ES2662401T3 - MicroARN plasmático para la detección de cáncer colorrectal incipiente - Google Patents

Abstract

Método para diagnosticar o detectar adenomas colorrectales avanzados en un sujeto humano que comprende las etapas de: medir un patrón o nivel de expresión global de uno o más microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto, en el que al menos uno de esos microARN es miR18a; y comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece adenomas colorrectales avanzados con el patrón de expresión global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece adenomas colorrectales avanzados, y en el que la sobreexpresión de miR18a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados.

Description

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DESCRIPCION

MicroARN plasmático para la detección de cáncer colorrectal incipiente Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la detección de cáncer colorrectal, y más particularmente, a microARN plasmáticos para la detección de cáncer colorrectal incipiente.

Antecedentes de la invención

Sin limitar el alcance de la invención, se describen sus antecedentes en relación con cánceres colorrectales.

La solicitud de patente estadounidense n.° 20100317533 (Lou et al. 2010) proporciona un panel de biomarcadores de metástasis tumoral que comprende dos cualesquiera de anhidrasa carbónica-9 (CAIX), factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C), efrina A5 (EFNA5), receptor de eph B2 (EPHB2), factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF-P3), piruvato deshidrogenasa quinasa isoenzima-3 (PDK3), anhidrasa carbónica-12 (CAXII), queratina 14 (KrT14), subunidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-Ia) o tenascina C (TNC). CAIX, 20 VEGF-C, EFNA5, EPHB2, TGF-p3 o PDK3 pueden ser indicadores de potencial metastásico moderado, mientras que CAXII, KRT14, HIF-Ia o TNC pueden ser indicadores de alto potencial metastásico. También se proporciona un método para determinar el riesgo de metástasis tumoral usando los biomarcadores mencionados anteriormente. Los biomarcadores pueden usarse en el diagnóstico, pronóstico, selección de tratamiento o para someter a prueba posibles opciones terapéuticas. Los biomarcadores pueden usarse para evaluar tumores malignos o cánceres que tienen regiones hipóxicas, tales como cáncer de mama.

La solicitud de patente estadounidense n.° 20100120898 (Croce et al. 2010) divulga métodos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (HCC). También se proporcionan métodos para identificar agentes anti-HCC. La solicitud de Croce proporciona un método que diagnostica si un sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular (HCC), que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de prueba del sujeto, en el que una alteración en el nivel del producto génico de miR en la muestra de prueba, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto o bien tiene, o bien está en riesgo de desarrollar HCC.

La patente estadounidense n.° 7.939.255, expedida a Chung se refiere a métodos de diagnóstico para cáncer colorrectal. Brevemente, la patente divulga un método de diagnóstico y un kit para la evaluación del pronóstico de cáncer colorrectal (CRC) con un gen supresor tumoral que va a usarse para el diagnóstico de cáncer colorrectal (CRC), en el que el método comprende: identificar regiones alteradas de manera recurrente (RAR) en un cromosoma; y detectar alteraciones genómicas en las RAR. Se dice que la invención hace posible realizar un diagnóstico temprano, así como una evaluación del pronóstico para diversos cánceres y tumores incluyendo cáncer colorrectal (CrC).

La publicación n.° WO2011076147, titulada, Plasma-Based Micro-RNA Biomarkers And Methods For Early Detection of Colorectal, presentada por Li, divulga un kit de diagnóstico de marcadores moleculares en sangre para diagnosticar cáncer colorrectal, y/o monitorizar el efecto terapéutico para tratar cáncer colorrectal. Se dice que el kit comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, y cada molécula de ácido nucleico codifica para un biomarcador de microARN, en el que una o más de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se expresan de manera diferencial en plasma de paciente y control sano, y la una o más moléculas de ácido nucleico expresadas de manera diferencial representan juntas un biomarcador de expresión de ácidos nucleicos que es indicativo de la presencia de cáncer colorrectal. Se dice que la invención proporciona además métodos correspondientes que usan tales biomarcadores de expresión de ácido nucleico para identificar cáncer colorrectal, así como para prevenir o tratar un estado de este tipo. Finalmente, la invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de cáncer colorrectal.

La publicación n.° WO2011076142, titulada, Compositions And Methods For MicroRNA Expression Profiling in Plasma of Colorectal, también presentada por Li, se dice que enseña composiciones y métodos para la obtención del perfil de expresión de microARN (miARN) en plasma de cáncer colorrectal. En particular, se dice que la invención se refiere a un kit de diagnóstico de marcadores moleculares en sangre para diagnosticar cáncer colorrectal, monitorizar la terapia contra el cáncer y/o tratar cáncer colorrectal que incluye una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, codificando cada molécula de ácido nucleico para una secuencia de microARN, en el que una o más de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se expresan de manera diferencial en plasma de cáncer colorrectal y plasma de control sano, y en el que la una o más moléculas de ácido nucleico expresadas de manera diferencial representan juntas una firma de expresión de ácido nucleico que es indicativa de la presencia de cáncer colorrectal. La invención se dice que se refiere además a métodos correspondientes para usar tales firmas de expresión de ácido nucleico para identificar cáncer colorrectal, así como para prevenir o tratar un estado de este tipo. Finalmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de cáncer colorrectal.

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La publicación n.° WO2011088226, titulada, Detection Of Gastrointestinal Disorders, presentada por Christine, se dice que enseña métodos y sistemas para caracterizar un fenotipo detectando microARN, vesículas o biomarcadores que son indicativos de enfermedad o progresión de enfermedad. La enfermedad puede ser un trastorno gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal. Los microARN, vesículas o biomarcadores pueden detectarse en un fluido corporal.

La publicación n.° WO2010004562, titulada, Methods And Compositions For Detecting Colorectal Cancer, presentada por Baruch, se dice que enseña un método para llevar a cabo una detección temprana mínimamente invasiva de cáncer colorrectal y/o de células precursoras de cáncer colorrectal, usando moléculas de microARN asociadas con cáncer colorrectal, así como diversas moléculas de ácido nucleico relacionadas con el mismo o derivadas del mismo.

Finalmente, la publicación n.° WO2011012136, titulada, A Method For Classifying A Human Cell Sample As Cancerous, presentada por Fog, et al., se dice que enseña un método para discriminar entre muestras cancerosas y no cancerosas. Se dice que el método comprende detectar el nivel de al menos un microARN (miR) seleccionado del grupo I de Mir que consiste en: miR-21, miR-34a y miR-141, y detectar el nivel de al menos un miR seleccionado del grupo II de Mir que consiste en: miR-126, miR-143 y miR-145 en una muestra de células de prueba y, comparar el nivel de expresión de dichos miR seleccionados en la muestra de células de prueba con el nivel de expresión de los mismos miR seleccionados en un conjunto de prueba previamente registrado.

Sumario

Esta descripción incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: obtener una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal; medir un patrón o nivel de expresión global de uno o más microARN obtenidos de la una o más muestras biológicas del sujeto; y comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de cáncer colorrectal. En un aspecto, el método comprende además el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a, o miR335 que en comparación con la expresión del sujeto normal es indicativa de neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el método comprende además el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141. En otro aspecto, la una o más muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el método es capaz de detectar CRC incipiente (I-II) de manera tan precisa como CRC avanzado (estadio II-III), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo. En otro aspecto, el método comprende un intervalo de confianza que es del 90, el 9l, el 92, el 93, el 94 o el 95 % o mayor. En otro aspecto, el método comprende además determinar el nivel de expresión de microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal seleccionados de:

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En otro aspecto, el método comprende además determinar el nivel de expresión de microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal seleccionados de:

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En otro aspecto, el nivel de expresión del uno o más microARN se mide mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos. En otro aspecto, el método se usa para tratar un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia de agente antineoplásico para un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el patrón o nivel de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se selecciona de las tablas 2, 3, 4 y 5, en el que los microARN aumentan la especificidad de la determinación, diagnóstico o detección de neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el método comprende además la etapa de usar el patrón o nivel de expresión global de microARN para el pronóstico, guía de tratamiento o monitorización de la respuesta al tratamiento de la neoplasia colorrectal.

Esta descripción incluye un biomarcador para la progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal, metástasis o ambas en el que el biomarcador comprende uno o más microARN y un cambio en la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal obtenidas de un paciente es indicativo de progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal en comparación con la expresión global de la expresión del uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal normales o células de neoplasia colorrectal obtenidas en un punto de tiempo anterior del mismo paciente, en el que la sobreexpresión de la combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b, es indicativa de cáncer colorrectal. En un aspecto, el método comprende además el análisis de uno o más de los

siguientes microARN miR29a, miR92a, miR141, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a o miR335. En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal seleccionados de:

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En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que están sobreexpresados en colorrectal

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hsa-miR-15b; hsa-miR-15a; hsa-miR-30e*; hsa-miR-132*; y hsa-miR-921.

En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

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R-636;

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R-876-3p;

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R-1537;

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R-548¡;

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En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

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R-302b;

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hsa-miR-921.

El experto en la técnica reconocerá que con más frecuencia una biofirma (ensayo) incluirá la combinación de tanto microARN sobreexpresado como infraexpresado. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de tanto microARN sobreexpresado como infraexpresado de microARN respectivos. En otro aspecto, las muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el método es capaz de detectar CRC incipiente (I-II) de manera tan precisa como CRC avanzado (estadio II-III), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo. En otro aspecto, el patrón o nivel de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se selecciona de las tablas 2, 3, 4 y 5, en el que los microARN aumentan la especificidad de la determinación, diagnóstico o detección de neoplasia colorrectal.

Esta descripción incluye un kit para un diagnóstico de neoplasia colorrectal que comprende: reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b, en el que la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de neoplasia colorrectal, en el que un intervalo de confianza para cáncer colorrectal es del 90 % o mayor. En un aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a, o miR335. En un aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141. En otro aspecto, el kit comprende además instrucciones para el uso en el diagnóstico del riesgo de neoplasia colorrectal, en el que la instrucción comprende indicaciones etapa por etapa para comparar el nivel de expresión de los microARN, cuando se mide la expresión de una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que tiene neoplasia colorrectal con el nivel de expresión de una muestra obtenida de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el kit comprende además herramientas, recipientes y reactivos necesarios para obtener muestras de un sujeto seleccionadas del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para el análisis de microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

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R-636;

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R-876-3p;

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R-1537;

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R-630;

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hsa-miR-664*; hsa-miR-548j; hsa-miR-130b*; y hsa-miR-515-3p.

En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para el análisis de microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

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En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis del patrón de expresión o nivel de expresión para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN que se determina para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal seleccionados de los microARN de las tablas 2, 3, 4 y 5.

Aún otra realización de la descripción incluye un método para seleccionar una terapia contra el cáncer para un paciente al que se le ha diagnosticado neoplasia colorrectal, comprendiendo el método: obtener una muestra de un sujeto que tiene una neoplasia colorrectal; y determinar el nivel de expresión de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 en comparación con el nivel de expresión de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de los microARN es indicativa de cáncer colorrectal; y seleccionar la terapia contra el cáncer basándose en la determinación de la neoplasia colorrectal en el paciente.

Otro aspecto incluye un método para realizar un ensayo clínico para evaluar un fármaco candidato que se cree que es útil en el tratamiento de un estado patológico, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de microARN obtenidos de un conjunto de pacientes, en el que los microARN se seleccionan de uno o más microARN seleccionados de microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de los pacientes, y un placebo a un segundo subconjunto de los pacientes; un fármaco comparativo a un segundo subconjunto de los pacientes; o una combinación de fármacos del fármaco candidato y otro agente activo a un segundo subconjunto de pacientes; (c) repetir la etapa (a) tras la administración del fármaco candidato o el placebo, el fármaco comparativo o la combinación de fármacos; y (d) determinar si el fármaco candidato reduce el número de células neoplásicas colorrectales que tienen un cambio en la expresión de los microARN que es estadísticamente significativa en comparación con cualquier cambio que se produce en el segundo subconjunto de pacientes, en el que una reducción estadísticamente significativa indica que el fármaco candidato es útil en el tratamiento de dicho estado patológico.

