CN104651521A - 用于早期结直肠癌检测的血浆微小rna - Google Patents

用于早期结直肠癌检测的血浆微小rna Download PDF

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Abstract

本发明一般地涉及结直肠癌检测领域，更具体地说，涉及用于早期结直肠癌检测的血浆微小RNA。具体而言，本发明包括用于诊断或检测人受试者中的结直肠肿瘤的方法、试剂盒和生物标志物。本发明提供了一种用于诊断或检测人受试者中的结直肠肿瘤的方法，包含以下步骤：从疑似患上结直肠肿瘤的受试者处获得一个或更多个生物样本；测量从所述受试者的一个或更多个生物样本中获得的一个或更多个微小RNA的整体表达模式或水平；以及将来自所述疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式进行比较，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠癌。

Description

用于早期结直肠癌检测的血浆微小RNA
相关申请的交叉援引
本申请是2012年10月20日提交的发明名称为“用于早期结直肠癌检测的血浆微小RNA”的中国专利申请201280064096.7的分案申请。本申请要求2011年10月21日提交的美国临时申请序列号61/550,148的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及结直肠癌检测领域，更具体地说，涉及用于早期结直肠癌检测的血浆微小RNA。
联邦政府资助研究的声明
无。
光盘提交资料的援引加入
无。
发明背景
在不限制发明范围的情况下，其背景被描述为与结直肠癌有关。
美国专利申请号20100317533(Lou等人2010年)提供了一组肿瘤转移生物标志物，其包括后述的任意两个：碳酸酐酶-9(CAIX)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)、肝配蛋白A5(EFNA5)、eph受体B2(EPHB2)、转化生长因子β3(TGF-β3)、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶-3(PDK3)、碳酸酐酶-12(CAXII)、角蛋白14(KRT14)、缺氧诱导因子1α亚基(HIF-lα)或生腱蛋白C(TNC)。CAIX、VEGF-C、EFNA5、EPHB2、TGF-β3或PDK3可能是中度转移潜能的指标，而CAXII、KRT14、HIF-la或TNC可能是高度转移潜能(high metastatic potential)的指标。还提供了使用上述生物标志物确定肿瘤转移风险的方法。所述生物标志物可用于诊断、预后、治疗选择或测试推定的治疗剂。所述生物标志物还可用于评估具有缺氧区的恶性肿瘤或癌症，例如乳腺癌。
美国专利申请号20100120898(Croce等人2010年)披露了用于肝细胞癌(HCC)的诊断、预后和治疗的方法及组合物。还提供了识别抗HCC剂的方法。Croce的申请提供了诊断受试者是否患有肝细胞癌或具有患上肝细胞癌(HCC)风险的方法，包括测量来自该受试者的测试样本中至少一个miR基因产物的水平，其中相对于对照样本中对应miR基因产物的水平，测试样本中miR基因产物水平的改变提示该受试者或者患有HCC或者具有患上HCC的风险。
颁发给Chung的美国专利号7,939,255涉及结直肠癌的诊断方法。简单地说，该专利披露了结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的诊断方法和预后评估试剂盒，以及可用于诊断结直肠癌(CRC)的肿瘤抑制基因，其中该方法包括：识别染色体上的反复改变区(recurrently altered regions,RAR)以及检测RAR中的基因组改变情况。据称，该发明使得对多种癌症及肿瘤(包括结直肠癌(CRC))的早期诊断和预后评估成为可能。
由Li提交的公开号WO2011076147、题为《基于血浆的Micro-RNA生物标志物和用于结直肠癌早期检测的方法》(Plasma-Based Micro-RNA Biomarkers And MethodsFor Early Detection of Colorectal)的专利申请披露了用于诊断结直肠癌和/或监测结直肠癌治疗效果的血液分子标志物诊断试剂盒。该试剂盒据称包括多个核酸分子，每个核酸分子编码一个微小RNA生物标志物，其中所述多个核酸分子中的一个或更多个在患者和健康对照者的血浆中表达有差异，所述一个或更多个表达有差异的核酸分子一起代表核酸表达生物标志物，其提示结直肠癌的存在。该发明据称进一步提供了利用此类核酸表达生物标志物来识别结直肠癌以及预防或治疗此类病情(condition)的相应方法。最后，本发明提供用于结直肠癌预防和/或治疗的药物组合物。
同样由Li提交的公开号WO2011076142、题为《结直肠癌血浆中微小RNA表达谱的组合物和方法》(Compositions And Methods For MicroRNA Expression Profiling inPlasma of Colorectal)的专利申请据称教导了结直肠癌血浆中微小RNA(miRNA)表达谱(Expression Profiling)的组合物和方法。具体而言，本发明据称与血液分子标志物诊断试剂盒有关，用于诊断结直肠癌、监测癌症疗法和/或治疗结直肠癌，其包含多个核酸分子，每个核酸分子编码一个微小RNA序列，其中所述多个核酸分子中的一个或更多个在结直肠癌血浆及健康对照血浆中表达有差异，其中所述一个或更多个表达有差异的核酸分子一起代表核酸表达签名(nucleic acid expression signature)，该核酸表达签名提示结直肠癌的存在。本发明据称进一步涉及利用此类核酸表达签名的相应方法，用于鉴定结直肠癌以及预防或治疗此类病情。最后，本发明涉及用于结直肠癌预防和/或治疗的药物组合物。
由Christine提交的公开号WO2011088226、题为《胃肠功能紊乱检测》(DetectionOf Gastrointestinal Disorders)的专利申请据称教导了通过检测指示病情或病情进展的微小RNA、水疱或生物标志物来表征表型的方法和系统。该疾病可以是胃肠道疾病，例如结直肠癌。微小RNA、水疱或生物标志物可在体液中检出。
由Baruch提交的公开号WO2010004562、题为《检测结直肠癌的方法和组合物》(Methods And Compositions For Detecting Colorectal Cancer)的专利申请据称教导了通过使用与结直肠癌相关的微小RNA分子以及与其相关或由其衍生的各种核酸分子，来进行结直肠癌和/或结直肠癌前体细胞的微创早期检测的方法。
最后，由Fog等人提交的公开号WO2011012136、题为《将人细胞样本分类为癌细胞的方法》(A Method For Classifying A Human Cell Sample As Cancerous)的专利申请据称教导了区分癌和非癌样本的方法。该方法据称包括检测测试细胞样本中选自由miR-21、miR-34a和miR-141构成的Mir-I组的至少一个微小RNA(miR)的水平，和检测选自由miR-126、miR-143和miR-145组成的Mir-II组的至少一个miR的水平，以及将测试细胞样本中上述所选miR的表达水平与之前记录的测试组中相同的所选miR的表达水平进行比较。
发明概要
