CN110452976A - 一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其是一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用，针对现有的尚无可靠的生物标志物可以对糖尿病进行风险预测和早期诊断问题，现提出如下解决方案，包括包括试剂盒和诊断引物，所述试剂盒内部设有芯片，所述芯片包括基因芯片、基因引物和分子标志物，所述诊断引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均设置为RNA分子序列。通过对血栓分子标志物相关项目的检测，不仅有助于进一步了解DM血管损伤的并发症和血栓形成的发病机制,并为使用抗凝抗血小板药物治疗提供了依据，同时检测2型糖尿病患者这些分子,对早期预防或干预血栓形成和血管病变的发生具有重要的临床意义。

Description

一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用。
背景技术
糖尿病是以胰岛素绝对或相对缺乏，而导致的高慢性血葡萄糖(简称血糖)水平为主要特征的代谢紊乱性疾病，是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一，根据国际糖尿病联盟统计，2011年全球糖尿病患者人数已达3.7亿，其中80％在发展中国家，估计到2030年全球将有近5.5亿糖尿病患者。2011年全球共有460万人死于糖尿病，当年糖尿病的全球医疗花费达4650亿美元。其中糖尿病在中国和其他发展中国家中的快速增长，已给这些国家的社会和经济发展带来了沉重负担。糖尿病作为常见病与多发病在我国有逐年上升趋势，临床常见的多为I型和II型糖尿病。
糖尿病最常见的形式是免疫介导的疾病，其中的胰岛素分泌β细胞被自身免疫应答破坏。若干遗传和环境因素都与所述疾病的发病相关，这涉及到特异性靶向胰岛素分泌β细胞的免疫细胞对胰岛的进行性炎性浸润。这种病变在临床发病前(前糖尿病)的一段不确定时间形成并且在患者被诊断患有所述疾病之后继续。
随着人类基因组计划的完成和分子遗传学的发展，基因的研究受到广泛重视，寻找与疾病相关的基因成为当前研究的热点。越来越多的研究证实，基因在糖尿病的发生发展过程中起着重要的调控作用，因此基因与糖尿病发病风险的关系也备受关注。
目前，糖尿病的诊断主要依靠临床检查和各种辅助技术，尽管相比以往来说，医学技术已高度发达，但是临床上尚无可靠的生物标志物可以对糖尿病进行风险预测和早期诊断。
发明内容
本发明提出的一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用，解决了尚无可靠的生物标志物可以对糖尿病进行风险预测和早期诊断问题（解决的问题只能是权1的方案所解决的）。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种用于糖尿病诊断的分子标志物，包括试剂盒和诊断引物，所述试剂盒内部设有芯片，所述芯片包括基因芯片、基因引物和分子标志物，所述诊断引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均设置为RNA分子序列；所述分子标志物设置为述非编码RNA分子标志物，所述非编码RNA分子标志物为has-miR-802 和has-lncRNA-ROIT，所述分子标志物用于阳性对照。
优选的，所述基因芯片包括固相载体和检测探针，所述检测探针固定设置于固相载体表面，所述检测探针设置为寡核苷酸探针。
优选的，所述基因引物设置为针对分子标志物的引物试剂或探针，所述试剂或探针内部设有柠檬酸检验试剂。
优选的，本发明还提供了一种用于糖尿病诊断的应用，具体操作步骤为：
步骤一：需检测病人检测前需空腹6-8h，对病人进行第一次抽血，抽血后喝一定量的葡萄糖试液并计算时间，分别在喝葡萄糖试液后30min、1h和2h分别抽血一次，并将分别抽的血液放置在不同的试管中进行检测；
步骤二：对第一次抽血的试管中添加分离血清，并对其血糖和CRP等物质成分进行检测；
步骤三：对喝糖水后抽血的试管中注入柠檬酸检验试剂，轻轻混匀后通过离心机对试管进行离心加工，并收集上层液，使用基因芯片和诊断引物对其进行检测；
