KR20150036804A - 조기 대장암 검출을 위한 혈장 마이크로rna - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간을 대상으로 하는 결장직장 종양(colorectal neoplasia) 진단 또는 검출 방법, 바이오마커, 또는 진단 키트로서, 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 실험대상자의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들에 대한 전반적 발현 패턴과 정상적인 실험대상의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들에 대한 전반적 발현 패턴을 비교하는 및 측정하는 과정 또는 바이오마커를 포함하여, 상기 마이크로RNA들 중 miR19a, 및 miR19b, 또는 miR19a 및 miR19b 및 miR15b의 조합의 과발현(overexpression)은 대장암(colorectal cancer)을 나타내는 것을 특징으로 한다.

Description

조기 대장암 검출을 위한 혈장 마이크로RNA {Plasma MicroRNAs for The Detection of Early Colorectal Cancer}
본 발명은 본 발명은 일반적으로 대장암 검출 분야와 관련되어 있으며, 구체적으로는 조기 대장암(Colorectal Cancer) 검출을 위한 혈장 마이크로RNA에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술은은 대장암에 관련된 것으로서, 발명의 범위를 제한하지 않는다.
미국 특허출원 제 20100317533호(Lou et al. 2010)는 탄산 무수화 효소-9 (CAIX), 혈관내피세포 성장인자 C (VEGF-C), 에프린 A5 (EFNA5), eph 수용체 B2 (EPHB2), 형질전환 성장인자 베타 3 (TGF-ß3), 피루브산 탈수소 효소 키나아제 동위효소 -3 (PDK3), 탄산 무수화 효소-12 (CAXII), 케라틴 14 (KRT14), 저산소유도인자 1 알파 서브유닛 (HIF-la) 또는 테나신 C (TNC) 중 두 가지로 구성된 종양 전이 바이오마커(biomarker) 패널을 개시한다. CAIX, VEGF-C, EFNA5, EPHB2, TGF-ß3, 또는 PDK3은 중간 정도의 전이 가능성(metastatic potential)을 나타내는 지표인 한편 CAXII 또는 KRT14, HIF-la, TNC는 높은 전이 가능성을 나타내는 지표이다. 또한 전술한 바이오마커를 이용하여 종양 전이 위험을 결정하는 방식 역시 개시한다. 상기 바이오마커는 진단, 예후(prognosis), 치료 선택(treatment selection)에 사용하거나 또는 추정 치료법 테스트(test putative therapeutics)에서 사용될 수 있다. 상기 바이오마커는 유방암 등과 같은 저산소증 부위가 있는 악성 종양 또는 유방암을 평가하는 데 사용할 수 있다.
미국 특허출원 제 20100120898호(Croce et al. 2010)은 간세포 암(HCC)의 진단과 예후, 치료를 위한 방법과 구성요소 및 HCC 항암제 식별 방법을 개시한다. 상기 특허출원은 실험군이 간세포 암(HCC)이 있는지 또는 HCC로 발전될 위험이 있는지 여부를 진단하는 방법을 제공하고, 실험군의 테스트 시료에서 최소한 하나 이상의 miR 유전자 산물 단계를 측정하는 과정을 포함하며, 대조군의 해당 miR 유전자 산물 단계와 비교한 상기 테스트 시료의 miR 유전자 산물 단계 변화는 실험군이 HCC가 있는지 또는 HCC로 발전될 위험이 있는지 여부를 나타내는 지표가 된다.
미국 등록특허 제 7,939,255호(Chung)는 대장암 진단방식과 직접적으로 관련이 있다. 간단히 말하여, 상기 특허는 대장암 (CRC) 진단에 사용하는 종양억제 유전자로 대장암 (CRC) 진단방식과 예후 평가 키트를 개시하고 있으며, 상기 진단방식은 염색체에서 주기적으로 변경되는 영역(RAR)의 식별과 RAR 내 유전체 변이 검출로 이루어진다. 상기 발명은 대장암 (CRC)을 포함하여 다양한 암과 종양을 위한 조기 진단은 물론 예후 평가를 가능하게 한다.
PCT 공개 공보 제 W02011076147호(Li)에 개시된 ‘혈장 기반 Micro-RNA 바이오마커와 대장암 조기 검출 방식’은 대장암 진단과 대장암 치료효과 모니터링을 위한 혈액 내 분자 표지 인자 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 다수의 핵산 분자로 구성되고 각 핵산 분자에 마이크로RNA 마이오마커가 코드화 되어 있는 것으로 개시되어 있으며, 여기서 하나 또는 그 이상의 핵산 분자가 환자와 건강한 대조군의 혈장에서 다르게 발현되며, 하나 이상의 다르게 발현되는 핵산 분자는 모두 대장암의 존재를 보여주는 핵산 발현 바이오마커(nucleic acid expression biomarker)를 나타낸다. 상기 발명은 더 나아가 대장암 식별뿐만 아니라 예방 또는 치료를 위해 그 같은 핵산 발현 바이오마커를 사용하는 방법을 제공하며, 최종적으로 대장암 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물을 제공한다.
PCT 공개공보 제 WO2011076142호(Li, 위와 동일)에 개시된 ‘대장암 혈장 내 마이크로RNA 발현 프로파일링을 위한 조성 및 방법’은 대장암 혈장 내 마이크로RNA (miRNA) 발현 프로파일링을 위한 조성 및 방법을 설명하고 있다. 구체적으로, 상기 발명은 하나 또는 그 이상의 서로 다르게 발현된 핵산 분자가 함께 핵산 발현 시그네이처(nucleic acid expression signature)를 표현하게 되고 이는 대장암의 존재를 나타내는 지표가 되어, 대장암 진단과 암 치료 모니터링, 대장암 진단을 위한 혈액 내 분자 마커 진단 키트와 관련된다. 상기 발명은 또한 대장암 식별과 예방 또는 치료를 위해 상기와 같은 핵산 발현 시그네이처를 사용하는 방법에 관한 것이며, 최종적으로, 대장암 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
PCT 공개 공보 제 WO2011088226호(Christine)에 개시된 ‘위장장애 검출(Detection Of Gastrointestinal Disorders)’은 질환 또는 질환의 진행을 나타내는 마이크로RNA들, 소낭들(vesicles), 또는 바이오마커들을 검출함으로써 형질형을 특징짓는 방법과 시스템에 관한 것이다. 상기 질환은 대장암 등과 같은 위장장애일 수 있으며, 마이크로RNA들 또는 소낭들, 바이오마커들은 체액에서 검출할 수 있다.
Baruch 이 등록한 ‘대장암 검출 방식과 조성’이란 제목의 PCT 공개 공보 제 WO2010004562호는 대장암에 수반된 마이크로RNA 분자뿐만 아니라 이와 관련되거나 파생된 다양한 핵산 분자를 사용하여 대장암 및/또는 대장암 전구 세포의 최소 침습성(minimally-invasive) 조기 검출 실시 방법에 관한 것이다.
마지막으로 Fog 등이 등록한 ‘인간 세포 시료를 암세포로 분류하는 방법’이라는 제목의 PCT 공개 공보 제 WO2011012136호는 암과 비암 시료를 구분하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 miR-21과 miR-34a, miR-141로 구성된 Mir-군 I 에서 선택한 최소 한 개의 마이크로RNA (miR)의 레벨 검출과 테스트 세포 시료 내 miR-126과, miR-143, miR-145로 구성된 Mir-그룹 II 에서 선택한 최소 한 개의 miR 단계 검출, 테스트 세포 시료 내 전술한 miR의 발현 단계와 이전에 기록한 테스트 세트 내 동일하게 선택한 miR의 발현 단계 비교로 구성된다.
다만, 상기 방법들, 바이오마커들, 및 세트들은 초기 암세포를 정확히 검출하기 어렵고, 이용되는 검출되는 마이크로RNA양이 충분하지 않아, 대장암 치료시, 약품선택 및 진단에 어려움이 있었다. 따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
이에 본 발명은 인간을 대상으로 하는 결장직장 종양(colorectal neoplasia) 진단 또는 검출 방법으로서, 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 실험대상자에게서 하나 또는 그 이상의 생체 시료들(biological sample)을 얻는 과정; 상기 실험대상의 하나 또는 그 이상의 생체 시료들에서 얻은 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 또는 단계를 측정하는 과정; 및 상기 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 실험대상자의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들에 대한 전반적 발현 패턴과 정상적인 실험대상의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들에 대한 전반적 발현 패턴을 비교하는 과정으로서, 상기 miR19a 및 miR19b, 또는 miR19a 및 miR19b, 및 miR15b의 조합의 과발현(overexpression)은 대장암(colorectal cancer)을 나타내는 것을 특징으로 한다.
구체적으로 본 발명에 따른 하나의 실시예에서는 인간 실험대상자의 결장직장 종양을 진단 또는 검출하는 방식이 포함되어 있으며 하기와 같은 단계로 구성된다:
결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 실험대상자에서 한 개 이상의 생체 시료 획득 및 전체 발현 패턴, 또는 실험대상자의 한 개 이상의 생체 시료에서 획득한 한 개 이상의 마이크로RNA 단계 측정; 및 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 연구대상의 생체 시료에서 추출한 한 개 이상의 생체 시료의 전체 발현 패턴과 정상적인 실험대상자의 생체 시료에서 추출한 한 개 이상의 생체 시료의 전체 발현 패턴 비교, 상기 정상적인 실험대상자는 결장직장 종양을 앓고 있지 않은 건강한 실험대상자이며, 상기 miR19a, miR19b, 또는 miR19a 및 miR19b의 조합에 의한 과발현은 대장암의 지표가 될 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 방법은 정상적인 실험대상자의 발현이 결장직장 종양의 지표와 비교하여 miR18a와 miR29a, 또는 miR335들 중 적어도 하나를 분석하는 과정을 더 포함한다. 또 다른 실시예에서 상기 방법은, miR29a와miR92a, 또는 miR141 중 적어도 하나를 분석하는 과정을 더 포함할 수 있고 상세하게는, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 생체 시료는 한 가지 이상의 생체액 또는 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료, 대변 시료로 구성된 그룹에서 선택된다. 또한 상기 방법은, 우측 종양과 좌측의 병변(lesion)을 검출함으로써, 초기 CRC(early CRC, I-II)를 후기 CRC(advanced CRC, II-III 단계)만큼 정확히 검출할 수 있으며, 상기 방법은 또한, 90 또는 91, 92, 93, 94, 95% 이상의 신뢰구간(confidence interval)을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는, 이 방법은 또한, 하기에서 선택한 결장직장 종양에서 저발현(underexpressed)된 마이크로RNA의 발현 단계를 결정하는 과정을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00001
또 다른 측면에서 상기 방법은 또한, 하기에서 선택한 결장직장 종양에서 과발현(overexpressed)된 마이크로RNA의 발현 단계를 결정하는 과정을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00002
또 다른 측면에서 상기 방법은, 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA 발현 단계는 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 역전사 효소 실시간 PCR(reverse transcriptase real-time PCR), 실시간 정량 PCR(quantitative real-time PCR), 평가변수 PCR(end-point PCR), 다중 평가변수 PCR(multiplex end-point PCR), 콜드 PCR(cold PCR), 아이스 콜드 PCR(icecold PCR), 질량 분석법, 가시적 분자결합화 (ISH), 복합 가시 분자결합화 또는 핵산 시퀸싱(nucleic acid sequencing)을 통해 측정한다. 또 하나의 측면에서 상기 방법은, 결장직장 종양 위험이 있거나 종양이 있는 환자의 치료와 결장직장 종양 위험이 있거나 종양이 있는 환자를 위한 항신생물제 치료 선택, 환자를 결장직장 종양의 하부군으로 계층화하거나 또는 결장직장 종양 치료 임상시험을 위한 계층화, 결장직장 종양 치료요법에 대한 저항 또는 반응 결정, 결장직장 종양 진단 키트 개발 또는 이의 조합에서 사용한다. 또 다른 측면에서 상기 방법은, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 또는 단계는 표 2, 3, 4, 및 5에서 선택되어, 상기 마이크로RNA들의 결장직장 종양, 결장직장 종양의 결정 또는 진단, 검출 특이성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 측면에서 상기 방법은, 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 또는 단계를 예후, 치료 안내, 또는 결장직장 종양 치료에 대한 반응 모니터링에 사용하는 과정을 더 포함할 수 있다.
