CN112522415A - 基于lgals3剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了LGALS3的3号内含子保留和/或丢失剪接体LGALS3‑R和/或LGALS3‑M在制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有该诊断试剂的试剂盒中的应用，本发明具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的及早观察到慢粒急变期，以便及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

Description

基于LGALS3剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒

技术领域

本发明涉及LGALS3剪接变体作为标志物在诊断慢性粒细胞白血病急变期患者中的应用，以及制备相应的检测试剂和试剂盒盒中的应用。

背景技术

慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，约占人白血病的20％。研究发现约95％的CML患者存在异常的细胞遗传学改变，即9号染色体和22号染色体交互易位形成费城染色体(philadelphia，Ph)和Bcr-Abl融合基因。BCR/ABL融合蛋白具有强烈酪氨酸激酶活性，异常激活下游多条信号通路，刺激造血细胞异常增殖和恶性转化。CML的病程通常分为慢性期、加速期及急变期三个阶段，慢性期相对较长且症状可控，如不经合理治疗疾病会不可避免经加速期进展到急变期，而一旦急变，预后极差。

针对CML急变的诊断，国内外出台了多套标准。这些标准的诊断指标主要有骨髓/外周血原始细胞计数、细胞克隆演化、脾肿大程度及临床药物反应性等(融合基因bcr/abl定量由于对诊断急变不敏感而未被纳入)。综合而言，这些指标均过于依赖CML细胞生物学表型和临床表现，只在急变发生之后才有一定的诊断价值，而不能在急变前期提供预警，导致临床上一再错失最佳治疗时机。因此，CML急变早期预警、靶向治疗这两个紧密相连的重要环节都亟待寻求突破。

可变剪接是指选择性地对前mRNA剪接位点的组合剪接加工，形成不同的成熟mRNA，从而使一个基因产生若干个具有独特结构和功能的蛋白质异构体的过程。近年来的研究表明，可变剪接与疾病例如癌症等的发育、分化有关，许多疾病相关基因受可变剪接调控，回顾研究发现，其中CML的特征融合基因Bcr-Abl的异常选择性可变剪接出现与CML耐药和急变的发生密切相关。Wnt通路作为转录组和蛋白质组多样性的重要驱动因素，调控基因的突变和可变剪接是导致白血病进展和治疗耐药性的重要因素。

半乳糖凝集素3基因(Galectin-3,LGALS3)属于凝集素家族一员，参与核酸代谢的多个过程，包括RNA转录、前mRNA剪接、分化和降解等。根据前期二代测序结果发现，LGALS3存在可变性剪接体。全长LGALS3-R亚型为1975bp，较短的1322bp是LGALS3-M亚型，这两种亚型是通过选择性保留/丢失3号内含子出现可变剪接体。虽然前期一些研究报道证实可变剪接在CML的发生发展过程中扮演重要角色，但尚未有LGALS3可变剪接可能调控前mRNA异常剪接并参与慢粒急变进展的报道，因此，本领域对于慢粒急变的早期、准确和特异性的检测有迫切的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够准确早期预警慢性粒细胞白血病急变期(慢粒急变期)的诊断试剂和诊断试剂盒，以及使用所述试剂或试剂盒预警慢粒急变的方法。

本发明的一个方面在于提供了LGALS3剪接变体用于制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂或含有所述诊断试剂的试剂盒中的用途，所述LGALS3剪接变体是LGALS3-R亚型(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)和/或LGALS3-M亚型(核苷酸序列如SEQ ID NO.2)。

所述LGALS3-R亚型是LGALS3的3号内含子选择性保留产生的剪接变体，所述LGALS3-M亚型是LGALS3的3号内含子选择性丢失产生的剪接变体。

本发明的另一个方面在于：提供了诊断受试者是否处于慢粒急变期的方法，该方法包括至少两个步骤：(a)测定怀疑处于慢性粒细胞白血病急变期的受试者外周血标本中LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型的表达量/结合量；和

(b)根据LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型的表达量/结合量，评估该受试者是否处于慢性粒细胞白血病急变期。

作为本发明优选的实施方案，所述评估包括：

(1)将所测定的LGALS3-R亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-R亚型表达量/结合量低于阈值；或者

