JPWO2015133477A1 - 膵がんの検出を補助する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
uggagugugacaaugguguuug (配列番号1)
miR-16
uagcagcacguaaauauuggcg (配列番号2)
miR-19b
ugugcaaauccaugcaaaacuga (配列番号3)
miR-25
cauugcacuugucucggucuga (配列番号4)
第 1 節 臨床検体
第 1 項 使用した臨床検体
末梢血の採取は、広島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会から承認されたヒトゲノム遺伝子解析研究計画書に基づいて行われた。本実施例で解析に用いた末梢血の内訳を以下の表に示す。
1) EDTA-2K が添加されたベノジェクトII真空採血管に採血された 5 mL の全血を 15 mL チューブに移し、3500 rpm で 10 分間、室温で遠心した。
2) 遠心により、上から血漿層、白血球層、赤血球層の 3 層に分離される。そのうち、血漿層のみを新しい 2 mL チューブに移した。
3) 2)を 10000 rpm で 10 分間、室温で遠心し、採取した血漿に混入している血球成分を沈殿させた。
4) 血漿層のみを新しい 1.5 mL チューブに 250 μL ずつ分注し、-80 ℃で凍結保存した。
血漿中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μL を新しい 1.5 mL チューブに移した。
3) 1000 μL の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μL 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200 μL のクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で3 分間静置した。
6) 12000 xg、15 分間、4℃で遠心し、上層の水層を新しい 2 mL チューブに移した。
7) RNA を析出させるため、1155 μL の 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μL の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μL の Buffer RWT をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μL のBuffer RPE をカラムに加え、8000xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μL のBuffer RPE をカラムに加え、8000xg、2 分間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collectionチューブに移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブに移し、50 μL の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃で保存した。
第 1 項 網羅的解析の原理
血漿中 miRNA の網羅的解析は、miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR,Polyadenylation and cDNA synthesis kit、microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel Iand panel II(Exiqon) を用いて行った。解析の流れを図1に示す。また、その測定原理を図2に示す。
本実施例では、血漿中より抽出できる RNA 量が微量であり、濃度測定が困難であったため、RNA 溶液の濃度調節は行わなかった。したがって、「同じ質量の RNA 中にどれだけの目的miRNA が含まれていたか」ではなく、「同容量の血漿から抽出した RNA 溶液中にどれだけの目的 miRNA が含まれていたか」を比較したことになる。これは、この後の qRT-PCR 解析でも同様である。
た。
2) ピックアップされた miRNA の Ct 値の平均値を算出した。
3) 算出した Ct 値の平均値を補正値とし、各 miRNA の Ct 値から補正値を差し引いたものを補正後の Ct 値 (ΔCt 値) として解析に用いた。
第 1 項 microRNA の逆転写
血漿中 miRNA の逆転写は Universal cDNA Synthesis Kit (EXIQON) を用いて行った。
1) 0.65 mL チューブに、以下のように RT master mix を調製した。