本发明的一个实施方案包括诊断或检测人受试者中的结直肠肿瘤(colorectal neoplasia)的方法，包含以下步骤：从疑似患上结直肠肿瘤的受试者处获得一个或更多个生物样本；测量从所述受试者的一个或更多个生物样本中获得的一个或更多个微小RNA(microRNA)的整体表达模式或水平；以及将来自所述疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式(overall expression pattern)与来自正常受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式进行比较，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达(overexpression)提示结直肠癌。一方面，该方法进一步包括对miR18a、miR29a或miR335中的至少一个进行分析并与来自正常受试者的表达量进行比较，其中miR18a、miR29a或miR335的过度表达提示结直肠肿瘤。另一方面，该方法进一步包括对miR29a、miR92a或miR141中至少一个的分析。另一方面，所述一个或更多个生物样本选自由一种或更多种生物流体(one or more biological fluids)、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。另一方面，该方法检测早期CRC(I-II)的准确性与检测晚期CRC(II-III期)、右侧肿瘤(right-sided tumors)和左侧病变(left-sided lesions)的准确性相同。另一方面，该方法包括90、91、92、93、94或95％或更大的置信区间。另一方面，该方法进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的(underexpressed)微小RNA的表达水平：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
另一方面，该方法进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的(overexpressed)微小RNA的表达水平：
另一方面，通过微阵列表达谱(microarray expression profiling)、PCR、逆转录酶PCR(reverse transcriptase PCR)、逆转录酶实时PCR(reverse transcriptase real-time PCR)、定量实时PCR(quantitative real-time PCR)、终点PCR(end-point PCR)、多重终点PCR(multiplex end-point PCR)、冷PCR(cold PCR)、冰冷PCR(ice-cold PCR)、质谱分析法(mass spectrometry)、原位杂交(ISH)、多重原位杂交(multiplex in situ hybridization)或核酸测序对所述一个或更多个微小RNA的表达水平进行测量。另一方面，该方法用于治疗有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者(apatient at risk or suffering from colorectal neoplasia)，为有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者选择抗肿瘤剂疗法(anti-neoplastic agent therapy)，将患者分入结直肠肿瘤亚组或用于结直肠肿瘤疗法临床试验(stratifying a patient to a subgroup of colorectalneoplasia or for a colorectal neoplasia therapy clinical trial)，确定对结直肠肿瘤治疗方案的耐药性或应答性，开发用于诊断结直肠肿瘤的试剂盒或其任何组合。另一方面，选自表2、3、4和5中的4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平，其中微小RNA提高了所述结直肠肿瘤测定、诊断或检测的特异性。另一方面，该方法进一步包括使用微小RNA的整体表达模式或水平(overall expression pattern or level)来进行结直肠肿瘤的预后、治疗指导或监测治疗应答的步骤。
本发明的又一个实施方案包括针对结直肠肿瘤病情进展、转移或两者的生物标志物(biomarker)，其中该生物标志物包括一个或更多个微小RNA，并且从患者处获得的结直肠肿瘤细胞中所述一个或更多个微小RNA的整体表达，在与正常结直肠肿瘤细胞或来自同一患者更早时点的结直肠肿瘤细胞中的所述一个或更多个微小RNA的整体表达进行比较时，如果有变化，则提示结直肠肿瘤病情进展(colorectal neoplasiadisease progression)，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠癌。一方面，该方法进一步包括对以下微小RNA中的一个或更多个的分析：miR29a、miR92a、miR141、miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a或miR335。另一方面，所述生物标志物进一步包括从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
另一方面，所述生物标志物进一步包括从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA：
另一方面，所述生物标志物进一步包括从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518C*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
另一方面，所述生物标志物进一步包括从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA：
熟练的技术人员将认识到最常见的情况是，生物学签名(biosignature)(测定)将包括过度表达的和表达不足的微小RNA的组合。因此，本发明一方面也包括各个微小RNA的过度表达和表达不足的微小RNA的组合。另一方面，所述生物样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。另一方面，该方法检测早期CRC(I-II)的准确性与检测晚期CRC(II-III期)、右侧肿瘤和左侧病变的准确性相同。另一方面，选自表2、3、4和5中的4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平，其中微小RNA提高所述结直肠肿瘤的测定、诊断或检测的特异性。
本发明的又一个实施方案包括结直肠肿瘤诊断试剂盒，包括：用于确定miR19a和miR19b，或miR19a和miR19b和miR15b微小RNA的不同表达水平的生物标志物检测试剂，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠肿瘤，其中结直肠癌的置信区间是90％或更大。一方面，该试剂盒进一步包括用于对miR18a、miR29a或miR335中的至少一个进行检测和分析的试剂。一方面，该试剂盒进一步包括用于对miR29a、miR92a或miR141中至少一个进行检测和分析的试剂。另一方面，该试剂盒进一步包括用于诊断患结直肠肿瘤风险的说明书，其中该说明书包括逐步的指导，用于当测量来自疑似患上结直肠肿瘤的受试者的样本的表达水平以及来自正常受试者的样本的表达水平时，比较所述微小RNA的表达水平，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者。另一方面，该试剂盒进一步包括从受试者获得样本所必需的工具、容器和试剂，所述样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。另一方面，该试剂盒进一步包括用于分析从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA的试剂：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