Aún otro aspecto incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal; obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en el que las muestras biológicas se seleccionan de uno o más 5 fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal; medir un patrón o nivel de expresión global de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335; y comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia 10 colorrectal, en el que la sobreexpresión de microARN: miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335, es indicativa de cáncer colorrectal.

Aún otro aspecto incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal; 15 obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en el que las muestras biológicas se seleccionan de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal; medir un patrón o nivel de expresión global de uno o más microARN seleccionados de:

50 mejores miARN (UMMA)

AUC IC bajo IC alto punto de corte S Sp

hsa-miR-636

0,8079 0,6885 0,9273 0,6074 0,8537 0,6500

hsa-miR-876-3p

0,8402 0,7296 0,9509 0,6403 0,8537 0,7000

hsa-miR-1537

0,8524 0,9464 0,9780 0,699 0,8293 0,8000

hsa-miR-630

0,8256 0,7218 0,9294 0,6619 0,7561 0,7500

hsa-miR-380*

0,8244 0,7269 0,9780 0,7065 0,7317 0,8000

hsa-miR-338-5p

0,8439 0,7296 0,9581 0,7118 0,7317 0,8500

hsa-miR-573

0,8354 0,7243 0,9464 0,6829 0,8500 0,7592

hsa-miR-182*

0,8622 0,7687 0,9557 0,5313 0,8780 0,7000

hsa-miR-518c*

0,8610 0,7471 0,9748 0,5781 0,9024 0,8000

hsa-miR-187*

0,8537 0,7435 0,9638 0,7095 0,7561 0,8500

hsa-miR-1233

0,8707 0,7587 0,9827 0,5828 0,9268 0,8000

hsa-miR-449b

0,8329 0,7146 0,9512 0,6777 0,8049 0,8500

hsa-miR-1204

0,8622 0,7545 0,9699 0,6715 0,8293 0,8500

hsa-miR-518d-3p

0,8512 0,7389 0,9635 0,6514 0,9024 0,7500

hsa-miR-1290

0,8439 0,7338 0,9540 0,7042 0,7805 0,8000

hsa-miR-144:9.1

0,8524 0,7497 0,9552 0,7249 0,7561 0,8000

hsa-miR-105

0,8866 0,7972 0,9760 0,6281 0,8780 0,8000

hsa-miR-298

0,8805 0,7846 0,9764 0,6964 0,8049 0,8500

hsa-miR-491-5p

0,8610 0,7412 0,9807 0,6511 0,8780 0,8000

hsa-miR-576-3p

0,8866 0,7900 0,9830 0,635 0,8537 0,8000

hsa-miR-590-3p

0,8329 0,7122 0,9536 0,6806 0,7805 0,8000

hsa-miR-1257

0,8451 0,7254 0,9649 0,6496 0,7805 0,8000

hsa-miR-1225-3p

0,8683 0,7550 0,9815 0,6726 0,8293 0,8500

hsa-miR-127-3p

0,8683 0,7648 0,9718 0,5883 0,9024 0,7500

hsa-miR-936

0,8744 0,7743 0,9745 0,5981 0,8780 0,8000

hsa-miR-379

0,8732 0,7839 0,9624 0,5632 0,9268 0,7000

hsa-miR-664*

0,8171 0,6895 0,9446 0,6124 0,9024 0,7000

hsa-miR-548¡

0,8232 0,7127 0,9337 0,5905 0,8537 0,7000

hsa-miR-130b*

0,8518 0,7534 0,9502 0,7281 0,7805 0,7500

hsa-miR-515-3p

0,8659 0,7779 0,9538 0,5678 0,8537 0,7000

hsa-miR-302b

0,8280 0,7084 0,9477 0,5507 0,9024 0,7000

hsa-miR-125a-5p

0,8354 0,7242 0,9465 0,7217 0,7317 0,8500

hsa-miR-424

0,8463 0,7439 0,9488 0,6183 0,8537 0,7000

hsa-miR-125b

0,8488 0,7417 0,9558 0,7011 0,8049 0,8000

hsa-miR-100

0,8463 0,7328 0,9599 0,6536 0,8780 0,8000

hsa-miR-768-3p:11.0

0,8110 0,6945 0,9275 0,6736 0,7561 0,7500

hsa-miR-24

0,8317 0,7142 0,9493 0,6589 0,7805 0,7500

hsa-miR-23a

0,8659 0,7626 0,9690 0,5803 0,9268 0,7000

hsa-miR-1274b

0,8390 0,7303 0,9477 0,7056 0,7561 0,8000

hsa-miR-27a

0,8049 0,6821 0,9276 0,7093 0,7561 0,7500

hsa-miR-26b

0,8220 0,7122 0,9317 0,714 0,7561 0,7500

hsa-miR-30d

0,8311 0,7199 0,9422 0,6859 0,7805 0,8000

hsa-miR-520h,hsa-miR-520g

0,8427 0,7403 0,9451 0,7064 0,7561 0,8500

hsa-miR-302a

0,9024 0,8114 0,9935 0,6163 0,9268 0,8000

hsa-miR-518c

0,8610 0,7159 0,9402 0,5781 0,9024 0,8000

hsa-miR-335

0,8061 0,6837 0,9285 0,6744 0,7805 0,7000

hsa-miR-29a

0,8573 0,7427 0,9719 0,6418 0,8293 0,8000

hsa-miR-152

0,8329 0,7287 0,9372 0,716 0,7561 0,7500

hsa-miR-191

0,8463 0,7387 0,9540 0,6702 0,8293 0,7500

hsa-miR-17

0,8329 0,7164 0,9495 0,6218 0,6218 0,8000

hsa-miR-19b

0,8238 0,7006 0,9470 0,6582 0,8293 0,7500

hsa-miR-30a

0,8720 0,7641 0,9798 0,6823 0,8049 0,8500

hsa-miR-151-5p

0,8280 0,7062 0,9499 0,6133 0,8537 0,7500

hsa-miR-92a

0,8598 0,7634 0,9561 0,5437 0,9268 0,6500

hsa-miR-25

0,8549 0,7572 0,9525 0,7136 0,7561 0,8000

hsa-miR-15b

0,8329 0,7215 0,9443 0,6642 0,8049 0,7000

hsa-miR-15a

0,8585 0,7564 0,9607 0,6298 0,8537 0,7500

hsa-miR-30e*

0,8707 0,7810 0,9605 0,7165 0,7805 0,8500

hsa-miR-132*

0,8463 0,7280 0,9647 0,5986 0,9024 0,8000

hsa-miR-921

0,8476 0,7263 0,9689 0,6769 0,8537 0,8500

en el que ROC son los parámetros de área bajo la curva (AUC), IC es un intervalo de confianza del 95 %, S es la sensibilidad, y Sp es la especificidad; y comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN obtenidos de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión 5 global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que un cambio en el patrón de expresión global del uno o más microARN en la muestra biológica del sujeto es indicativo de neoplasia colorrectal. En un aspecto, los microARN están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-636;

hsa-m

R-876-3p;

hsa-m

R-1537;

hsa-m

R-630;

hsa-m

R-380*;

hsa-m

R-338-5p;

hsa-m

R-573;

hsa-m

R-182*;

hsa-m

R-518c*;

hsa-m

R-187*;

hsa-m

R-1233;

hsa-m

R-449b;

hsa-m

R-1204;

hsa-m

R-518d-3p;

hsa-m

R-1290;

hsa-m

R-144:9.1;

hsa-m

R-105;

hsa-m

R-298;

hsa-m

R-491-5p;

hsa-m

R-576-3p;

hsa-m

R-590-3p;

hsa-m

R-1257;

hsa-m

R-1225-3p;

hsa-m

R-127-3p;

hsa-m

R-936;

hsa-m

R-379;

hsa-m

R-664*;

hsa-m

R-548j;

hsa-m

R-130b*; y

hsa-m

R-515-3p.

En otro aspecto, los microARN están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-miR-302b;_____

hsa-miR-125a-5p;

hsa-miR-424;______

hsa-miR-125b;_____

hsa-miR-100;______

hsa-miR-768-3p:11.0;

5

10

15

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25

30

35

40

hsa-m

R-24;

hsa-m

R-23a

hsa-m

R-1274b;

hsa-m

R-27a

hsa-m

R-26b

hsa-m

R-30d

hsa-m

R-520h;

hsa-m

R-520g;

hsa-m

R-302 a.

hsa-m

R-518c;

hsa-m

R-335

hsa-m

R-29a

hsa-m

R-152

hsa-m

R-191

hsa-m

R-17;

hsa-m

R-19b

hsa-m

R-30a

hsa-m

R-151 -5p;

hsa-m

R-92a

hsa-m

R-25;

hsa-m

R-15b

hsa-m

R-15a

hsa-m

R-30e k.

hsa-m

R-132 *; y

hsa-m

R-921

En otro aspecto, el nivel de expresión del uno o más microARN se mide mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos.

En otro aspecto, el método se usa para tratar un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia de agente antineoplásico (por ejemplo, agentes de reticulación de ácidos nucleicos, pequeñas moléculas, agentes biológicos tales como anticuerpos monoclonales con o sin cargas de destrucción celular, tanto dirigidos como no dirigidos) para un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el patrón o nivel de expresión global de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se determina para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.

Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace ahora referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las que:

las figuras 1A y IB muestran la expresión de miARN diferencial mediante microalineamientos entre pacientes con CRC y controles del conjunto 1 (figura 1A), y entre pacientes con AA y controles (figura IB). El mapa de calor muestra los 50 miARN significativamente desregulados con el FC más alto. Los píxeles de color rojo corresponden a un aumento de la abundancia de miARN en la muestra de plasma indicada, mientras que los píxeles de color verde indican una disminución de los niveles de miARN.

La figura 2 es un gráfico del análisis entre grupos (BGA) que muestra el agrupamiento de las muestras basándose en la obtención del perfil de expresión de miARN. Controles sanos (C); pacientes con cáncer colorrectal (CRC); pacientes con adenomas avanzados (AA).

La figura 3 muestra gráficos de cajas que muestran la expresión de miARN plasmático en el conjunto 2 de CRC determinada mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de miARN se normalizan a miR16 y se representan como valores de -dCt. Las líneas dentro de las cajas indican las medianas. Las cajas marcan el intervalo entre los percentiles 25 y 75.

Las figuras 4A y 4B son análisis de características operativas del receptor (ROC) para la firma de dos miARN plasmáticos: miR19a + miR19b (figura 4A) y la firma de tres miARN plasmáticos: miR19a + miR19b + miR15b (figura 4B) según los resultados obtenidos a partir de la obtención del perfil de microalineamientos en el conjunto 1 de CRC y los datos de qRT-PCR en el conjunto 2 de CRC.

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Descripción detallada

Para facilitar la comprensión de esta invención, se definen varios términos a continuación. Los términos definidos en el presente documento tienen significados tal como entiende comúnmente un experto habitual en las áreas relevantes para la presente invención. Términos tales como “un”, “una” y “el/la” no pretenden referirse a solo una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual puede usarse un ejemplo específico para ilustración. La terminología en el presente documento se usa para describir realizaciones específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto tal como se señala en las reivindicaciones.

Abreviaturas: adenomas avanzados, AA; área bajo la curva de ROC, AUC; análisis entre grupos, BGA; cáncer colorrectal, CRC; cambio en veces, FC; modelos lineales para datos de microalineamientos, LIMMA; microARN, miARN; curva de características operativas del receptor, curva de ROC.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer colorrectal” y “neoplasia colorrectal” incluyen la definición médica bien aceptada que define el cáncer colorrectal como un estado médico caracterizado por cáncer de células del tubo gastrointestinal por debajo del intestino delgado (es decir, el intestino grueso (colon), incluyendo el ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto) e incluye precáncer (también denominado en el presente documento adenomas avanzados), cáncer en fase inicial y cáncer en fase terminal. Adicionalmente, tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer colorrectal” también incluye además estados médicos que se caracterizan por cáncer de células del duodeno e intestino delgado (yeyuno e íleon).