(4)将所测定的LGALS3-M亚型的表达量/结合量与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-M亚型表达量/结合量高于阈值；或者

(5)将所测定的LGALS3-R亚型和LGALS3-M亚型表达量/结合量之比与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-R亚型和LGALS3-M亚型之比低于阈值；

指示该受试者处于慢性粒细胞白血病急变期。

作为本发明优选的实施方案，所述试剂包括检测LGALS3-R亚型的核酸扩增引物和/或检测LGALS3-M亚型的核酸扩增引物。

(6)作为本发明优选的实施方案，所述检测LGALS3-R亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：TTGGGAGGCAAGAATAAAG，下游5'-3'：GGTTTCCAGACCCAGATAA，所述检测LGALS3-M亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：CTTCAAACCATGGAAAATGGCA，下游5'-3'；CCATCCTTGAGGGTTTGGGT。

本发明具有的有益效果为：

本发明将LGALS3剪接变体LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型用于诊断慢性粒细胞白血病急变期，具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的方法及早观察到疾病进展，及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明中验证预警慢粒急变的LGALS3可变剪接的流程示意图；

图2为本发明中高通量测序LGALS3剪接变体差异表达示意图；

图3为本发明中qPCR验证LGALS3剪接变体在各组表达情况图；

图4为本发明琼脂糖凝胶电泳LGALS3剪接变体亚型在各组表达情况图；

图5为本发明中LGALS3剪接变体测序验证图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。

发明人采用高通量技术，通过比较慢粒急变患者、慢粒慢性期患者和正常对照组外周血单个核细胞总RNA可变剪接表达谱的差异，发现LGALS3-R剪接亚型在慢粒急变组中有较低的特异性表达。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、CML病患组标本采集

据2016年CML的NCCN诊断标准，收集初次诊断并未进行治疗慢粒初发和急变病患外周血标本。

二、外周血单个核细胞提取

Ficoll密度梯度离心法：①将5ml全血置入50ml离心管中，5ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；②取两支15ml离心管先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液用移液管(各5ml)轻轻加到Ficoll上层(避免两种溶液混合)；③离心2000rpm，20min；④用吸管吸取白色细胞层(即PBMC)放入干净的15ml离心管中；⑤加入PBS至10-15ml，1500rpm，10min离心后去掉上清，加入Trizol混匀。-80℃保存备用。

三、总RNA提取

TRIzol法：①加入1ml TRIzol/5×106个PBMC加入，放置无核酶EP管中反复吹打后，室温静置5min；②加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol，剧烈震荡15s，室温静置2-3min；③4℃，12000rpm，离心15min，最上层的无色水相层(约50％)为RNA层(可见三层，轻拿轻放，避免三层液体混合)；④轻轻吸取上层水相至新的EP管中(避免吸到中间层)，加入0.5ml异丙醇/1mlTRIzol，颠倒混匀，室温放置10min；⑤4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，胶状沉淀可见于EP管侧壁及管底；⑥RNA沉淀用1ml的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无核酶水现配)吹打混匀洗涤，后4℃、7500rpm，离心5min；⑦弃上清后获RNA沉淀于室温干燥5-10min，加入无核酶水(适量)溶解RNA，-80℃保存备用。

四、RT-PCR分析

1.对RNA-seq数据进行验证，通过时实荧光定量PCR(qRT-PCR)方法，选择各组间多个DEGs和RASG进行表达水平比较。来自各组样本的总RNA用RQ1 DNase酶除去除DNA。总RNA纯度和浓度测定，备用。

2.模板DNA即cDNA的合成：按Takara逆转录反应试剂盒说明对制备的总RNA进行反转录，配制反应体系如下：

其中，100ng的总RNA，据RNA浓度可换算所需加入的体积。配制体系需在冰上操作完成，精准加样，避免操作误差。配制好的体系需点动混匀并离心，随后置于PCR扩增仪上逆转录，反应条件为37℃15min、85℃5s和4℃30min，逆转录结束后及时取出扩增产物(即为模板cDNA)，-20℃保存备用。