하지만 본 발명의 또 다른 실시예는 결장직장 종양 질병 진행, 전이에 대한 바이오마커를 들 수 있으며 이 두 가지 바이오마커는 결장직장 종양의 질환 진행, 전이, 또는 상기 진행 및 전이 바이오마커(biomarker)로서, 상기 바이오마커는 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들을 포함하고 있고, 환자로부터 입수한 결장직장 종양 세포의 상기 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들과 상기 입수 시점의 이전 시점에 상기 활자로부터 입수된 결장직장 종양 세포 또는 일반 결장직장 종양 세포의 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들과 비교하여 전체 발현 변화가 결장직장 종양 질환의 진행의 지표가 되고, 상기 miR19a 및 miR19b, miR19a 및 miR19b, 및 miR15b의 조합의 과발현은 대장암의 지표가 될 수 있다. 상세하게는, 상기 바이오마커는 하기에서 선택되고 결장직장 종양에서 저발현(underexpressed)된 마이크로RNA들을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00003
또 다른 측면에서, 상기 바이오마커는 결장직장 종양에서 과발현(overexpressed)되고, 하기에서 선택되는 마이크로RNA들을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00004
또 다른 측면에서, 상기 바이오마커는 결장직장 종양에서 저발현(underexpressed)되고, 하기에서 선택되는 마이크로RNA들을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00005
또 다른 측면에서, 상기 바이오마커는 결장직장 종양에서 과발현(overexpressed)되고, 하기에서 선택되는 마이크로RNA들을 더 포함할 수 있다:
Figure pat00006
통상의 기술자는 생물학적 바이오시그니처(분석) 대부분이 종종 과발현 및 저발현 마이크로RNA들의 조합을 포함하고 있음을 인식한다. 이러한 이유로, 한 가지 측면에서 본 발명은 또한, 각각의 마이크로RNA에서 과발현 및 저발현 마이크로RNA 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 생체 시료는 생체액 또는 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료, 대변 시료로 구성된 군에서 하나 또는 그 이상의 선택될 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 바이오마커를 사용하는 방법은 초기 CRC (I-II 단계)를 후기 CRC (II-III 단계)의 우측 종양(tumors)들과 좌측 병변(lesion) 만큼 정확히 검출할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 바이오마커는 표 2, 3, 4 및 5의 마이크로RNA들 중에서 선택된 결장직장 종양을 진단하고 검출하기 위하여 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 마이크로RNA들의 발현 패턴 또는 발현 단계 검출 및 분석을 더 포함하며, 상기 마이크로RNA들은 결장직장 종양의 결정 또는 진단, 검출 특이성을 증가시킬 수 있다.
그러나, 본 발명의 또 다른 실시예로는 miR19a 및 miR19b, 또는 miR19a 및 miR19b, 및 miR15b 마이크로RNA들의 조합의 과발현에 대한 차동(differential) 발현 단계 판별용 바이오마커 검출 시약(biomarker detecting reagent)을 포함하는 결장직장 종양 진단 키트로서, 상기 miR19a 및 miR19b, 또는 miR19a 및 miR19b, 및 miR15b 마이크로RNA들의 조합의 과발현은 결장직장 종양을 나타내고, 대장암의 신뢰 구간은 90% 이상일 수 있다. 한 가지 측면에서, 상기 키트는 적어도 miR18a, miR29a 또는 miR335 중 어느 하나의 분석 또는 검출을 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 또 한 가지 측면에서, 상기 키트는 적어도 miR29a, miR92a 또는, miR141 중 어느 하나의 분석 또는 검출을 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 결장직장 종양을 앓고 있지 않은 건강한 실험대상인 정상 실험대상(normal subject)에서 입수한 시료의 발현 레벨과 결장직장 종양이 의심되는 실험대상으로부터 입수한 시료의 발현을 측정할 때 마이크로RNA들의 발현 단계을 비교하는 단계별 지침을 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 생체액 또는 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료, 대변 시료로 구성된 군에서 하나 또는 그 이상의 선택된 도구, 용기, 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 키트는 결장직장 종양으로 저발현(underexpressed)되고 하기에서 선택된 마이크로RNA들의 분석 시료를 더 포함할 수 있다:
Figure pat00007
또 다른 측면에서, 상기 키트는 결장직장 종양으로 과발현(overexpressed)되고 하기에서 선택된 마이크로RNA들의 분석 시료를 더 포함할 수 있다:
Figure pat00008
또 다른 측면에서, 상기 키트는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 또는 단계는 결장직장 종양 진단 또는 검출을 위해 결정하는 시약을 더 포함할 수 있다.
하지만 본 발명의 또 다른 실시예로는, 결장직장 종양을 가지고 있는 실험대상의 시료를 입수하는 과정; 상기 시료와 정상 실험대상의 생체 시료의 발현 단계를 비교하여 miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a, 및 miR335의 발현 단계를 결정하는 과정으로서, 상기 정상 실험대상은 결장직장 종양을 앓고 있지 않은 건강한 실험대상이고, 마이크로RNA의 과발현은 대장암의 지표인 과정; 및 환자의 졀정직장 종양의 상기 결정에 근거하여 암 치료법을 선택하는 과정을 포함하는 결장직장 종양으로 진단된 환자의 암 치료법 선택 방법일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로는, 질병 상태(disease state) 치료 시 유용하게 사용될 것으로 확실시되는 후보 약품(candidate drug)을 평가하기 위하여 하기 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 임상 실험 수행 방법을 들 수 있으며 이 방법은 하기와 같은 과정을 포함할 수 있다: (a) 환자로 이루어진 하나의 실험대상군에서 입수한 마이크로RNA들의 단계를 측정하는 과정으로서, 상기 마이크로RNA들은 miR19a 및 miR19b, 또는 miR 19a 및 miR 19b, 및 miR 15b 마이크로RNA에서 선택된 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들 (b) 상기 실험대상군에서 제 1 하위 실험대상군에 후보 약물 (candidate drug) 투여, 및 제 2 하위 실험대상군에 플라시보(placebo) 투여; 또는 제 2 하위 실험대상군에 비교 약물 투여(comparator drug), 및 또 다른 활성 시료를 제 2 실험대상군에 투여 (c) 상기 후보 약물, 상기 플라시보, 또는 상기 비교 약물 투여 후 단계 (a) 반복 및 (d) 제 2 하위 실험대상군에서 발현하는 것과 대조하여 마이크로RNA들이 통계학적으로 중요한 발현 변화를 보인 결장직장 종양 세포 수를 감소하는지 여부 결정으로서, 상기 통계학적으로 중요한 발현 변화는 후보 약품이 언급한 질병 상태 치료 시 유용하게 사용되는 것의 지표인 발현 변화일 수 있다.
나아가 본 발명의 또 다른 실시예로, 하기의 과정을 포함하는 인간 실험대상 내 결장직장 종양 진단 또는 검출 방법일 수 있다: 결장직장 종양을 앓고 있거나 앓고 있을 것으로 의심되는 인간 실험대상 식별하는 과정; 상기 실험대상에서 입수한 하나 또는 그 이상의 생체 시료 입수하는 과정으로서, 상기 생체 시료는 하나 또는 그 이상의 생체액(biological fluid), 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료 또는 대변 시료로 구성된 군에서 하나 또는 그 이상 선택된 생체시료; miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a, 및 miR335의 전체 발현 패턴 또는 단계 측정 과정; 및 결장직장 종양을 앓고 있을 것으로 의심되는 실험대상의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴과 정상 실험대상의 생체 시료에서 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 비교로서, 상기 정상 실험대상은 결장직장 종양을 앓고 있지 않은 건강한 실험대상이고, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a 및 miR335에 대한 조합의 과발현은 대장암을 나타낸다.
또한 본 발명의 또 다른 실시예로, 결장직장 종양을 앓고 있거나 앓고 있을 것으로 의심되는 인간 실험대상을 식별하는 과정; 상기 실험대상으로부터 하나 또는 그 이상의 생체 시료 입수하는 과정으로서 상기생체시료는 하나 또는 그 이상의 생체액, 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료 또는 대변 시료에서 선택되는 과정; 및 하기에서 선택된 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전반적 발현 패턴 또는 단계 측정 과정을 포함하는 인간 실험대상에서 결장직장 종양 진단 또는 검출 방법을 들 수 있다:
Figure pat00009
Figure pat00010
상기 ROC는 곡선 아래 영역(AUC) 매개변수, CI는 95% 신뢰 구간, S는 감도, Sp는 특이성이다; 또한 결장직장 종양을 앓고 있을 것으로 의심되는 실험대상의 생체 시료에서 입수한 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴과 정상 실험대상의 생체 시료에서 입수한 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 비교로서, 상기 실험대상의 생체 시료에서 입수한 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 변화는 결장직장 종양을 나타낸다. 상세하게는, 상기 마이크로RNA들은 결장직장 종양으로 저발현(underexpressed)되고 하기에서 선택된다:
Figure pat00011
또 다른 측면에서, 상기 마이크로RNA들은 결장직장 종양에서 과발현(overexpressed)되고 하기에서 선택될 수 있다:
Figure pat00012
또 다른 측면에서, 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 발현 단계는 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 역전사 효소 실시간 PCR(reverse transcriptase real-time PCR), 실시간 정량 PCR(quantitative real-time PCR), 평가변수 PCR(end-point PCR), 다중 평가변수 PCR(multiplex end-point PCR), 콜드 PCR(cold PCR), 아이스 콜드 PCR(icecold PCR), 질량 분석법, 가시적 분자결합화 (ISH), 복합 가시 분자결합화 또는 핵산 시퀸싱(nucleic acid sequencing)을 통해 측정될 수 있다. 또 다른 측면에서 상기 방법은, 결장직장 종양 위험이 있거나 결장직장 종양이 있는 환자의 치료와 결장직장 종양 위험이 있거나 결장직장 종양을 앓고 있는 환자를 위한 항신생물제 치료(anti-neoplastic agent therapy) 선택(예. 핵산 가교제, 소분자, 세포를 죽이는 페이로드의 유무와 상관 없이, 타깃 또는 미 타깃 모두에서 단클론 항체 등과 같은 생물학적 제제), 환자를 결장직장 종양의 하부군으로 계층화(stratifying), 결장직장 종양 치료 임상시험을 위한 계층화, 결장직장 종양 치료요법(therapeutic regimen)에 대한 저항 또는 반응성 결정, 또는 결장직장 종양 진단 키트 개발 또는 이들의 조합에 사용되는 방법일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 결장직장 종양 진단 또는 검출을 위해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 마이크로RNA들의 전체 발현 패턴 또는 단계는 결장직장 종양 진단 또는 검출을 위해 결정될 수 있다.
본 발명의 특징과 장점을 더 완벽하게 이해하기 위해, 관련 도면과 함께 발명 세부설명을 참조한다:
도 1A 및 도 1B에는 CRC를 앓고 있는 환자와 세트 1 (도 1A)의 대조군 간 그리고 AA를 앓고 있는 환자와 대조군 (도 1B) 간의 마이크로어레이(microarray)에 의해 다르게 나타나는 miRNA 발현이 도시되어 있다. 적외선 열상 지도(heatmap)는 가장 높은 FC를 갖는 50개의 비조절된 miRNA가 도시되어 있다. 붉은색 픽셀은 지시된 혈장 시료에 증가한 miRNA 레벨에 해당하는 반면, 녹색 픽셀은 감소한 miRNA 레벨을 나타낸다;
도 2에는 miRNA 발현 프로파일링에 근거하여 클러스터링(clustering)된 시료가 표시된 그룹 간 분석 (BGA) 결과가 도시되어 있다. 건강한 대조군 (C); 대장암 환자군 (CRC); 고급 선종(advanced adenoma)(AA)을 보유한 환자군;
도 3에는 qRT- PCR에 의해 결정된 CRC 세트 2에서 혈장 miRNA 발현을 나타내는 상자 도가 도시되어 있다. miRNA의 발현 단계는 miR16으로 정상화되며 -dCt 값으로 표시된다. 상자 안쪽의 선들은 중간 값을 의미한다. 이 상자들은 25번째 및 75번째 백분위수 사이의 차이를 나타낸다; 및
도 4A 및 도 4B에는 CRC 세트 1에서의 마이크로 어레이 프로파일링 및 CRC 세트 2에서의 qRT-PCR 데이터로부터 입수한 결과에 따른 두 가지 혈장 miRNA 시그니처 (miR19a+miR19b) (도 4A) 및 세 가지 혈장 miRNA 흔적 (miR19a+miR19b+miR15b) (도 4B)에 대한 수신자 조작 특성 (ROC) 분석 방법이 도시되어 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
본 발명을 쉽게 이해할 수 있도록 아래에 여러 용어를 정의하였다. 본 명세서에 정의되어 있는 용어는 본 발명과 관련된 분야에서 통상적인 기술을 보유하고 자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. "하나(a, an)" 및 "그것(the)"은 단수 실체만 나타내려고 의도한 것은 아니며 설명을 위해 특정한 예제를 활용할 수 있는 일반적인 등급의 의미를 포함한다. 본 명세서에 제공된 용어는 발명의 특정한 실시예를 설명하는데 사용하지만 이를 사용한다고 해서 청구항에 개괄적으로 설명된 사항들을 제외하고는 해당 발명의 범위를 제한하지 않는다.