另一方面，该试剂盒进一步包括用于分析从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA的试剂：
另一方面，该试剂盒进一步包括试剂，所述试剂用于检测和分析选自表2、3、4和5的微小RNA的4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的表达模式或表达水平，以诊断或检测结直肠肿瘤。
本发明的另一个实施方案包括为诊断患有结直肠肿瘤的患者选择癌症疗法的方法，该方法包括：获得来自患有结直肠肿瘤的受试者的样本；测定miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的表达水平，并与来自正常受试者的生物样本的表达水平进行比较，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中所述微小RNA的过度表达提示结直肠癌；以及根据该患者结直肠肿瘤的测定结果选择癌症疗法。
本发明的另一个实施方案包括进行临床试验以评估被认为可用于治疗疾病状态(disease state)的候选药物的方法，该方法包括：(a)测量从一组患者中获得的微小RNA水平，其中所述微小RNA是从miR19a和miR19b或者miR19a和miR19b和miR15b微小RNA中选择的一个或更多个微小RNA；(b)给予第一亚组患者候选药物、给予第二亚组患者安慰剂、给予第二亚组患者对照药物(comparator drug)或者给予第二亚组患者所述候选药物与另一种活性剂的药物组合；(c)在给予候选药物或安慰剂、对照药物或药物组合后重复步骤(a)；以及(d)确定所述候选药物是否使具有以下特征的结直肠肿瘤细胞数量减少，与第二亚组患者发生的任何变化相比，这些结直肠肿瘤细胞中所述微小RNA表达量的变化具有统计显著性，其中具有统计显著性的数量减少提示该候选药物可用于治疗所述疾病状态。
本发明的另一个实施方案包括诊断或检测人受试者的结直肠肿瘤的方法，包括以下步骤：识别患上或疑似患上结直肠肿瘤的人受试者；获取来自该受试者的一个或更多个生物样本，其中所述生物样本选自一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本；测量miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的整体表达模式或水平；以及将来自疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式进行比较，其中正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中微小RNA：miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的中过度表达提示结直肠癌。
本发明的另一个实施方案则包括诊断或检测人受试者的结直肠肿瘤的方法，包括以下步骤：识别患上或疑似患上结直肠肿瘤的人受试者；获取来自该受试者的一个或更多个生物样本，其中所述生物样本选自一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本；测量选自以下的一个或更多个微小RNA的整体表达模式或水平：
其中ROC是曲线下的面积(AUC)参数，CI是95％置信区间，S是敏感性(sensitivity)，Sp是特异性(specificity)；将从疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本获取的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者的生物样本的一个或更多个微小RNA的整体表达模式进行比较，其中正常受试者是指未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中所述受试者(subject)生物样本中一个或更多个微小RNA整体表达模式的变化提示结直肠肿瘤。一方面，所述微小RNA在结直肠肿瘤中表达不足，并且选自：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
另一方面，所述微小RNA在结直肠肿瘤中过度表达，并且选自：
另一方面，通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、定量实时PCR、终点PCR、多重终点PCR、冷PCR、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序来对所述一个或更多个微小RNA的表达水平进行测量。另一方面，该方法用于治疗有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者，为有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者选择抗肿瘤剂疗法(例如核酸交联剂、小分子、生物药(biologics)，例如单克隆抗体，包括有或没有细胞杀伤有效负载(payloads)的，靶向的或非靶向的)，将患者分入结直肠肿瘤亚组或用于结直肠肿瘤疗法临床试验，确定对结直肠肿瘤治疗方案的耐药性或应答性，开发用于诊断结直肠肿瘤的试剂盒或其任何组合。另一方面，测定2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平，以诊断或检测结直肠肿瘤。
附图简介
为了更完整地理解本发明的特点和优势，现在将参考附图对本发明进行详细描述，其中：
图1A和1B显示了通过微阵列测定的来自第1组的CRC患者与对照者之间(图1A)以及AA患者和对照者之间(图1B)的miRNA差异化表达。热图显示了具有最高FC的50个显著失调的miRNA。红色像素对应于所示血浆样本中丰度提高的miRNA，而绿色像素则表示降低的miRNA水平。
图2是组间分析(Between Group Analysis,BGA)图，显示了基于miRNA表达谱的样本簇。健康对照者(C)；结直肠癌患者(CRC)；高危腺瘤(AA)患者。
图3的柱型图显示了通过qRT-PCR测定的CRC第2组的血浆miRNA表达。miRNA的表达水平归一化为miR16，表示为-dCt值。柱内的线表示中位数。这些柱子标示出第25个百分位和第75个百分位之间的间隔区。
图4A和4B是对两个血浆miRNA签名：miR19a+miR19b(图4A)和三个血浆miRNA签名：miR19a+miR19b+miR15b(图4B)进行的接受者工作特征(ROC)分析，是根据CRC第1组的微阵列谱获得的结果和CRC第2组的qRT-PCR数据来进行的。
发明详细说明
虽然在下文中详细讨论了本发明各个实施方案的制造和使用，但是应当理解，本发明提供了许多适用的发明构思，可在很大范围的特定情境中实施。此处探讨的具体实施方案只是用于说明制造和使用本发明的具体方法，而不会限制本发明的范围。
为便于理解本发明，下面对多个术语进行定义。此处定义的术语具有本发明相关领域中普通技术人员通常理解的含义。如“a”、“an”和“the”等术语不仅指单数形式的实体(singular entity)，还包括一般类别(general class)，其中的具体实例可用于解释说明。此处的术语用于描述本发明的具体实施方案，但其使用不会限制本发明，除非权利要求书中另有陈述。
