CN109055538B - 一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒 - Google Patents

一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明提供的外泌体miR‑204‑5p序列及相应引物可以用于制备类风湿关节炎诊断试剂盒，具有很高的灵敏度与特异性，有利于推动我国类风湿性关节炎的早期诊断、预测治疗、监测复发的发展。

Description

一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
类风湿关节炎是一种系统性的自身免疫性疾病，以对称性、侵蚀性滑膜炎为特征，导致骨或软骨的破坏。类风湿关节炎给病人带来巨大的痛苦，使患者生活质量下降，晚期致残率较高，寿命缩短。类风湿关节炎的治疗周期长，易复发，目前尚无有效的预防和根治措施，研究表明对类风湿关节炎进行早期干预能够使病情得到有效的控制。类风湿因子和抗环瓜氨酸肽抗体等传统生化标志物在类风湿性关节炎的诊断中很难兼顾敏感性和特异性，因此开发新型类风湿关节炎标志物有利于疾病早期诊断和预防，进而开展有效的干预，减少类风湿关节炎对机理的危害。
目前大部分类风湿关节炎诊断标志物采用ELISA或电化学发光的方法，检测血清中的类风湿关节炎相关蛋白，主要存在如下问题：1)部分血浆中的类风湿关节炎标志物(如细胞因子)，ELISA无法检测到；2)血浆中游离的类风湿关节炎标志物受保存条件和检测时间影响易降解或变性，都会使检测结果受到影响，产生误差；3)血浆中类风湿关节炎标志物(如类风湿因子，红细胞沉降率)，对类风湿关节炎的诊断敏感性和特异性较低。
外泌体分布于血浆、尿液和乳汁等体液中，包含了miRNA、蛋白质和脂类等物质，参与了细胞通讯、细胞迁移等过程。在类风湿关节炎发生过程中，免疫和滑膜等细胞能够释放外泌体至体液，随着血液循环运输至靶细胞，引起局部或系统性的生理反应。microRNA(miRNA)作为表观遗传修饰的重要组成部分，主要通过与靶基因mRNA分子3’端非翻译区(3’-UTR)特异性结合，抑制靶基因mRNA的翻译或影响其稳定性，最终调控相应靶蛋白的表达。外泌体miRNA在血浆等体液中较为稳定，且可以反映疾病状态的变化，是一种新型的生物标志物，用于疾病早期诊断、治疗和药物反应的评估。目前尚无利用关外泌体miRNA用于类风湿性关节炎诊断。探索类风湿关节炎患者血浆中异常表达的外泌体miRNA，以此作为生物标志物，研制相应的辅助诊断试剂盒，对类风湿关节炎诊断和预防，具有重要的临床意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过人群样本研究，首次发现血浆外泌体miR-204-5p在类风湿关节炎患者中的表达显著下调，同时与类风湿关节炎患者活动度等疾病指标密切相关，血浆外泌体miR-204-5p作为新型标志物对类风湿关节炎患者有很高的诊断价值。
本发明的第一个目的是提供一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物，所述的外泌体miRNA标志物为miR-204-5p。
在本发明的一种实施方式中，所述miR-204-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述miR-204-5p为血浆外泌体miRNA标志物。
本发明的第二个目的是提供所述外泌体miRNA标志物在制备检测类风湿性关节炎的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种类风湿性关节炎诊断用miRNA引物、探针的组合，其特征在于，包括miR-204-5p引物、探针。
在本发明的一种实施方式中，所述miR-204-5p引物包括miR-204-5p的反转录引物、定量PCR正向引物和定量PCR反向引物。
