CN112795656B - 与口腔鳞癌发生发展相关的生物标志物及其在诊疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与口腔鳞癌发生发展相关的生物标志物及其在诊疗中的应用，所述生物标志物为RP11‑588H23.3，或RP11‑588H23.3与AC108142.1或RP13‑297E16.4的组合，本发明的生物标志物应用于口腔鳞癌的诊断具有较高的准确性、敏感性和特异性。

Description

与口腔鳞癌发生发展相关的生物标志物及其在诊疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及与口腔鳞癌发生发展相关的生物标志物及其在诊疗中的应用。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔最常见的恶性肿瘤，每年全球有500000例新发病例出现，给整个社会的医疗保障系统带来了巨大的挑战与负担。OSCC常发病于舌、颊、牙酿、上颌窦等部位，早期常表现为口腔黏膜表面不光滑的白斑，伴随病情的发展，可进展成为乳头状或溃疡型，也可两者混合出现，其中以溃疡型多见(Wu M,Zhu Y,Zhao J.et al.Soluble costimulatory molecules Tim3 regulates thedifferentiation of Thl and Th2 in patients with unexplained recurrentspontaneous abortion[J].International Journal of Clinical&ExperimentalMedicine,2015,8(6):8812.)。OSCC早期即有淋巴结转移趋势，随着病情进展，晚期时癌细胞可向远处转移，患者的生命健康安全受到极大的威胁(Clayton K,Douglasvail M,Rahman A,et al.Soluble Tim-3is shed from CD8⁺T cells by the sheddase ADAM10,is increased in plasma during untreated HIV infection,and correlates with HIVdisease progression(VIR6P.1165)[J].Journal of Virology,2015,89(7):33-36.)。当前，大多数口腔鳞状细胞癌患者在诊断时即已处于疾病的晚期，因此一个合适的肿瘤相关标志物将有助于口腔鳞状细胞癌患者的早期诊断与预后判断。

近几年，为寻找肿瘤早期检测的新方法以及新治疗策略，来提高OSCC的生存率，很多学者付出了很大努力。通过大量研究，已揭示了部分OSCC发生的分子机制，发现OSCC的进展通常多个步骤，这些改变最终导致细胞突变和异常增殖，促使正常粘膜向OSCC进展(Troiano G,Caponio VCA,Botti G,et al.Immunohistochemical Analysis Revealed aCorrelation between Musashi-2and Cyclin-D1 Expression in Patients with OralSquamous Cells Carcinoma.[J].Int J Mol Sci,2019,21(1):121.)。而且有证据证明基因的改变也在口腔癌中发挥作用，但目前仍未发现具体的、高特异性的生物标志物。OSCC仍然缺乏理想的、高灵敏的基因靶点。探索OSCC的诊断标志物及OSCC的靶向治疗是生物医学研究的一个持续挑战。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与口腔鳞癌的发展相关的生物标志物，该标志物可以用于诊断受试者是否患有口腔鳞癌或者患口腔鳞癌的风险。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测生物标志物的试剂在制备诊断口腔鳞癌的产品中的应用，所述生物标志物包括RP11-588H23.3。

进一步，所述生物标志物还包括AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

进一步，所述生物标志物为RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交或芯片检测样本中生物标志物表达水平的试剂。其中，所述样本包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别所述生物标志物的探针；或

特异性扩增所述生物标志物的引物。

本发明的第二方面提供了一种诊断口腔鳞癌的试剂盒，所述试剂盒包含进行DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、RNA印迹法、RNase保护试验和反转录聚合酶链反应所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、探针或引物，以检测生物标志物的表达；所述生物标志物包括RP11-588H23.3。

进一步，所述生物标志物还包括AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

进一步，所述生物标志物为RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述试剂盒通过DNA微阵列、反转录聚合酶链反应的方法进行检测。

本发明所述的试剂盒可用于检测包括RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4基因在内的多个基因(例如，与口腔鳞癌发展进程相关的多个基因)的表达水平。

本发明的第三方面提供了生物标志物在构建评诊断口腔鳞癌的计算模型中的应用，所述生物标志物包括RP11-588H23.3。

进一步，所述生物标志物还包括AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

进一步，所述生物标志物为RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4的组合。

本发明的第四方面提供了RP11-588H23.3在制备治疗口腔鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括RP11-588H23.3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为特异性降低RP11-588H23.3表达的试剂。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA。

本发明的第五方面提供了一种治疗口腔鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括RP11-588H23.3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为特异性降低RP11-588H23.3表达的试剂。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA。

本发明的优点和有益效果：

本发明选择RP11-588H23.3作为生物标志物，可以诊断受试者是否患有口腔鳞癌或者判断受试者患有口腔鳞癌的风险，从而指导医生适时的采取治疗策略、手段及措施。

附图说明

图1是生物标志物在口腔鳞癌组织中的表达情况图，其中，图A是RP11-588H23.3在口腔鳞癌组织中的表达情况图；图B是AC108142.1在口腔鳞癌组织中的表达情况图；图C是RP13-297E16.4在口腔鳞癌组织中的表达情况图；

图2是生物标志物作为检测变量的ROC曲线图，其中，图A是RP11-588H23.3作为检测变量的ROC曲线图；图B是RP11-588H23.3、AC108142.1与RP13-297E16.4联合作为检测检测变量的ROC曲线图。

