CN103571936A - 微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒 - Google Patents

微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用微核酸-196a分子及微核酸-196b分子侦测口腔癌的方法及其专用引物、探针与试剂盒，是检测潜在病患的肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQID NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。本发明利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应技术(RT-qPCR)，侦测口腔癌病患及正常者血浆中miR-196a分子和miR-196b分子的表达量，发现无论是微核酸miR-196a还是微核酸miR-196b的表达量均较正常者有明显的高度表达(p＜0.0001)，且侦测敏感度达90％，专一性达85％，证明miR-196a分子及miR-196b分子应用于口腔癌的侦测具有良好的鉴别度。

Description

微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒
技术领域
本发明提供一种将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，尤其以miR-196a分子及miR-196b分子作为口腔癌的肿瘤标记，分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量来推断该潜在病患罹患口腔癌的方法。 
背景技术
血液肿瘤标志具有疾病侦测、预后及监控治疗结果的价值。因此，一个临床上应用的血液型肿瘤标志可以提供更好的疾病控制。现行的血液型肿瘤标志有侦测大肠直肠癌的CEA、侦测肝癌的AFP与侦测摄护腺癌的PSA，过去也有报导指出SCC抗原与Cyfra21可以作为头颈癌的侦测标志，但目前尚未提到有临床使用的口腔癌侦测标志。此外，微核酸(miRNA)是内生性，不转译蛋白的小片段RNA，其利用结合到标的基因讯息RNA的3’不转译区域(3’UTR)，进而抑制标的基因转译而达到负向调控基因表达。微核酸被认为是一群重要的基因调控分子，估计有1/3-1/2的人类基因会受微核酸调控，此外每个微小RNA亦可以同时调控不同的标的基因。已知微核酸参与多样的生物功能，如细胞增生、分化、凋亡及移行功能，甚至微核酸表达异常也认为与细胞恶性转化有关。近年来研究显示，许多不同的癌症都有其特异的微核酸表达，然而研究显示共同的结果并不多，表示微核酸的复杂性及其机制并未被真正了解。 
目前口腔癌是十大癌症之一，每年约以五十万人的新病例增加，为改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，除了改善治疗的方式外，发现并建立一个临床上可以用来侦测以及监控病程的肿瘤标志，可有效减少口腔癌病人的死亡率。 
发明内容
目前并无适当的分子肿瘤标志，可应用于口腔癌的临床侦测，为了改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，本发明提供一种以将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，是分析潜在病患的肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分 子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。 
以血浆检体为例，又本发明分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量的分析步骤为：步骤一：首先取得血浆检体，将血浆样分装出200μl，用可纯化miRNA的试剂组来萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700μl QIAzol使其均质化后再加入140μl氯仿分离萃取RNA，离心之后取上清液(约525μl)加入750μl纯乙醇沉淀核酸产物，然后用离心管柱分离出沉淀物，丢弃下层流出液，在润洗管柱后，每个样本用20μl无核酸水解酶(RNase-free)的水将核酸提取出来；步骤二：微核酸(miRNA)的定量，微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂进行，首先将所萃取的核酸取3μl进行反转录反应，30μl反应体系包含4单位的反转录酶、10单位的核酸水解酶抑制剂及25mM dNTP，置于37℃孵育30分钟，接着用实时荧光定量PCR检测仪进行实时荧光定量PCR检测，方法为：将8μl反转录后的产物与1μl上述用于侦测miR-196a分子或miR-196b分子表达量的引物和探针混和，并加入6μl水和10μl实时荧光定量PCR试剂后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显示，以已知浓度的miR-196a分子及miR-196b分子的检测结果为对照，根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量。 
本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针，其中，检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300021
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中，检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300022
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中。 