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de tejido” (el término “tejido” se usa de manera intercambiable con el término “muestra de tejido”) se refiere a e incluye cualquier material compuesto por una o más células, o bien individuales o bien en complejo con cualquier matriz o en asociación con cualquier compuesto químico. La definición incluirá cualquier material biológico u orgánico y cualquier subporción, producto o subproducto celular del mismo. La definición de “muestra de tejido” debe entenderse que incluye sin limitación esperma, óvulos, embriones y componentes sanguíneos. También se incluyen dentro de la definición de “tejido” para los propósitos de esta invención determinadas estructuras acelulares tales como capas dérmicas de la piel que tienen un origen celular pero que ya no se caracterizan como celulares. El término “deposición” tal como se usa en el presente documento es un término clínico que se refiere a heces excretadas por humanos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a una unidad que codifica para una proteína, un polipéptido o un péptido funcional. Tal como entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc o fragmentos o combinaciones de los mismos, así como productos génicos, incluyendo los que se han alterado artificialmente. Se usan genes, ácidos nucleicos y proteína y similares purificados para referirse a estas entidades cuando se identifican y se separan de al menos un ácido nucleico o proteína contaminante con la que están asociados habitualmente. El término “alelo” o “forma alélica” se refiere a una versión alternativa de un gen que codifica para la misma proteína funcional pero que contiene diferencias en la secuencia de nucleótidos en relación con otra versión del mismo gen.

Tal como se usa en el presente documento, el término “microARN” (“miARN” o “miR”) se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende el producto de un gen endógeno, no codificante cuyos transcritos de ARN precursor pueden formar horquillas pequeñas de las que se escinden “miARN” maduros mediante, por ejemplo, Dicer. Los “miARN” se codifican en genes distintos de los ARNm cuya expresión controlan.

Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, el resto de azúcar completo puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Pueden unirse monómeros de ácido nucleico mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares. El término “molécula de ácido nucleico” también incluye los denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que comprenden bases de ácido nucleico modificadas o que se producen de manera natural unidas a una estructura principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien monocatenarios o bien bicatenarios.

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El término “biomarcador” tal como se usa en el presente documento en diversas realizaciones se refiere a un compuesto bioquímico específico en el organismo que tiene una característica molecular particular que lo hace útil para diagnosticar y medir el progreso de la enfermedad o los efectos del tratamiento. Por ejemplo, los metabolitos o biomarcadores comunes encontrados en el aliento de una persona, y la condición de diagnóstico respectiva de la persona que proporciona tal metabolito incluyen, pero no se limitan a, acetaldehído (fuente: etanol, X-treonina; diagnóstico: intoxicación), acetona (fuente: acetoacetato; diagnóstico: dieta/diabetes), amoniaco (fuente: desaminación de aminoácidos; diagnóstico: uremia y enfermedad hepática), CO (monóxido de carbono) (fuente: CH2CI2, % de COHb elevada; diagnóstico: contaminación del aire de interiores), cloroformo (fuente: compuestos halogenados), diclorobenceno (fuente: compuestos halogenados), dietilamina (fuente: colina; diagnóstico: sobrecrecimiento de bacterias intestinales), H (hidrógeno) (fuente: intestinos; diagnóstico: intolerancia a la lactosa), isopreno (fuente: ácido graso; diagnóstico: estrés metabólico), metanotiol (fuente: metionina; diagnóstico: sobrecrecimiento de bacterias intestinales), metil etil cetona (fuente: ácido graso; diagnóstico: contaminación del aire de interiores/dieta), O-toluidina (fuente: metabolito de carcinoma; diagnóstico: carcinoma broncogénico), sulfuros y sulfuros de pentano (fuente: peroxidación de lípidos; diagnóstico: infarto de miocardio), H2S (fuente: metabolismo; diagnóstico: enfermedad periodontal/ovulación), MeS (fuente: metabolismo; diagnóstico: cirrosis) y Me2S (fuente: infección; diagnóstico: gingivitis ulceronecrosante aguda).

El término diferencias “estadísticamente significativas” entre los grupos estudiados se refiere a una condición en la que usando el análisis estadístico apropiado (por ejemplo, prueba de ji-cuadrado, prueba de la t) la probabilidad de que los grupos sean iguales es inferior al 5 %, por ejemplo p < 0,05. En otras palabras, la probabilidad de obtener los mismos resultados en una base completamente aleatoria es inferior a 5 de 100 intentos.

El término “kit” o “kit de pruebas” denota combinaciones de reactivos y adyuvantes requeridos para un análisis. Aunque un kit de pruebas consiste en la mayoría de los casos de varias unidades, también están disponibles elementos de análisis de una pieza, que deben considerarse asimismo kits de pruebas.

El término “reacción en cadena de la polimerasa” (PCR) tal como se usa en el presente documento se refiere al método de K.B. Mullis, patentes estadounidenses n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188, incorporadas por el presente documento como referencia, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores de oligonucleótido en la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclado término en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia diana bicatenaria. Para efectuar la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y entonces se aparean los cebadores con sus secuencias complementarias dentro de la molécula diana. Tras el apareamiento, se extienden los cebadores con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, apareamiento de los cebadores y extensión con polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, el apareamiento y la extensión constituyen un “ciclo”; puede haber numerosos “ciclos”) para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto al otro y, por tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del procedimiento, el método se denomina “reacción en cadena de la polimerasa” (a continuación en el presente documento PCR).

Tal como se usa en el presente documento, el uno o más microARN puede medirse mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos. Sin embargo, pueden usarse otras técnicas para determinar la expresión de microARN tal como resonancia de plasmones superficiales, efectos de resonancia de fluorescencia (transferencia, extinción y variantes de las mismas) o la siguiente generación de cualquiera de las técnicas enumeradas anteriormente y combinaciones de las mismas, todas las cuales están dentro del alcance de la presente invención. El nivel de expresión global del uno o más microARN puede usarse para aumentar la sensibilidad y calidad de la determinación de la presencia de la neoplasia colorrectal. Por ejemplo, es típico que un aumento en la sensibilidad vaya acompañado por un aumento en el número de microARN medidos, por ejemplo, cuantos más microARN se midan (por ejemplo, 2 frente a 8 o 15 frente a 30) hay un aumento concomitante en la calidad de la determinación tal como conocen bien los expertos en la técnica en el área de niveles de expresión. El experto en la técnica reconocerá que lo más a menudo una biofirma (ensayo) incluirá la combinación de microARN tanto sobreexpresados como infraexpresados. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de tanto microARN sobreexpresados como infraexpresados de microARN respectivos.

La presente invención puede usarse para el diagnóstico y tratamiento de pacientes, que incluye o puede ampliarse a pronóstico, guía de tratamiento, monitorización de la respuesta al tratamiento, uso en ensayos clínicos, investigación y combinaciones de los mismos. El experto en la técnica reconocerá que la detección de los microARN identificados en el presente documento puede usarse para cualquiera de estos usos.

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Los microARN (miARN) son moléculas de ARN no codificante conservadas evolutivamente, endógenas, pequeñas de 20-22 nucleótidos que funcionan como reguladores de la expresión génica. Pruebas recientes han mostrado que los miARN regulan diversos procesos celulares cruciales tales como desarrollo, diferenciación, proliferación y apoptosis. Se cree que desempeñan un papel importante en el inicio y la progresión de cáncer humano, actuando como oncogenes o supresores de tumores [I].

Se han observado cambios en los perfiles de expresión de miARN en diversos tejidos en una variedad de patologías humanas incluyendo cáncer. Hasta la fecha, cada tipo de tumor analizado mediante obtención del perfil tisular de miARN ha mostrado perfiles de miARN significativamente diferentes en comparación con células normales del mismo tejido [2-4]. Además, algunos informes recientes han demostrado que están presentes miARN en el suero y el plasma de humanos y otros animales [5-7]. Los niveles circulantes de miARN son bastante estables, reproducibles y constantes entre individuos de la misma especie [5]. Por tanto, la obtención del perfil de expresión de miARN circulante es muy prometedora como estrategia no invasiva nueva para el diagnóstico de cáncer y otras enfermedades.

El cáncer colorrectal (CRC) es el segundo cáncer más común en los países occidentales, y representa la segunda causa principal de muerte relacionada con cáncer [8]. Afortunadamente, hay pruebas de que el examen de individuos de riesgo promedio puede dar como resultado una reducción de la incidencia y mortalidad mediante la detección temprana de cáncer y la eliminación de las lesiones precursoras de cáncer [9]. De hecho, el objetivo de los programas de examen es la detección de CRC en fase inicial y adenomas avanzados (AA) que son lesiones premalignas asociadas con un alto riesgo de progresión a una lesión invasiva.

Actualmente, no hay ninguna estrategia óptima y universalmente aceptada para el examen de CRC [10,11] y las pruebas basadas en heces se ven dificultadas por su limitada sensibilidad, la colonoscopia constituye un enfoque invasivo [12]. Por tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques que puedan complementar y mejorar las estrategias actuales. En ese sentido, estudios previos han encontrado que algunos miARN están aumentados en plasma de pacientes con CRC, lo que sugiere un posible papel como biomarcadores no invasivos (13-16).

Sin embargo, todos ellos estaban limitados al análisis de un pequeño número de miARN. Por consiguiente, es obligatorio caracterizar adicionalmente la obtención del perfil de miARN plasmáticos mediante técnicas de alto rendimiento y evaluar sus características de rendimiento en la detección de individuos que albergan CRC y/o lesiones precursoras de cáncer. En el presente estudio, se realizó una obtención del perfil de miARN plasmáticos mediante microalineamientos en un conjunto de pacientes con CRC o AA, e individuos sanos, identificando un grupo de miARN que podían detectar pacientes con neoplasia colorrectal con alta capacidad de discriminación. La validación en una cohorte independiente de individuos y el uso de una tecnología diferente permite confirmar 6 miARN plasmáticos como biomarcadores muy prometedores para el diagnóstico no invasivo de CRC.

Los miARN circulantes son muy prometedores como biomarcadores nuevos para el diagnóstico de cáncer y otras enfermedades. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques no invasivos que puedan complementar y mejorar las estrategias actuales para el examen de cáncer colorrectal (CRC). Se realizó la obtención del perfil de expresión de miARN plasmáticos en todo el genoma mediante microalineamientos en un conjunto de individuos (n = 61) incluyendo pacientes con CRC o con lesiones premalignas tales como adenomas colorrectales avanzados (AA), y sujetos sanos. Se usó qRT-PCR en tiempo real para validar la expresión de miARN seleccionados en una cohorte independiente de pacientes de otro hospital (n = 135). Los pacientes con CRC o AA mostraron perfiles de expresión de miARN plasmáticos significativamente diferentes en comparación con los controles. Se seleccionó un grupo de 13 miARN para que se validaran en una cohorte independiente de pacientes, y se confirmó que 6 de ellos estaban significativamente sobreexpresados en el grupo de CRC, mostrando una alta exactitud de discriminación. Se confirmó que uno de estos 6 miARN también estaba significativamente sobreexpresado en pacientes con AA, con una capacidad de discriminación moderada.