약어: 고급 선종(adveanced adenomas); AA, ROC 곡선 아래 영역(area under the ROC curve); AUC, 그룹 간 분석(between group analysis); BGA, 대장암(colorectal cancer); CRC, 폴드 변화(fold-change); FC, 마이크로어레이 데이터의 선형 모델(linear models for microarray data); LIMMA, 마이크로RNA; miRNA, 수신자 조작 특성(receiver operating characteristics) 곡선; ROC 곡선.
본 명세서에 사용된 "대장암(colorectal cancer)" 및 "결장직장 종양(colorectal neoplasia)" 용어에서 대장암은 대장암을 소장 아래 장관 (즉, 맹장, 상행 결장, 하행 결장, S자 결장, 직장 포함하는 대장(결장)) 세포의 암으로 특징 지워지는 의학적 상태를 의미하는 일반적인 의학적 정의를 포함하며, 종양 (고급 선종으로도 표현함), 초기 단계 및 말기 단계 암에 대한 정의를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용한 "대장암"이라는 용어는 추가로 십이지장과 소장(공장, 회장)의 세포 암이 특징인 의학적 상태를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "조직 시료(tissue sample)" ("조직(tissue)"과 "조직 시료(tissue sample)"는 같은 의미로 사용됨)라는 용어는 개별적 또는 어떠한 구조를 갖는 복합 형태 또는 특정한 화학 물질과 관련된 한 개 이상의 세포로 구성된 물질을 포함하는 것으로 간주된다. 이러한 정의는 생체 또는 기관 물질 및 세포 하위 부분, 산물 또는 부산물을 모두 포함한다. "조직 시료(tissue sample)"에 대한 정의는 정액, 정자, 배아 및 혈액 구성 요소를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 목적상 "조직(tissue)"이라는 정의에 피부 표피층과 같이 세포에 기원을 두지만 더 이상 세포로 특징지어지지 않는 특정하게 지정된 무세포성 구조물의 정의가 포함된다. 본 명세서에 사용되는 "대변(stool)"이라는 용어는 임상학적 용어로 인간이 배출한 분뇨를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "유전자(gene)"라는 용어는 기능성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 부호화 단위를 나타낸다.
해당 분야의 전문가들이 이해하고 있는 바와 같이 이러한 기능적인 용어는 유전적 결과물, cDNA 결과물 또는 이 결과물의 단편 또는 조합을 포함하고 인간이 조작하여 변경할 수 있는 결과물을 비롯한 유전자 산물을 포함한다. 정제 유전자, 핵산, 단백질 등은 일반적으로 관련되어 있는 하나 이상의 핵산 또는 단백질에서 식별하고 분리한 이러한 객체를 언급하는 데 사용된다. "대립 형질(allele)" 또는 "대립 형태(alleic form)" 는 동일한 기능 단백질을 부호화하지만 동일한 유전자의 또 다른 버전과 상대적으로 뉴클레오티드에서의 차이를 포함하는 유전자의 다른 형태를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 "마이크로RNA" ("miRNA" 또는 "miR") 용어는 RNA (또는 RNA 유사체)로 언급되며 이는 내생의 비 부호화 유전자 산물로 구성된다. 이 유전자 산물에서 전구 RNA 전사가 작은 스템 루프를 구성할 수 있고 이 형태에서 성숙된 "miRNA들"이 다이서(Dicer) 등에 의해 절단된다. "miRNA들"은 상기 miRNA들이 발현을 조절하는 mRNA들과 뚜렷이 구분되는 유전자로 부호화된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "핵산(nucleic acid)" 또는 "핵산 분자(nucleic acid molecule)" 라는 용어는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효로 연쇄반응(PCR)에 의해 생성된 단편 및 결찰, 절제, 엔도뉴클리아제 반응 및 엑소노클리아제 반응에 의해 생성된 단편 등의 폴리 뉴클레오티드를 나타낸다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드 (예: DNA 및 RNA), 또는 자연 발생 뉴클레오티드 유사체 (예: 자연 발생 뉴클레오티드의 이성질체) 또는 이들 두 조합인 단량체로 구성될 수 있다. 수정된 뉴클레오티드는 당부분 및/또는 피리미딘 또는 푸린 염기 부분에서 변경이 있을 수 있다. 예를 들어, 당 수정으로는 할로겐, 알킬군, 아민이 포함된 하나 이상의 하이드록실군 및 아지도군의 교체를 포함한다. 또는 당은 에테르나 에스테르로 기능을 분류할 수 있다. 또한, 전체 당 부분은 아자당과 탄소환상당 유사체와 같이 입체 구조적 및 전자적으로 유사한 구조물로 대체될 수 있다. 염기 부분의 개조에 대한 예로는 알킬화 푸린 및 피리미딘, 알실화 푸린 또는 피리미딘 또는 기타 잘 알려진 이종환식 대용물을 들 수 있다. 핵산 단량체는 인산디에스테르 결합 또는 이러한 연동 유사체에 의해 연동될 수 있다. 인산디에스테르 유사체 연동으로는 포스포로티오에이트, 포스포로다이싸이오에이트, 포스포로솔레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로애니로씨이오에이트 등을 들 수 있다. "핵산 분자(nucleic acid molecule)" 라는 용어는 소위 "펩티드 핵산(peptide nucleic acids)" 이라는 용어의 의미를 포함하는데 이는 폴리아미드 중추 부분에 부착되는 자연 발생 또는 개조 핵산 염기를 구성한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 하나로 되어 있을 수 있다.
여러 실시예로 본 명세서에 사용된 "바이오마커(biomarker)"라는 용어는 신체의 특정한 생화학적 성질을 의미하며 이는 질병 진단 및 진행 과정 또는 치료 효과 측정에 유용하게 사용되는 특정한 분자 특성을 갖는다. 예를 들어, 개인이 숨쉴 때 나타나는 일반 신진대사 또는 바이오마커 및 아세트알데히드 (출처: 에탄올, X-트레오닌, 진단: 중독), 아세톤 (출처: 아세토아세테이트, 진단: 식이요법/당뇨), 암모니아 (출처: 아미노산 이탈, 진단: 요독증 및 간 질환), CO (일산화탄소) (출처: CH2CI2, 증가된 % COHb, 진단: 실내 공기 오염), 클로로포름 (출처: 할로겐제), 다이클로로벤젠 (출처: 할로겐제), 다이에틸아민 (출처: 콜린, 진단: 창자 세균 과대 증가), H (수소) (출처: 창자, 진단: 락토오스불내증), 이소프렌 (출처: 지방산, 진단: 신진대사 스트레스), 메테인싸이올 (출처: 메티오인; 진단: 창자 세균 과대 증가), 메틸에틸케톤 (출처: 지방산, 진단: 실내 공기 오염/다이어트), O-톨루이딘 (출처: 암종 대사산물, 진단: 기관지원성암종), 팬탄 황화물 및 황화물 (출처: 지질과산화, 진단: 심근 경색), H2S (출처: 신진대사, 진단: 치주 질환/배란 장애), MeS (출처: 신진대사, 진단: 간경변) 및 Me2S (출처: 감염, 진단, 참호성 구강염) 등을 포함하지만 이에 국한되지 않고 신진대사를 제공하는 개인의 각각의 진단 상태를 들 수 있다.
연구군 간 "통계학적으로 중요한(statistically significant)" 차이 용어는 적절한 통계 분석 방법(예: 카이-제곱 테스트, t-테스트)을 사용할 때 동일한 그룹의 발생 가능성 조건 차이가 5% 이내 즉, p<0.05인 것과 관련이 있다. 달리 말해, 무작위 근거에 대한 동일한 결과 획득 가능성이 100회 시도에서 5 이내인 것을 의미한다.
"키트(kit)" 또는 "테스트 키트(testing kit)"는 분석에 필요한 시약과 보조제 조합을 의미한다. 테스트 키트가 여러 장치의 대부분 단위로 구성되더라도 각각의 단위 분석 요소들 또한 사용 가능하고, 마찬가지로, 상기 요소들도 테스트 키트로 간주되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)" (PCR)이라는 용어는 참조 명세서로 통합된 K.B. Mullis, U.S. 특허 번호. 4,683,195, 4,683,202 및 4,965,188에서 사용하는 방법을 의미하며 이는 복제 또는 정제 과정 없이 유전체 DNA 혼합 과정에서 대상 시퀀스의 세그먼트 농도를 증대시키는 방법을 나타낸다. 대상 시퀀스 증폭 과정은 바람직한 대상 시퀀스를 포함하고 있는 DNA 혼합물에 올리고핵산염 프라이머 2개를 과도하게 유도하는 과정으로 구성되며 이 과정은 DNA 폴리머라아제 존재 시 정교한 열 순환 시퀀스가 뒤따른다. 두 개의 프라이머는 이중 가닥으로 되어 있는 대상 시퀀스의 각각의 가닥을 보완한다. 증폭 효과를 제공하도록 혼합물은 변질되고 프라이머는 대상 분자 내의 보완 시퀀스까지 열처리된다. 열처리 후, 프라이머는 새로운 쌍의 보완 가닥을 형성하도록 폴리메라아제와 함께 확장된다. 변질 단계, 프라이머 열처리 및 폴리메라아제 확장을 여러 번 반복 (즉, 변질, 열처리 및 확장 단계는 하나의 "주기"를 구성하고 거기에 여러 "주기"가 존재할 수 있음)하여 바람직한 대상 시퀀스의 증폭된 세그먼트에 대한 높은 농도를 얻을 수 있다. 바람직한 대상 시퀀스의 증폭된 세그먼트 길이는 서로 관련되어 있는 프라이머의 상대적 위치를 통해 결정되므로 이 길이는 제어 가능한 매개변수이다. 이 프로세스의 반복적 특성 때문에 이 방법은 "중합효소 연쇄반응" (이하 PCR)으로 언급된다.
본 명세서에 사용되어 있는 바와 같이, 또 다른 측면에서, 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA들의 발현 단계는 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 역전사 효소 실시간 PCR(reverse transcriptase real-time PCR), 실시간 정량 PCR(quantitative real-time PCR), 평가변수 PCR(end-point PCR), 다중 평가변수 PCR(multiplex end-point PCR), 콜드 PCR(cold PCR), 아이스 콜드 PCR(icecold PCR), 질량 분석법, 가시적 분자결합화 (ISH), 복합 가시 분자결합화 또는 핵산 시퀸싱(nucleic acid sequencing)을 통해 측정할 수 있다. 하지만 마이크로RNA 발현을 판별하는 다른 기법, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명, 형광 공명 효과(전송, ?칭 및 이종) 또는 위에 열거된 차세대 기법 및 이들 조합을 사용할 수 있으며 이들 모두는 본 발명 범위 내에 해당한다. 하나 또는 그 이상의 마이크로RNA 발현에 대한 전체 단계를 활용하여 결장직장 종양 존재 여부 판별 가도 및 품질을 높일 수 있다. 예를 들어, 측정한 마이크로RNA 수를 늘려 즉, 마이크로RNA를 보다 많이 측정 (예를 들어, 2개: 8개 또는 15개: 30개) 감도를 늘릴 수 있고 발현 레벨 구역에서 숙련된 기능 보유자에게 알려진 바와 같이 판별 품질을 동시에 늘릴 수 있다는 견해가 일반적이다. 숙련된 기능 보유자는 생물학적 시그니처(분석) 대부분이 종종 과발현 및 저발현 마이크로RNA 조합을 포함하고 있음을 인정한다. 이러한 이유 때문에, 한 가지 측면에서 본 발명 또한 각각의 마이크로RNA에서 과발현 및 저발현 마이크로RNA 조합을 포함한다.
본 발명은 예후와 치료 안내, 치료에 대한 반응 모니터링, 임상시험 및 연구, 두 가지 결합에서의 사용을 포함하거나 또는 그 보다 더 확장되어 환자의 진단과 치료를 위해 사용할 수 있다. 숙련된 기술자는 여기서 식별된 마이크로RNA의 검출이 상기 사용 예에서 사용할 수 있음을 인식할 것이다.