缩略语：高危腺瘤(advanced adenomas)，AA；ROC曲线下面积(area under the ROCcurve)，AUC；组间分析(between group analysis)，BGA；结直肠癌(colorectal cancer)，CRC；倍数变化(fold-change)，FC；微阵列数据的线性模型(linear models for microarraydata)，LIMMA；微小RNA，miRNA；接受者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristics curve)，ROC曲线。
本文所用的术语“结直肠癌”(colorectal cancer)和“结直肠肿瘤”(colorectal neoplasia)包括公认的医学定义，其将结直肠癌定义为以小肠以下的肠道(即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)的癌细胞为特征的医学状况，并且包括癌前病变(pre-cancer)(又称为高危腺瘤)、早期和晚期癌症。此外，本文所用的术语“结直肠癌”还包括以十二指肠和小肠(空肠、回肠)的癌细胞为特征的医学状况(medical conditions)。
本文所用的术语“组织样本”(术语“组织”与术语“组织样本”可互换使用)是指包含一个或更多个细胞的任何材料，所述细胞可以是单独的，与任何基质复合在一起，或与任何化学物质结合在一起。该定义应当包括任何生物或有机材料及其任何细胞子部分、产物或副产物。“组织样本”的定义应理解为包括但不限于精子、卵子和血液成分。出于本发明的目的，“组织”的定义还包括某些确定的非细胞结构，例如皮肤的真皮层(dermal layer)，其具有细胞来源但不再被表征为细胞结构。本文使用的术语“粪便”是临床术语，是指人体排泄的粪便。
本文所用的术语“基因”是指功能性蛋白、多肽或肽的编码单元。如本领域技术人员所理解的，该功能性术语包括基因组序列、cDNA序列或其片段或组合，以及基因产物，包括那些可能已经被人工改变的产物。纯化的基因、核酸、蛋白质等用于指称那些与至少一个其通常关联的污染性核酸或蛋白质相分离的被鉴定的实体。术语“等位基因”或“等位基因形式”(allelic form)是指相对于相同基因的另一个版本，对相同功能性蛋白进行编码但包含核苷酸序列差异的基因替代版本。
本文所用的术语“微小RNA”(microRNA)(“miRNA”或“miR”)是指包括内源性非编码基因的产物的RNA(或RNA类似物)，其前体RNA转录物可以形成小茎环，成熟的“miRNA”从该小茎环中通过例如Dicer切割出来。“miRNAs”的编码基因不同于其表达被这些miRNAs所控制的mRNAs的编码基因。
本文所用的术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及通过连接、切割、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种产生的片段。核酸分子可以由单体组成，所述单体为天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)、或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)或两者的组合。修饰的核苷酸的糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分可以具有改变。糖修饰包括例如以卤素、烷基、胺和叠氮基团替换一个或更多个羟基，或者糖可以被功能化为醚或酯。而且，整个糖部分都可以用空间上和电子上类似的结构进行替换，例如氮杂-糖和碳环糖类似物。碱基部分的修饰示例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其他众所周知的杂环取代物。核酸单体可以由磷酸二酯键或该键的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺磷酸硫醇酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoroanilidate)、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺主链的天然存在或修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链。
本文多个实施方案中使用的术语“生物标志物”(biomarker)是指身体中的特定生化物质，其具有特定的分子特征，以使其可用于诊断和检测病情进展或治疗效果。例如，在人的呼吸中以及提供此类代谢物的人的相应诊断病况中发现的常见代谢物或生物标志物包括但不限于乙醛(来源：乙醇，X-苏氨酸；诊断：中毒)，丙酮(来源：乙酰乙酸；诊断：饮食/糖尿病)，氨(来源：氨基酸脱氨；诊断：尿毒症和肝病)，CO(一氧化碳)(来源：CH2Cl2，COHB％升高；诊断：室内空气污染)，氯仿(来源：卤代化合物)，二氯苯(来源：卤代化合物)，二乙胺(来源：胆碱；诊断：小肠细菌过度生长)，H(氢)(来源：肠；诊断：乳糖不耐受)，异戊二烯(来源：脂肪酸；诊断：代谢应激)，甲硫醇(来源：蛋氨酸；诊断：肠细菌过度生长)，甲乙酮(来源：脂肪酸；诊断：室内空气污染/饮食)，O-邻甲苯胺(来源：癌代谢物；诊断：支气管癌)，戊烷硫化物和硫化物(来源：脂质过氧化；诊断：心肌梗死)，硫化氢(来源：新陈代谢；诊断：牙周病/排卵)，MeS(来源：新陈代谢；诊断：肝硬化)，和Me2S(来源：感染；诊断：战壕口炎)。
术语研究组间“统计上显著”的差异，涉及在使用适当的统计分析(例如卡方检验、t-检验)时各组相同的概率小于5％(例如，p<0.05)时的情况。换言之，在完全随机的情况下获得相同结果的概率为尝试100次时小于5次。
术语“试剂盒”或“测试试剂盒”表示分析所需试剂和辅剂(adjuvants)的组合。尽管在大多数情况下，测试试剂盒由多个单元构成，但单件分析元件(one-pieceanalysis elements)也可用，其必须同样被视为测试试剂盒。
本文所用的术语“聚合酶链反应”(PCR)是指K.B.Mullis,U.S专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中的方法，在此通过引用加入本文，其描述了一种方法，可以在不克隆或纯化的情况下，增加基因组DNA混合物中靶序列片段的浓度。扩增靶序列的过程包括将两个大量过量的寡聚核苷酸引物引入到包含想要的靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在的情况下进行精确顺序的热循环。两个引物互补于双链靶序列中相应的链。为了实现扩增，对混合物进行变性，然后引物退火至它们在靶分子内的互补序列。退火后，用聚合酶延伸引物，以便形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以多次重复(即变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有很多“循环”)，以获得高浓度的想要的靶序列的扩增片段。想要的靶序列的扩增片段的长度是由引物相对于彼此的位置来确定的，因此，这个长度是可控参数。凭借该流程的重复性，该方法被称为“聚合酶链反应”(以下简称为PCR)。