Se incluyeron de manera prospectiva un total de 273 sujetos de dos hospitales (Hospital Clinic de Barcelona, Cataluña, España y Hospital de Donostia, Guipúzcoa, España). De ellos, se excluyeron 77 debido a que cumplían cualquiera de los siguientes criterios: diagnóstico clínico de poliposis adenomatosa familiar o síndrome de Lynch, presencia de más de 10 adenomas colorrectales, diagnóstico de cáncer en otros sitios en el momento de la selección, presencia de enfermedad inflamatoria del intestino, estar sometiéndose a quimioterapia o radioterapia en el momento de la toma de muestras de sangre, examen incompleto del intestino, preparación inadecuada del intestino en la colonoscopía de diagnóstico o la presencia de hemólisis en muestras de plasma. Finalmente, se incluyeron 196 individuos: 123 pacientes recién diagnosticados con neoplasia colorrectal esporádica (63 con CRC y 40 con AA) y 73 individuos sanos sin historia personal de ningún cáncer y con una colonoscopia reciente que confirma la ausencia de lesiones neoplásicas colorrectales. Los pacientes con AA fueron aquellos con adenomas que tenían un tamaño de al menos 10 mm o que tenían histológicamente displasia de alto grado o >20% de componente velloso. Estos individuos se dividieron en dos conjuntos diferentes y no relacionados: conjunto 1, 61 sujetos del Hospital Clinic de Barcelona, que se emplearon para realizar la obtención del perfil de microARN plasmáticos en todo el genoma; y conjunto 2, 135 sujetos del Hospital de Donostia, que se reclutaron para validar adicionalmente los resultados obtenidos en el conjunto 1. Las características de los participantes se muestran en la

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tabla 1. Se recogieron muestras de sangre antes de la endoscopia o la cirugía en todos los individuos. Tabla 1. Características de los pacientes.

Conjunto 1 (microalineamiento) Conjunto 2 (qRT-PCR)

Control (n = 20) Neoplasma (n =41) Control (n = 53) Neoplasma (n = 82)

Edad promedio (DE)

60,6 (12,5) 72,5 (9,7) 62,1 (3,5) 62,8 (6,3)

Género -n.°

Hombre

11 20 26 42

Mujer

9 21 27 40

Características de cáncer colorrectal

Pacientes -n.°

- 21 - 42

Estadio de TNM -n.°

I

- 4 - 8

II

- 8 - 13

III

- 6 - 16

IV

- 3 - 5

Ubicación -n.°

Proximal

- 10 - 14

Distal

- 11 - 28

Características de adenoma

Pacientes -n.°

- 20 - 40

Tamaño >1 cm -n.°

- 20 - 36

Tamaño medio (mm)

- 22,4 - 11,5

Displasia de alto grado -n.°

- 3 - 0

Componente velloso -n.°

- 10 - 23

Morfología sésil -n.°

- 10 - 5

El Comité de Ética Institucional del Hospital Clinic de Barcelona aprobó el estudio (fecha de aprobación: 26/03/2009), y se obtuvo consentimiento informado por escrito de todos los participantes según la Declaración de Helsinki.

Extracción de ARN a partir de muestras de plasma. Se recogieron veinte ml de sangre completa de cada participante en tubos de EDTA. Se colocaron las muestras de sangre a 4 °C hasta la separación del plasma, y se congeló el plasma en el plazo de 6 horas de la extracción de la sangre. Brevemente, se centrifugaron las muestras a 1600 x g durante 10 minutos a 4 °C para desacelerar las células sanguíneas, y se transfirió el plasma a tubos nuevos, seguido por centrifugación adicional a 16 000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar completamente los componentes celulares. Entonces se tomaron alícuotas del plasma y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Se aisló ARN total que contenía ARN pequeños a partir de 550 |il de plasma usando reactivo Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania), según el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones. Se añadió reactivo Trizol LS a muestras de plasma en una razón volumétrica 2:1. Tras la separación de fases mediante adición de cloroformo y centrifugación, se separó la fase acuosa a un nuevo tubo y se añadió adicionalmente un volumen de Trizol LS. Tras la segunda separación de fases, se añadieron 1,5 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa y se cargó la mezcla en una columna miRNeasy, según las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo tratamiento con ADNasa (Qiagen) para eliminar cualquier ADN contaminante. El volumen de elución final era de 30 |il. Se cuantificó la concentración de ARN usando NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, DE) en todas las muestras y osciló entre 3 y 35 ng/|il. Se repitió el procedimiento de extracción para cada muestra hasta obtener una cantidad de ARN suficiente para las siguientes etapas.

Obtención del perfil de miARN plasmáticos en todo el genoma mediante microalineamiento. Se realizó la obtención del perfil de expresión de miARN en todas las muestras del conjunto 1 usando el ensayo de obtención del perfil de expresión de microARN basándose en la plataforma SAM-Bead Array (lllumina, Inc. San Diego, CA). Este microalineamiento contiene 1146 sondas, incluyendo 743 miARN validados, que detectan alrededor del 97 % de los miARN humanos anotados en la base de datos miRBase Sanger v.12.0. Se realizó el ensayo de microalineamiento de miARN usando 200 ng de ARN total por muestra. Se realizaron todas las etapas según el protocolo del fabricante, tal como se describió previamente [13,14]. Se extrajeron los datos usando el software de análisis de datos BeadStudio y se transformaron a la escala logarítmica de base 2. Se normalizaron por cuantiles los datos de microalineamiento usando el paquete bioconductor Lumi [15].

Análisis de la expresión de miARN mediante qRT-PCR en tiempo real. Se analizó la expresión de miARN mediante qRT-PCR en tiempo real con un procedimiento de preamplificación múltiple previo. Brevemente, se transcribieron de manera inversa 21 ng de ARN plasmático con una mezcla de cebadores Megaplex RT (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) y se preamplificaron con cebadores Megaplex PreAmp y TaqMan PreAmp MasterMix (Applied

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Biosystems Inc.) durante 14 ciclos. Se evaluó la expresión de cada miARN mediante qPCR usando ensayos de miARN TaqMan (Applied Biosystems Inc.) en un sistema de PCR en tiempo real Viia7 (Applied Biosystems Inc.). Se analizaron varios supuestos ARN nucleares pequeños de mantenimiento con el fin de determinar el más adecuado en las muestras (RNU6B, miR16, miR423-5p, rNu48, miR544, miR103, miR525, miR451). MiR16 presentó la mayor estabilidad y abundancia y, por tanto, se normalizaron los niveles de expresión de miARN a miR16 como control interno en concordancia con otras publicaciones [16,17]. Se calcularon los valores de Ct a partir del umbral automático. Ningún control de molde mostró amplificación. Se incluyeron tres réplicas técnicas para cada punto de qPCR. Se calcularon los niveles de expresión relativa de miARN seleccionados para cada muestra como valores de ACt [ACt = Ct de miARN diana - Ct de miARN de control interno].

Análisis estadístico. Se usó un modelo lineal para datos de microalineamiento (LIMMA) para identificar miARN expresados de manera diferencial entre grupos. LIMMA usa modelos lineales y estadísticos de F y estadísticos de t moderada apareada de Bayes empírica [18]. Se usaron los miARN más significativos usando estadística de F para realizar el análisis de correspondencia tal como se implementa en la función de análisis entre grupos (BGA) incluida en el paquete made4 [19]. Este método es capaz de visualizar datos de alta dimensión (tal como mediciones de expresión múltiple) en un gráfico 2D en el que las áreas delimitadas por las elipses representan el 95 % de la distribución binormal estimada de las puntuaciones de muestra en los ejes primero y segundo [20], se realizaron diagramas de Venn considerando como acierto solo miARN con un cambio en veces absoluto mayor de 1,5 y un valor de p moderado < 0,05 (VennCounts y VennDiagram del paquete de LIMMA). Se analizaron las variables cuantitativas usando la prueba de Student. Se consideró un valor de p bilateral < 0,05 como significativo. Se calculó la evaluación de la predictibilidad de miARN individuales y diferentes combinaciones de miARN, ajustadas por edad y género, usando regresión logística (distribución binomial GLM). Se calcularon gráficos de análisis de ROC y puntos de corte derivados, así como parámetros de precisión de discriminación global usando el paquete DiagnosisMed R. Se calcularon la sensibilidad y especificidad a partir del punto de corte óptimo asociado con la distancia mínima entre la curva de ROC y la esquina superior izquierda.

Obtención del perfil de miARN en todo el genoma en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal. La expresión de miARN plasmáticos discrimina pacientes con cáncer colorrectal de individuos sanos. Para evaluar la obtención del perfil de expresión de miARN circulante diferente entre pacientes con CRC e individuos sanos, se llevaron a cabo experimentos de microalineamiento de miARN en ARN total obtenido de muestras de plasma de 21 pacientes con CRC y 20 controles sanos. Para investigar adicionalmente si se encontraron patrones de expresión de miARN alterados en pacientes con lesiones precursoras de cáncer colorrectal, también se realizaron experimentos de microalineamiento de miARN en ARN plasmático de 20 pacientes con adenomas colorrectales avanzados (AA).

Un análisis estadístico comparativo inicial que empleaba LIMMA produjo un total de 93 miARN significativamente desregulados (p < 0,05) en pacientes con CRC en comparación con individuos sanos, y 125 miARN cuando se compararon pacientes con aA con controles sanos. Todos los datos de microalineamiento están disponibles en GEO (número de registro: GSE 25609). Las figuras 1A y 1B muestran mapas térmicos que incluyen los 50 miARN con el cambio en veces significativo más alto entre pacientes con CRC y controles (figura 1A), y entre pacientes con AA y controles (figura 1B). Los valores de p y las diferencias de cambio en veces, así como los parámetros de predictibilidad correspondientes para estos miARN en CRC o AA se muestran en las tablas 2-3 y 4-5, respectivamente. Entonces se realizó un gráfico de BGA para representar visualmente la proximidad entre pacientes que albergan CRC o AA, y controles según la expresión de miARN plasmáticos. Tal como se representa en la figura 2, los pacientes con CRC o AA, y los individuos sanos aparecieron como tres grupos claramente separados. También se analizaron las especificidades de expresión de miARN de cada tipo de lesión neoplásica, es decir, CRC y AA, en comparación con muestras de control usando análisis de Venn (figura 2). Se encontró que un subconjunto de 21 y 28 miARN se regulaban por incremento de manera exclusiva y significativa en pacientes con CRC y AA, respectivamente, mientras que ambos tipos de pacientes neoplásicos compartían 24 miARN regulados por incremento de manera significativa. Por tanto, cada lesión neoplásica colorrectal tiene un perfil de expresión de miARN particular, pero ambas comparten también un número importante de miARN desregulados, lo que podría permitir la identificación de ambas lesiones usando una única prueba basada en una firma de miARN plasmático común.

Tabla 2. Parámetros de cambio en veces y valor de p para los 50 mejores miARN desregulados en CRC que muestran los cambios en veces más altos.