本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，包括侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300023
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300024
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中的引物和探针。 
本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，由侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针组成；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为Appl ied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300025
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游 引物及探针序列为Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300031
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中的引物和探针。 
本发明通过实验证明口腔癌病人血浆中的miR-196a分子及miR-196b分子含量比起正常人有显著上升(P＜0.001，AUC＞0.90)，且侦测敏感度达90％，专一性达85％，表示miR-196a分子及miR-196b分子具有良好的口腔癌侦测能力，因此，测定生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的含量可以用于侦测口腔癌，以往并无适当的口腔癌肿瘤标志，因此miR-196a分子及miR-196b分子应用于口腔癌的发现与侦测上为一医学上的突破，且具有良好的功效。 
附图说明
图1：利用各微核酸在癌细胞即正常口腔上皮细胞的平均荧光表达含量作图，其所示为侦测470个微核酸的荧光强度图。 
图2：透过非预设性阶层分级分析并以AN0VA计算，以FDR＜0.1且具有两倍以上差异的结果显示有23个微核酸的表达在口腔癌细胞与正常口腔上皮的样本中有显著差异。 
图3：表示使用miR-196a及miR-196b的抑制核酸序列(antagomir)处理细胞会降低细胞移行能力。 
图4：表示高度表达miR-196a与miR-196b会促进细胞移行能力。 
图5：表示细胞向外侵犯能力会因为抑制miR-196a及miR-196b而下降。 
图6：表示高度表达细胞中的miR-196a及miR-196b会促进口腔癌细胞的侵犯能力。 
图7(A)(B)：表示测定临床组织检体中口腔癌肿瘤样本(T)与周围正常组织样本(N)内miR-196a与miR-196b的表达量。 
图8(A)(B)：表示miR-196a在口腔癌病人的血浆有过度表达的现象。 
图9(A)(B)：表示miR-196b在口腔癌病人的血浆有过度表达的现象。 
具体实施方式
本发明提供一种将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，分析潜在病患的血浆、血清、口水、漱口水或肿瘤组织等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子包含具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子包含具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88，本数值是采一般正常人的平均表现量来作为正常值，所测定的值是一个相对定量后的 结果)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。 
本发明首先经由分析口腔癌细胞的微核酸(miRNA)，发现miR-196a分子及miR-196b分子在口腔癌细胞中扮演重要的致癌角色，而进一步侦测口腔癌病人以及正常人血浆中miR-196a分子及miR-196b分子的含量发现，在口腔癌病患的血浆中miR-196a分子及miR-196b分子呈高度表达，因此认为miR-196a分子及miR-196b分子具有可以做为早期侦测口腔癌肿瘤标志的潜力。故本发明利用微核酸微阵列(Agilent Technology，USA)的方式分析比对在口腔癌细胞与正常的口腔上皮细胞内的微核酸是否有差异，本发明总共分析6株口腔癌细胞以及5株的正常口腔上皮细胞内470个微核酸的表达，实验方法为：一个样品以总量1μg的核糖核酸进行实验，RNA首先用碱性去磷酸酶37℃处理30分钟将其去磷酸化后，100度高温终止反应5分钟，并立即降温至0℃，加入5μl的DMSO(Dimethyl sulfoxide)加热至100度后随即降温至0℃，后续加上ligase buffer及BSA与50μM pCp-Cy，15单位的T4ligase总体积为28μl后静置于16度2小时，荧光标定完成后以MicroBioSpin6管柱去盐类，并加入杂交缓冲液与阻断试剂使总体积为45μl，混和物加热100℃并立即降温至0℃后取至Agilent human miRNA microarray vl芯片上于55℃进行杂交反应20小时，反应后芯片用清洗液在室温下清洗5分钟后用Agilent microarray scanner进行扫描(miRNA microarray送外检(威健公司，Agilent)，上述操作步骤为Aglilent的操作步骤经发明人简化翻译而成)，数据用GeneSpring GX software分析，将微弱讯息过滤之后，以ANONA计算，选择标准订为错误选取率＜0.1(FDR＜0.1)且有两倍以上差异。结果如图1所示，图1利用各微核酸在癌细胞即正常口腔上皮细胞的平均荧光表达含量作图，其所示为侦测的470个微核酸的荧光强度图，X轴为在5个正常口腔上皮细胞平均强度，Y轴为在6个口腔癌细胞中的平均表达强度。 