在本发明的一种实施方式中，所述miR-204-5p的反转录引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述miR-204-5p的定量PCR正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述miR-204-5p的定量PCR反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第四个目的是提供一种类风湿性关节炎诊断用的试剂盒，包含对外泌体miRNA标志物miR-204-5p的表达量进行检测的miRNA引物、探针的组合。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包括qPCR扩增检测的组件，所述qPCR扩增检测的组件包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、dd H2O、荧光染料、Taq酶、标准品和对照物。
本发明的第五个目的是提供一种类风湿性关节炎诊断用的芯片，包含对外泌体miRNA标志物miR-204-5p的表达量进行检测的miRNA探针。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用血浆外泌体miR-204-5p，在小样本中便证实可以作为类风湿关节炎生物标志物，与疾病指标存在较好的相关性，具有很高的灵敏度和特异性，miR-204-5p的AUC值分别是0.893，灵敏度和特异性分别是90.0％和85.7％，具有很高的诊断价值，可作为类风湿关节炎诊断的标志物。
(2)本发明通过检测血浆外泌体miRNA，外泌体来不仅可以更好的反应疾病进展，同时有很高的稳定性，不易降解，即使保存很久的样本中外泌体miRNA仍能有效存在，保证了检测结果的稳定性。
附图说明
图1为聚类分析产生的显著差异表达的microRNA(p<0.05，差异不小于2倍)分析结果示意图；
图2为外泌体miR-204-5p在重复组和验证组中的表达水平变化示意图；其中E为重复组：30例类风湿关节炎和30例健康人；F为验证组：56例类风湿关节炎和60例健康人；
图3为外泌体miR-204-5p用于区分56例类风湿关节炎和60例健康人的ROC曲线图；
图4为外泌体miR-204-5p与类风湿关节炎患者疾病活动度的相关性；
图5miR-204-5p在T淋巴细胞中生物学功能；
图6miR-204-5p在滑膜细胞中生物学功能。
具体实施方式
本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。实施例中未说明具体条件的实验，通常按照常规条件如厂商说明书、实验指南或教科书内容的条件。
在对实例描述前，有必要提供一些备注说明：采用不同厂家、不同批次的试剂会造成实验结果的差异，属于正常现象。
在进行小规模实验时，为保证平行实验间的重复性，建议配置试剂后，充分混匀并分装，以保证每次实验试剂的均一性。
样本采集：本发明类风湿关节炎患者及对照样本在取得患者知情同意后，从苏州大学附属第一人民医院共获得三组样本：(1)筛选组样本18例，包含9例确诊为类风湿关节炎患者及9例健康人对照样本，每3例为一组，共计6组。(2)重复组样本60例，其中30例确诊为类风湿关节炎患者和30例健康人对照样本。(3)验证组样本116例，其中56例确诊为类风湿关节炎患者和30例健康人对照样本。血样采集后置于枸橼酸抗凝管中，在4℃下以离心力2500g离心10分钟，吸取上层淡黄色血清之后存储于-80℃冰箱中。
统计方法：统计采用SPSS 18.0(SPSS Inc.,Chicago,USA)软件进行。
实施例1血浆外泌体差异表达microRNA的芯片筛选实验
1、在取得患者知情同意后，从苏州大学附属第一人民医院收集9例确诊为类风湿关节炎患者的外周血样本及9例健康人作为正常对照的外周血样本于枸橼酸钠抗凝管。3人为一组，共计6组。
2、外泌体提取。采用Qiagen公司的exoRNeasy Serum/Plasma试剂盒进行血浆外泌体miRNA的提取，该试剂盒采用离心柱法对外泌体进行提取，分为血浆外泌体的分离和外泌体总RNA的提取两步。首先取1ml血浆，用0.22μm针头过滤器过滤，与等体积的Buffer XBP充分混匀，然后通过离心柱过滤，使外泌体与离心柱充分结合，利用Buffer XWP洗涤，最后通过Buffer XE溶液将外泌体洗脱。向分离的外泌体加入Qiazol和氯仿，离心后收集上层液体转移至新收集管中，加入无水乙醇洗涤。然后将混合液加入RNeasy MinElute回收柱纯化外泌体总RNA。
3、miRNA表达谱构建。对于外泌体miRNA表达谱检测利用miRNA PCR arrays(楚天生物)，该芯片基于qRT-PCR平台，能够同时检测768个miRNA的表达，用U6作为内参。