50 mejores miARN

n.° de MIMAT FC P

hsa-miR-302a

MIMAT0000684 10,57 0,0002

hsa-miR-30a

MIMAT0000087 9,43 0,0001

hsa-miR-302b

MIMAT0000714 5,97 0,0042

hsa-miR-565:9.1

MI0003571 5,69 0,0010

hsa-miR-191

MIMAT0000440 5,32 0,0061

hsa-miR-125b

MIMAT0000423 5,27 0,0022

hsa-miR-100

MIMAT0000098 4,69 0,0180

hsa-miR-194

MIMAT0000460 4,67 0,0160

hsa-miR-27a

MIMAT0000084 4,53 0,0045

hsa-miR-424

MIMAT0001341 4,47 0,0055

hsa-miR-125a-5p

MIMAT0000443 4,41 0,0060

hsa-miR-335

MIMAT0000765 4,16 0,0268

hsa-miR-29a

MIMAT0000086 4,11 0,0237

hsa-miR-219-5p

MIMAT0000276 4,00 0,0427

hsa-miR-17

MIMAT0000070 3,95 0,0386

hsa-miR-520h/g

MIMAT0002867 3,92 0,0047

hsa-miR-151-5p

MIMAT0004697 3,92 0,0131

hsa-miR-524-5p

MIMAT0002849 3,82 0,0172

hsa-miR-29b

MIMAT0000086 3,77 0,0340

hsa-miR-202*

MIMAT0002810 3,51 0,0231

hsa-miR-9

MIMAT0000441 3,36 0,0074

hsa-miR-150

MIMAT0000451 3,30 0,0394

hsa-miR-15b

MIMAT0000417 3,21 0,0019

hsa-miR-518c

MIMAT0002848 3,20 0,0304

hsa-miR-23a

MIMAT0000078 3,14 0,0003

hsa-miR-19b

MIMAT0000074 3,03 0,0035

hsa-miR-25

MIMAT0004498 3,03 0,0060

hsa-miR-15a

MIMAT0000068 3,02 0,0238

hsa-miR-143

MIMAT0004599 3,00 0,0069

hsa-miR-141

MIMAT0004598 2,77 0,0211

hsa-miR-30d

MIMAT0000245 2,62 0,0315

hsa-miR-627

MIMAT0003296 2,62 0,0207

hsa-miR-26b

MIMAT0000083 2,60 0,0059

hsa-miR-24

MIMAT0000080 2,46 0,0140

hsa-miR-217

MIMAT0000274 2,24 0,0278

hsa-miR-92a

MIMAT0000092 1,83 0,0437

hsa-miR-376b

MIMAT0002172 -1,90 0,0281

hsa-miR-637

MIMAT0003307 -1,90 0,0432

hsa-miR-130b*

MIMAT0004680 -1,95 0,0116

hsa-miR-1537

MIMAT0007399 -1,97 0,0383

hsa-miR-633

MIMAT0003303 -2,01 0,0448

hsa-miR-10a

MIMAT0000253 -2,12 0,0337

hsa-miR-127-3p

MIMAT0000446 -2,23 0,0072

hsa-miR-337-3p

MIMAT0000754 -2,23 0,0319

hsa-miR-575

MIMAT0003240 -2,24 0,0257

hsa-miR-936

MIMAT0004979 -2,25 0,0084

hsa-miR-626

MIMAT0003295 -2,31 0,0361

hsa-miR-1271

MIMAT0005796 -2,38 0,0315

hsa-miR-876-3p

MIMAT0004925 -2,65 0,0023

hsa-miR-639

MIMAT0003309 -2,90 0,0222

Tabla 3. Predictibilidad de cada miARN individual entre los 50 mejores miARN desregulados en CRC. Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área bajo la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95 %, y sensibilidad (S) y especificidad (Sp)) correspondientes a un punto de corte óptimo.

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50 mejores miARN

AUC IC ba¡o IC alto punto de corte S Sp

hsa-miR-302a

0,9143 0,8233 1,0053 0,5195 81 90

hsa-miR-30a

0,9048 0,7992 1,0103 0,5151 86 85

hsa-miR-302b

0,8524 0,7327 0,9720 0,5333 81 80

hsa-miR-565:9.1

0,8905 0,7861 0,9948 0,5262 81 85

hsa-miR-191

0,8667 0,7557 0,9776 0,4503 90 75

hsa-miR-125b

0,8714 0,7429 1,0000 0,5443 86 85

hsa-miR-100

0,8643 0,7381 0,9904 0,5230 86 90

hsa-miR-194

0,8238 0,6885 0,9591 0,4942 86 75

hsa-miR-27a

0,8405 0,7092 0,9717 0,5899 86 80

hsa-miR-424

0,8619 0,7514 0,9725 0,5888 76 80

hsa-miR-125a-5p

0,8500 0,7272 0,9728 0,5901 76 85

hsa-miR-335

0,8310 0,6973 0,9646 0,5494 81 85

hsa-miR-29a

0,8667 0,7435 0,9898 0,5449 81 85

hsa-miR-219-5p

0,8238 0,6967 0,9509 0,5895 76 75

hsa-miR-17

0,8429 0,7185 0,9672 0,4718 81 80

hsa-miR-520h/g

0,8786 0,7724 0,9847 0,5382 81 85

hsa-miR-151-5p

0,8476 0,7183 0,9770 0,4912 90 80

hsa-miR-524-5p

0,8333 0,7023 0,9643 0,5795 76 90

hsa-miR-29b

0,8381 0,7136 0,9626 0,4574 90 75

hsa-miR-202*

0,8405 0,7121 0,9689 0,4558 90 75

hsa-miR-9

0,8381 0,7138 0,9624 0,5730 81 80

hsa-miR-150

0,8429 0,7184 0,9673 0,4537 86 75

hsa-miR-15b

0,8643 0,7507 0,9778 0,5775 81 80

hsa-miR-518c

0,8476 0,7216 0,9737 0,5840 81 85

hsa-miR-23a

0,8905 0,7861 0,9948 0,5799 81 80

hsa-miR-19b

0,8381 0,7016 0,9746 0,6538 81 80

hsa-miR-25

0,8952 0,8028 0,9876 0,5533 81 80

hsa-miR-15a

0,8619 0,7493 0,9745 0,4686 81 75

hsa-miR-143

0,8524 0,7333 0,9714 0,5989 76 85

hsa-miR-141

0,8429 0,7082 0,9776 0,5084 86 85

hsa-miR-30d

0,8226 0,6918 0,9534 0,5176 76 80

hsa-miR-627

0,8333 0,7083 0,9584 0,5961 71 85

hsa-miR-26b

0,8619 0,7505 0,9733 0,5455 90 70

hsa-miR-24

0,8524 0,7292 0,9756 0,4210 90 75

hsa-miR-217

0,8310 0,7035 0,9584 0,5650 67 80

hsa-miR-92a

0,8571 0,7451 0,9692 0,2972 95 65

hsa-miR-376b

0,8262 0,7004 0,9520 0,6884 62 90

hsa-miR-637

0,8595 0,7435 0,9756 0,4911 86 75

hsa-miR-130b*

0,8762 0,7694 0,9830 0,6915 71 95

hsa-miR-1537

0,8524 0,7198 0,9849 0,4172 90 75

hsa-miR-633

0,8595 0,7439 0,9751 0,5986 76 85

hsa-miR-10a

0,8810 0,7764 0,9855 0,4161 86 75

hsa-miR-127-3p

0,8833 0,7744 0,9922 0,5676 81 85

hsa-miR-337-3p

0,8452 0,7222 0,9683 0,5727 71 80

hsa-miR-575

0,8298 0,7015 0,9580 0,6407 76 85

hsa-miR-936

0,8476 0,7249 0,9704 0,5919 71 90

hsa-miR-626

0,8214 0,6928 0,9501 0,6718 71 80

hsa-miR-1271

0,8190 0,6896 0,9485 0,6845 67 85

hsa-miR-876-3p

0,8476 0,7212 0,9741 0,4657 90 75

hsa-miR-639

0,8071 0,6753 0,9390 0,7118 52 95

Tabla 4. Parámetros de cambio en veces y valor de p para los 50 mejores miARN desregulados en AA que muestran los cambios en veces más altos.

50 mejores miARN

n.° de MIMAT FC valor de p

hsa-miR-302a

MIMAT0000684 10,37 0,0003

hsa-miR-29a

MIMAT0000086 9,12 0,0001

hsa-miR-152

MIMAT0000438 6,29 0,0002

hsa-miR-518e*

MIMAT0005450 6,12 0,0079

hsa-miR-768-3p:11.0

MI0005117 5,68 0,0048

hsa-miR-335

MIMAT0000765 5,67 0,0112

hsa-miR-17

MIMAT0000070 5,46 0,0069

hsa-miR-30a

MIMAT0000087 4,91 0,0142

hsa-miR-191

MIMAT0000440 4,82 0,0162

hsa-miR-100

MIMAT0000098 4,55 0,0235

hsa-miR-519d

MIMAT0002853. 4,24 0,0277

hsa-miR-199a-5p

MIMAT0000231 4,11 0,0222

hsa-miR-125a-5p

MIMAT0000443 3,96 0,0219

hsa-miR-424

MIMAT0001341 3,95 0,0174

hsa-miR-18a

MIMAT0000072 3,88 0,0133

hsa-miR-193b

MIMAT0002819 3,80 0,0394

hsa-miR-302a*

MIMAT0000683 3,76 0,0340

hsa-miR-151-5p

MIMAT0004697 3,75 0,0150

hsa-miR-125b

MIMAT0000423 3,75 0,0275

hsa-miR-518c

MIMAT0002848 3,67 0,0159

hsa-miR-130a

MIMAT0000425 3,59 0,0079

hsa-miR-30d

MIMAT0000245 3,58 0,0025

hsa-miR-22

MIMAT0000077 3,27 0,0096

hsa-miR-15a

MIMAT0000068 3,25 0,0133

hsa-miR-192

MIMAT0000222 3,22 0,0404

hsa-miR-484

MIMAT0002174 3,18 0,0067

hsa-miR-522

MIMAT0002868 2,93 0,0394

hsa-miR-423-3p

MIMAT0001340 2,88 0,0367

hsa-miR-217

MIMAT0000274 2,79 0,0056

hsa-miR-664

MIMAT0005949 2,70 0,0252

hsa-miR-30e*

MIMAT0000693 2,63 0,0001

hsa-miR-185

MIMAT0000455 2,59 0,0357

hsa-miR-19b

MIMAT0000074 2,57 0,0321

hsa-miR-1274b

MI0006427 2,55 0,0216

hsa-miR-23a

MIMAT0000078 2,51 0,0047

hsa-miR-324-3p

MIMAT0000762 2,48 0,0118

hsa-let-7d

MIMAT0000065 2,47 0,0300

hsa-miR-581

MIMAT0003246 2,46 0,0081

hsa-miR-450b-3p

MIMAT0004910 -2,49 0,0268

hsa-miR-187*

MIMAT0004561 -2,59 0,0002

hsa-miR-576-3p

MIMAT0004796 -2,59 0,0001

hsa-miR-1290

MIMAT0005880 -2,62 0,0005

hsa-miR-380*

MIMAT0000734 -2,66 0,0016

hsa-miR-369-3p

MIMAT0000721 -2,84 0,0190

hsa-miR-876-3p

MIMAT0004925 -3,09 0,0022

hsa-miR-671-3p

MIMAT0004819 -3,52 0,0008

hsa-miR-936

MIMAT0004979 -3,55 0,0001

hsa-miR-218

MIMAT0000275 -4,56 0,0122

hsa-miR-379

MIMAT0000733 -5,71 0,0000

hsa-miR-630

MIMAT0003299 -6,29 0,0010

Tabla 5. Predictibilidad de cada miARN individual entre los 50 mejores miARN desregulados en AA. Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área bajo la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95 %, y sensibilidad (S) y especificidad (Sp)) correspondientes a un punto de corte óptimo.

