der zu untersuchenden Nukleinsäure (s. Myers, R.M. et al. (1985), Nucleic Acids Res. 13, 3131). Bei Anwendung der parallelen Temperaturgradien­ ten-Gelelektrophorese ergibt sich bei Mutation IVS-1-6 im Probenmaterial das in Abb. 7 dargestellte Bild.

Die Abb. 7 zeigt die Autoradiographie einer Analy­ se verschiedener Patienten-DNAs nach Amplifikation und Test mit dem Wild-Typ Standard (s. Abb. 6, Abb. 2). Die Patienten-DNAs, die die IVS-1-6-Mutation enthalten, weisen eine zweite Bande auf. Da die Test-DNA nur einen markierten Strang enthält, enthalten nur zwei der vier Banden die radioaktive Markierung (s. Einschub in Abb. 7). Der parallele Temperaturgradient verläuft zwi­ schen 25 und 65°C.

Eine besonders einfache und effektive Probenvorberei­ tung für die Analyse der zu untersuchenden Nukleinsäure wird durch die Verwendung eines Primers mit Affinitäts­ gruppen ermöglicht. Als Affinitätsgruppen kommen bei­ spielsweise Histidyl- und Biotinylreste in Frage. Im Fall der Histidylreste kommen zwei bis acht, besonders bevorzugt sechs Histidylreste zum Einsatz. Dieser che­ misch modifizierte Primer wird dann an einen polymeren Träger über entsprechende Affinitätsgruppen fixiert. Im Fall der histidylmodifizierten Primer empfiehlt sich ein an einen polymeren Träger gebundener Chelatkomplex aus zweiwertigen Übergangsmetallionen, wie Kupfer und Nickel, und Nitrilotriessigsäure. Die freien Koordina­ tionsstellen des Übergangsmetallions werden durch zwei Histidylreste besetzt. Da Primer und Histidylreste ko­ valent miteinander verbunden sind, wird auf diese Weise der Primer an die polymere Matrix gebunden. Komplexe sind für rekombinante Proteine (EP-A-02 82 042, EP-A-01 86 069) an NTA-Harze beschrieben worden (EP-A-02 53 303).

Werden beispielsweise Biotinylreste kovalent an den Primer gebunden, empfiehlt sich ein polymerer Trä­ ger, der Avidinmoleküle kovalent gebunden hat.

Als polymere Träger kommen entsprechend modifizierte Membranen oder entsprechend modifizierte Partikel in Frage. Der polymere Träger soll mechanisch hinreichend stabil sein, um bei Operationen auftretende Druckschwan­ kungen aufgrund von Durchfluß unbeschadet zu überste­ hen. Werden nun Nukleinsäuren mit Mutationen unter Ver­ wendung des beschriebenen Primers amplifiziert, so bil­ den sich Doppelstränge aus, welche an einem Ende (Pri­ mer-vermittelt) besagte Affinitätsgruppen tragen. Nach erfolgter hinreichender Amplifizierung bringt man das Reaktionsgemisch mit dem polymeren Träger und daran gebundenen Affinitätsgruppierungen wie Nickelchelaten oder Avidinmolekülen zur Umsetzung. So werden spezi­ fisch die durch den Primer amplifizierten Sequenzen an der Oberfläche des festen Trägers gebunden. Dies kann entweder in einem Batch-Verfahren oder in Form einer Säulenfiltration erfolgen. Durch diese Vorgehensweise werden die unerwünschten Enzyme und Reagenzien, welche zur Amplifikation benötigt werden, einfach und schonend abgetrennt. Die an der Matrix gebundenen amplifizierten Nukleinsäurefragmente können nun in einfacher Weise mit einer markierten Nukleinsäuresonde, die vom Wildtyp abgeleitet ist, inkubiert werden. Durch einen oder meh­ rere Denaturierungs-/Renaturierungszyklen bilden sich Heteroduplices, die nach Elution vom polymeren Träger, etwa durch Variation der Pufferbedingungen oder Aus­ waschen mit einem Kompetitor, der Analyse direkt unter­ zogen werden können. Die so aufgearbeiteten Proben kön­ nen zum Beispiel unmittelbar der Temperatur-Gelelektro­ phorese unterzogen werden.