表1为以微阵列方式筛选的有显著差异的微核酸，表列23个有显著差异的微核酸在6个口腔癌细胞(C)与5个正常口腔上皮细胞(K)的平均表达量与相对倍数差及P值，P值低显示在同群组中微核酸的表达趋势相同，而在23个微核酸中，miR-196a及miR-196b在癌细胞显著高表达(＞10倍)，显示出miR-196a及miR-196b在口腔癌形成时扮演一种重要角色。侦测470个人类微核酸，接着经过常态化(normalization)并去除微弱讯号后共190个微核酸进行群集分析(clustering analysis)，非预设性阶层分级分析(The unsupervised hierarchical clustering analysis)结果显示，这190个微核酸的表达数据图谱可以将样本分为癌细胞及正常口腔上皮细胞两个群组，以统计方法(analysis of variance，ANOVA)计算，将条件设定为错误发现率(False discovery rate，FDR)＜0.1，并同时有两倍以上差异，得知有23个微小RNA的表达在口腔癌细胞与正常口腔上皮的样本中有显著 差异，其中包含19个微核酸表达量上升，4个微核酸表达量下降于口腔癌细胞株(如图2所示)，图2是非预设性阶层分级分析图。 
表1以微阵列方式筛选的口腔癌细胞(Cancer)与正常口腔上皮细胞(Normal)表达量有显著差异的微核酸 
Figure BSA00000758668300051
此外，本发明利用活体外伤痕愈合实验来分析miR-196a及miR-196b对于细胞移行能力的影响，操作过程是：利用 culture insert贴附在细胞培养盘后，将70μl细胞(0ECMl4×105/mL，SAS6×105/mL种入空位中8小时后带细胞平贴为单层，移除 
Figure BSA00000758668300053
culture insert使细胞中出现间隙。观察细胞爬行至间隙中的时间并照相记录，将两株口腔癌细胞(0ECMl，SAS)处理miR-196a及miR-196b的抑制序列(antagomiR、anti-196a，序列为 
5’-CCCAACAACATGAAACTACCTA-3’、ant i-196b，序列为 
5’-CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’)来减低细胞内miR-196a及miR-196b的表达量，则细胞爬行至间隙的速度比控制组慢，如图3所示，图3将miR-196a及miR-196b的抑制序列及控制序列(scramble control是指序列中核酸基与抑制序列相同但顺序为随机打散的序列)处理口腔癌细胞OECMl及SAS后进行体外伤口 愈合试验。 
两株细胞都显示出当控制组的细胞已经满布间隙的时候，不管是减低miR-196a或miR-196b的实验组细胞仍未爬满间隙。此外，为进一步证实miR-196a及miR-196b对细胞移行的影响，本发明亦设计可以高度表达miR-196a及miR-196b的载体，使细胞表达高量的miR-196a及miR-196b，如图4所示，在口腔癌细胞OECMl及SAS中用特定载体pcDNA3.1(+)(Invitrogene产品)表达miR-196a、miR-196b后，以体外伤口愈合试验测定细胞移行能力，并以空载体(pcDNA)处理的细胞当作控制组，显示不管高度表达miR-196a或miR-196b都可以加快两株口腔癌细胞的移行能力，高度表达miR-196的细胞在9小时后就可以爬满间隙，显著较控制组细胞(pcDNA)快。 
本发明并利用基底膜穿透实验(Matrigel invasion assay)来判断miR-196a及miR-196b是否会改变细胞向外侵犯的能力，操作过程为：取膜孔径8μm的Millicell invasion chamber在其中加入100μl浓度为5ng/mL的matrigel待其凝固后种入1×105颗细胞，并培养在37度培养箱24小时，计数侵犯matrigel并穿过膜至下层的细胞数，并拍摄记录于膜下方的细胞。将miR-196a及miR-196b的抑制序列(antagomiR、anti-196a、anti-196b)及控制序列(scramble control)处理口腔癌细胞OECMl及SAS来减低细胞内miR-196a及miR-196b的表达量，其中控制序列SC是指序列中核酸基与抑制序列相同但顺序为随机打散的序列，结果如图5所示。在两株口腔癌细胞中，以特定的miR-196a及miR-196b抑制序列来减低细胞miR-196a及miR-196b的表达，则比控制组细胞出现较少穿越基底膜胶质的细胞数，与对照组细胞比较之后发现，抑制miR-196a的表达后，OECMl细胞的穿越数下降至49％，而SAS细胞更下降至31％；另外，抑制miR-196b表达则发现OECMl及SAS细胞穿越基底膜的数目减少到控制组的34％及47％。进一步高度表达miR-196a及miR-196b于细胞中，如图6所示，高度表达细胞中的miR-196a及miR-196b会促进口腔癌细胞的侵犯能力，在口腔癌细胞OECMl及SAS中以特定载体表达miR-196a及miR-196b后，以基底膜穿透试验(Matrigel invasion assay)测定细胞侵犯能力，并以空载体(pcDNA)处理的细胞当作控制组，发现有miR-196a及miR-196b高度表达的细胞穿过基底膜到另一端的细胞数比控制组(pcDNA)多约2倍。 
除了miR-196a及miR-196b在细胞功能的鉴定，本发明也测定了临床的组织检体中miR-196a及miR-196b的表达，本发明总共操作了54个病人的肿瘤组织样本(T)及其周围正常组织样本(N)，利用实时荧光定量PCR方式检测miR-196a及miR-196b的表达量，并以U6核酸(序列为5’-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CGT GAA GCGTTC CAT ATT TTT-3’)作为标准化用的内部控制，以相对表达量来呈现结果，其 中图7(A)表示在54组样本中有52个(96.3％)肿瘤组织中miR-196a及miR-196b的表达量比其周围正常组织中的表达量高出两倍以上(p＜0.001)；图7(B)表示在54组样本中有48个(88.6％)肿瘤检体中miR-196b的表达量显著比周围正常组织中的表达量高过两倍(p＜0.001)。 