5

50 mejores miARN

AUC IC ba¡o IC alto punto de corte S Sp

miR.302a

0,9100 0,8170 1,0030 0,3571 95 80

miR.29a

0,8775 0,7656 0,9894 0,3763 90 80

miR.152

0,875 0,7700 0,9800 0,5804 80 85

miR.518c*

0,7925 0,6551 0,9299 0,5243 65 70

miR.768.3p.11.0

0,8175 0,6888 0,9462 0,4317 80 65

miR.335

0,7925 0,6545 0,9305 0,5461 65 75

miR.17

0,8525 0,7340 0,9710 0,4344 80 75

miR.30a

0,8350 0,7050 0,9650 0,4889 80 80

miR.191

0,8200 0,6888 0,9512 0,5530 75 75

miR.100

0,8300 0,6963 0,9637 0,5106 80 80

miR.519d

0,7925 0,6527 0,9323 0,4689 80 70

miR.199a.5p

0,8050 0,6711 0,9389 0,4913 75 70

miR.125a.5p

0,8225 0,6922 0,9528 0,3773 90 65

miR.424

0,8350 0,7128 0,9572 0,4925 75 70

miR.18a

0,8400 0,7164 0,9636 0,5475 80 80

miR.193b

0,7875 0,6473 0,9277 0,5452 75 75

miR.302a*

0,8200 0,6850 0,9550 0,5003 80 80

miR.151.5p

0,7950 0,6564 0,9336 0,4711 75 70

miR.125b

0,8250 0,6988 0,9512 0,3842 80 70

miR.518c

0,8475 0,7273 0,9677 0,5524 75 70

miR.130a

0,8275 0,6900 0,9650 0,5786 80 85

miR.30d

0,8725 0,7659 0,9791 0,3596 85 70

miR.22

0,8525 0,7310 0,9740 0,5737 75 80

miR.15a

0,8725 0,7654 0,9796 0,4755 80 75

miR.192

0,7800 0,6386 0,9214 0,4435 80 65

miR.484

0,8625 0,7492 0,9758 0,3974 90 70

miR.522

0,7975 0,6613 0,9337 0,5762 70 75

miR.423.3p

0,8150 0,6780 0,9520 0,5520 70 85

miR.217

0,8525 0,7257 0,9793 0,5673 75 95

miR.664

0,8175 0,6715 0,9635 0,5403 80 80

5

10

15

20

25

30

35

miR.30e*

0,8775 0,7709 0,9841 0,5039 85 80

miR.185

0,8275 0,6976 0,9574 0,6138 65 85

miR.19b

0,8087 0,6746 0,9429 0,4663 80 70

miR.1274b

0,8400 0,7189 0,9611 0,5231 70 75

miR.23a

0,8400 0,7195 0,9605 0,4723 85 70

miR.324.3p

0,8275 0,6976 0,9574 0,5407 80 70

let.7d

0,8025 0,6645 0,9405 0,5203 75 70

miR.581

0,8525 0,7340 0,9710 0,6819 70 90

miR.450b.3p

0,7550 0,6059 0,9041 0,5207 65 70

miR.187*

0,9075 0,8125 1,0025 0,5139 85 85

miR.576.3p

0,9575 0,8941 1,0209 0,4191 90 90

miR.1290

0,8750 0,7669 0,9831 0,4742 85 80

miR.380*

0,8475 0,7156 0,9794 0,5532 75 90

miR.369.3p

0,7925 0,6533 0,9317 0,5663 65 80

miR.876.3p

0,8325 0,7090 0,9560 0,6131 70 80

miR.671.3p

0,8550 0,7393 0,9707 0,5179 65 85

miR.936

0,9225 0,8427 1,0023 0,5084 85 85

miR.218

0,8000 0,6591 0,9409 0,4740 75 70

miR.379

0,9325 0,8519 1,0131 0,5830 85 95

miR.630

0,8375 0,7132 0,9618 0,4579 75 70

Validación de la expresión de miARN plasmáticos mediante qRT-PCR en tiempo real. Los resultados de la expresión de miARN plasmáticos basados en microalineamientos son técnicamente reproducibles. Inicialmente, se realizó una qRT-PCR en tiempo real para confirmar los resultados de microalineamiento en 28 muestras seleccionadas aleatoriamente del conjunto 1 (19 pacientes con neoplasmas colorrectales y 9 controles sanos). Para estos estudios, se seleccionó un total de 14 miARN candidatos. Se seleccionaron doce miARN candidatos (miR17-5p, miR92a, miR19b, miR18a, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24, miR335, miR424 y miR15b) por estar presentes en los 50 mejores miARN desregulados en CRC y/o AA y tener una intensidad de microalineamiento de base logarítmica 2 > 8. Se seleccionaron también dos miARN adicionales (miR19a, y miR20a) por ser parte de la agrupación de miR 17-92, una de las agrupaciones de miARN oncogénicos mejor caracterizadas, aunque no satisfacían los criterios anteriores. Globalmente, se correlacionaron los resultados de qRT-PCR y microalineamiento (datos no mostrados) excepto para miR424 que no mostró ninguna amplificación mediante qRT-PCR y, por tanto, se excluyó del análisis posterior.

Se confirmó que seis microARN plasmáticos se sobreexpresaban en pacientes con CRC de una cohorte independiente. En segundo lugar, se analizaron los 13 miARN candidatos que mostraban amplificación adecuada en la fase anterior (miR92a, miR17-5p, miR18a, miR19a, miR19b, miR20a, miR15b, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24 y miR335) en plasma de un conjunto independiente de 42 pacientes con CRC y 53 controles sanos, para validar los resultados mediante qRT-PCR en tiempo real.

De manera interesante, se confirmó que miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 se regulaban por incremento significativamente en pacientes con CRC (figura 3). Además, miR-24 también se sobreexpresaba en este grupo de pacientes, pero sin alcanzar significación estadística (p = 0,08). Notablemente, los miARN validados en este segundo conjunto también demostraron una alta precisión en la discriminación de CRC de controles sanos con áreas bajo la curva de ROC (AUC) que oscilaban entre 0,8 (IC del 95 %: 0,71-0,89) y 0,7 (IC del 95 %: 0,59-0,80). A continuación, se buscó observar si cualquier combinación de estos miARN podría mejorar la precisión de discriminación en la detección de CRC con respecto a cada uno de ellos solos. Entre las combinaciones que mostraban la mejor capacidad de discriminación destacaban las firmas miR19a + miR19b, y miR19a + miR19b + miR15b (tabla 6; figura 4). Finalmente, se exploró la capacidad de predicción de estas firmas en pacientes con CRC en fase inicial (TNM I-II) y avanzada (TNMIII-IV). Tal como se expone en la tabla 2, ambas firmas mostraron una alta precisión de discriminación tanto en casos iniciales como en casos avanzados. De manera similar, se examinó si estas firmas también eran capaces de detectar tumores de lado derecho de manera tan precisa como los de lado izquierdo, y fue el caso para ambos (tabla 2).

Tabla 6. Predictibilidad de las mejores firmas de miARN plasmáticos en pacientes con CRC del conjunto 2.

FIRMAS:

miR19a+miR19b miR19a+miR19b+miR15b

Todos los CRC (n = 42)

AUC (IC del 95 %)

0,82 (0,73-0,90) 0,84 (0,76-0,92)

Sensibilidad

78,57 78,57

Especificidad

77,36 79,25

TNM I/II (n = 21)

AUC (IC del 95 %)

0,85 (0,75-0,96) 0,87 (0,71-0,92)

Sensibilidad

71,43 80,95

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Especificidad

92,45 79,25

TNM III/IV (n =21)

AUC (IC del 95 %)

0,81 (0,71-0,92) 0,81 (0,70-0,92)

Sensibilidad

85,71 76,19

Especificidad

71,70 77,36

Lado derecho (n = 14)

AUC (IC del 95 %)

0,82 (0,71-0,92) 0,84 (0,73-0,94)

Sensibilidad

85,71 85,71

Especificidad

79,25 79,25

Lado izquierdo (n = 28)

AUC (IC del 95 %)

0,8 (0,71-0,90) 0,83 (0,73-0,92)

Sensibilidad

82,14 75,47

Especificidad

78,57 79,25

Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área bajo la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95 % para todos los casos de CRC, así como para diferentes estadios tumorales (l/ll y lll/IV) y ubicaciones (derecha e izquierda, con respecto al ángulo esplénico del colon)).

Se confirmó que un microARN plasmático estaba aumentado en pacientes con adenomas colorrectales avanzados. Con el fin de evaluar si cualquiera de los miARN plasmáticos que se encontró que se sobreexpresaban en ambos conjuntos de pacientes con CRC también estaban aumentados en pacientes que albergaban lesiones precursoras de cáncer, que se analizaron mediante qRT-PCR en tiempo real en muestras de plasma de una cohorte independiente de 40 pacientes con AA y 53 controles sanos. Se confirmó que el miR18a se sobreexpresaba significativamente en este segundo conjunto de pacientes con AA en comparación con los controles, ya que estaba en el primer conjunto (figura 1B). Sin embargo, aunque este miARN mostró una buena capacidad de discriminación en el primer conjunto de pacientes con AA (AUC: 0,84, IC del 95 %: 0,72-0,96, S: 80 %, Sp: 80 %), este parámetro era menor en el segundo conjunto de pacientes (AUC: 0,64, IC del 95 %: 0,52-0,75, S: 72 %, Sp: 57 %).

En este estudio, los inventores realizaron la obtención del perfil de miARN en todo el genoma mediante microalineamientos en muestras de plasma de pacientes con CRC o AA, e individuos sanos. Estos resultados muestran que la expresión de miARN plasmáticos puede discriminar entre pacientes con neoplasia colorrectal y sujetos de control, lo que sugiere su posible valor para la detección no invasiva de estas lesiones. En lo que respecta al conocimiento de los inventores, este es el primer informe que analiza la expresión en todo el genoma de miARN plasmáticos en pacientes con CRC y AA mediante una tecnología de alto rendimiento y, después, validando los resultados en una cohorte externa, independiente. Basándose en este análisis de alto rendimiento, se ha identificado un gran número de supuestos biomarcadores de miARN plasmáticos útiles para detectar pacientes que albergan CRC o AA. Además, se ha confirmado la alta capacidad de discriminación entre CRC e individuos sanos de seis microARN plasmáticos en una cohorte diferente y usando una tecnología diferente. Merece la pena mencionar que cinco de estos miARN (es decir, miR19a, miR19b, miR18a, miR15b, y miR335) representan biomarcadores nuevos, no notificados anteriormente.

El reciente descubrimiento de miARN estables en plasma y otros fluidos ha abierto la posibilidad de usar estas moléculas como biomarcadores de enfermedad, y varios estudios han evaluado esta estrategia en diferentes entornos. En cáncer humano, este enfoque es realmente prometedor porque el análisis de miARN circulantes relacionados con tumores probablemente sería capaz de detectar neoplasia de un modo no invasivo. Sin embargo, mientras que la mayor parte de los estudios de obtención del perfil de expresión de miARN en cáncer se han realizado usando muestras de tejidos, solo un número limitado de ellos se han centrado en el posible valor de miARN circulantes en el diagnóstico y pronóstico [21-23]. Notablemente, el uso de miARN como biomarcadores parece ser una estrategia mejor que marcadores de ARN o proteína debido a la alta estabilidad de estas moléculas, incluso en presencia de ARNasas [23].

Hasta ahora, solo algunos estudios han analizado la expresión de algunos miARN plasmáticos candidatos en CRC. Inicialmente, Ng et al. encontraron mediante análisis de qRT-PCR que dos miARN plasmáticos (es decir, miR17-3p, y miR92a) estaban significativamente elevados en pacientes con CRC en comparación con sujetos de control. Sin embargo, su análisis inicial se limitó a 95 miARN en 10 muestras de plasma (cinco pacientes con CRC y cinco individuos sanos). Más importante, este estudio solo evaluó la posible utilidad de miARN plasmáticos en el diagnóstico de CRC, pero no en la identificación de lesiones precursoras [24]. Poco después, Huang et al. notificaron la posible utilidad de 2 miARN plasmáticos, miR29a y miR92a, para detectar pacientes tanto con CRC como con AA. Sin embargo, este análisis de qRT-PCR se limitó a 12 miARN seleccionados basándose en los informes previos. Pu et al. analizaron mediante qRT-PCR la expresión de tres miARN en muestras de plasma de pacientes con CRC notificando una sobreexpresión significativa de miR221, pero no se incluyeron pacientes con AA en este estudio [25]. Por último, Cheng et al. notificaron una regulación por incremento significativa de niveles plasmáticos de miR141 en pacientes metastásicos con CRC tras analizar la expresión de tres miARN [26].

El estudio era para realizar una obtención del perfil completo de miARN circulantes usando tecnología de alto

5

10

15

20

25

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45

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rendimiento en pacientes con CRC y AA, con el fin de identificar los miARN plasmáticos con posible utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de pacientes con estas lesiones. Entre los 743 miARN analizados, se encontraron 95 miARN circulantes significativamente desregulados en pacientes con CRC, y 125 en pacientes con AA, mostrando algunos de ellos una buena capacidad de discriminación. Es importante mencionar que entre los miARN regulados por incremento de manera significativa en los análisis de microalineamiento, los presentes inventores no solo confirmaron los miARN plasmáticos relacionados con CRC en estudios previos, tales como miR29a, miR92a y miR141, sino que también notificaron nuevos miARN candidatos con posible implicación en la carcinogénesis de CRC. Además, entre estos miARN sobreexpresados, se encontraron todos los miembros de la agrupación de miR17-92 (miR17, miR92a, miR19a, miR19b, miR18a, y miR20a) y dos miembros de la agrupación de miR106b-25 (miR-25 y miR93), una agrupación caracterizada de manera menos extensa paráloga a miR17-92 en mamíferos. Estos hallazgos destacan la agrupación de miR17-92 como un actor central en la carcinogénesis colorrectal. La agrupación de miR17-92, también denominada oncomiRI, es una de las agrupaciones de miARN oncogénicos mejor caracterizadas [27,28]. En ese sentido, se ha sugerido que el aumento en la inestabilidad cromosómica, responsable de la progresión de adenoma a adenocarcinoma, no solo conduce a regulación por incremento de oncogenes, sino que también provoca sobreexpresión de miARN críticos, incluyendo la agrupación de miR17-92 [29].