Die Abb. 8 stellt ein erfindungsgemäßes Schema zur TGGE-gerechten Probenvorbereitung dar. Der Primer Hnp1 trägt einen Oligo-Histidyl-Rest als 5′-gekoppelte Sei­ tenkette und ist somit unter neutralen oder alkalischen Bedingungen an NTA-Liganden tragende Festphasenträger zu binden. Bei diesem Schritt werden kontaminierende Enzyme und Reagenzien entfernt. Nach Zugabe des Nach­ weisreagenzes und eventuell interner Markersubstanzen wird der Denaturierungs-/Renaturierungszyklus durchlau­ fen. Auf diese Weise werden die umrahmten Strukturen Mm und Mv (markierter Homoduplex/markierter Heteroduplex) zur TGGE-Analyse verfügbar. Das heißt, der zweite Strang des Analyten wird in der nachfolgenden TGGE-Analyse nachgewiesen.

Claims (35)

1. Verfahren zur Detektion von Mutationen von Nukleinsäu­ ren durch Analyse des durch Hybridisierung des die Mu­ tation aufweisenden Nukleinsäurefragments (Mutante) mit dem diese Mutation nicht aufweisenden Nukleinsäurefrag­ ment (Wildtyp) gewonnenen Heteroduplexes, wobei das die Mutation tragende, zu untersuchende Nukleinsäurefrag­ ment so gewählt wird, daß die Mutation in einer thermo­ dynamisch instabilen Region des Heteroduplexes liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Auswahl der die Mutation enthaltenden thermodynamisch instabilen Region durch Berechnung erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das zu untersuchende Nukleinsäurefragment so gestaltet wird, daß die Mutation in der thermodynamisch insta­ bilsten Region liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die thermodynamisch stabilere Region des Nukleinsäurefrag­ ments endständig Oligo-G- und/oder -C-Nukleotide trägt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Anzahl der G- und/oder C-Nukleotide 20 bis 30 beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäuren durch Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifiziert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die beiden verwendeten Oligonukleotide in unmittelbarer Nachbarschaft zur nachzuweisenden Mutation an die zu amplifizierende DNA hybridisieren.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zu untersuchenden Heterduplices nach Probenvorbereitung einer Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE) unterzogen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Temperaturgradient senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes ver­ läuft.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Temperaturgradient parallel zur Feldrichtung des elektrischen Feldes ver­ läuft.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Temperaturgradient zeitlich variiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Temperaturgra­ dient von einem höheren Temperaturniveau kathodenseitig des elektrischen Feldes ausgeht, das über dem Schmelz­ punkt der thermodynamisch instabilen Region der Hetero­ duplices liegt, und zeitlich in Richtung zum Niveau des anodenseitig liegenden tieferen Temperaturniveaus regu­ liert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das anodenseitige Temperaturniveau des statischen Temperaturgradienten höher liegt als das Temperaturniveau der Kathodenseite.

14. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das kathodenseitige Temperaturniveau des statischen Temperaturgradienten höher liegt als das Temperaturniveau der Anodenseite.

15. Oligonukleotid mit 5′-terminalen Affinitätsgruppen.

16. Oligonukleotid nach Anspruch 15, wobei als Affinitäts­ gruppe zwei bis acht Histidinreste 5′-terminal gebunden sind.

17. Oligonukleotid nach Anspruch 16, wobei die Anzahl der Histidinreste sechs beträgt.

18. Oligonukleotid nach Anspruch 15, wobei als Affinitäts­ gruppe Biotinylreste 5′-terminal gebunden sind.

19. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 18, ent­ haltend zusätzlich eine Restriktionsschnittstelle und/oder eine G/C-reiche Box und/oder eine A/T-reiche Box und eine mit der zu untersuchenden Nukleinsäurese­ quenz hybridisierende Sequenz.