如本文所用的，可以通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、定量实时PCR、终点PCR、多重终点PCR、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序来对一个或更多个微小RNA进行测量。然而，也可以使用其它技术来确定微小RNA的表达，例如表面等离子共振、荧光共振效应(转移、淬灭和其变体)或任何上述技术的下一代技术及其组合，所有这些都在本发明的范围内。一个或更多个微小RNA的整体表达水平可用于提高结直肠肿瘤测定的敏感性和质量。例如，通常敏感性增加会伴随测量的微小RNA数量的增加，例如，测量更多微小RNA时(例如2比8或15比30)，测量的质量会同时提高，这是表达水平领域中熟练的技术人员公知的。熟练的技术人员将认识到最常见的情况是，生物学签名(biosignature)(测定)将包括过度表达和表达不足的微小RNA的组合。因此，本发明一方面也包括各个微小RNA的过度表达和表达不足的微小RNA的组合。
本发明可用于诊断和治疗患者，包括或者可以延伸到预后、治疗指导、监测治疗应答、用于临床试验、研究以及上述的组合。熟练的技术人员将认识到本文鉴定的微小RNA的检测可用于任何这些用途。
微小RNA(miRNA)是在进化上保守的内源性小型非编码RNA分子，包含20-22个核苷酸，发挥基因表达调节者的作用。最近有证据表明，miRNA调节多种关键细胞进程，例如发育、分化、增殖和凋亡。它们被视为在人类癌症发生和进展中发挥重要作用，充当原癌基因(oncogenes)或抑癌基因[l]。
在各种人类疾病(包括癌症)中，已经观察到各种组织中miRNA表达谱的改变。迄今，通过miRNA组织谱(miRNA tissue profiling)分析的每种类型肿瘤都已显示出与来自相同组织的正常细胞明显不同的miRNA谱[2-4]。而且，最近一些报道已经表明，miRNA存在于人类和其他动物的血清和血浆中[5-7]。在同一物种的个体间miRNA的循环水平相当稳定、可以重复并且是一致的[5]。因此，作为癌症和其他疾病诊断的新型非侵入性策略，循环miRNA的表达谱显示出很好的前景。
结直肠癌(CRC)是西方国家中的第二大最常见癌症，代表癌症相关死亡的第二大原因[8]。幸运的是，有证据表明，通过早期癌症检测和清除癌前病变，平均风险个体(average-risk individuals)的筛查可使死亡率和发病率降低[9]。事实上，筛查计划的目标是检测早期CRC和高危腺瘤(advanced adenomas,AA)，这些都是与进展到侵入性病变的高风险关联的癌前病变。
目前，还没有最佳且普遍接受的CRC筛查策略[10,11]，基于粪便的测试因其有限的敏感性而受到阻碍，而结肠镜构成一种侵入性方法[12]。因此，迫切需要可以补充和完善当前策略的新方法。在这个意义上，以前的研究已经发现，在CRC患者的血浆中，一些miRNA增加，表明其作为非侵入性生物标志物的潜在作用(13-16)。然而，所有这些都限于对少量miRNA的分析。因此，必须通过高通量技术来进一步表征血浆miRNA谱，并评估其在检测具有CRC和/或癌前病变(cancer precursorlesions)的个体时的表现特征。在本研究中，我们在一组患有CRC或AA的患者和健康个体中，通过微阵列进行血浆miRNA谱分析，鉴定出一组能够以高分辨能力检测结直肠肿瘤患者的miRNA。个体独立群组(independent cohort of individuals)中的验证以及使用不同的技术，让我们能够确认6种血浆miRNA是非常有前途的非侵入性CRC诊断生物标志物。
循环miRNA显示出作为癌症和其他疾病诊断的新型生物标志物的巨大前景。迫切需要可以补充和改善结直肠癌(CRC)筛查当前策略的新型非侵入性方法。全基因组血浆miRNA表达谱(genome-wide plasma miRNA expression profiling)是在一组个体(n＝61)中通过微阵列进行分析的，该组个体包括CRC患者或具有癌前病变(pre-malignant lesions)(如晚期结直肠腺瘤(AA))的患者与健康受试者。实时qRT-PCR用于验证来自另一间医院的独立患者群(n＝135)中选定miRNA的表达。与对照相比较，CRC或AA患者显示出显著不同的血浆miRNA表达谱。一组13个miRNA被选定在独立患者群中进行验证，它们中的6个被确认在CRC组中显著过度表达，显示出高区分精度(discriminative accuracy)。这6个miRNA中的1个被确认在AA患者中也有显著的过度表达，具有中度区分能力。
来自两间医院(西班牙加泰罗尼亚省巴塞罗那临床医院和西班牙吉普斯夸省多诺斯蒂亚医院)的总共273个受试者被纳入到本研究中。其中77人因满足以下任一标准而被排除：家族性腺瘤性息肉病或Lynch综合征的临床诊断，存在超过10个结直肠腺瘤，在选择时其它部位诊断有癌症，呈现炎性肠病，在血液采样时接受化疗或放疗，不完全肠检查(incomplete bowel examination)，在诊断性结肠镜检查时肠道准备不足(inadequate bowel preparation)，或血浆样本中出现溶血。最后纳入196人：新诊断为散发性结直肠肿瘤的123名患者(63名患上CRC，40名具有AA)和无任何癌症个人历史记录且最近结肠镜检查确认无结直肠肿瘤病变的73名健康个体。AA患者是指那些具有至少10mm大小的腺瘤或者在组织学上具有高度异型增生(highgrade dysplasia)或>20％的绒毛状成分(villous component)。这些个体被分到两个不同且不相关的组内：第1组，来自巴塞罗那临床医院的61个受试者，他们被用于进行全基因组血浆微小RNA表达谱分析；第2组，来自多诺斯蒂亚医院(Hospital ofDonostia)的135个受试者，他们被用于进一步验证得自第1组的结果。表1显示参与者的特征。血液样本在所有个体进行内窥镜检查(endoscopy)或手术前收集。
表1.患者特征。
研究经巴塞罗那临床医院院伦理委员会批准(批准日期：2009年3月26日)，并根据《赫尔辛基宣言》获得所有参与者的书面知情同意书。
从血浆样本中提取RNA。将每位参与者的二十毫升全血收集到EDTA管中。将血液样本置于4℃，直至进行血浆分离，并在抽血后6小时内冰冻血浆。简而言之，在4℃以1,600x g对样本进行10分钟离心，将血细胞沉淀下来，将血浆转移到新管中，之后在4℃以16,000x g进行10分钟离心，以完全去除细胞成分。然后分装血浆，并一直存放在-80℃直至使用。采用Trizol LS试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)和miRNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)，按照制造商协议并进行以下修饰，从550μl血浆中将含小RNA的总RNA分离出来。按2:1体积比将Trizol LS试剂加入到血浆样本中。在通过加入氯仿和离心进行相分离后，分离水相到新管中，再加入一个体积的Trizol LS。按照制造商说明书，在第二阶段分离后，将1.5个体积的100％乙醇加入到水相中，将混合物装入miRNeasy柱中。进行DNase处理(Qiagen)，以去除任何污染性DNA。最终洗脱的体积为30μl。在所有样本中使用NanoDrop 1000(Nanodrop,Wilmington,DE)，对RNA浓度进行定量，范围在3到35ng/μl之间。对每个样本重复该提取过程，直至为后面的步骤获得足够数量的RNA。
通过微阵列进行全基因组血浆miRNA谱分析。利用基于SAM珠阵列平台的微小RNA表达谱检测(MicroRNA Expression Profiling Assay)(总部设在美国加利福尼亚州圣迭戈的Illumina,Inc.)，对来自第1组的所有样本进行MiRNA表达谱分析。该微阵列包含1,146个探针，包括743个经验证的miRNA，检测miRBase Sangerv.12.0数据库中大约97％的经注释的人体miRNA。每个样本使用200ng总RNA进行miRNA微阵列检测。按照之前的描述[13,14]，根据制造商协议进行所有步骤。使用BeadStudio数据分析软件提取数据并转化到log base 2尺度(scale)。来自所有样本的微阵列数据使用Lumi bioconductor包进行分位数归一化(quantile-normalized)[15]。