为进一步确定miR-196a及miR-196b是否可以应用在临床上，本发明另比较miR-196a及miR-196b在口腔癌病人与正常人的血浆中的表达量，本发明共侦测54个口腔癌病人与33个正常人的血浆，本发明所采用的测定血浆中miR-196a及miR-196b的方法为： 
步骤一：首先取得血浆检体，将血浆样分装出200μl，以可纯化miRNA的试剂组(具体试剂为 mini kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA))来萃取出微核酸，使用 
Figure BSA00000758668300072
mini kit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)，第一步加入700μl QIAzol使其均质化后再加入140μl氯仿分离萃取RNA，离心之后取上清液(约525μl)加入750μl纯乙醇沉淀核酸产物，并用试剂盒中提供的离心管柱分离出沉淀物，并丢弃下层流出液，在润洗管柱后，每个样本用20μl无核酸水解酶(RNase-free)的水将核酸提取出来；微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂来进行，本发明的实验使用 
Figure BSA00000758668300073
miRNA assays kit(ABI，Forest City，CA)作为反转录实时荧光定量PCR反应试剂，首先将所萃取的核酸取3μl进行反转录反应，加入4单位的反转录酶AMV(HT Biotech Ltd，UK)、10单位的核酸水解酶抑制剂CalBiochem(CA，USA)及25mM脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)于总量30μl反应体积内置于37℃孵育30分钟，接着，用实时荧光定量PCR检测仪(本发明使用Bio-Rad的MiniOpticon)进行实时荧光定量PCR，将8μl(本发明中plasma RNA未定量，以”固定血浆体积所萃取的RNA，取固定体积进行反转录”，控制因子是”体积”)反转录后的产物与1μl(浓度为20×)引物(检测miR-196a的上、下游引物序列以及检测miR-196b的上、下游引物序列均存在于Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300074
MicroRNA Assays试剂盒中，其中miR-196a：000495，miR-196b：002215)、1μl(浓度为20×)特定微核酸探针(检测miR-196a的探针和检测miR-196b的探针均存在于Applied Biosystems- 
Figure BSA00000758668300075
MicroRNAAssays试剂盒中，其中miR-196a：000495，miR-196b：002215)混合，并加入6μl水和10μl实时荧光定量PCR试剂(iQ supermix(Bio-Rad，Hercules，CA))后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显示，以已知浓度的miR-196a分子及miR-196b分子的检测结果为对照，根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量。 
结果显示，与正常人血浆中的miR-196a及miR-196b比较，癌症病人血浆中的 miR-196a显著增加，这表示miR-196a在口腔癌病人的血浆有过度表达的现象，平均增加达14.27(约为14)倍(P＜0.0001)。请参阅图8(A)，以散布的黑点表示出正常人血浆及口腔癌病人血浆群组中每一个样本以RT-qPCR测定的miR-196a相对表达量，黑直线则为该群组的平均量。卡方测定(chi-squared)t-test计算后可得知两群组间差异是否具有统计上的意义；图8(B)以ROC曲线(receiver operational curve)分析，评估miR-196a在正常人与口腔癌病人检体间的鉴别力，miR-196a可以得到曲线下面积(aera under curve，AUC)为0.938，显示miR-196a具有高潜力用以将口腔癌的病人从正常人中鉴别出来，逻辑回归分析(logistic regression model)预测miR-196a用以区别口腔癌病人的敏感度达92.6％，专一性亦可达84.6％。 
又，miR-196b的侦测结果表示，miR-196在口腔癌病人血浆中同样显著增加，平均增加达10.03(约为10)倍(P＜0.0001)，这表示miR-196b在口腔癌病人的血浆也有过度表达的现象，请参阅图9(A)，以散布的黑点表示出正常人血浆及口腔癌病人血浆群组中每一个样本以RT-qPCR测定的miR-196b相对表达量，黑直线则为该群组的平均量。卡方测定(chi-squared)t-test计算后可得知两群组间差异是否具有统计上的意义。图9(B)以ROC曲线(receiver operational curve)分析，评估miR-196b在正常人与口腔癌病人检体间的鉴别力，miR-196b的线下面积为0.942，显示miR-196b同样有高潜力来从正常人血浆中鉴别出口腔癌病人血清，经逻辑回归分析(logistic regression model)预测miR-196b侦测口腔病人的灵敏度可高达90.7％，专一性则达84.9％。 