20. Verwendung des Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 15 bis 19 als Primer in der PCR zur Amplifizierung der zu untersuchenden Nukleinsäuren und/oder in einem Ver­ fahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die die Mutation tragende Nukleinsäure unter Verwendung des Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 15 bis 19 amplifiziert wird, an einem zu den Affinitätsgruppen der Oligonukleotide nach Ansprüchen 15 bis 19 an fester Phase fixierten affinen Material gebunden wird, sodann in Gegenwart gewünschtenfalls markierter, die Mutation nicht aufweisender Nukleinsäure-Einzel- oder -Doppel­ stränge mindestens einem Denaturierungs-/Renaturierungs­ zyklus unterworfen wird, anschließend eluiert und da­ nach dem Trennungsverfahren unterworfen wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das zu der Affinitäts­ gruppe des Oligonukleotids nach Anspruch 15 affine Ma­ terial ein polymerer Träger ist, der ein Chelat aus einem Chelatbildner und einem Übergangsmetallion ent­ hält.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das zu der Affini­ tätsgruppe des Oligonukleotids affine Material ein po­ lymerer Träger ist, der ein Chelat aus über kovalent an den Träger gebundener Nitrilotriessigsäure und Nickel²⁺ enthält.

24. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das zu der Affini­ tätsgruppe des Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 14 bis 18 affine Material ein polymerer Träger ist, der kovalent gebundenes Avidin oder Streptavidin aufweist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei der polymere Träger eine Membran oder ein partikelförmiges Material ist.

26. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25 zur Auffindung und Charakte­ risierung von Mutationen in DNA oder RNA wie Punktmuta­ tionen, Deletionen, Insertionen und Umstellungen der Nukleinsäurekette.

27. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25, wobei das Probenmaterial aus lebendem, totem fossilem und in vivo nicht mehr stoff­ wechselaktivem Gewebe stammt.

28. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25 zur Durchführung genetischer Studien wie forensische Analytik, Aufklärung von Erb­ krankheiten und/oder genetisch charakterisierter Anoma­ lien, Individuenanalytik, Fingerprinting.

29. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25, wobei Feincharakterisierun­ gen von Stammabweichungen in der industriellen Mikro­ biologie, bei medizinisch relevanten Krankheitserregern, den Viren, insbesondere bei den für häufige Mutationen bekannten Viren, Bakterien, Pilzen und Einzellern durchgeführt werden.

30. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25, wobei evolutionäre Entwick­ lungsstudien betrieben werden.

31. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25 zur präparativen Herstellung gefundener Mutanten, wobei eine Mutante als einzelne Bande in der Detektionseinheit aufgespürt wird und di­ rekt oder durch Richtungsänderung der Spannungsgradien­ ten im Rahmen einer Elektroevolution isoliert, direkt PCR-amplifiziert oder direkt sequenziert und/oder klo­ niert wird.

32. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25 zur Bestimmung und Zuordnung von Individuen, wobei genetisch amplifizierte Genseg­ mente, insbesondere solche aus Einzel-Kopie-Regionen des Genoms, mit einem homogenen Standardsegment hybri­ disiert werden oder mit homologen Sequenzen einer auf Identität des zugehörigen Individuums zu prüfenden, analog genetisch amplifizierten DNA hybridisiert wer­ den.

33. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25, bestehend aus einem Gemisch von Reagentien wie einer oder mehrerer markierter Nukleinsäuresonden, einer teilweise oder vollständig homologen Standardnukleinsäure in nicht markierter Form sowie einem Hybridisierungspuffer, der im Temperaturbereich zwischen 0 und 100°C Denaturierung und Renaturierung von Doppelstrangstrukturen erlaubt.

34. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder 21 bis 25, bestehend aus einem Gemisch von mindestens einer markierten Nuklein­ säuresonde, einer teilweise oder vollständig homologen Standardnukleinsäure in nicht markierter Form sowie einem Hybridisierungspuffer, der im Temperaturbereich zwischen 0 und 100°C Denaturierung und Renaturierung von Doppelstrangstrukturen erlaubt.

35. Mittel gemäß Anspruch 34, wobei das Gemisch einen Fest­ phasenträger nach einem der Ansprüche 21 bis 25 ent­ hält, mit dessen Hilfe amplifizierte Segmente direkt dem Reaktionsgemisch entzogen werden können.