마이크로RNA (miRNA)는 유전자 발현의 조절자로서 기능하는 20~22개의 뉴클레오티드로 구성된 매우 잘 보존된, 내생성의 코딩되지 않은 작은 RNA 분자이다. 최근의 증거는 miRNA가 세포 발전과 분화, 확산, 사멸 등 다양한 매우 중요한 세포 과정을 제어함을 보여준다. 이것들은 종양 형성 유전자 또는 종양 억제 유전자로 작용하여 인간 암의 시작 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다[l].
암을 포함한 다양한 인간 병리학에서 다양한 조직 내 miRNA의 발현 프로파일 변화가 관찰되고 있다. 현재까지, miRNA 조직 프로파일링에 의해 분석된 각 유형의 종양은 정상 세포와 비교하여 동일 조직과 크게 다른 miRNA 프로파일을 나타내며[2-4] 또한 일부 최근의 보고는 miRNA가 인간과 다른 동물의 혈청과 혈장 내에 존재함을 입증하고 있다[5-7]. miRNA의 순환 단계는 동일 종의 개인 간에 상당히 안정적이고 재현 가능하고 일관된다[5]. 따라서 miRNA가 순환했을 때 발현 프로파일링은 암 또는 다른 질환 진단을 위한 순수한 비침습성 전략으로 훨씬 더 많이 사용된다는 사실을 알 수 있다.
대장암 (CRC)은 서양 국가에서 두 번째로 흔한 암이며 암 관련 사망 원인으로 두 번째 위치를 차지하고 있다[8]. 다행히, 평균 위험 개인 조사를 통해 조기 암 검출 및 암 전구체 장애를 제거하여 치사율과 사고 발생률을 줄일 수 있다는 명백한 증거가 존재한다[9]. 실제로, 조사 프로그램을 실시하는 목적은 초기 단계 CRC 및 침습성 병변(invasion lesion)으로 진행될 수 있는 높은 위험과 관련된 전구체 장애인 고급 선종 (AA)을 검출하는 데 있다.
최근, CRC 조사를 위한 최적의 그리고 범 세계적으로 수용된 전략이 존재하지 않고[10,11] 대변 기반 테스트는 제한적인 감도로 제약을 받으며 대장내시경은 침습성 접근방식을 구성[12]하므로 현재 전략을 보완하고 개선할 수 있는 접근방식이 시급한 실정이다. 이와 관련하여 이전 연구를 통해 CRC를 앓고 있는 환자의 혈장에서 일부 miRNA가 증대되었고 비침습성 바이오마커 (13-16)로서의 잠재적 역할이 필요하다는 사실을 알 수 있었다. 하지만 이는 소수의 miRNA를 분석하는 것에만 국한되어 있었다. 따라서 높은 산출량 기법을 통해 혈장 miRNA 프로파일링을 추가로 특징화하고 CRC 및/또는 암 전구체 장애를 앓고 있는 환자를 검출하는 과정에서 성과 특성을 평가하는 작업이 반드시 필요하다. 현재 연구에서, CRC 또는 AA를 앓고 있는 환자 세트와 건강한 개인에 대해 마이크로어레이 방법으로 혈장 miRNA 프로파일링을 수행하여 miRNA 군에서 뚜렷한 높은 성능을 가지고 결장직장 종양을 앓고 있는 환자를 검출해 낼 수 있다는 사실을 파악했다. 독립적인 개인 집단을 확인하고 다른 기법을 활용한 결과 CRC의 비침습성 진단을 위한 매우 신뢰성 있는 생체 지표로 6 혈장 miRNA를 사용할 수 있음을 확인했다.
miRNA를 순환시킨 결과 암 또는 기타 질환의 진단을 위한 순수 바이오마커로써 이 miRNA가 높은 신뢰성을 보인다는 사실을 알 수 있었다. 대장암 (CRC) 조사를 위한 현재 전략을 보완하고 개선하는 새로운 비침습성 접근방식이 시급한 실정이다. CRC 또는 진행된 대장선종 (AA)와 같은 전구체 장애를 앓고 있는 환자 세트를 비롯한 개인 (n=61)과 건강한 실험대상을 대상으로 마이크로 어레이 방법을 통해 전체 유전체 혈장 miRNA 발현 프로파일링을 수행했다. 실시간 qRT-PCR을 사용하여 다른 병원의 독립적 환자 집단 (n=135)에서 선택한 miRNA 발현을 검증하였다. CRC 또는 AA가 있는 환자가 대조군에 비해 상당히 다른 혈장 miRNA 발현 프로파일을 보였다. 13 miRNA 군을 선택하여 독자적인 환자군을 검증했으며 이 중 6명이 CRC 군에서 상당히 과발현된 것으로 확인된 바, 이는 뚜렷한 고도의 정확성을 의미한다. 이러한 6개의 miRNA들 중 하나를 확인한 결과 AA를 앓고 있는 환자에게서 상당히 과발현된 것으로 나타났다. 이는 약간의 뚜렷한 성능을 보인다.
두 병원(스페인 카탈로니아 Hospital Clinic of Barcelona 및 스페인 기푸수코아 Hospital of Donostia)의 총 273명의 대상자가 이 연구에 참여했다. 가족력이 있는 대장폴립증 또는 린치 증후군 이상 진단, 10개 이상의 대장선종 존재, 대상자 선정 시점에 다른 부위의 암 진단, 염증성 장 질환 발현, 혈액 샘플 채취 시 화학 치료 또는 방사선 치료 경험, 대장 검사 미완료, 진단 대장내시경 시 부적절한 장 준비 또는 혈장 시료에서 용혈 존재 등의 이유로 인해 이 중 77명이 제외되었다. 최종적으로 하기와 같이 196명의 대상자만 이 연구에 참여했다. 산발성 결장직장 종양 (CRC의 경우 63명 및 AA의 경우 40명)으로 새로 진단 받은 123명의 환자 및 개인적인 암 병력이 없고 최근 대장대시경을 통해 산발성 전구체 장애가 없는 것으로 확인된 73명의 건강한 개인. AA를 앓고 있는 환자는 최소 10 mm이상 크기를 갖거나 높은 등급의 선종 장애를 갖거나 20% 이상 융모성 성분을 가진 선종을 가지고 있는 환자였다. 이러한 개인들을 두 개의 서로 다르고 관련이 없는 세트 즉, 전체 유전체 혈장 마이크로RNA 발현 프로파일링을 수행한 Hospital Clinic of Barcelona 병원의 61명 실험대상으로 구성된 세트 1에서 얻은 결과를 추가로 검증하기 위해 선택한 Hospital of Donostia 병원의 135명 실험대상으로 구성된 세트 2로 구분하였다. 참가자 특성은 표 1에 제시되어 있다. 모든 개인에 대해 내시경 또는 시술을 시작하기 전 혈액 시료를 채취했다.
세트 1 (마이크로 어레이) 세트 2 (qRT-PCR)
대조군 (n=20) 종양 (n=41) 대조군 (n=53) 종양 (n=82)
평균 연령 (SD) 60.6 (12.5) 72.5 (9.7) 62.1 (3.5) 62.8 (6.3)
성별 수
남성 11 20 26 42
여성 9 21 27 40
대장암 특징
환자 수 - 21 - 42
TNM 단계 수
I - 4 - 8
II - 8 - 13
III - 6 - 16
IV - 3 - 5
위치 수
근위부 - 10 - 14
말단부 - 11 - 28
선종 특징
환자 수 - 20 - 40
1 cm 미만 크기 환자 수. - 20 - 36
평균 크기 (mm) - 22.4 - 11.5
높은 등급의 형성 장애 환자 수 3 - 0
융모성 성분 환자 수 - 10 - 23
고착 형태 환자 수. - 10 - 5
본 연구는 바르셀로나 병원 임상 윤리 위원회 (Institutional Ethics Committee of Hospital Clinic of Barcelona)의 승인(승인 날짜: 03/26/2009)을 받았으며, 헬싱키 선언문(Declaration of Helsinki)에 따라 임상시험대상자 동의서를 모든 참가자로부터 받았다.
혈장 시료에서 RNA 추출. 각 참가자의 총 혈액 중 20 ml를 EDTA 튜브로 수집하였다. 혈장 분리 시까지 혈액 시료를 4 ℃로 유지했고 혈액 체취 후 6시간 이내에 혈장을 냉동 처리하였다. 간단히 말해, 혈액 세포를 스핀 다운하기 위해 시료를 4 ℃에서 10분 동안 1,600 xg로 원심 분리했고 혈장을 새 튜브로 옮겨 세포 구성 요소를 완전히 제거하기 위해 4 ℃에서 10분 동안 16,000 xg로 추가 원심 분리하였다. 그 하기에 혈장을 부분 표본을 채취해 사용할 때까지 분주(aliquoted)하고, -80 ℃에서 보관하였다. 하기와 같이 수정된 제조업체 프로토콜에 따라 Trizol LS 시약 (Invitrogem, Carlsbad, CA) 및 miRNeasy Mini 키트 (Qiagen, Hilden, 독일)을 사용하여 소형 RNA(small RNAs)들을 포함하고 있는 총 RNA를 550 ㎖ 혈장에서 분리하였다. Trizol LS 시료를 2:1 용적 비율로 혈장 시료에 첨가하였다. 클로로포름 첨가 및 원심분리에 의한 위상 분리(phase separation) 및 원심 분리 후, 수상(aqueous phase)을 분리하여 새 튜브에 넣고, 1 용적 해당하는 Trizol LS 추가로 첨가하였다. 두 번째 위상 분리 후, 100% 에탄올 1.5 용량을 수상에 첨가하였고 제조업체 지침에 따라 혼합물을 miRNeasy 칼럼에 넣었다. DNase 치료 (Qiagen)를 수행하여 오염된 DNA를 모두 제거하였다. 최종 용리 용적(elution volume)은 30 ㎖였다. NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, DE)을 사용해 모든 시료에서 RNA 농도를 정량화했으며 이는 3 ~ 35 ng/㎖ 범위 내에 있었다. 하기의 다음 단계에서 사용할 충분한 RNA를 확보할 때까지 각 시료에 대해 추출 공정을 반복하였다.
마이크로어레이법으로 실시한 전체 유전체 혈장 miRNA 프로파일링. SAM-Bead Array 플랫폼 (Illumina, Inc. San Diego, CA)에 기반한 마이크로RNA 발현 프로파일링 분석 기법을 활용해 세트 1의 모든 시료에서 miRNA 발현 프로파일링 작업을 실시했다. 상기 마이크로어레이에는 1,146개의 탐침이 포함되어 있으며 상기 탐침은 743개의 검증된 miRNA들을 포함하고, miRBase Sanger v.12.0 데이터베이스에 명시되어 있는 인간 miRNA의 약 97%를 검출한다. 시료 당 총 200 ng RNA를 사용해 상기 miRNA 마이크로어레이 분석 작업을 실시하였다. 앞서 논의한 바와 같이, 제조업체 프로토콜에 따라 모든 단계를 수행 [13,14]하였다. BeadStudio 데이터 분석 소프트웨어를 사용해 데이터를 추출하여 로그 기반 2 스케일(log base 2 scale)로 변환하였다. Lumi 바이오컨덕터 패키지를 사용하여 모든 시료의 마이크로어레이 데이터를 quantile-normalization하였다 [15].
실시간 qRT-PCR에 따른 miRNA 발현 분석. 이전의 복합 사전 증폭 공정(multiplex preamplification process.)을 이용하여 실시간 qRT-PCR에 따라 niRNA 발현을 분석하였다. 간단히 설명하면, 14주기(cycle) 동안 Megaplex RT 프라이머 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)의 혼합물로 21 ng의 혈장 RNA를 소급 기술하여 Megaplex PreAmp 프라이머 및 TaqMan PreAmp MasterMix (Applied Biosystems Inc.)로 사전 증폭하였다. Viia7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems Inc.)의 TaqMan miRNA Assays (Applied Biosystems Inc.)을 이용해 qPCR에 따른 각각의 miRNA 발현을 평가하였다. 시료 (RNU6B, miR16, miR423-5p, RNU48, miR544, miR103, miR525, miR451)에서 가장 적합한 시료를 판별하기 위해 소형 핵 RNA들의 여러 추정 하우스키핑(putative housekeeping)을 분석하였다. MiR16이 가장 높은 안전성과 존재비를 보였는 바, 다른 공개 공보[16,17]와 일치하도록 내부의 대조군 miRNA의 발현 단계를 miR16로 표준화(normalize)하였고 자동 임계 값에서 Ct 값을 계산하였다. 상기 대조군 주형(template)은 증폭을 보이지 않았다. 각각의 qPCR 지점에 3개의 기술적 복제본을 포함시켰다. 각 시료에 대해 선택된 miRNA의 상대적 발현 단계를 ΔCt 값 [ΔCt = 대상 miRNA의 Ct - 내부의 대조군 miRNA의 Ct]으로 계산하였다.