通过实时qRT-PCR分析miRNA表达。使用之前的多重预扩增(multiplexpreamplification)流程，通过实时qRT-PCR分析MiRNA表达。简而言之，用MegaplexRT Primers混合物(美国加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems Inc.)对21ng的血浆RNA进行逆转录，并使用Megaplex PreAmp Primers和TaqMan PreAmpMasterMix(Applied Biosystems Inc.)对其进行14个循环的预扩增。在Viia7实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.)中使用TaqMan miRNA Assays(Applied BiosystemsInc.)，通过qPCR评估每个miRNA的表达。对几个推定的(putative)看家小核RNA进行分析，以确定在我们的样本中最适合的(RNU6B、miR16、miR423-5p、RNU48、miR544、miR103、miR525、miR451)。MiR16显示出最高的稳定性和丰度，因此，根据其他文章的报道，miRNA的表达水平被归一化(normalized)至miR16作为内部对照[16,17]。由自动阈值计算Ct值。无模板对照显示没有扩增。qPCR的每个点都包括三个技术重复。为每个样本计算选定miRNA的相对表达水平作为ΔCt值[ΔCt＝靶miRNA的Ct-内部对照miRNA的Ct]。
统计分析。利用微阵列数据的线性模型(Linear Models for Microarray Data)(LIMMA)，确定组间表达有差异的miRNA。LIMMA利用线性模型和empirical Bayespaired moderated t-statistics和F-statistics[18]。将利用F-statistics的最显著miRNA用于相关分析，如made4包中包括的组间分析(BGA)功能中所实现的[19]。该方法能够使高维数据(例如多个表达测量)在二维图形中可视化，其中由椭圆界定的面积代表第一和第二条轴上样本分数的估计双正态分布(estimated binormal distribution)的95％[20]。制作维恩图(Venn Diagrams)，仅将绝对倍数变化大于1.5且中度p值(moderate p-value)<0.05的miRNA视为命中(来自LIMMA包的VennCounts和VennDiagram)。利用Student's test，分析定量变量。两侧p值<0.05视为显著。各个miRNA和不同miRNA组合的可预测性评估，按年龄和性别调整后，通过逻辑回归(GLM二项分布)(GLM binomial distribution)计算得出。ROC分析图和派生切点(cut-points)以及整体区分精度参数均通过DiagnosisMed R-包计算得出。从与ROC曲线和左上角之间最短距离相关联的最佳切点，计算敏感性和特异性。
来自结直肠癌患者的血浆样本的全基因组miRNA谱分析。血浆miRNA表达将结直肠癌患者与健康个体区分开。为评估CRC患者与健康个体之间不同的循环miRNA表达谱，对从21位CRC患者和20位健康对照者的血浆样本获取的总RNA进行miRNA微阵列实验。为进一步调查是否在发生结直肠癌癌前病变的患者身上发现改变的miRNA表达模式，还对来自20位晚期结直肠腺瘤(AA)患者的血浆RNA进行miRNA微阵列实验。
利用LIMMA的初步对比统计分析获得了总共93个miRNA，当与健康个体相比较时，CRC患者中的这93个miRNA显著失调(significantly deregulated)(p<0.05)，以及当AA患者与健康对照者相比较时，有125个miRNA。所有微阵列数据均可在GEO(收录号：GSE 25609)中获得。图1A和1B显示热图，其包括CRC患者与对照者之间(图1A)以及AA患者与对照者之间(图1B)具有最高显著倍数变化的50个miRNA。倍数变化差异和p值以及CRC或AA中这些miRNA的对应可预测性参数分别显示在表2-3和4-5中。然后根据血浆miRNA表达，描绘BGA图，以直观地表示患有CRC或AA的患者与对照者之间的接近程度。如图2所示，CRC或AA患者与健康个体表现为3个明显有别的组。还对每种类型肿瘤性病变的miRNA表达的特异性进行分析，即使用维恩分析对CRC和AA与对照样本进行比较(图2)。结果发现，在CRC和AA患者中，包含21个和28个miRNA的子组(subset)分别专一地(exclusively)且显著地上调，而两类肿瘤患者共享24个显著上调的miRNA。因此，每一个结直肠肿瘤病变都具有特定的miRNA表达谱，但两者还共享重要数量的失调(deregulated)miRNA，这使得可以通过基于常见血浆miRNA签名的单一测试来确定两种病变。
表2.显示最高倍数变化的CRC中前50个失调miRNA的倍数变化和p值参数。
前50个miRNA MIMAT# FC P
hsa-miR-302a MIMAT0000684 10,57 0,0002
hsa-miR-30a MIMAT0000087 9,43 0,0001
hsa-miR-302b MIMAT0000714 5,97 0,0042
hsa-miR-565:9.1 MI0003571 5,69 0,0010
hsa-miR-191 MIMAT0000440 5,32 0,0061
hsa-miR-125b MIMAT0000423 5,27 0,0022
前50个miRNA MIMAT# FC P
hsa-miR-100 MIMAT0000098 4,69 0,0180
hsa-miR-194 MIMAT0000460 4,67 0,0160
hsa-miR-27a MIMAT0000084 4,53 0,0045
hsa-miR-424 MIMAT0001341 4,47 0,0055
hsa-miR-125a-5p MIMAT0000443 4,41 0,0060
hsa-miR-335 MIMAT0000765 4,16 0,0268
hsa-miR-29a MIMAT0000086 4,11 0,0237
hsa-miR-219-5p MIMAT0000276 4,00 0,0427
hsa-miR-17 MIMAT0000070 3,95 0,0386
hsa-miR-520h/g MIMAT0002867 3,92 0,0047
hsa-miR-151-5p MIMAT0004697 3,92 0,0131
hsa-miR-524-5p MIMAT0002849 3,82 0,0172
hsa-miR-29b MIMAT0000086 3,77 0,0340
hsa-miR-202* MIMAT0002810 3,51 0,0231
hsa-miR-9 MIMAT0000441 3,36 0,0074
hsa-miR-150 MIMAT0000451 3,30 0,0394
hsa-miR-15b MIMAT0000417 3,21 0,0019
hsa-miR-518c MIMAT0002848 3,20 0,0304
hsa-miR-23a MIMAT0000078 3,14 0,0003
hsa-miR-19b MIMAT0000074 3,03 0,0035
hsa-miR-25 MIMAT0004498 3,03 0,0060
hsa-miR-15a MIMAT0000068 3,02 0,0238
hsa-miR-143 MIMAT0004599 3,00 0,0069
hsa-miR-141 MIMAT0004598 2,77 0,0211
hsa-miR-30d MIMAT0000245 2,62 0,0315