Los presentes inventores demostraron que algunos de los miARN regulados por incremento en el primer conjunto de pacientes con CRC (es decir, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335) también se sobreexpresaban en una cohorte independiente. Notablemente, estos miARN validados mostraron una alta precisión de discriminación para CRC y varias combinaciones de estos miARN mejoraron la capacidad de discriminación de cualquiera de estos miARN solos. Además, fueron capaces de detectar CRC incipiente (I-II) de manera tan precisa como CRC avanzado (estadio II-IN), así como tumores de lado derecho de manera tan precisa como lesiones de lado izquierdo. Estos resultados apuntan a la posible utilidad de estos miARN plasmáticos como nuevos biomarcadores no invasivos para el diagnóstico de CRC.

Respecto a lesiones precursoras de cáncer colorrectal, se encontró que solo uno de los seis miARN sobreexpresados en cRc (miR-18a) se confirmó que se sobreexpresaba significativamente en las dos cohortes independientes de pacientes con AA. Aunque miR-18a mostró una capacidad de discriminación bastante buena en el primer conjunto de pacientes, esta capacidad era moderada en la segunda cohorte. De hecho, en la cohorte de pacientes con AA analizados por Huang et al. dos miR plasmáticos (miR-29a y miR-92a) mostraron una precisión bastante buena en la discriminación de AA de los controles [16]. Estos dos miARN plasmáticos también se sobreexpresaban significativamente en la primera cohorte de pacientes con AA, pero no en el segundo conjunto. Una posible explicación de esta discrepancia entre ambos conjuntos de pacientes podrían ser las características menos avanzadas de AA en las segundas cohortes de pacientes (tabla 1). Conjuntamente, estos resultados indican que la evaluación de la utilidad de microARN plasmáticos en pacientes con AA constituye una línea de investigación interesante y merece investigación adicional. Actualmente, la detección de AA sigue siendo un desafío importante para estrategias de examen de CRC no invasivas. Efectivamente, merece la pena mencionar que pruebas inmunoquímicas fecales, una estrategia aceptada actualmente para el examen de CRC no invasivo en la población de riesgo promedio, muestra un buen rendimiento para el diagnóstico de CRC, pero pasa por alto casi el 50 % de AA, tal como se ha demostrado recientemente en un estudio del presente grupo [12].

De manera interesante, se ha notificado previamente que todos los miARN validados en este estudio se sobreexpresan en muestras de tejidos de pacientes con CRC [30-34]. Por consiguiente, puede plantearse la hipótesis de que CRC constituye la fuente de estos miARN plasmáticos. Por tanto, los resultados no solo apuntan a miR29a, miR15b, miR19a, miR-19b, miR-18a y miR-335 como potentes biomarcadores para el diagnóstico de CRC, sino que también destacan su implicación en la carcinogénesis colorrectal. Además, considerando el posible papel oncogénico de estos miARN, los resultados abren la posibilidad de un futuro diseño de nuevos tratamientos dirigidos centrados en la inhibición de estas moléculas.

Además de los microARN enumerados y las familias de microARN, pueden añadirse otros microARN para potenciar la detección del cáncer colorrectal. Por ejemplo, el método puede comprender además la determinación del nivel de expresión de microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-miR-636;

hsa-miR-876-3p;

hsa-miR-1537;

hsa-miR-630;

hsa-miR-380*;

hsa-miR-338-5p;

hsa-miR-573;

hsa-miR-182*;

hsa-miR-518c*;

hsa-miR-187*;

hsa-miR-1233;

hsa-miR-449b;

hsa-m

R-1204;

hsa-m

R-518d-3p;

hsa-m

R-1290;

hsa-m

R-144:9.1;

hsa-m

R-105;

hsa-m

R-298;

hsa-m

R-491-5p;

hsa-m

R-576-3p;

hsa-m

R-590-3p;

hsa-m

R-1257;

hsa-m

R-1225-3p;

hsa-m

R-127-3p;

hsa-m

R-936;

hsa-m

R-379;

hsa-m

R-664*;

hsa-m

R-548¡;

hsa-m

R-130b*; y

hsa-m

R-515-3p.

el método puede comprender además la determinación del nivel de expresión de microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-302b;

hsa-m

R-125a-5p;

hsa-m

R-424

hsa-m

R-125b;

hsa-m

R-100

hsa-m

R-768 -3p:11.0;

hsa-m

R-24;

hsa-m

R-23a

hsa-m

R-1274b;

hsa-m

R-27a

hsa-m

R-26b

hsa-m

R-30d

hsa-m

R-520h;

hsa-m

R-520g;

hsa-m

R-302 a.

hsa-m

R-518c;

hsa-m

R-335

hsa-m

R-29a

hsa-m

R-152

hsa-m

R-191

hsa-m

R-17;

hsa-m

R-19b

hsa-m

R-30a

hsa-m

R-151 -5p;

hsa-m

R-92a

hsa-m

R-25;

hsa-m

R-15b

hsa-m

R-15a

hsa-m

R-30e k.

hsa-m

R-132 *; y

hsa-m

R-921

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Aún otra biofirma o ensayo incluirá la combinación de microARN tanto sobre como infraexpresados, por ejemplo, a partir de los enumerados anteriormente en el presente documento o divulgados en el presente documento. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de microARN tanto sobre como infraexpresados a partir de microARN respectivos, con o sin los microARN enumerados específicos y las familias de microARN (o 10 coexpresados).

En resumen, los pacientes con CRC y AA muestran perfiles de miARN plasmáticos significativamente diferentes en comparación con individuos sanos. Estos miARN circulantes relacionados con tumores constituyen biomarcadores nuevos y representan una posible estrategia para un diagnóstico temprano, no invasivo. En este estudio, se

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identifican seis miARN plasmáticos candidatos prometedores para la detección de CRC. No obstante, este enfoque debe validarse adicionalmente en cohortes más grandes de pacientes con el fin de evaluar su eficacia y posible aplicabilidad en un entorno de examen.

Se contempla que cualquier realización comentada en esta memoria descriptiva pueda implementarse con respecto a cualquier método, kit, reactivos o composición de la invención, y viceversa. Además, pueden usarse las composiciones de la invención para lograr los métodos de la invención.

Se entenderá que se muestran las realizaciones particulares descritas en el presente documento a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden emplearse en diversas realizaciones sin salirse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y están cubiertos por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de destreza de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en el presente documento como referencia en el mismo grado como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpore como referencia.

El uso de la palabra “un” o “una” cuando se usa conjuntamente con el término “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno”, pero también es coherente con el significado de “uno o más”, “al menos uno” y “uno o más de uno”. El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa con el significado de “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solo o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere a solo alternativas e “y/o”. En toda esta solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, empleándose el método para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación/reivindicaciones, las palabras “que comprende” (y cualquier forma de comprender, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de tener, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de incluir, tal como “incluyen” e “incluye”) o “que contiene” (y cualquier forma de contener, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen etapas del método o elementos no mencionados, adicionales. Tal como se usa en el presente documento, la frase “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a las etapas o materiales especificados y los que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y nueva(s) de la invención reivindicada. Tal como se usa en el presente documento, la frase “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en la reivindicación excepto por, por ejemplo, impurezas asociadas habitualmente con el elemento o limitación. El término “o combinaciones de los mismos” tal como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, “A, B, C, o combinaciones de los mismos” se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también bA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBaAa, CABABB, y así en adelante. El experto en la técnica entenderá que normalmente no hay límite en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente de otro modo a partir del contexto.

Tal como se usa en el presente documento, palabras de aproximación tales como, sin limitación, “aproximadamente”, “sustancial” o “sustancialmente” se refieren a una condición de que cuando está así modificada se entiende que no es necesariamente absoluta o perfecta, sino que se consideraría suficientemente próxima como para que los expertos habituales en la técnica justifiquen que la designación de la condición está presente. El grado en el que la descripción puede variar dependerá del tamaño del cambio que puede instituirse y que todavía un experto habitual en la técnica reconozca que el rasgo modificado tiene todavía las características y capacidades requeridas del rasgo no modificado. En general, pero sujeto a la discusión anterior, un valor numérico en el presente documento que está modificado por una palabra de aproximación tal como “aproximadamente” puede variar a partir del valor establecido en al menos ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 o 15 %.

Todas las composiciones y/o métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en cuanto a realizaciones preferidas, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Se considera que todos los sustitutos y modificaciones similares de este tipo evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

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La presente divulgación también comprende los siguientes puntos:

1. Un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de:

obtener una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal;

medir un patrón o nivel de expresión global de uno o más microARN obtenidos de la una o más muestras biológicas

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del sujeto; y

comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de cáncer colorrectal.

2. El método del punto 1, que comprende además el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a, o miR335 en comparación con la expresión del sujeto normal, en el que la sobreexpresión de miR18a, miR29a, o miR335 es indicativa de neoplasia colorrectal.

3. El método del punto 1, que comprende además el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a, o miR141.

4. El método del punto 1, en el que la una o más muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

5. El método del punto 1, en el que el método es capaz de detectar CRC incipiente (I-II) de manera tan precisa como CRC avanzado (estadio II-IN), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo.

6. El método del punto 1, en el que el método comprende un intervalo de confianza que es del 90, el 91, el 92, el 93, el 94 o el 95 % o mayor.

7. El método del punto 1, en el que el método comprende además determinar el nivel de expresión de microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

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R-636;

hsa-m

R-876-3p;

hsa-m

R-1537;

hsa-m

R-630;

hsa-m

R-380*;

hsa-m

R-338-5p;

hsa-m

R-573;

hsa-m

R-182*;

hsa-m

R-518c*;

hsa-m

R-187*;

hsa-m

R-1233;

hsa-m

R-449b;

hsa-m

R-1204;

hsa-m

R-518d-3p;

hsa-m

R-1290;

hsa-m

R-144:9.1;

hsa-m

R-105;

hsa-m

R-298;

hsa-m

R-491-5p;

hsa-m

R-576-3p;

hsa-m

R-590-3p;

hsa-m

R-1257;

hsa-m

R-1225-3p;

hsa-m

R-127-3p;

hsa-m

R-936;

hsa-m

R-379;

hsa-m

R-664*;

hsa-m

R-548j;

hsa-m

r-130b*; y

hsa-m

R-515-3p.

8. El método del punto 1, en el que el método comprende además determinar el nivel de expresión de microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-miR-302b;

hsa-miR-125a-5p;

hsa-miR-424;

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R-132 *; y

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R-921

9. El método del punto 1, en el que el nivel de expresión del uno o más microARN se mide mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos.

10. El método del punto 1, en el que el método se usa para tratar un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia de agente antineoplásico para un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos.

11. El método del punto 1, en el que el patrón o nivel de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se selecciona de las tablas 2, 3, 4, y 5, en el que los microARN aumentan la especificidad de la determinación, diagnóstico o detección de neoplasia colorrectal.

12. El método del punto 1, que comprende además la etapa de usar el patrón o nivel de expresión global de microARN para el pronóstico, guía de tratamiento o monitorización de la respuesta al tratamiento de la neoplasia colorrectal.

13. Un biomarcador para la progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal, metástasis o ambas en el que el biomarcador comprende uno o más microARN y un cambio en la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal obtenidas de un paciente es indicativo de progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal en comparación con la expresión global de la expresión del uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal normales o células de neoplasia colorrectal obtenidas en un punto de tiempo anterior del mismo paciente, en el que la sobreexpresión de la combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b, es indicativa de cáncer colorrectal.