통계 분석. 마이크로 어레이 데이의 선형 모델(Linear Models for Microarray Data, LIMMA)을 사용하여 그룹 간 다르게 발현되는 miRNA를 식별하였다. LIMMA는 선형 모델 및 경험적 Bayes 쌍으로 된 적절한 t-통계 및 F-통계[18]를 사용한다. F-통계를 사용한 가장 중요한 miRNA를 사용하여 made4 패키지[19]에 포함된 그룹 분석 (BGA) 기능 간 구현된 동일한 분석 작업을 실시하였다. 이러한 방법을 통해 2D 그래프로 고 차원 데이터 (예: 다중 발현 측정)를 시각화할 수 있으며 타원으로 구분된 영역은 첫 번째 및 두 번째 축 [20]에서의 95% 시료 점수 예측 이항 분포도를 나타낸다. 1.5 이상 되는 절대 배수 변화(absolute fold change)를 갖는 miRNA와 완만한 p-값 <0.05 (LIMMA 패키지의 벤 카운트 및 벤 다이어그램)을 고려하여 벤 다이어그램을 만들었다. Student’s test를 이용하여 정량적 변수(Quantitative variables)를 분석하였다. 양측의 p 값 <0.05은 중요한 지표로 간주되었다. 로지스틱 회기법(GLM 이항 분포)을 활용하여 연령 및 성별에 따라 조정한 개별적 miRNA와 다른 miRNA 조합에 대한 예측 가능성 평가 단계를 계산하였다. DiagnosisMed R-패키지를 활용하여 ROC 분석 플롯 및 파생된 구분점(cut-point) 뿐 아니라 전체적으로 구별되는 정확성 매개변수를 계산하였다. ROC 곡선과 좌측 상부 모서리 사이의 최소 거리와 관련된 최적의 구분점(cut-point)에서 감도와 특이성을 계산하였다.
대장암 환자의 혈장 시료에서 실시한 전체 유전체 miRNA 프로파일링. 혈장 miRNA 발현은 건강한 개인과 대장암 환자를 구별한다. CRC를 앓고 있는 환자와 건강한 개인 간의 차동 순환 miRNA 발현 프로파일링을 평가하기 위해 CRC를 앓고 있는 환자 21명과 건강한 대조군 20명의 혈장 시료에서 입수한 총 RNA에 대해 miRNA 마이크로어레이 실험을 실시하였다. 대장암 전구체 장애를 앓고 있는 환자에게서 변경된 miRNA 발현 패턴이 발견되었는지 추가로 조사하기 위해 고급 결장직장 선종 (AA)을 앓고 있는 환자 20명의 혈장 RNA에 대해 miRNA 마이크로어레이 실험을 실시했다.
LIMMA를 사용한 초기 비교 통계 분석 결과, 건강한 개인과 비교하여 조절되지 않은 (p<0.05) CRC 환자에게서 총 93 miRNA가 산출되었고, 대조군과 AA 환자를 비교했을 때 125 miRNA가 산출되었다. 모든 마이크로어레이 데이터는 GEO (기탁 번호: GSE 25609) 사용 가능하다. 도 1A 및 1B에는 적외선 열지도가 제시되어 있는데, 상기 지도에는 CRC 환자와 대조군 (도 1A) 간 그리고 AA 환자와 대조군 (도 1B) 간 가장 높은 중요한 배수 변화를 갖는 50 miRNA가 포함되어 있다. 배수 변화 차이 및 p-값 그리고 CRC 또는 AA에서의 miRNA에 대한 동일한 예측 가능성 매개변수는 표 2-3 및 4-5에 각각 도시되어 있다. BGA 그래프를 살펴 보면, CRC 또는 AA를 나타내는 환자와 혈장 miRNA 발현에 따른 대조군 간의 근접성을 시각적으로 확인할 수 있다. 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, CRC 또는 AA를 앓고 있는 환자와 건강한 개인은 3개의 명백한 분리군으로 나타났다. 각각의 종양성 장애 유형에 대한 miRNA 발현 특이성을 분석하였다. 즉, 벤 분석 (도 2) 방법을 활용해 CRC 및 AA를 대조시료와 비교했다. 21 및 28 miRNA 하위 세트(subset)가 각각 CRC 및 AA를 앓고 있는 환자에게서 배타적이고 크게 상위 조절(up-regulated)된 반면, 모든 유형의 종양성 장애 환자는 24개의 상당히 상위 조절된 miRNA들을 공유했다는 것을 알 수 있었다. 따라서 각 대장직장의 종양성 장애가 특정한 miRNA 발현 프로파일을 갖지만 두 유형은 중요한 조절되지 않은 miRNA 수를 공유하고 있다는 사실을 통해 일반적인 혈장 miRNA 시그니처에 기초한 단일 테스트 방법을 활용하여 모든 장애를 식별할 수 있었다. 가장 높은 배수 변화를 보이는 CRC의 상위 50명의 조절되지 않은 miRNA에 대한 배수 변화 및 p-값 매개변수를 하기 표 2에 나타내었다.
상위 50 miRNA MIMAT # FC P
hsa-miR-302a MIMAT0000684 10,57 0,0002
hsa-miR-30a MIMAT0000087 9,43 0,0001
hsa-miR-302b MIMAT0000714 5,97 0,0042
hsa-miR-565:9.1 MI0003571 5,69 0,0010
hsa-miR-191 MIMAT0000440 5,32 0,0061
hsa-miR-125b MIMAT0000423 5,27 0,0022
hsa-miR-100 MIMAT0000098 4,69 0,0180
hsa-miR-194 MIMAT0000460 4,67 0,0160
hsa-miR-27a MIMAT0000084 4,53 0,0045
hsa-miR-424 MIMAT0001341 4,47 0,0055
hsa-miR-125a-5p MIMAT0000443 4,41 0,0060
hsa-miR-335 MIMAT0000765 4,16 0,0268
hsa-miR-29a MIMAT0000086 4,11 0,0237
hsa-miR-219-5p MIMAT0000276 4,00 0,0427
hsa-miR-17 MIMAT0000070 3,95 0,0386
hsa-miR-520h/g MIMAT0002867 3,92 0,0047
hsa-miR-151-5p MIMAT0004697 3,92 0,0131
hsa-miR-524-5p MIMAT0002849 3,82 0,0172
hsa-miR-29b MIMAT0000086 3,77 0,0340
hsa-miR-202* MIMAT0002810 3,51 0,0231
hsa-miR-9 MIMAT0000441 3,36 0,0074
hsa-miR-150 MIMAT0000451 3,30 0,0394
hsa-miR-15b MIMAT0000417 3,21 0,0019
hsa-miR-518c MIMAT0002848 3,20 0,0304
hsa-miR-23a MIMAT0000078 3,14 0,0003
hsa-miR-19b MIMAT0000074 3,03 0,0035
hsa-miR-25 MIMAT0004498 3,03 0,0060
hsa-miR-15a MIMAT0000068 3,02 0,0238
hsa-miR-143 MIMAT0004599 3,00 0,0069
hsa-miR-141 MIMAT0004598 2,77 0,0211
hsa-miR-30d MIMAT0000245 2,62 0,0315
hsa-miR-627 MIMAT0003296 2,62 0,0207
hsa-miR-26b MIMAT0000083 2,60 0,0059
hsa-miR-24 MIMAT0000080 2,46 0,0140
hsa-miR-217 MIMAT0000274 2,24 0,0278
hsa-miR-92a MIMAT0000092 1,83 0,0437
hsa-miR-376b MIMAT0002172 -1,90 0,0281
hsa-miR-637 MIMAT0003307 -1,90 0,0432
hsa-miR-130b* MIMAT0004680 -1,95 0,0116
hsa-miR-1537 MIMAT0007399 -1,97 0,0383
hsa-miR-633 MIMAT0003303 -2,01 0,0448
hsa-miR-l0a MIMAT0000253 -2,12 0,0337
hsa-miR-127-3p MIMAT0000446 -2,23 0,0072
hsa-miR-337-3p MIMAT0000754 -2,23 0,0319
hsa-miR-575 MIMAT0003240 -2,24 0,0257
hsa-miR-936 MIMAT0004979 -2,25 0,0084
hsa-miR-626 MIMAT0003295 -2,31 0,0361
hsa-miR-1271 MIMAT0005796 -2,38 0,0315
hsa-miR-876-3p MIMAT0004925 -2,65 0,0023
hsa-miR-639 MIMAT0003309 -2,90 0,0222
CRC에서 상위 50명의 조절되지 않은 miRNA 중 각각의 개별적인 miRNA의 예측 가능성. 최적의 구분점과 동일한 ROC 곡선 매개변수 (곡선 (AUC) 아래 영역 및 95% 신뢰 구간(CI), 및 감도 (S) 및특이성 (Sp)을 하기 표 3에 나타내었다.
상위 50 miRNA AUC CI 낮음 CI 높음 구분점 S Sp
hsa-miR-302a 0,9143 0,8233 1,0053 0,5195 81 90
hsa-miR-30a 0,9048 0,7992 1,0103 0,5151 86 85
hsa-miR-302b 0,8524 0,7327 0,9720 0,5333 81 80
hsa-miR-565:9.1 0,8905 0,7861 0,9948 0,5262 81 85
hsa-miR-191 0,8667 0,7557 0,9776 0,4503 90 75
hsa-miR-125b 0,8714 0,7429 1,0000 0,5443 86 85
hsa-miR-100 0,8643 0,7381 0,9904 0,5230 86 90
hsa-miR-194 0,8238 0,6885 0,9591 0,4942 86 75
hsa-miR-27a 0,8405 0,7092 0,9717 0,5899 86 80
hsa-miR-424 0,8619 0,7514 0,9725 0,5888 76 80
hsa-miR-125a-5p 0,8500 0,7272 0,9728 0,5901 76 85
hsa-miR-335 0,8310 0,6973 0,9646 0,5494 81 85
hsa-miR-29a 0,8667 0,7435 0,9898 0,5449 81 85
hsa-miR-219-5p 0,8238 0,6967 0,9509 0,5895 76 75
hsa-miR-17 0,8429 0,7185 0,9672 0,4718 81 80
hsa-miR-520h/g 0,8786 0,7724 0,9847 0,5382 81 85
hsa-miR-151-5p 0,8476 0,7183 0,9770 0,4912 90 80
hsa-miR-524-5p 0,8333 0,7023 0,9643 0,5795 76 90
hsa-miR-29b 0,8381 0,7136 0,9626 0,4574 90 75
hsa-miR-202* 0,8405 0,7121 0,9689 0,4558 90 75
hsa-miR-9 0,8381 0,7138 0,9624 0,5730 81 80
hsa-miR-150 0,8429 0,7184 0,9673 0,4537 86 75
hsa-miR-15b 0,8643 0,7507 0,9778 0,5775 81 80
hsa-miR-518c 0,8476 0,7216 0,9737 0,5840 81 85
hsa-miR-23a 0,8905 0,7861 0,9948 0,5799 81 80
hsa-miR-19b 0,8381 0,7016 0,9746 0,6538 81 80
hsa-miR-25 0,8952 0,8028 0,9876 0,5533 81 80
hsa-miR-15a 0,8619 0,7493 0,9745 0,4686 81 75
hsa-miR-143 0,8524 0,7333 0,9714 0,5989 76 85
hsa-miR-141 0,8429 0,7082 0,9776 0,5084 86 85
hsa-miR-30d 0,8226 0,6918 0,9534 0,5176 76 80
hsa-miR-627 0,8333 0,7083 0,9584 0,5961 71 85
hsa-miR-26b 0,8619 0,7505 0,9733 0,5455 90 70
hsa-miR-24 0,8524 0,7292 0,9756 0,4210 90 75
hsa-miR-217 0,8310 0,7035 0,9584 0,5650 67 80
hsa-miR-92a 0,8571 0,7451 0,9692 0,2972 95 65
hsa-miR-376b 0,8262 0,7004 0,9520 0,6884 62 90
hsa-miR-637 0,8595 0,7435 0,9756 0,4911 86 75
hsa-miR-130b* 0,8762 0,7694 0,9830 0,6915 71 95
hsa-miR-1537 0,8524 0,7198 0,9849 0,4172 90 75
hsa-miR-633 0,8595 0,7439 0,9751 0,5986 76 85
hsa-miR-l0a 0,8810 0,7764 0,9855 0,4161 86 75
hsa-miR-127-3p 0,8833 0,7744 0,9922 0,5676 81 85
hsa-miR-337-3p 0,8452 0,7222 0,9683 0,5727 71 80
hsa-miR-575 0,8298 0,7015 0,9580 0,6407 76 85
hsa-miR-936 0,8476 0,7249 0,9704 0,5919 71 90
hsa-miR-626 0,8214 0,6928 0,9501 0,6718 71 80
hsa-miR-1271 0,8190 0,6896 0,9485 0,6845 67 85
hsa-miR-876-3p 0,8476 0,7212 0,9741 0,4657 90 75
hsa-miR-639 0,8071 0,6753 0,9390 0,7118 52 95
가장 높은 배수 변화를 보이는 AA의 상위 50명의 조절되지 않은 miRNA에 대한 배수 변화 및 p-값 매개변수를 하기 표 4에 나타내었다.