hsa-miR-627 MIMAT0003296 2,62 0,0207
hsa-miR-26b MIMAT0000083 2,60 0,0059
hsa-miR-24 MIMAT0000080 2,46 0,0140
hsa-miR-217 MIMAT0000274 2,24 0,0278
hsa-miR-92a MIMAT0000092 1,83 0,0437
hsa-miR-376b MIMAT0002172 -1,90 0,0281
hsa-miR-637 MIMAT0003307 -1,90 0,0432
前50个miRNA MIMAT# FC P
hsa-miR-130b* MIMAT0004680 -1,95 0,0116
hsa-miR-1537 MIMAT0007399 -1,97 0,0383
hsa-miR-633 MIMAT0003303 -2,01 0,0448
hsa-miR-l0a MIMAT0000253 -2,12 0,0337
hsa-miR-127-3p MIMAT0000446 -2,23 0,0072
hsa-miR-337-3p MIMAT0000754 -2,23 0,0319
hsa-miR-575 MIMAT0003240 -2,24 0,0257
hsa-miR-936 MIMAT0004979 -2,25 0,0084
hsa-miR-626 MIMAT0003295 -2,31 0,0361
hsa-miR-1271 MIMAT0005796 -2,38 0,0315
hsa-miR-876-3p MIMAT0004925 -2,65 0,0023
hsa-miR-639 MIMAT0003309 -2,90 0,0222
表3.CRC中前50个失调miRNA之中各miRNA的可预测性。显示了ROC曲线参数(曲线下面积(AUC)和95％置信区间(CI)以及对应最佳切点的敏感性(S)和特异性(Sp))
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
hsa-miR-302a 0,9143 0,8233 1,0053 0,5195 81 90
hsa-miR-30a 0,9048 0,7992 1,0103 0,5151 86 85
hsa-miR-302b 0,8524 0,7327 0,9720 0,5333 81 80
hsa-miR-565:9.1 0,8905 0,7861 0,9948 0,5262 81 85
hsa-miR-191 0,8667 0,7557 0,9776 0,4503 90 75
hsa-miR-125b 0,8714 0,7429 1,0000 0,5443 86 85
hsa-miR-100 0,8643 0,7381 0,9904 0,5230 86 90
hsa-miR-194 0,8238 0,6885 0,9591 0,4942 86 75
hsa-miR-27a 0,8405 0,7092 0,9717 0,5899 86 80
hsa-miR-424 0,8619 0,7514 0,9725 0,5888 76 80
hsa-miR-125a-5p 0,8500 0,7272 0,9728 0,5901 76 85
hsa-miR-335 0,8310 0,6973 0,9646 0,5494 81 85
hsa-miR-29a 0,8667 0,7435 0,9898 0,5449 81 85
hsa-miR-219-5p 0,8238 0,6967 0,9509 0,5895 76 75
hsa-miR-17 0,8429 0,7185 0,9672 0,4718 81 80
hsa-miR-520h/g 0,8786 0,7724 0,9847 0,5382 81 85
hsa-miR-151-5p 0,8476 0,7183 0,9770 0,4912 90 80
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
hsa-miR-524-5p 0,8333 0,7023 0,9643 0,5795 76 90
hsa-miR-29b 0,8381 0,7136 0,9626 0,4574 90 75
hsa-miR-202* 0,8405 0,7121 0,9689 0,4558 90 75
hsa-miR-9 0,8381 0,7138 0,9624 0,5730 81 80
hsa-miR-150 0,8429 0,7184 0,9673 0,4537 86 75
hsa-miR-15b 0,8643 0,7507 0,9778 0,5775 81 80
hsa-miR-518c 0,8476 0,7216 0,9737 0,5840 81 85
hsa-miR-23a 0,8905 0,7861 0,9948 0,5799 81 80
hsa-miR-19b 0,8381 0,7016 0,9746 0,6538 81 80
hsa-miR-25 0,8952 0,8028 0,9876 0,5533 81 80
hsa-miR-15a 0,8619 0,7493 0,9745 0,4686 81 75
hsa-miR-143 0,8524 0,7333 0,9714 0,5989 76 85
hsa-miR-141 0,8429 0,7082 0,9776 0,5084 86 85
hsa-miR-30d 0,8226 0,6918 0,9534 0,5176 76 80
hsa-miR-627 0,8333 0,7083 0,9584 0,5961 71 85
hsa-miR-26b 0,8619 0,7505 0,9733 0,5455 90 70
hsa-miR-24 0,8524 0,7292 0,9756 0,4210 90 75
hsa-miR-217 0,8310 0,7035 0,9584 0,5650 67 80
hsa-miR-92a 0,8571 0,7451 0,9692 0,2972 95 65
hsa-miR-376b 0,8262 0,7004 0,9520 0,6884 62 90
hsa-miR-637 0,8595 0,7435 0,9756 0,4911 86 75
hsa-miR-130b* 0,8762 0,7694 0,9830 0,6915 71 95
hsa-miR-1537 0,8524 0,7198 0,9849 0,4172 90 75
hsa-miR-633 0,8595 0,7439 0,9751 0,5986 76 85
hsa-miR-l0a 0,8810 0,7764 0,9855 0,4161 86 75
hsa-miR-127-3p 0,8833 0,7744 0,9922 0,5676 81 85
hsa-miR-337-3p 0,8452 0,7222 0,9683 0,5727 71 80
hsa-miR-575 0,8298 0,7015 0,9580 0,6407 76 85
hsa-miR-936 0,8476 0,7249 0,9704 0,5919 71 90
hsa-miR-626 0,8214 0,6928 0,9501 0,6718 71 80
hsa-miR-1271 0,8190 0,6896 0,9485 0,6845 67 85
hsa-miR-876-3p 0,8476 0,7212 0,9741 0,4657 90 75
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
hsa-miR-639 0,8071 0,6753 0,9390 0,7118 52 95
表4.显示最高倍数变化的AA中前50个失调miRNA的倍数变化和p值参数。