3.目的基因的PCR扩增：加入模板cDNA、LGALS3的3号内含子保留可变剪接特异基因的扩增引物及其他必须试剂配制反应体系在PCR扩增仪上进行扩增。各可变剪接亚型的扩增引物序列、退火温度如下(其中GAPDH作为本实验的内参)：

4.SYBR Green法qRT-PCR检测：①差异基因及内参GAPDH引物由北京全式金公司合成，分别用无核酶水溶解为10nmol/ml，备用；②按Takara荧光定量试剂盒配制qRT-PCR反应体系如下表：

③反应条件：95℃20s，然后按95℃10s、退火温度(上文)、20s和70℃30s的顺序循环40次；④分析结果：结合扩增曲线及熔解曲线判断扩增效果，利用ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，计算公式如下：

ΔΔC_t＝(Ct_{LGALS3-R基因}–Ct_GAPDH)_CML-BP/CP–(Ct_{LGALS3-M基因}–Ct_GAPDH)_CML-BP/CP

五、琼脂糖凝胶电泳分析

1.用蒸馏水将制胶工具洗干净，准备好制胶平板，用琼脂将模具边缘封闭，架好梳子；

2.琼脂糖凝胶的制作：称取2g琼脂糖以及100mL 0.5×TAE缓冲液倒入三角瓶中。放入微波炉里加热2-3min至琼脂糖完全溶化，中间需要摇匀几次。取出冷却至60左℃右，加入5μL荧光染料，混匀。倒入插有梳子的凝胶槽中。半小时后待凝胶凝固，拔出梳子。再将凝胶加样孔端置阴极段放置于电泳槽中，在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。

3.点样：用移液枪将5μL DNA marker加入第一个点样孔，吸取2μL上样缓冲液(loading buffer)(6×)加入10μL待测DNA样品中，在EP管中吹打混匀之后吸取10μL依次加入其他点样孔中。

4.电泳：打开电泳仪，调节电压100V。20min后电泳结束，取出凝胶。在凝胶成像仪上观察条带位置并比对marker判断大小。

六、LGALS3扩增产物测序与琼脂糖凝胶电泳结果对比分析。

1.分组设计

慢粒急变组(18例)和慢粒慢性期组(37例)；为减少试验误差，每例样本进行3次重复试验。

2.主要仪器与试验耗材

3.实验结果

(1)分析LGALS3可变剪接高通量测序结果

分析前期研究中我们对慢粒急变期(5例)、慢性期(5例)和正常人(5例)外周血单个核细胞总mRNA高通量测序结果，根据LGALS3可变剪接模式图(图2)在3号内含子出现内含子保留剪接模式，导致LGALS3中3号内含子保留和丢失两种剪接亚型。通过剪接结合点的分析，在慢粒急变期患者标本中LGALS3-R/M亚型之比与慢粒慢性期和正常人标本具有明显差异(图2)，提示LGALS3-R亚型可能成为慢粒急变特异性表达。

(2)qPCR结果分析

通过qPCR分析慢粒急变期(18例)、慢粒慢性期(37例)外周血单个核细胞中LGALS3-R和LGALS3-M两种剪接亚型的表达情况，结果显示在慢粒急变组中LGALS3-R亚型呈低表达(图3.A)，而在慢粒急变期中LGALS3-M亚型呈高表达(图3.B)，LGALS3-R/M亚型之比在慢粒急变期和慢性期之间具有明显差异(图3.C)，进一步确认LGALS3可变剪接可用于慢粒急变预警。

(3)琼脂糖凝胶电泳结果分析

通过琼脂糖凝胶电泳对慢粒急变期(5例)、慢粒慢性期(4例)表达情况，结果发现在慢粒急变组中低表达LGALS3-R亚型，而慢粒急变期中高表达LGALS3-M亚型(图4)。在琼脂糖凝胶水平上证实LGALS3可变剪接可应用慢粒急变。琼脂糖凝胶电泳结果显示两个剪接亚型分别在248bp和小于84bp位置处。

(4)qPCR扩增产物结果分析

为验证LGALS3的3号内含子保留剪接模式，对qPCR扩增产物进行测序(图5)。结果证实为LGALS3的可变剪接模式为3号内含子保留。综述所述LGALS3可变剪接与慢粒急变密切相关，LGALS3-R亚型在慢粒急变组中呈低表达，此外，LGALS3-R/M之比可提高慢粒急变与慢粒慢性期患者的诊断。