상위 50 miRNA MIMAT # FC p 값
hsa-miR-302a MIMAT0000684 10,37 0,0003
hsa-miR-29a MIMAT0000086 9,12 0,0001
hsa-miR-152 MIMAT000043 8 6,29 0,0002
hsa-miR-518e* MIMAT0005450 6,12 0,0079
hsa-miR-768-3p:11.0 MI0005117 5,68 0,0048
hsa-miR-335 MIMAT0000765 5,67 0,0112
hsa-miR-17 MIMAT0000070 5,46 0,0069
hsa-miR-30a MIMAT0000087 4,91 0,0142
hsa-miR-191 MIMAT0000440 4,82 0,0162
hsa-miR-100 MIMAT0000098 4,55 0,0235
hsa-miR-519d MIMAT0002853 4,24 0,0277
hsa-miR-199a-5p MIMAT0000231 4,11 0,0222
hsa-miR-125a-5p MIMAT0000443 3,96 0,0219
hsa-miR-424 MIMAT0001341 3,95 0,0174
hsa-miR-18a MIMAT0000072 3,88 0,0133
hsa-miR-193b MIMAT0002819 3,80 0,0394
hsa-miR-302a* MIMAT0000683 3,76 0,0340
hsa-miR-151-5p MIMAT0004697 3,75 0,0150
hsa-miR-125b MIMAT0000423 3,75 0,0275
hsa-miR-518c MIMAT0002848 3,67 0,0159
hsa-miR-130a MIMAT0000425 3,59 0,0079
hsa-miR-30d MIMAT0000245 3,58 0,0025
hsa-miR-22 MIMAT0000077 3,27 0,0096
hsa-miR-15a MIMAT0000068 3,25 0,0133
hsa-miR-192 MIMAT0000222 3,22 0,0404
hsa-miR-484 MIMAT0002174 3,18 0,0067
hsa-miR-522 MIMAT0002868 2,93 0,0394
hsa-miR-423-3p MIMAT0001340 2,88 0,0367
hsa-miR-217 MIMAT0000274 2,79 0,0056
hsa-miR-664 MIMAT0005949 2,70 0,0252
hsa-miR-30e* MIMAT0000693 2,63 0,0001
hsa-miR-185 MIMAT0000455 2,59 0,0357
hsa-miR-19b MIMAT0000074 2,57 0,0321
hsa-miR-1274b MI0006427 2,55 0,0216
hsa-miR-23a MIMAT0000078 2,51 0,0047
hsa-miR-324-3p MIMAT0000762 2,48 0,0118
hsa-let-7d MIMAT0000065 2,47 0,0300
hsa-miR-581 MIMAT0003246 2,46 0,0081
hsa-miR-450b-3p MIMAT0004910 -2,49 0,0268
hsa-miR-187* MIMAT0004561 -2,59 0,0002
hsa-miR-576-3p MIMAT0004796 -2,59 0,0001
hsa-miR-1290 MIMAT0005880 -2,62 0,0005
hsa-miR-380* MIMAT0000734 -2,66 0,0016
hsa-miR-369-3p MIMAT0000721 -2,84 0,0190
hsa-miR-876-3p MIMAT0004925 -3,09 0,0022
hsa-miR-671-3p MIMAT0004819 -3,52 0,0008
hsa-miR-936 MIMAT0004979 -3,55 0,0001
hsa-miR-218 MIMAT0000275 -4,56 0,0122
hsa-miR-379 MIMAT0000733 -5,71 0,0000
hsa-miR-630 MIMAT0003299 -6,29 0,0010
AA에서 상위 50명의 조절되지 않은 miRNA 중 각각의 개별적인 miRNA의 예측 가능성. 최적의 구분점과 동일한 ROC 곡선 매개변수 (곡선 (AUC) 아래 영역 및 95% 신뢰 구간(CI), 및 감도(S) 및 특이성(Sp)을 하기 표 5에 나타내었다.
상위 50 miRNA AUC CI 낮음 CI 높음 구분점 S Sp
miR.302a 0,9100 0,8170 1,0030 0,3571 95 80
miR.29a 0,8775 0,7656 0,9894 0,3763 90 80
miR.152 0,875 0,7700 0,9800 0,5804 80 85
miR.518e* 0,7925 0,6551 0,9299 0,5243 65 70
miR.768.3p.11.0 0,8175 0,6888 0,9462 0,4317 80 65
miR.335 0,7925 0,6545 0,9305 0,5461 65 75
miR.17 0,8525 0,7340 0,9710 0,4344 80 75
miR.30a 0,8350 0,7050 0,9650 0,4889 80 80
miR.191 0,8200 0,6888 0,9512 0,5530 75 75
miR.100 0,8300 0,6963 0,9637 0,5106 80 80
miR.519d 0,7925 0,6527 0,9323 0,4689 80 70
miR.199a.5p 0,8050 0,6711 0,9389 0,4913 75 70
miR.125a.5p 0,8225 0,6922 0,9528 0,3773 90 65
miR.424 0,8350 0,7128 0,9572 0,4925 75 70
miR.18a 0,8400 0,7164 0,9636 0,5475 80 80
miR.193b 0,7875 0,6473 0,9277 0,5452 75 75
miR.302a* 0,8200 0,6850 0,9550 0,5003 80 80
miR.151.5p 0,7950 0,6564 0,9336 0,4711 75 70
miR.125b 0,8250 0,6988 0,9512 0,3842 80 70
miR.518c 0,8475 0,7273 0,9677 0,5524 75 70
miR.130a 0,8275 0,6900 0,9650 0,5786 80 85
miR.30d 0,8725 0,7659 0,9791 0,3596 85 70
miR.22 0,8525 0,7310 0,9740 0,5737 75 80
miR.15a 0,8725 0,7654 0,9796 0,4755 80 75
miR.192 0,7800 0,6386 0,9214 0,4435 80 65
miR.484 0,8625 0,7492 0,9758 0,3974 90 70
miR.522 0,7975 0,6613 0,9337 0,5762 70 75
miR.423.3p 0,8150 0,6780 0,9520 0,5520 70 85
miR.217 0,8525 0,7257 0,9793 0,5673 75 95
miR.664 0,8175 0,6715 0,9635 0,5403 80 80
miR.30e* 0,8775 0,7709 0,9841 0,5039 85 80
miR.185 0,8275 0,6976 0,9574 0,6138 65 85
miR.19b 0,8087 0,6746 0,9429 0,4663 80 70
miR.1274b 0,8400 0,7189 0,9611 0,5231 70 75
miR.23a 0,8400 0,7195 0,9605 0,4723 85 70
miR.324.3p 0,8275 0,6976 0,9574 0,5407 80 70
let.7d 0,8025 0,6645 0,9405 0,5203 75 70
miR.581 0,8525 0,7340 0,9710 0,6819 70 90
miR.450b.3p 0,7550 0,6059 0,9041 0,5207 65 70
miR.187* 0,9075 0,8125 1,0025 0,5139 85 85
miR.576.3p 0,9575 0,8941 1,0209 0,4191 90 90
miR.1290 0,8750 0,7669 0,9831 0,4742 85 80
miR.380* 0,8475 0,7156 0,9794 0,5532 75 90
miR.369.3p 0,7925 0,6533 0,9317 0,5663 65 80
miR.876.3p 0,8325 0,7090 0,9560 0,6131 70 80
miR.671.3p 0,8550 0,7393 0,9707 0,5179 65 85
miR.936 0,9225 0,8427 1,0023 0,5084 85 85
miR.218 0,8000 0,6591 0,9409 0,4740 75 70
miR.379 0,9325 0,8519 1,0131 0,5830 85 95
miR.630 0,8375 0,7132 0,9618 0,4579 75 70
실시간 qRT-PCR에 따른 miRNA 발현 검증. 마이크로어레이 기반 혈장 miRNA 발현 결과는 기술적으로 다시 산출 가능하다. 먼저, 실시간 qRT-PCR를 실시하여 세트 1 (결장직장 종양을 가지고 있는 환자 19명과 건강한 대조군 9명)로부터 무작위적으로 선택한 28개 시료에서 마이크로어레이 결과를 확인했다. 상기 연구를 위해 총 14 개의 후보 miRNA를 선택하였다. CRC 및/또는 AA에서 상위 50명의 조절되지 않은 miRNA를 포함시키고, 8 이상 되는 로그 기반 2 마이크로어레이 강도를 갖도록 12개의 후보 miRNA (miR17-5p, miR92a, miR19b, miR18a, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24, miR335, miR424 및 miR15b)를 선택하였다. 이전 기준을 충족하지 않았음에도 불구하고 가장 특성화된 종양 원소 miRNA 클러스터 중 하나인 miR17-92 클러스터 부분을 위해 추가적인 miRNA (miR19a 및 miR20a)를 또한 선택하였다. 전반적으로 보면, qRT-PCR에 의해 어떠한 증폭도 나타내지 않아 부수적인 분석 과정에서 배제된 miR424를 제외하고 qRT-PCR 및 마이크로 어레이 결과는 상호 관련 (데이터를 도시하지 않음)이 있었다.
6개의 혈장 마이크로RNA가 개별적인 집단의 CRC 환자에게서 과발현된 것으로 확인되었다. 둘 째, CRC를 앓고 있는 환자 42명과 건강한 대조군 53명으로 구성된 개별적인 실험대상의 혈장에서 이전 단계에서 적절한 증폭 결과를 나타낸 13 개의 후보 miRNA (miR92a, miR17-5p, miR18a, miR19a, miR19b, miR20a, miR15b, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24 및 miR335)를 분석하여 실시간 qRT-PCR에 따른 결과를 검증하였다.
흥미롭게도, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a 및 miR335가 CRC를 앓고 있는 환자에게서 상위 규제되었음이 확인되었다는 점이다 (도 3). 또한, miR-24은 이 환자군에서 과발현되었지만 통계학적으로 중요한 단계 (p=0.08)에 도달하지 않았다. 현저하게도, ROC 곡선 (AUC) 아래 영역을 갖는 건강한 대조군의 CRC를 구분하는 과정에서 두 번째 실험대상에서 검증한 miRNA 또한 높은 정확성을 나타냈으며 이러한 단계는 0.8 (95% CI: 0.71-0.89) ~ 0.7 (95% CI: 0.59-0.80) 범위를 갖는다. 하기로, 개별적으로 CRC를 검출하는 과정에서 이러한 miRNA의 특정 조합이 명백하게 정확성을 개선할 수 있는지 살펴보았다. 가장 명백한 성능을 보인 조합 중 miR19a + miR19b 및 miR19a + miR19b + miR15b (표 6; 도 4) 시그네이처를 강조 표시하였다. 마지막으로, 초기 (TNM I-II) 및 진행된 (TNMIII-IV) CRC 환자에 대한 이러한 시그네이처 예측 가능성을 조사하였다. 표 2에 나와 있는 바와 같이 양쪽 환경에서 초기 및 진행된 경우 모두 명백하게 높은 정확성을 나타냈다. 이와 유사하게, 이러한 환경이 왼쪽 종양과 정확히 동일한 오른쪽 종양을 검출할 수 있는지 조사하였는 데 이는 양쪽 사례에 모두 해당되었다 (표 2).
실험대상 2에서 CRC를 앓고 있는 환자의 최상위 혈장 miRNA 환경 예측 가능성을 하기 표 6에 나타내었다.
환경: miR19a+miR19b miR19a+miR19b+miR15b
모든 CRC (n=42)
AUC (95% IC) 0.82(0.73-0.90) 0.84(0.76-0.92)
감도 78.57 78.57
특이성 77.36 79.25
TNM I/II (n=21)
AUC (95% IC) 0.85(0.75-0.96) 0.87(0.71-0.92)
감도 71.43 80.95
특이성 92.45 79.25
TNM III/IV (n=21)
AUC (95% IC) 0.81(0.71-0.92) 0.81(0.70-0.92)
감도 85.71 76.19
특이성 71.70 77.36
오른쪽 (n=14)
AUC (95% IC) 0.82(0.71-0.92) 0.84(0.73-0.94)
감도 85.71 85.71
특이성 79.25 79.25
왼쪽 (n=28)
AUC (95% IC) 0.8(0.71-0.90) 0.83(0.73-0.92)
감도 82.14 75.47
특이성 78.57 79.25
ROC 곡선 매개변수 (모든 CRC 경우 뿐 아니라 다른 종양 단계 (I/II 및 III/IV) 및 위치 (비결장곡과 관련하여 오른쪽 및 왼쪽)에서 곡선 (AUC) 아래 영역 및 95% 신뢰 구간 (CI)).