3) 抽出した血漿中 RNA を 2 μL 加え、ピペッティングで十分に混和した。
4) GeneAmp(商品名) PCR System 9700 (Applied Biosystems) を用い、以下の条件で逆転写反応を行った。
real-time PCR 反応は LightCycler(商品名 480 SYBR Green I Master (Roche)、KAPA SYBR(商品名)FAST Master Mix (2x) Universal (日本ジェネティクス)、384-well plate は LightCycler(商品名)480Multiwell Plate 384, white (Roche) を用いて行った。PCR reaction mix、希釈済み cDNA の384-well plate への分注は、Bravo Automated Liquid Handling Platform (AgilentTechnologies) を用いた。
2) 0.65 mL チューブに、次項のように PCR reaction mix を調製した (表示はレプリケート数 1 のときの 1 サンプルあたりの量)。
4) 1) で調製した希釈 cDNA を 384-well plate に 4 μL ずつ分注し、ピペッティングで十分に混和した。
5) サンプルの蒸発防止のため、384-well plate にシールを貼り、1500 xg、1 分間、室温で遠心した。
6) LightCycler(商品名) 480 (Roche) を用い、以下の条件で real-time PCR を行った。
※LightCycler(商品名) 480 SYBR Green I Master (Roche) 使用時
Ct 値の算出には、蛍光の増幅曲線の変化幅が最大となる点を Ct 値とする二次導関数法を用い、解析には、検量線を作成せず、相対的に miRNA 量を比較するΔΔCt 法を用いた。また、サンプル同士を比較するために、miRNA 量の補正を行う必要があるが、この補正には、第 2 節の 4) で添加した外部コントロール cel-miR-39 を用いた。補正値 (ΔCt 値) の算出方法を下記に示す。
ΔCt = Ct - Ctcel-miR-39
第 1 節 膵がん患者特異的な変動を示す血漿中 microRNA の同定
第1項
本節では、健常人と膵がん患者の血漿中 miRNA プロファイルを網羅的に解析し、比較することで、膵がん患者で変動する miRNA の同定を行った。
(第1のスクリーニング)
20 代健常人群、40 代健常人群、60 代健常人群、膵がん患者群、各 4 名の血漿中における175 種類の miRNA 量をmicroRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I and panel IIを用いて網羅的に解析し、各群における miRNA 量を比較した。各群毎に miRNA 量の平均値を算出し、各群間での比較を行った。解析に用いた臨床検体に関するデータは表7の通りである。
健常人に比べ、膵がん患者で血漿中 miRNA 量減少:miR-16、miR-19b、miR-24、miR-25
(第2のスクリーニング)
第1のスクリーニングで示された健常人と膵がん患者における miRNA の血漿中量の違いは、実験に用いた検体の個人差の影響を少なからず受けていると考えられる。そこで、マーカー候補 miRNAの血漿中量から個人差の影響を排除するため、60 歳以上の健常人群と膵がん患者群の各群をそれぞれ 50 検体に増やし、第2のスクリーニングとして各検体における個々の候補 miRNA の血漿中量をqRT-PCR で測定した。測定に用いた臨床検体に関する性別ならびに平均年齢は表8の通りである。膵がん患者群は全て UICC 分類法におけるステージIII、IVa に該当する患者で構成されている。第 2 項でも述べたように、膵がんは高齢で発症する傾向の疾患であるため、コントロール群として 60 歳以上の健常人を設定した。第2のスクリーニングでのマーカー候補 miRNA 量の測定は、SYBR Green を用いた qRT-PCR 法で行った。
のマーカー候補 miRNA とし、解析を進めることとした。
第 3 項で第2のスクリーニングを行い、膵がんのマーカー候補 miRNA を 4 種類同定したが、膵がん患者群の年齢、性別への影響を考慮していない。同定したマーカー候補 miRNA が年齢、性別の影響を受けた場合には、疾患による miRNA 量変動を検出できない可能性が考えられたため、これら miRNA の血漿中量が年齢、性別による影響をどの程度受けるかを、第1のスクリーニングで測定した結果をもとに検討した。年齢の影響を調べるのに用いた臨床検体は、2項、表7に挙げた各年代の健常人で、性別の影響を調べるのに用いた臨床検体は、第3項表8で挙げた 60 歳以上の健常人である。