上述步骤为本专利的较佳实施方式，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的技术或研究人员，可在各所处知识领域内，且不脱离本专利宗旨的前提下作出相应的变化。

序列表

<110> 南昌大学第二附属医院

<120> 基于LGALS3剪接变体诊断慢粒急变期的试剂及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1975

<212> DNA

<213> 人工序列( )

<400> 2

gcccgcagca cctcctcgcc agcagccgtc cggagccagc caacgagcgg aaaatggcag 60

acaatttttc ggtaagtgtt ttatgcctgt ttcttcccct tgatcagctc cacatggttg 120

agggttgggg gttttgtttt taccatgact ttcccttttc actctcccac tgcgtggctt 180

cccctggact catttgtcca atgagggctt gcaagctgga gccttgtttt tccagcagca 240

gatttgggaa gaaagccagg cagagcgagg cctgggactc actcacagta accctttcac 300

caaaaggccc agggcggaag ggagtggact ctgccggcag gagctgagaa atcctctgag 360

tagcgggaag tgcggtacag tctgggcatt ctgatgtttg tgattgtttt tctcacggtg 420

atgaaaaagt atgtgctata agtagaggag cgctaactcc tgacttgagc taattatgaa 480

aatgcagccc tccctgatct gagacgttgg gaggcaagaa taaagtgaaa aagtatatgt 540

aatcccaaca tctaatttta gtcttagaaa ctcaaactat taataagtgg aaaaagttta 600

atgatatgca tgtaatgcct ttgccatatt cctctccttc ttagatcaca tattcctatt 660

ttcctgaaaa ttctgctttt gagaatgctt tctgtcccgt aattgtgtat gtctttcttt 720

ccagctccat gatgcgttat ctgggtctgg aaacccaaac cctcaaggat ggcctggcgc 780

atgggggaac cagcctgctg gggcaggggg ctacccaggg gcttcctatc ctggggccta 840

ccccgggcag gcacccccag gggcttatcc tggacaggca cctccaggcg cctaccctgg 900

agcacctgga gcttatcccg gagcacctgc acctggagtc tacccagggc cacccagcgg 960

ccctggggcc tacccatctt ctggacagcc aagtgccacc ggagcctacc ctgccactgg 1020

cccctatggc gcccctgctg ggccactgat tgtgccttat aacctgcctt tgcctggggg 1080

agtggtgcct cgcatgctga taacaattct gggcacggtg aagcccaatg caaacagaat 1140

tgctttagat ttccaaagag ggaatgatgt tgccttccac tttaacccac gcttcaatga 1200

gaacaacagg agagtcattg tttgcaatac aaagctggat aataactggg gaagggaaga 1260

aagacagtcg gttttcccat ttgaaagtgg gaaaccattc aaagtaaggg tttcactgtg 1320

ttagccagga tggtctcgat ctcctgacct tgtgatccac ccgcctcagc ctcccaaagt 1380

gctgggatta caggcgtgag ccaccccgcc cagcataact tggcattttt gctgtaaagt 1440

tactttctct ggatcttaac tggtcccaca aatgataagg atgaaatgtt ggacatcctg 1500

ggctcaggcc agactggttt gaaattaatg gacatttttt ccctttattt cagttgacaa 1560

aaaattgttt ctatagtgca gatgaaatat gtatatattg tggaatgcct aaatccagct 1620

gacatatgca ttacctcatg taacagttta tgtatatgcc atttcagata caagtactgg 1680

ttgaacctga ccacttcaag gttgcagtga atgatgctca cttgttgcag tacaatcatc 1740

gggttaaaaa actcaatgaa atcagcaaac tgggaatttc tggtgacata gacctcacca 1800

gtgcttcata taccatgata taatctgaaa ggggcagatt aaaaaaaaaa aaagaatcta 1860

aaccttacat gtgtaaaggt ttcatgttca ctgtgagtga aaatttttac attcatcaat 1920

atccctcttg taagtcatct acttaataaa tattacagtg aattacctgt ctcaa 1975

<210> 2

<211> 1322

<212> DNA

<213> 人工序列( )