4、血浆外泌体差异表达miRNA。对预处理后的miRNA表达谱数据进行miRNA差异表达分析。分析主要包括：通过fold-change值(FC)方法比较病例组与对照组的miRNA表达差异；利用t检验计算病例组与对照组间的差异p值。筛选条件为表达差异不小于2倍(FC≥2)或p<0.05。按照上述标准共筛选出14个包含miR-204-5p在内的差异表达的外泌体miRNA(参见图1)。
如图1所示，利用miRNA芯片对筛选组样本中血浆外泌体miRNA进行检测，共筛选出14个差异表达的外泌体miRNA，其中共有7个外泌体miRNA在类风湿性关节炎患者中显著上调，7个外泌体miRNA在类风湿性关节炎患者中显著下调。血浆外泌体miR-204-5p在类风湿关节炎患者中显著下调。
实施例2：血浆外泌体miR-204-5p的RT-PCR实验
1、根据miRNA芯片结果，按以下条件从14个差异表达的miRNA中挑选了9个miRNA进行RT-PCR的验证。具体条件为：(1)该miRNA此前未被报道过已在RA人群中进行RT-PCR验证；(2)该miRNA拥有较高的FC值；(3)该miRNA在芯片中拥有较高的表达水平。所选择的miR-204-5p等miRNA的引物见表1。对类风湿关节炎患者和正常对照的血浆外泌体中候选miRNA的RT-PCR检测，在整个研究中实施严格质控，每个样本连续检测至少三次。
表1miR-204-5p引物序列表
Figure GDA0003160501990000061
2、在取得患者知情同意后，从苏州大学附属第一人民医院收集两个独立批次样本。第一批样本为重复组，包含了30例确诊为类风湿关节炎患者及30例健康常对照样本。第二批样本为验证组，包含了56例确诊为类风湿关节炎患者及60例健康常对照样本。
3、外泌体提取。采用Qiagen公司的exoRNeasy Serum/Plasma试剂盒进行血浆外泌体miRNA的提取，该试剂盒采用离心柱法对外泌体进行提取，分为血浆外泌体的分离和外泌体总RNA的提取两步。
4、使用miRNA反转录试剂盒(楚天生物)按操作手册进行逆转录反应。
(1)配置RT mastermix：1.5ul 10×RT buffer，0.19ul Rnase inhibitor(20U/ul)，0.15uldNTP mix(100mM total)，最后加入Rnase free H2O至7ul。
(2)每7ul RT mastermix中加入5ul RNA(100ng)和3ul stem-loop RT primer混合液(5nM)，混匀后冰上放置5min。
(3)预先将PCR仪降至16℃，将上述反应管转移至PCR仪上，按以下程序进行反转录：16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min；4℃forever。
5、使用SYBR Green MasterMix(楚天生物)进行qPCR反应，仪器使用罗氏实时荧光定量PCR仪Roche light cycler 480II(Roche公司)。
6、数据分析
PCR扩增结果用Ct值表示，即PCR反应中荧光信号达到所设定阈值时的循环数。计算差异表达的miRNAs的ΔCt值，采用RNU6作为内参进行标化，运用相对定量2-ΔΔCt法计算病例与对照组间miRNA的表达差异。组间比较运用t-test比较差异，P<0.05认为具有统计学差异。用MedCalc 15.8软件进行ROC曲线分析，并计算出灵敏度和特异性。
分别在重复组样本中检测血浆外泌体miR-484,miR-92a-3p,miR-532-3p,miR-181c-3p,and miR-204-5p的表达水平；在验证组样本中检测血浆外泌体miR-204-5p的表达水平。如图2所示，血浆外泌体miR-204-5p的表达水平在重复组(E)和验证组(F)中均显著下调。重复组包含60例样本(健康：患者＝30:30)，验证组包含116例样本(健康：患者＝56:60)。*代表P<0.05；**代表P<0.01。
采用ROC曲线图计算血浆外泌体miR-204-5p在诊断类风湿关节炎时工作曲线下面积和诊断的精确性、敏感性，结果如图3所示，缩写:AUC代表曲线下面积，ROC代表工作曲线特性；95％CI代表95％可信区间。结果显示血浆外泌体miR-204-5p在诊断类风湿关节炎时工作曲线下面积可以达到AUC＝0.8937(95％CI:0.816-0.971)。并计算出灵敏度和特异性分别为90.0％和85.71％。血浆外泌体miR-204-5p可作为类风湿关节炎诊断标志物。