膵がんの発症によって変動し、健常人と膵がん患者で血漿中量が異なる miRNA として、第1のスクリーニングで 5 種類が候補として挙がり、第2のスクリーニングにおいて miR-122、miR-16、miR-19b、miR-25 の 4 種類が同定された。これらの miRNA 量の違いは統計学的にも有意であることが明らかとなり、また、年齢・性別の影響をほとんど受けないことから、診断マーカーとして応用が可能であると考えられる。特に、miR-122、miR-16、miR-19b、miR-25 の 4 種類のマイクロRNAは、膵臓癌の発症年齢は40歳未満で発生することはまれで40歳代後半から50歳代になるにつれ徐々に増え、60歳〜80歳代が全体の80%を占めることを考慮に入れると、年齢・性別の影響を全く受けないものである。次節以降では、同定した 4 種類の miRNA に関して膵がん診断における有用性を更に検証した。
第 1 項
第 1 節で膵がんのマーカー候補 miRNA として 4 種類の miRNA が同定された。しかし、これらの miRNA が示す血漿中 miRNA 量の違いが膵がん患者特異的なものであるのか、それとも他の疾患でも非特異的に変動するのかという点は不明である。そこで本節では、膵がん以外の疾患におけるマーカー候補 miRNA の血漿中量を測定し、健常人及び膵がん患者と比較することで、同定した miRNA の膵がん患者に対する特異性の検証を行った。
膵がん以外の疾患患者 16 名の血漿中において、第 1 節で同定した 4 種類のマーカー候補miRNA 量を測定し、健常人 50 名、膵がん患者 50 名の血漿中 miRNA 量と比較した。健常人と膵がん患者は、第 1 節第 3 項、表8で示した検体を用いた。膵がん以外の疾患として、アルツハイマー症と胃がんを設定した (表9)。アルツハイマー症は膵がんと同様に高齢者での発症率が高い疾患として、胃がんは膵がんとは異なるがん疾患として選んだ。ここでの測定は、SYBR Green を用いた qRT-PCR 法で行った。
アルツハイマー症患者及び胃がん患者を用いた膵がん以外の疾患患者との比較により、miR-16、miR-25 は膵がん患者特異的に血漿中量が変動する可能性が示唆された。miR-122 及び miR-19b は、アルツハイマー症患者、胃がん患者の血漿中 miRNA 量の変動が膵がん患者と同様の傾向を示したことから、これらの miRNA の変動は膵がん患者特異的ではないことが明らかとなった。
第 1 項
これまでの実験結果より、4種類のマーカー miRNA の血漿中量が健常人と膵がん患者で異なることが明らかとなったが、これらのマーカー miRNA を用いて膵がんの診断を行う場合には、膵がんの陽性と陰性を分ける正確さが重要である。また、検査値の測定は病院でのスクリーニング検査を想定し、測定方法が簡便なものが望ましい。以上の観点から、本研究では qRT-PCR の測定結果から容易に算出できるΔCt値に着目し、診断マーカーとしての有用性を検討した。
ROC (受信者操作特性) 曲線を描き AUC を算出して比較する方法は、診断マーカーの精度評価の方法である。ROC は横軸に「1-特異度」(偽陽性率) を、縦軸に「感度」をプロットし、陽性/陰性を判断するカットオフ値を媒介変数として変化させたときに得られる曲線である。AUC (曲線下面積) はこの ROC 曲線下の面積のことであり、0.5〜1 の値をとる。ある診断マーカーを用いてROC 曲線を作成し、AUC を算出した際、その値が 1 に近づけば近づく程精度の良いマーカーと評価される。本研究ではこの方法を用いて 4 種類のマーカー miRNA の精度評価を行った。ROC 曲線作成に用いたのは表8、表9に示した検体のΔCt 値で、非膵がん患者検体として、健常人、アルツハイマー症患者、胃がん患者を設定した。
Claims (3)
- 生体から分離された被検試料中に含まれる、(1)miR-122-5pと、(2)miR-16-5p、miR-19b-3p及びmiR-25-3pから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とする膵がんの検出を補助する方法であって、miR-122-5pの存在量が健常者よりも多く、miR-16-5p、miR-19b-3p及びmiR-25-3pから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、膵がんを発症している可能性が大きいことを示す、方法。
- (1) miR-122-5pと、(2)miR-16-5p、miR-19b-3p及びmiR-25-3pから成る群より選ばれる1種のmiRNAの存在量を指標とする請求項1記載の方法。
- (1) miR-122-5pと、(2)miR-25-3pの存在量を指標とする請求項2記載の方法。
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