综上所述，本发明通过实验发现miR-196a分子及miR-196b分子具有良好的口腔癌侦测能力，因此，测定生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的含量(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，可以利用于侦测口腔癌。 
Figure ISA00000758668500011

Claims (8)

1.用实时荧光定量PCR法侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针，其中，检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列存在于AppliedBiosystems-
Figure FSA00000758668200011
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中，检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems-
Figure FSA00000758668200012
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中。
2.一种用miR-196a分子和miR-196b分子侦测口腔癌的方法，是用权利要求1所述的引物、探针和实时荧光定量PCR法分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值，即可推断该潜在病患罹患口腔癌，其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述miR-196a分子高出正常值约14倍。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述miR-196b分子高出正常值约10倍。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述生物检体可为肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：以血浆检体为例，所述分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量的分析步骤为：
步骤一：首先取得血浆检体，将血浆样分装出200μl，用可纯化miRNA的试剂萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700μl QIAzol使其均质化后再加入140μl氯仿分离萃取RNA，离心后取上清液(约525μl)加入750μl纯乙醇沉淀微核酸，然后用离心管柱分离出沉淀物(微核酸)，丢弃下层流出液，润洗管柱后，每个样本用20μl无核酸水解酶(RNase-free)的水将微核酸提取出来；
步骤二：微核酸的定量，微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂进行，首先取步骤一萃取的3μl微核酸进行反转录反应，在30μl反应体系中加入4单位的反转录酶、10单位的核酸水解酶抑制剂及25mM dNTP，置于37℃孵育30分钟，接着用实时荧光定量PCR检测仪进行实时荧光定量PCR检测，方法为：将8μl反转录后的产物与1μl权利要求1所述的侦测miR-196a分子或miR-196b分子表达量的引物和探针混和，并加入6μl水和10μl实时荧光定量PCR试剂后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显示，以已知浓度的miR-196a分子及miR-196b分子的检测结果为对照，根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量。
7.一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，包括侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems-
Figure FSA00000758668200021
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems-
Figure FSA00000758668200022
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中的引物和探针。
8.一种用实时荧光定量PCR法侦测口腔癌的试剂盒，由侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针组成；所述检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems-
Figure FSA00000758668200023
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中的引物和探针；所述检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列为Applied Biosystems-
Figure FSA00000758668200024
MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中的引物和探针。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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YA-CHING LU等: "Oncogenic Function and Early Detection Potential of miRNA-10b in Oral Cancer as Identified by microRNA Profiling", 《CANCER PREV RES》 *

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