진행된 결장직장 선종을 앓고 있는 환자에게서 하나의 혈장 마이크로RNA가 증가한 것으로 확인되었다. CRC 환자로 구성된 양쪽 실험대상에서 과발현된 혈장 miRNA 중 특정한 부분이 암 전구체 장애를 앓고 있는 환자에게서도 증가했는지 평가하기 위해 AA를 앓고 있는 환자 40명과 건강한 대조군 53명의 개별 집단의 현잘 시료에서 실시간 qRT-PCR에 따라 이를 분석하였다. 첫 번째 실험대상에서와 마찬가지로 대조군에 비해 AA 환자로 구성된 두 번째 실험대상에서 miR18a가 상당히 과발현된 것으로 확인되었다 (도 1B). 하지만 이러한 miRNA가 AA 환자로 구성된 첫 번째 실험대상 (AUC: 0.84, 95%CI: 0.72-0.96, S: 80%, Sp: 80%)에서 명백한 성능이 나타났더라도 이 매개변수는 두 번째 환자 실험대상 (AUC: 0.64, 95% CI: 0.52-0.75, S: 72%, Sp: 57%)의 경우에서보다 낮았다.
상기 연구에서 발명자는 CRC 또는 AA를 앓고 있는 환자와 건강한 개인의 혈장 시료에서 마이크로 어레이 방법을 통해 전체 유전체 miRNA 프로파일링을 실시하였다. 이러한 결과를 통해 혈장 miRNA 발현이 결장직장 종양을 앓고 있는 환자와 대조군 실험대상 간의 뚜렷한 차이가 있음을 알 수 있고 이러한 장애에 대한 비침습성 검출 잠재 가치가 있는 것을 알 수 있었다. 알려진 바, 이러한 결과는 높은 산출 기법에 의해 CRC와 AA를 앓고 있는 환자의 경우 혈장 miRNA의 전체 유전체 발현을 분석하고 외부의 독립 집단의 결과를 검증한 첫 번째 보고 결과이다. 높은 산출 분석 결과에 기초하여 CRC 또는 AA를 앓고 있는 환자를 검출하는 데 유용하게 사용되는 다수의 추정 혈장 miRNA 바이오마커를 확인하였다. 또한, CRC와 다른 집단의 6개 혈장 마이크로RNA으로 구성된 건강한 개인 간의 높은 구별 및 다른 기법 활용 가능성을 확인하였다. 이러한 miRNA (i.e. miR19a, miR19b, miR18a, miR15b 및 miR335) 중 5개가 이전에 보고되지 않은 새로운 바이오마커를 나타낸다고 볼 수 있다.
혈장 및 다른 액체 내의 안정적인 miRNA의 최근 발견은 이러한 분자를 질병의 바이오마커로써 활용할 수 있는 가능성을 열었고 여러 연구는 다른 환경에서 이러한 전략을 평가하였다. 인간 암의 경우, 이러한 접근방식은 실제로 유용하게 사용된다. 이 접근방식이 종양 관련 순환 miRNA 분석 작업을 통해 비침습성 형태에서 종양 형성을 검출할 수 있기 때문이다. 하지만 암에 대한 대부분의 miRNA 발현 프로파일링 연구는 조직 시료를 사용하여 실시하는 반면, 한정된 수의 연구만 진단 및 예후 과정에서 순환 miRNA의 잠재 가치에 초점을 맞추고 있다 [21-23]. 현저히, RN아제가 존재하는 경우라도 이러한 분자의 높은 안정성 때문에 바이오마커로 miRNA를 사용하는 것이 RNA 또는 단백질 표지를 사용하는 것보다 더 나은 전략인 것처럼 보인다 [23].
지금까지, 일부 연구만 CRC에서 일부 후보 혈장 miRNA 발현을 분석하였다. Ng 등이 최초로 qRT-PCR 분석 방법을 통해 억제 실험대상에 비해 CRC 환자에서 2개의 혈장 miRNA (즉, miR17-3p 및 miR92a)가 상당히 증가했음을 발견했다. 하지만 초기 분석은 10개의 혈장 시료(CRC 환자의 시료 5개 및 건강한 개인의 시료 5개)로 국한되었다. 보다 중요한 사실은, 이 연구에서만 전구체 장애 식별이 아닌 CRC 진단 과정에서 혈장 miRNA의 잠재적 활용 가능성을 평가했다는 점이다 [24]. 이 연구 직후, Huang et al.은 CRC 및 AA 환자를 검출하는 과정에서 2개의 혈장 miRNA (miR29a 및 miR92a)의 잠재적 활용 가능성이 있음을 보고했다. 하지만 이러한 qRT-PCR 분석은 이전 보고서에 근거하여 선택한 12개의 miRNA 시료로만 제한되었다. Pu et al.은 qRT-PCR을 활용하여 CRC 환자의 혈장 시료 중 3개의 miRNA의 발현을 분석한 결과, miR221의 상당한 과발현이 있었음을 보고했다. 하지만 AA를 앓고 있는 환자는 이 연구에 포함되지 않았다[25]. 최근 들어, Cheng et al.은 3개의 miRNA 발현을 분석한 후 전이 CRC 환자의 경우 miR141 혈장 레벨이 상당한 상위 규제를 나타냈다고 보고했다 [26].
본 연구의 목적은 이러한 장애를 가지고 있는 환자의 진단을 위해 바이오마커로 잠재적 활용성을 갖는 혈장 miRNA를 파악하기 위해 CRC 및 AA를 앓고 있는 환자에 대해 높은 산출 기법을 활용하여 순환 miRNA의 완벽한 프로파일링을 실시하는 데 있었다. CRC 환자의 경우 분석한 743개의 miRNA 중, 95개의 순환 miRNA 그리고 AA를 앓고 있는 환자의 경우 125개가 상당한 결핍 제한되었고 이중 일부가 우수한 분별 능력을 나타냈다. 본 발명인이 이전 연구에서 마이크로 어레이 분석 작업을 통해 상당히 상위 규제된 miRNA 중 miR29a, miR92a 및 miR141과 같이 CRC와 관련된 혈장 miRNA를 확인했을 뿐만 아니라 새로운 후보 miRNA가 CRC 발암 현상의 잠재적 지표를 갖는다고 보고한 것은 매우 중요하다. 또한, 이러한 과발현 miRNA 중 miR17-92 클러스터의 모든 구성 요소 (miR17, miR92a, miR19a, miR19b, miR18a 및 miR20a)와 miR106b-25 클러스터의 두 가지 구성 요소 (miR-25 및 miR93), 포유 동물에서 miR17- 92 에 대한 다소 협소하게 특징지어진 클러스터 파라로그를 발견하였다. 이러한 결과를 통해 결장직장 암의 중심적인 역할 수행자로서 miR17-92 클러스터를 사용할 수 있음을 알 수 있었다. oncomiRl로도 지정되는 miR17-92 클러스터는 최상으로 특징화된 종양 원소 miRNA 클러스터 중 하나이다 [27,28]. 이러한 관점에서, 선종에서 선암으로 진행되도록 한 염색체 불안정성 증가가 종양 유전자의 상위 규제를 초래할 뿐만 아니라 miR17-92 클러스터를 비롯해 중요한 miRNA의 과발현의 원인이 된다는 사실을 알 수 있었다 [29].
본 발명자는 첫 번째 CRC 환자 실험대상에서 발견된 몇몇 상위 규제된 miRNA (즉, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a 및 miR335)이 독립적 집단에서도 과발현되었음을 입증했다. 현저하게도, 이와 같이 검증된 miRNA가 CRC의 경우 높은 구별 정확성을 나타냈으며 이러한 일부 miRNA 조합의 구별 정확성이 miRNA만 있을 때의 구별 정확성보다 개선되었다. 또한, 진행된 CRC (단계 II-III)와 정확히 동일한 조기 CRC (I-II)뿐 아니라 좌측 장애와 정확히 동일한 오른쪽 종양을 검출할 수 있었다. 이러한 결과는 이러한 혈장 miRNA가 CRC 진단을 위한 새로운 비침습성 바이오마커로써의 잠재적 활용성이 있음을 나타낸다.
대장암 전구체 장애와 관련하여, CRC (miR-18a)의 경우 6개의 miRNA 과발현 중 하나만 AA를 앓고 있는 환자의 2개의 개별 집단에서 상당히 과발현되었음을 확인했다. 첫 번째 환자 실험대상에서 miR-18a가 매우 양호한 구분 능력을 나타냈다 하더라도 이러한 구분 능력은 두 번째 집단에서 완만하게 나타났다. 실제로, Huang et al.이 분석한 AA를 앓고 있는 환자 집단에서 2개의 혈장 miR (miR-29a 및 miR-92a)가 AA 환자군과 대조군을 구별하는 과정에서 매우 우수한 정확성을 나타냈다 [16]. 이러한 2개의 혈장 miRNA는 두 번째 실험대상이 아닌 첫 번째 AA 환자군에서 상당히 과발현되었다. 이 두 가지 환자군의 차이는 두 번째 환자군에서 AA의 덜 진행된 특징을 보이는 것을 잠정적으로 나타낼 수 있다(표 1). 또한, 이러한 결과는 AA 환자에 대한 혈장 마이크로RNA의 유용성 평가 작업이 흥미로운 연구를 구성하고 추가적인 조사 가치가 있음을 나타낸다. 현재, AA 검출 여부는 비침습성 CRC 조사 전략의 주요 난제로 남아 있다. 사실, 그룹 연구에서 최근 입증된 바와 같이 현재 평균-위험 인구에 대해 허용된 비침습성 CRC 조사 전략인 대변 면역 화학성 테스트가 CRC의 진단을 위한 우수한 성능을 나타내지만 거의 50%가 AA를 간과하고 있음을 나타내고 있음은 주목할만한 내용이다 [12].
흥미롭게도, 이 연구에서 검증한 모든 miRNA는 CRC 환자의 조직 시료에서 과발현된 것으로 이미 보고된 바 있다 [30-34]. 따라서 CRC가 이러한 혈장 miRNA를 구성하는 것으로 가설을 세울 수 있다. 따라서 이러한 결과는 miR29a, miR15b, miR19a, miR-19b, miR-18a 및 miR-335가 CRC 진단을 위한 강력한 바이오마커임을 나타내고 결장직장 암에서 중요한 의미를 갖는다는 사실을 알 수 있다. 또한, 이러한 miRNA의 잠재적 종양 원소 역할을 고려해 볼 때, 결과가 이러한 분자 억제에 초점이 맞추어진 새로운 목표의 치료에 대한 향후 설계 가능성을 열어주고 있음을 알 수 있다.
상기 열거한 마이크로RNA들, 마이크로RNA의 패밀리들, 및 다른 마이크로RNA들은 대장암 검출 수단을 강화하는 방법으로 더 포함될 수 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 더 나아가 하기에서 선택한 결장직장 종양에서 저발현된 마이크로RNA의 발현 레벨의 결정으로 구성될 수 있다:
Figure pat00013
상기 방법은 더 나아가 하기에서 선택한 결장직장 종양에서 과발현된 마이크로RNA의 발현 레벨의 결정으로 구성될 수 있다:
Figure pat00014
하지만 또 다른 생체 지표 또는 분석 방법은 위에서 열거하거나 본 명세서에 공개된 부분에서 과발현 및 저발현된 마이크로RNA들의 조합을 모두 포함한다. 이러한 이유로 인해, 특별히 열거한 마이크로RNA들과 (공동 발현된) 마이크로RNA들 일부를 포함하거나 포함하지 않은 상태에서 본 발명은 각각의 마이크로RNA에서 한 가지 상황에서의 과발현 및 저발현된 마이크로RNA들의 모든 조합을 포함한다.
요약하자면, CRC 및 AA를 앓고 ?는 환자는 건강한 개인에 비해 상당히 다른 혈장 miRNA 프로파일을 나타낸다. 이러한 종양 관련 순환 miRNA는 새로운 바이오마커를 구성하고 비침습성 조기 진단을 위한 잠재적 전략을 나타낸다. 상기 연구에서, CRC 검출에 유용한 6개의 후보 혈장 miRNA를 파악하였다. 그럼에도 불구하고, 조사 환경에서 효능안전 및 잠재적 적용 가능성을 평가하기 위해서는 여러 환자 집단 연구를 통해 이러한 접근방식을 추가로 검증해야 한다.