<400> 2

gcccgcagca cctcctcgcc agcagccgtc cggagccagc caacgagcgg aaaatggcag 60

acaatttttc gctccatgat gcgttatctg ggtctggaaa cccaaaccct caaggatggc 120

ctggcgcatg ggggaaccag cctgctgggg cagggggcta cccaggggct tcctatcctg 180

gggcctaccc cgggcaggca cccccagggg cttatcctgg acaggcacct ccaggcgcct 240

accctggagc acctggagct tatcccggag cacctgcacc tggagtctac ccagggccac 300

ccagcggccc tggggcctac ccatcttctg gacagccaag tgccaccgga gcctaccctg 360

ccactggccc ctatggcgcc cctgctgggc cactgattgt gccttataac ctgcctttgc 420

ctgggggagt ggtgcctcgc atgctgataa caattctggg cacggtgaag cccaatgcaa 480

acagaattgc tttagatttc caaagaggga atgatgttgc cttccacttt aacccacgct 540

tcaatgagaa caacaggaga gtcattgttt gcaatacaaa gctggataat aactggggaa 600

gggaagaaag acagtcggtt ttcccatttg aaagtgggaa accattcaaa gtaagggttt 660

cactgtgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgaccttgt gatccacccg cctcagcctc 720

ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccccgcccag cataacttgg catttttgct 780

gtaaagttac tttctctgga tcttaactgg tcccacaaat gataaggatg aaatgttgga 840

catcctgggc tcaggccaga ctggtttgaa attaatggac attttttccc tttatttcag 900

ttgacaaaaa attgtttcta tagtgcagat gaaatatgta tatattgtgg aatgcctaaa 960

tccagctgac atatgcatta cctcatgtaa cagtttatgt atatgccatt tcagatacaa 1020

gtactggttg aacctgacca cttcaaggtt gcagtgaatg atgctcactt gttgcagtac 1080

aatcatcggg ttaaaaaact caatgaaatc agcaaactgg gaatttctgg tgacatagac 1140

ctcaccagtg cttcatatac catgatataa tctgaaaggg gcagattaaa aaaaaaaaaa 1200

gaatctaaac cttacatgtg taaaggtttc atgttcactg tgagtgaaaa tttttacatt 1260

catcaatatc cctcttgtaa gtcatctact taataaatat tacagtgaat tacctgtctc 1320

aa 1322

Claims (6)

1.用于检测LGALS3剪接变体表达水平的试剂在制备诊断慢性粒细胞白血病急变期的试剂盒中的用途，所述LGALS3剪接变体是LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型，其中，所述LGALS3-R亚型的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述LGALS3-M亚型的核苷酸序列如SEQ IDNO.2。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述LGALS3-R亚型是LGALS3的3号内含子选择性保留产生的剪接变体，所述LGALS3-M亚型是LGALS3的3号内含子选择性丢失产生的剪接变体。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的用途，其特征在于所述诊断包括以下步骤：

(a)测定怀疑处于慢性粒细胞白血病急变期的受试者外周血标本中LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型的表达量；和

(b)根据LGALS3-R亚型和/或LGALS3-M亚型的表达量，评估该受试者是否处于慢性粒细胞白血病急变期。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述评估包括：

(1)将所测定的LGALS3-R亚型的表达量与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-R亚型表达量低于阈值；或者

(2)将所测定的LGALS3-M亚型的表达量与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-M亚型表达量高于阈值；或者

(3)将所测定的LGALS3-R亚型和LGALS3-M亚型表达量之比与预确定的阈值进行比较，所测定的LGALS3-R亚型和LGALS3-M亚型之比低于阈值；

指示该受试者处于慢性粒细胞白血病急变期。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述试剂包括检测LGALS3-R亚型的核酸扩增引物和/或检测LGALS3-M亚型的核酸扩增引物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述检测LGALS3-R亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：TTGGGAGGCAAGAATAAAG，下游5'-3'：GGTTTCCAGACCCAGATAA，所述检测LGALS3-M亚型的核酸扩增引物，其引物上游5'-3'：CTTCAAACCATGGAAAATGGCA，下游5'-3'；CCATCCTTGAGGGTTTGGGT。

Images