14. El biomarcador del punto 13, que comprende además el análisis de uno o más de los siguientes microARN miR29a, miR92a, miR141, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a o miR335.

15. El biomarcador del punto 13, en el que el biomarcador comprende además microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal seleccionados de:

hsa-miR-636;

hsa-miR-876-3p;

hsa-m

R-1537;

hsa-m

R-630;

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R-380*;

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R-338-5p;

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R-182*;

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R-518c*;

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R-187*;

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R-1233;

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R-449b;

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R-1204,

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R-518d-3p;

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R-1290;

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R-144:9.1;

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R-105;

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R-298;

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R-491-5p;

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R-576-3p;

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R-590-3p;

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R-1257;

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R-1225-3p;

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R-127-3p;

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R-936;

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R-379;

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R-664*;

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R-130b*; y

hsa-m

R-515-3p.

16. El biomarcador del punto 13, en el que el biomarcador comprende además microARN que sobreexpresados en neoplasia colorrectal seleccionados de:

están

hsa-m

R-302b;

hsa-m

R-125a-5p;

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R-424

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R-768 -3p:11.0;

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R-1274b;

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R-30d

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R-15b

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R-15a

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R-30e k.

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R-132 *; y

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R-921

17. El biomarcador del punto 13, en el que los microARN están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-636;

hsa-m

R-876-3p;

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R-1537;

hsa-m

R-630;

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R-380*;

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R-338-5p;

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R-573;

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R-182*;

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R-518c*;

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R-187*;

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R-1233;

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R-1204;

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R-518d-3p;

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R-105;

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R-298;

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R-491-5p;

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R-576-3p;

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R-590-3p;

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R-1257;

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R-1225-3p;

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R-127-3p;

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R-936;

hsa-m

R-379;

hsa-m

R-664*;

hsa-m

R-548¡;

hsa-m

R-130b*; y

hsa-m

R-515-3p.

5

18. El biomarcador del punto 13, en el que los microARN están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-302b;

hsa-m

R-125a-5p;

hsa-m

R-424

hsa-m

R-125b;

hsa-m

R-100

hsa-m

R-768 -3p:11.0;

hsa-m

R-24;

hsa-m

R-23a

hsa-m

R-1274b;

hsa-m

R-27a

hsa-m

R-26b

hsa-m

R-30d

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R-520h;

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R-520g;

hsa-m

R-302 a.

hsa-m

R-518c;

hsa-m

R-335

hsa-m

R-29a

hsa-m

R-152

hsa-m

R-191

hsa-m

R-17;

hsa-m

R-19b

hsa-m

R-30a

hsa-m

R-151 -5p;

hsa-m

R-92a

5

10

15

20

25

30

35

hsa-miR-25;

hsa-miR-15b;

hsa-miR-15a;

hsa-miR-30e*;

hsa-miR-132*; y

hsa-miR-921.

19. El biomarcador del punto 13, en el que las muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

20. El biomarcador del punto 13, en el que el método es capaz de detectar CRC incipiente (I-II) de manera tan precisa como CRC avanzado (estadio II-IN), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo.

21. El biomarcador del punto 13, que comprende además la detección y el análisis del patrón o nivel de expresión de expresión para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal seleccionados de los microARN de las tablas 2, 3, 4 y 5.

22. Un kit para un diagnóstico de neoplasia colorrectal que comprende:

reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial en el que la sobreexpresión de una combinación de los microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de neoplasia colorrectal, en el que un intervalo de confianza para cáncer colorrectal es del 90 % o mayor.

23. El kit del punto 22, que comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a, o miR335.

24. El kit del punto 22, que comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141.

25. El kit del punto 22, que comprende además instrucciones para el uso en el diagnóstico del riesgo de neoplasia colorrectal, en el que las instrucciones comprenden indicaciones etapa por etapa para comparar el nivel de expresión de los microARN, cuando se mide la expresión de una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que tiene neoplasia colorrectal con el nivel de expresión de una muestra obtenida de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal.

26. El kit del punto 22, que comprende además herramientas, recipientes y reactivos necesarios para obtener muestras de un sujeto seleccionadas del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

27. El kit del punto 22, que comprende además reactivos para el análisis de microARN que están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-636;

hsa-m

R-876-3p;

hsa-m

R-1537;

hsa-m

R-630;

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R-518d-3p;

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R-298;

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R-491-5p;

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R-576-3p;

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R-590-3p;

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hsa-miR-127-3p;

hsa-miR-936;

hsa-miR-379;

hsa-miR-664*;

hsa-miR-548j;

hsa-miR-130b*; y

hsa-miR-515-3p.

28. El kit del punto 22, que comprende además reactivos para el análisis de microARN que están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-302b;

hsa-m

R-125a-5p;

hsa-m

R-424

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R-125b;

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R-100

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R-768 -3p:11.0;

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R-24;

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R-23a

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R-1274b;

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R-27a

hsa-m

R-26b

hsa-m

R-30d

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R-520h;

hsa-m

R-520g;

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R-302 a.

hsa-m

R-518c;

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R-335

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R-29a

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R-152

hsa-m

R-191

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R-17;

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R-19b

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R-30a

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R-151 -5p;

hsa-m

R-92a

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R-25;

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R-15b

hsa-m

R-15a

hsa-m

R-30e k.

hsa-m

R-132 *; y

hsa-m

R-921

5

29. El kit del punto 22, en el que el patrón o nivel de expresión global de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se determina para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.

30. Un método para seleccionar una terapia contra el cáncer para un paciente al que se le ha diagnosticado 10 neoplasia colorrectal, comprendiendo el método:

obtener una muestra de un sujeto que tiene una neoplasia colorrectal; y

determinar el nivel de expresión de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 en comparación con el 15 nivel de expresión de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de los microARN es indicativa de cáncer colorrectal; y

seleccionar la terapia contra el cáncer basándose en la determinación de la neoplasia colorrectal en el paciente.

20 31. Un método para realizar un ensayo clínico para evaluar un fármaco candidato que se cree que es útil en el

tratamiento de un estado patológico, comprendiendo el método:

(a) medir el nivel de microARN obtenidos de un conjunto de pacientes, en el que los microARN se seleccionan de uno o más microARN seleccionados de: miR19a y miR19b, o microARN miR19a y miR19b y miR15b;

5

10

15

20

25

30

35

(b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de los pacientes, y un placebo a un segundo subconjunto de los pacientes;

un fármaco comparativo a un segundo subconjunto de los pacientes; o

una combinación de fármacos del fármaco candidato y otro agente activo a un segundo subconjunto de pacientes;

(c) repetir la etapa (a) tras la administración del fármaco candidato o el placebo, el fármaco comparativo o la combinación de fármacos; y

(d) determinar si el fármaco candidato reduce el número de células neoplásicas colorrectales que tienen un cambio en la expresión de los microARN que es estadísticamente significativa en comparación con cualquier cambio que se produce en el segundo subconjunto de pacientes, en el que una reducción estadísticamente significativa indica que el fármaco candidato es útil en el tratamiento de dicho estado patológico.

32. Un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de:

identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal;

obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en el que las muestras biológicas se seleccionan de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal;

medir un patrón o nivel de expresión global de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335; y

comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global del uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de microARN: miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335, es indicativa de cáncer colorrectal.

33. El método del punto 32, en el que los microARN están infraexpresados en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

hsa-m

R-636;

hsa-m

R-876-3p;

hsa-m

R-1537;

hsa-m

R-630;

hsa-m

R-380*;

hsa-m

R-338-5p;

hsa-m

R-573;

hsa-m

R-182*;

hsa-m

R-518c*;

hsa-m

R-187*;

hsa-m

R-1233;

hsa-m

R-449b;

hsa-m

R-1204;

hsa-m

R-518d-3p;

hsa-m

R-1290;

hsa-m

R-144:9.1;

hsa-m

R-105;

hsa-m

R-298;

hsa-m

R-491-5p;

hsa-m

R-576-3p;

hsa-m

R-590-3p;

hsa-m

R-1257;

hsa-m

R-1225-3p;

hsa-m

R-127-3p;

hsa-m

R-936;

hsa-m

R-379;

hsa-m

R-664*;

hsa-miR-548j; hsa-miR-130b*; y hsa-miR-515-3p.

34. El método del seleccionan de:

punto 32, en el que los microARN están sobreexpresados en neoplasia colorrectal y se

hsa-m

R-302b;

hsa-m

R-125a-5p;

hsa-m

R-424

hsa-m

R-125b;

hsa-m

R-100

hsa-m

R-768 -3p;11.0;

hsa-m

R-24;

hsa-m

R-23a

hsa-m

R-1274b;

hsa-m

R-27a

hsa-m

R-26b

hsa-m

R-30d

hsa-m

R-520h;

hsa-m

R-520g;

hsa-m

R-302 a.

hsa-m

R-518c;

hsa-m

R-335

hsa-m

R-29a

hsa-m

R-152

hsa-m

R-191

hsa-m

R-17;

hsa-m

R-19b

hsa-m

R-30a

hsa-m

R-151 -5p;

hsa-m

R-92a

hsa-m

R-25;

hsa-m

R-15b

hsa-m

R-15a

hsa-m

R-30e k.

hsa-m

R-132 *; y

hsa-m

R-921

5

35. El método del punto 32, en el que el nivel de expresión del uno o más microARN se mide mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos.

10

36. El método del punto 32, en el que el método se usa para tratar un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia de agente antineoplásico para un paciente en riesgo o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal,

15 desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos.

37. El método del punto 32, en el que el patrón o nivel de expresión global de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN se determina para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para diagnosticar o detectar adenomas colorrectales avanzados en un sujeto humano que comprende las etapas de:

   medir un patrón o nivel de expresión global de uno o más microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto, en el que al menos uno de esos microARN es miR18a; y

   comparar el patrón de expresión global del uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se

   10 sospecha que padece adenomas colorrectales avanzados con el patrón de expresión global del uno o más

   microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano que no padece adenomas colorrectales avanzados, y en el que la sobreexpresión de miR18a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados.

   15 2. Método para diagnosticar o detectar adenomas colorrectales avanzados y neoplasia colorrectal en un sujeto

   humano que comprende las etapas de:

   medir un patrón o nivel de expresión global de microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto, en el que al menos esos miARN son miR18a y miR19a y miR19b, o miR18a y miR19a y miR19b y

   20 miR156; y

   comparar el patrón de expresión global de microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece adenomas colorrectales avanzados o neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de los microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en el que el sujeto normal es un sujeto sano

   25 que no padece adenomas colorrectales avanzados o neoplasia colorrectal, en el que la sobreexpresión de

   miR18a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados y en el que la sobreexpresión de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de neoplasia colorrectal.
2. 3. El método de la reivindicación 2, que comprende además el análisis de al menos uno de miR29a o miR335

   30 en comparación con la expresión del sujeto normal, en el que la sobreexpresión de miR29a, o miR335 es

   indicativa además de neoplasia colorrectal.
3. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la una o más muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste en uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra

   35 de suero o una muestra de sangre.
4. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la una o más muestras biológicas es una muestra de plasma.

   40 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de expresión del uno o más

   microARN se mide mediante la obtención del perfil de expresión de microalineamiento, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR de transcriptasa inversa en tiempo real, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR de punto final, PCR múltiple de punto final, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación múltiple in situ o secuenciación de ácidos nucleicos.

   45
5. 7. Uso de un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de miR18a y en el que la sobreexpresión de dicho microARN es indicativa de adenomas colorrectales avanzados para diagnosticar in vitro el riesgo de adenomas colorrectales avanzados.

   50
6. 8. Uso de un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de miR18a y miR19a y miR19b o miR18a y miR19a, miR19b y miR15b, en el que la sobreexpresión de dicho miR18a es indicativa de adenomas colorrectales avanzados y en el que la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de

   55 neoplasia colorrectal para diagnosticar in vitro el riesgo de adenomas colorrectales avanzados y/o neoplasia

   colorrectal.
7. 9. Uso, según la reivindicación 8, en el que el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR29a o miR335.