步骤四：将多个检测数据分别记录和对比，并对各组数据进行分析，实现对糖尿病及其血管并发症的诊断、治疗和观察病情均有所帮助。
优选的，所述步骤三中离心机以3000r/min进行离心加工，持续加工15min后收集上层液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：（下面对每个创新点进行分条阐述）
本发明中通过对血栓分子标志物相关项目的检测，不仅有助于进一步了解DM血管损伤的并发症和血栓形成的发病机制,并为使用抗凝抗血小板药物治疗提供了依据，同时检测2型糖尿病患者这些分子,对早期预防或干预血栓形成和血管病变的发生具有重要的临床意义。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一：
一种用于糖尿病诊断的分子标志物，包括试剂盒和诊断引物，其特征在于，所述试剂盒内部设有芯片，所述芯片包括基因芯片、基因引物和分子标志物，所述诊断引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均设置为RNA分子序列；所述分子标志物设置为述非编码RNA分子标志物，所述非编码RNA分子标志物为has-miR-802 和has-lncRNA-ROIT，所述分子标志物用于阳性对照。
所述基因芯片包括固相载体和检测探针，所述检测探针固定设置于固相载体表面，所述检测探针设置为寡核苷酸探针。
所述基因引物设置为针对分子标志物的引物试剂或探针，所述试剂或探针内部设有柠檬酸检验试剂。
一种用于糖尿病诊断的应用，其特征在于，具体操作步骤为：
步骤一：需检测病人检测前需空腹6-8h，对病人进行第一次抽血，抽血后喝一定量的葡萄糖试液并计算时间，分别在喝葡萄糖试液后30min、1h和2h分别抽血一次，并将分别抽的血液放置在不同的试管中进行检测；
步骤二：对第一次抽血的试管中添加分离血清，并对其血糖和CRP等物质成分进行检测；
步骤三：对喝糖水后抽血的试管中注入柠檬酸检验试剂，轻轻混匀后通过离心机对试管进行离心加工，离心机以3000r/min进行离心加工，持续加工15min后收集上层液，使用基因芯片和诊断引物对其进行检测；
步骤四：将多个检测数据分别记录和对比，并对各组数据进行分析，实现对糖尿病及其血管并发症的诊断、治疗和观察病情均有所帮助。
参照实施例一和实施例二所提供的一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用，通过检测血栓分子标志物:
（1）血管内皮的标志物:血管性假血友病因子(vWF)与6-酮-前列腺素Fla(6-K-PGFla)；
（2）血小板激活标志物:血栓烷Br(TXB2)和去氢-血栓烷B2(DH-TXB2)与P选择素；
（3）纤溶标志物: D-二聚体(D-D)与组织纤溶酶原活化素(t-PA)的水平。
实现为患者合并高凝状态的诊断、治疗与预防提供较全面的实验室指标依据,以利早期诊断,早期治疗,防治并发症的发生与发展。
实施例三：
对实施例和实施例二提供的一种用于糖尿病诊断的分子标志物及其应用进行临床检验：
选取正常对照组:30例,男17例,女13例,平均年龄54，6±9，6岁,无感染性疾病、血栓、出血及肝肾疾病史,未使用抗凝剂和避孕药物；
2型DM组:60例,男32例,女28例,平均年龄55，8±9，6岁，诊断符合WHO制定的糖尿病诊断标准,其平均血糖浓度为14，16±5，96mmol/L。其中临床，上无心、脑、肾、眼底血管病变并发症者30例为2型DM无临床并发症组；
临床上有心、脑,肾，眼底某一种或多种血管病变并发症者30例为2型DM有临床并发症组。
检测方法血栓分子标志物:wWF、6-K-PGFla、TXB2、DH-TXB2、P-选择素、D-D、t-PA的测定均采用ELISA法。
具体检测结果如下表：
组别（30） 有并发症 无并发症 正常对照组
wWF（%） 140，45±18，98 128，5±22 99，36±14，82
6-K-PGFla（pg/mL） 4，59±0，25 18，02±6，98 25，38±6，78
TXB<sub>2</sub>（ng/L） 86，48±48，22 69，15±50，84 39，21±18，35
DH-TXB<sub>2</sub>（ng/L） 30，84±10，28 7，26±5，89 4，25±1，23