키트, 시약 또는 발명 구성 요소와 관련하여 본 명세서에 논의되어 있는 모든 실시예를 구현할 수 있고 그 역으로도 구현할 수 있음을 고려할 수 있다. 또한, 본 발명의 구성 요소를 사용하여 발명의 방법을 모색할 수 있다.
본 명세서에 설명되어 있는 특정한 실시예가 발명의 제한 요소가 아닌 도해 방법으로 제시되었음을 알 수 있다. 발명의 범위에서 출발하지 않고 여러 실시예에 본 발명의 기본 특징을 활용할 수 있다. 이 분야의 숙련된 기술자는 단순한 실험을 넘어 본 명세서에 설명되어 있는 특정한 절차와 동일한 여러 방법을 활용하여 확인할 수 있음을 인정할 것이다. 이러한 동일한 방법은 본 발명의 범위에 해당하는 것으로 간주하고 특허 청구범위에 포함된다.
본 명세서에 언급되어 있는 모든 공보 및 특허 출원 내용은 이 발명과 관련된 분야의 숙련된 기술자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원 내용은 마치 각각의 간행물 또는 특허 출원 내용이 특징적으로 그리고 개별적으로 참고 자료로 통합되는 것처럼 동일한 범위까지 참고 자료로 본 명세서에 통합된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 사용된 "구성하는" 이라는 용어와 관련하여 "a" 또는 "an"은 "하나"를 의미할 수 있지만 "한 개 이상의," "최소한 1개" 및 "두 개 이상"의 의미와 동일하게 취급된다. 본 청구범위에서 사용되는 "또는"이라는 용어는 공개 명세서에 하나의 대체물과 "및/또는"을 나타내는 정의를 지지하더라도 하나의 대체물 또는 여러 대체물이 상호 배타적인 것으로 명백히 지시되지 않은 경우 "및/또는"을 의미한다. 본 특허 출원서 전반에서 사용하는 "대략 또는 ~에 대한(about)"이라는 용어는 하나의 값에 장치의 고유한 오류 차이, 값을 판별하는 데 사용하는 방법 또는 연구 대상에서 존재하는 차이가 포함되어 있음을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항에서 사용되는 "구성하는 (comprising)" (예를 들어, "구성하다 (comprise 및 comprises)"와 같이 구성하는 (comprising)의 모든 형태)와 "가지는 (having)" (예를 들어, "가지다 (have 및 has)"의 모든 형태) 또는 "포함하는 ("including" (예를 들어, "포함하다 (includes 및 include)의 모든 형태) 또는 "포함되는 (containing)" (예를 들어, "포함되다 (contains 및 contain)"의 모든 형태) 용어는 포함되거나 제약을 두지 않고 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 "본질적으로 구성 (consisting essentially of)" 문구는 청구범위를 지정된 자료 또는 단계 그리고 청구된 발명의 기본 및 새로운 특성에 실제로 영향을 미치지 않는 범위로 제한된다. 본 명세서에 사용되는 "구성하는 (consisting of)' 문구에는 예를 들어, 요소 또는 제한 요소와 일상적으로 관련된 불순물을 제외하고 청구범위에 명시되지 않은 어떠한 요소, 단계 또는 성분이 제외된다.
본 명세서에 사용되는 "~의 조합 (combinations thereof)" 이라는 용어는 해당 용어 이전에 열거한 항목의 모든 순열 및 조합을 의미한다. 예를 들어, "A, B, C 또는 이들 조합(A, B, C, or combinations thereof)"은 최소한 하기 중 하나를 의미한다. A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC 그리고 특정한 전후 관계에서 순서가 중요할 경우 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB. 여기에서 계속하여 명백하게 포함되는 것은 BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같이 하나 또는 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합이다. 숙련된 기술자라면 전후 관계에서 명백히 명시되지 않은 경우 항목 또는 용어의 수에 제한이 없는 것으로 이해할 것이다.
본 명세서에 사용되는 예를 들어, "대략 (about)", "실제적인 (substantial)" 또는 "실제적으로 (substantially)"와 같은 추정치를 의미하는 용어는 변경된 내용이 반드시 절대 또는 완벽한 값으로 이해되지 않지만 존재하는 조건을 지정하는 것을 보증하기 위해 해당 분야의 일반적인 기술에 대한 충분히 가까운 것으로 간주될 수 있는 조건을 나타낸다. 얼마나 많은 변경이 이루어졌는지 그리고 해당 분야에서 일상적으로 인식되는 범위를 갖는지 여부에 따라 달라지는 설명이 다를 수 있는 범위는 수정된 특징이 수정되지 않은 특징에 필요한 특성 및 성능을 가지는 것으로 인식된다. 일반적이지만 선행 논의 대상이 되는 "대략 (about)"과 같은 추정치 단어에 의해 변경되는 본 명세서의 숫자 값은 적어도 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 또는 15%에 의해 명시된 값과 다를 수 있다.
본 명세서에 공개 및 청구되어 있는 모든 구성 및/또는 방법은 본 공개 정보에 비추어 추가적인 실험 없이 이루어지고 이행될 수 있다. 본 발명의 구성 및 방법이 선호된 실시예에 대한 용어로 설명되었지만 이는 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 출발하지 않고 구성 및/또는 방법 그리고 본 명세서에 설명된 단계 또는 단계 시퀀스에 변형이 적용될 수 있는 해당 분야의 기술로 명백해 질 수 있다. 해당 분야에서 명백한 기술이 되는 모든 유사한 대용 및 수정은 첨부된 청구항에서 지정한 바와 같이 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (15)

  1. 하기 과정들을 포함하는 인간 실험대상자(human subject) 내의 진행성 대장 선종(advanced colorectal adenomas) 진단 또는 검출 방법:
    실험대상자(subject)의 하나 이상의 생체 시료들에서 얻은 하나 이상의 마이크로 RNA(microRNAs)의 전체 발현 패턴 또는 레벨을 측정하는 과정으로서, 상기 마이크로 RNA에서 적어도 하나는 miR18a인 과정; 및
    진행성 대장 선종이 있는 것으로 의심되는 실험대상자의 생체 시료에서 하나 이상의 마이크로 RNA의 전체 발현 패턴과 정상적인 실험대상자의 생체 시료에서 하나 이상의 마이크로 RNA의 전체 발현 패턴을 비교하는 과정으로서, 상기 정상적인 실험대상자는 진행성 대장 선종이 없는 건강한 실험대상자이고, miR18a의 과발현(overexpression)이 진행성 대장 선종을 나타내는 것인 과정.
  2. 하기 과정들을 포함하는 인간 실험대상자 내의 진행성 대장 선종 및 결장직장 종양(colorectal neoplasia) 진단 또는 검출 방법:
    실험대상자의 하나 이상의 생체 시료들에서 얻은 하나 이상의 마이크로 RNA의 전체 발현 패턴 또는 레벨을 측정하는 과정으로서, 상기 마이크로 RNA는 적어도 miR18a와 miR19a 및 miR19b, 또는 miR18a와 miR19a 및 miR19b 및 miR15b인 과정; 및
    진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양이 있는 것으로 의심되는 실험대상자의 생체 시료에서 하나 이상의 마이크로 RNA의 전체 발현 패턴과 정상적인 실험대상자의 생체 시료에서 하나 이상의 마이크로 RNA의 전체 발현 패턴을 비교하는 과정으로서, 상기 정상적인 실험대상자는 진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양이 없는 건강한 실험대상자이고, miR18a의 과발현이 진행성 대장 선종을 나타내고, miR19a 및 miR19b, 또는 miR19a와 miR19b 및 miR15b의 과발현이 결장직장 종양을 나타내는 것인 과정.
  3. 제 2 항에 있어서, 정상적인 실험대상의 발현과 비교하여 miR29a 또는 miR335 중의 적어도 하나의 분석 과정을 더 포함하고, 상기 miR29a 또는 miR335의 과발현이 결장직장 종양을 추가적으로 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 생체 시료는 하나 이상의 생체액(biological fluids), 혈장 시료, 혈청 시료, 및 혈액 시료로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 생체 시료는 혈장 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 마이크로 RNA의 발현 레벨은 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), PCR, 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 역전사 효소 실시간 PCR(reverse transcriptase real-time PCR), 실시간 정량 PCR(quantitative real-time PCR), 평가변수 PCR(end-point PCR), 다중 평가변수 PCR(multiplex end-point PCR), 콜드 PCR(cold PCR), 아이스 콜드 PCR(icecold PCR), 질량 분석법, 가시적 분자결합화 (ISH), 복합 가시 분자결합화, 또는 핵산 시퀸싱(nucleic acid sequencing)에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 진행성 대장 선종의 바이오마커(biomarker) 또는 바이오시그니처(biosignature)로서, 상기 바이오마커는 miR18a이고, 환자로부터 입수된 일반 생체 시료의 마이크로 RNA와, 상기 입수 시점의 이전 시점에 상기 환자로부터 입수된 일반 생체 시료의 상기 마이크로 RNA 또는 진행성 대장 선종이 없는 건강한 실험대상자로부터 입수된 일반 생체 시료의 상기 마이크로 RNA를 비교하여, 전체 발현의 변화가 진행성 대장 선종을 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오마커 또는 바이오시그니처.
  8. 진행성 대장 선종 및 결장직장 종양의 바이오마커 또는 바이오시그니처로서, 상기 바이오마커는 miR18a와, miR19a 및 miR19b, 또는 miR18a와, miR19a, miR19b 및 miR15b를 포함하고 있고, 환자로부터 입수된 생체 시료의 적어도 상기 마이크로 RNA들과, 상기 입수 시점의 이전 시점에 상기 환자로부터 입수된 일반 생체 시료의 상기 마이크로 RNA들 또는 진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양이 없는 건강한 실험대상자로부터 입수된 일반 생체 시료의 상기 마이크로 RNA를 비교하여, 전체 발현의 변화가 진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양을 나타내는 것을 특징으로 하는 바이오마커 또는 바이오시그니처.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 생체 시료들은 하나 이상의 생체액 또는 혈장 시료, 혈청 시료, 및 혈액 시료로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이오마커 또는 바이오시그니처.
  10. miR18a의 차동(differential) 발현 레벨 판별용 바이오마커 검출 시약(biomarker detecting reagent)을 포함하는 진행성 대장 선종용 진단 키트로서, 상기 마이크로 RNA의 과발현이 진행성 대장 선종을 나타내는 것을 특징으로 하는 진행성 대장 선종용 진단 키트.
  11. miR18a와, miR19a 및 miR19b, 또는 miR18a와, miR19a, miR19b 및 miR15b 의 차동 발현 레벨 판별용 바이오마커 검출 시약을 포함하는 진행성 대장 선종 및/또는 결장직장 종양용 진단 키트로서, 상기 miR18a의 과발현이 진행성 대장 선종을 나타내고, 상기 miR19a 및 miR19b, 또는 miR19a와 miR19b 및 miR15b의 조합의 과발현이 결장직장 종양을 나타내며, 대장암의 신뢰 구간이 90% 이상인 것을 특징으로 하는 진행성 대장 선종 및/또는 결장직장 종양용 진단 키트.
  12. 제 11 항에 있어서, miR29a 또는 miR335 중의 적어도 어느 하나의 검출 및 분석을 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 하나에 있어서, 하기 구성을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
    a. 진행성 대장 선종 및/또는 결장직장 종양의 위험 진단 시 사용하는 지침으로서, 진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양이 의심되는 실험대상으로부터 입수한 시료의 발현을 측정할 때, 마이크로 RNA들의 발현 레벨을, 진행성 대장 선종 또는 결장직장 종양을 앓고 있지 않은 건강한 실험대상인 정상적인 실험대상에서 입수한 시료의 발현 레벨과 비교하는 단계별 과정들(step-by-step directions)을 포함하는 지침; 및, 선택적으로,
    b. 하나 이상의 생체액, 혈장 시료, 혈청 시료, 혈액 시료, 조직 시료, 또는 대변 시료로 이루어진 군에서 선택된, 실험대상으로부터 시료를 입수하기 위한 도구, 용기, 및 시약.
  14. 진행성 대장 선종의 위험성을 생체외(in vitro)에서 진단하기 위한 제 10 항에 따른 키트의 용도.
  15. 진행성 대장 선종 및/또는 결장직장 종양의 위험성을 생체외(in vitro)에서 진단하기 위한 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 하나에 따른 키트의 용도.
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