具体的实施方式

在本发明中，本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。所述RP11-588H23.3基因在ensembl数据库中的基因ID为ENSG00000258168。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术。

在本发明中，试剂盒包括检测RP11-588H23.3的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在本发明中，试剂盒还包括检测AC108142.1和RP13-297E16.4的试剂。

术语“探针”是指寡核苷酸及其类似物，并涉及通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键相互作用而识别多核苷酸靶序列的一系列化学物质。意欲包括在促进杂交的条件下与核酸或其补体中的靶标序列特异性杂交，从而允许检测靶标序列或其扩增的核酸寡聚体或适体。检测可以是直接(即由直接与靶标或扩增的序列杂交的探针产生)或间接(即由与连接探针和靶标或扩增的序列的中间分子结构杂交的探针产生)的。探针的“靶标”通常指扩增的核酸序列中与至少部分探针序列通过标准氢键或“碱基配对”特异性杂交的序列。“充分地互补”的序列允许探针序列与靶标序列稳定杂交，即使该两个序列不完全互补。探针可被标记或不标记。探针可通过具体DNA序列的分子克隆生产，也可被合成。本发明所属领域的技术人员可容易地确定可在本发明的背景下设计和使用的多种引物和探针。

术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

术语“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

本发明提供了治疗口腔鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括RP11-588H23.3的抑制剂。所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制RP11-588H23.3基因的水平即可，这些抑制剂作为对于下调RP11-588H23.3有用的物质，可用于预防或治疗口腔鳞癌。

在本发明中，像RP11-588H23.3这样的非蛋白编码基因，下调RP11-588H23.3的抑制剂可以使RP11-588H23.3至少在两个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括RP11-588H23.3基因的启动子或调控区域的突变，如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％但可能对基因产物的功能具有严重影响。

第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译，例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

在本发明中，使用曲线下面积来判断生物标志物的诊断效能，“曲线下面积(areaunder the curve)”或“曲线下面积(AUC)”是指本技术领域中所众所周知的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve；ROC)的下面积。曲线下面积(AUC)测定有助于经由整体数据范围来比较分类器的准确性。具有更大的曲线下面积(AUC)的分类器具有更大的能力以在两个感兴趣的组(例如，癌样本及正常或对照样本)之间准确分类未知物。在于区别两个群体(例如，具有口腔鳞癌的组与不是口腔鳞癌的对照组)方面上，受试者工作特征曲线(ROC)有用于以图表形式来表现特定的特征(例如，本发明中所描述的生物标志物和/或额外的生物医学信息的任意项目)的性能。通常，基于单一特征值，经由整个群体(例如，患者组及对照组)的上述特征数据被升序排列。然后，针对上述特征的每个值，计算对于数据的真阳性率及假阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定上述真阳性率。通过计算高于针对其特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定上述假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(ROC)可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值(single sum value)，例如，可数学性地组合两个以上的特性(例如，加、减、乘等)，该单一和值可由受试者工作特征曲线(ROC)来表示。附加地，能够以受试者工作特征曲线(ROC)来画出可导出单一计算值的多重特性的组合。这些特性组合可构成测试。上述受试者工作特征曲线(ROC)为表示相对于测试的假阳性率(1-特异性)的测试的真阳性率(灵敏度)的图表。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR检测生物标志物的表达水平

1、样本收集

收集15例口腔鳞癌组织和15例相应的癌旁组织，患者术前未接受任何治疗，以癌组织作为实验组，癌旁组织作为正常对照组。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取样本中的RNA，详细操作按说明书进行。

3、QPCR检测

1)采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录；

2)根据RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4的序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成，以GAPDH作为内参基因。

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量，具体实验操作按产品说明书进行。

4、结果

结果如图1所示，RP11-588H23.3、AC108142.1或RP13-297E16.4在实验组与对照组中呈现显著性差异，相比对照组，RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4在实验组中呈现显著性上调，提示RP11-588H23.3、AC108142.1和RP13-297E16.4可作为生物标志物应用于口腔鳞癌的诊断。

实施例2生物标志物的诊断效能验证

从TCGA数据库下载预处理后的口腔鳞癌的测序数据及临床信息，样本量为癌旁:癌＝44:331。

使用R软件DESeq2进行差异lncRNA表达分析，结果显示RP11-588H23.3、AC108142.1或RP13-297E16.4在口腔鳞癌组织中呈现显著性上调。

使用R包“pROC”绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。在判断指标联合的诊断效能时，对各基因的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出每种联合检测方案的灵敏度、特异性以及准确性等。结果如表1和图2所示，RP11-588H23.3、AC108142.1、RP13-297E16.4的AUC值分别为0.687、0.831、0.818；三者联合的AUC值为0.923，说明使用RP11-588H23.3、AC108142.1和/或RP13-297E16.4进行口腔鳞癌的诊断具有较高的诊断效能。

表1曲线下面积(AUC)

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测生物标志物的试剂在制备诊断口腔鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括1）RP11-588H23.3，以及

2）AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测样本中生物标志物表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别所述生物标志物的探针；或

特异性扩增所述生物标志物的引物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包含进行DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、RNA印迹法、RNase保护试验和反转录聚合酶链反应所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、探针或引物。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品通过DNA微阵列、反转录聚合酶链反应的方法进行检测。

6.生物标志物在构建诊断口腔鳞癌的计算模型中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括1）RP11-588H23.3，以及

2）AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

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