P-选择素（ng/mL） 48，23±16，22 30，55±12，58 6，33±2，58
D-D（ng/L） 1，22±0，25 1，95±0，35 0，13±0，01
t-PA（ng/mL） 1，82±0，22 2，56±0，44 11，65±3，25
通过对血栓分子标志物相关项目的检测，发现DM患者的vWF、P-选择素、I-PA与正常对照组比变化最大,DH-TXB2与正常的重叠最少,提示wWF和6-K-PCFla可作为血管内皮损伤的特异性标志物，P-选择素和DH-TXB2可作为血小板活化程度的特异性标志物，D-D和I-PA可作为凝血和纤维系统激活的特异性标志物,尤以vWF、DH-TXB2、P-选择素、t-PA最有意义，其不仅有助于进一步了解DM血管损伤的并发症和血栓形成的发病机制,并为使用抗凝抗血小板药物治疗提供了依据。
另：
vWF促进皿小板在内皮下的粘附，起桥联作用,并与因子形成复合物,防止因子的降解。PGI2是内皮细胞花生四稀酸代谢的主要产物，由有功能正常的血管内皮细胞合成,具有强烈的血管扩张作用与抑制血小板激活的作用,PGI2在体内不稳定,半衰期仅1~3分钟,很快转变成无活性的6-K-PGFla,故测定6-K-PGF1a可反映PGI2的水平本结果显示DM病人的vWF较正常对照组明显升高(P<0，01),6-K-PGF1a在并发症组明显下降(P<0，01),而在无并发症组下降不明显(P>0，05),提示DM病人的血管细胞功能紊乱,在有并发症时尤为明显。
t-PA主要由内皮细胞合成,其主要功能是将纤溶酶原裂解,形成具有活性的纤溶酶，降解纤维蛋白原和纤维蛋白,起溶血栓作用。本结果显示DM患者的1-PA活性明显下降(P<0，01),且有并发症组活性下降更为明显,提示DM患者t-PA释放受损可导致血栓性疾病合并症的产生。
D-D是交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下所分解的一种特异的代谢产物,是体内存在继发性纤维蛋白溶解的特异指标,是敏感的纤溶分子标志物之-。国内赵宝珍等也报道2型DM患者的D-D明显高于正常对照组，且有血管病变组高于无血管病变组，本结果也支持这一点。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于糖尿病诊断的分子标志物，包括试剂盒和诊断引物，其特征在于，所述试剂盒内部设有芯片，所述芯片包括基因芯片、基因引物和分子标志物，所述诊断引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物均设置为RNA分子序列；所述分子标志物设置为述非编码RNA分子标志物，所述非编码RNA分子标志物为has-miR-802 和has-lncRNA-ROIT，所述分子标志物用于阳性对照。
2.根据权利要求1所述的一种用于糖尿病诊断的分子标志物，其特征在于，所述基因芯片包括固相载体和检测探针，所述检测探针固定设置于固相载体表面，所述检测探针设置为寡核苷酸探针。
3.根据权利要求1所述的一种用于糖尿病诊断的分子标志物，其特征在于，所述基因引物设置为针对分子标志物的引物试剂或探针，所述试剂或探针内部设有柠檬酸检验试剂。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种用于糖尿病诊断的应用，其特征在于，具体操作步骤为：
步骤一：需检测病人检测前需空腹6-8h，对病人进行第一次抽血，抽血后喝一定量的葡萄糖试液并计算时间，分别在喝葡萄糖试液后30min、1h和2h分别抽血一次，并将分别抽的血液放置在不同的试管中进行检测；
步骤二：对第一次抽血的试管中添加分离血清，并对其血糖和CRP等物质成分进行检测；
步骤三：对喝糖水后抽血的试管中注入柠檬酸检验试剂，轻轻混匀后通过离心机对试管进行离心加工，并收集上层液，使用基因芯片和诊断引物对其进行检测；
步骤四：将多个检测数据分别记录和对比，并对各组数据进行分析，实现对糖尿病及其血管并发症的诊断、治疗和观察病情均有所帮助。
5.根据权利要求4所述的一种用于糖尿病诊断的应用，其特征在于，所述步骤三中离心机以3000r/min进行离心加工，持续加工15min后收集上层液。
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