实施例3：miR-204-5p的扩增循环数与临床指标分析
选取病人的临床特征如表2所示。利用Pearson相关，对样本血浆外泌体miR-204-5p的扩增循环数(CT值)与临床指标进行分析，得到的结果如表3所示。结果显示：血浆外泌体miR-204-5p扩增循环数与血沉(ESR)，类风湿关节炎活动度(DAS28)，C反应蛋白(CRP)的相关性分别为,0.394，0.336和0.471。而与类风湿性因子(RF)，抗环瓜氨酸肽(CCP)无必然关系。图4纵坐标为血浆外泌体miR-204-5p的扩增循环数(CT值)，横坐标为类风湿患者的疾病活动度，两者相关性为0.336。
表2类风湿关节炎病人临床信息
Figure GDA0003160501990000081
表3血浆外泌体miR-204-5p扩增循环数与临床表征相关性分析
Figure GDA0003160501990000082
实施例4：miR-204-5p在Jurkat免疫细胞中的生物学功能
利用Jurkat细胞研究miR-204-5p的生物学功能。Jurkat细胞作为常见的CD4+T淋巴细胞系。首先研究在炎性因子刺激下对Jurkat细胞中的miR-204-5p表达水平的影响，如图5A所示，Jurkat细胞在PMA刺激下显著下调并具有时间依赖性。此外，加入免疫抑制剂CysA后可以显著抑制PMA对Jurkat细胞中miR-204-5p的抑制作用(图5B)。同样的，采用其它的免疫激活剂如CD3/28抗体也可以显著抑制miR-204-5p的表达(图5C)。接下来构建miR-204-5p的的稳定转染细胞系(OE)和对照细胞系(NC)，miR-204-5p稳定转染后miR-204-5p表达水平显著上调(图5D)。同时发现miR-204-5p可以抑制Jurkat细胞的增殖(图5E)。分别检测miR-204-5p对于IL-2和CD69两种细胞活化标志物检测，发现miR-204-5p可以显著抑制IL-2(图5F)和CD69的表达水平(图5G-5H)。
实施例5：miR-204-5p在滑膜成纤维细胞MH7A中的生物学功能
利用滑膜成纤维细胞MH7A研究miR-204-5p的生物学功能。如图6A所示，TNF-a刺激滑膜成纤维细胞MH7A导致细胞内的miR-204-5p水平显著下调，而IL-1β和IL17对于miR-204-5p的表达无影响。同时构建miR-204-5p稳定细胞系(图6B)，发现miR-204-5p过表达后显著抑制了MH7A细胞的增殖(图6C)。此外检测miR-204-5p对细胞迁移的影响发现miR-204-5p可以显著抑制TNFa诱导的细胞迁移(图6D-6E)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种类风湿性关节炎的外泌体miRNA标志物及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> RNA
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uucccuuugu cauccuaugc cu 22
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<212> DNA
<213> （人工序列）
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<212> DNA
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<400> 3
ttccctttgt catcctatgc ct 22
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<211> 16
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (1)

1.一种外泌体miRNA标志物的检测试剂在制备检测类风湿性关节炎的产品中的应用，其特征在于，所述的外泌体miRNA标志物为miR-204-5p，所述miR-204-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述miR-204-5p为血浆外泌体miRNA标志物。
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