前50个miRNA MIMAT# FC p值
hsa-miR-302a MIMAT0000684 10,37 0,0003
hsa-miR-29a MIMAT0000086 9,12 0,0001
hsa-miR-152 MIMAT0000438 6,29 0,0002
hsa-miR-518e* MIMAT0005450 6,12 0,0079
hsa-miR-768-3p:11.0 MI0005117 5,68 0,0048
hsa-miR-335 MIMAT0000765 5,67 0,0112
hsa-miR-17 MIMAT0000070 5,46 0,0069
hsa-miR-30a MIMAT0000087 4,91 0,0142
hsa-miR-191 MIMAT0000440 4,82 0,0162
hsa-miR-100 MIMAT0000098 4,55 0,0235
hsa-miR-519d MIMAT0002853 4,24 0,0277
hsa-miR-199a-5p MIMAT0000231 4,11 0,0222
hsa-miR-125a-5p MIMAT0000443 3,96 0,0219
hsa-miR-424 MIMAT0001341 3,95 0,0174
hsa-miR-18a MIMAT0000072 3,88 0,0133
hsa-miR-193b MIMAT0002819 3,80 0,0394
hsa-miR-302a* MIMAT0000683 3,76 0,0340
hsa-miR-151-5p MIMAT0004697 3,75 0,0150
hsa-miR-125b MIMAT0000423 3,75 0,0275
hsa-miR-518c MIMAT0002848 3,67 0,0159
hsa-miR-130a MIMAT0000425 3,59 0,0079
hsa-miR-30d MIMAT0000245 3,58 0,0025
hsa-miR-22 MIMAT0000077 3,27 0,0096
hsa-miR-15a MIMAT0000068 3,25 0,0133
hsa-miR-192 MIMAT0000222 3,22 0,0404
hsa-miR-484 MIMAT0002174 3,18 0,0067
hsa-miR-522 MIMAT0002868 2,93 0,0394
hsa-miR-423-3p MIMAT0001340 2,88 0,0367
hsa-miR-217 MIMAT0000274 2,79 0,0056
前50个miRNA MIMAT# FC p值
hsa-miR-664 MIMAT0005949 2,70 0,0252
hsa-miR-30e* MIMAT0000693 2,63 0,0001
hsa-miR-185 MIMAT0000455 2,59 0,0357
hsa-miR-19b MIMAT0000074 2,57 0,0321
hsa-miR-1274b MI0006427 2,55 0,0216
hsa-miR-23a MIMAT0000078 2,51 0,0047
hsa-miR-324-3p MIMAT0000762 2,48 0,0118
hsa-let-7d MIMAT0000065 2,47 0,0300
hsa-miR-581 MIMAT0003246 2,46 0,0081
hsa-miR-450b-3p MIMAT0004910 -2,49 0,0268
hsa-miR-187* MIMAT0004561 -2,59 0,0002
hsa-miR-576-3p MIMAT0004796 -2,59 0,0001
hsa-miR-1290 MIMAT0005880 -2,62 0,0005
hsa-miR-380* MIMAT0000734 -2,66 0,0016
hsa-miR-369-3p MIMAT0000721 -2,84 0,0190
hsa-miR-876-3p MIMAT0004925 -3,09 0,0022
hsa-miR-671-3p MIMAT0004819 -3,52 0,0008
hsa-miR-936 MIMAT0004979 -3,55 0,0001
hsa-miR-218 MIMAT0000275 -4,56 0,0122
hsa-miR-379 MIMAT0000733 -5,71 0,0000
hsa-miR-630 MIMAT0003299 -6,29 0,0010
表5.AA中前50个失调miRNA之中各miRNA的可预测性。显示了ROC曲线参数(曲线下面积(AUC)和95％置信区间(CI)以及对应最佳切点的敏感性(S)和特异性(Sp))
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
miR.302a 0,9100 0,8170 1,0030 0,3571 95 80
miR.29a 0,8775 0,7656 0,9894 0,3763 90 80
miR.152 0,875 0,7700 0,9800 0,5804 80 85
miR.518e* 0,7925 0,6551 0,9299 0,5243 65 70
miR.768.3p.l1.0 0,8175 0,6888 0,9462 0,4317 80 65
miR.335 0,7925 0,6545 0,9305 0,5461 65 75
miR.17 0,8525 0,7340 0,9710 0,4344 80 75
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
miR.30a 0,8350 0,7050 0,9650 0,4889 80 80
miR.191 0,8200 0,6888 0,9512 0,5530 75 75
miR.100 0,8300 0,6963 0,9637 0,5106 80 80
miR.519d 0,7925 0,6527 0,9323 0,4689 80 70
miR.199a.5p 0,8050 0,6711 0,9389 0,4913 75 70
miR.125a.5p 0,8225 0,6922 0,9528 0,3773 90 65
miR.424 0,8350 0,7128 0,9572 0,4925 75 70
miR.18a 0,8400 0,7164 0,9636 0,5475 80 80
miR.193b 0,7875 0,6473 0,9277 0,5452 75 75
miR.302a* 0,8200 0,6850 0,9550 0,5003 80 80
miR.151.5p 0,7950 0,6564 0,9336 0,4711 75 70
miR.125b 0,8250 0,6988 0,9512 0,3842 80 70
miR.518c 0,8475 0,7273 0,9677 0,5524 75 70
miR.130a 0,8275 0,6900 0,9650 0,5786 80 85
miR.30d 0,8725 0,7659 0,9791 0,3596 85 70
miR.22 0,8525 0,7310 0,9740 0,5737 75 80
miR.15a 0,8725 0,7654 0,9796 0,4755 80 75
miR.192 0,7800 0,6386 0,9214 0,4435 80 65
miR.484 0,8625 0,7492 0,9758 0,3974 90 70
miR.522 0,7975 0,6613 0,9337 0,5762 70 75
miR.423.3p 0,8150 0,6780 0,9520 0,5520 70 85
miR.217 0,8525 0,7257 0,9793 0,5673 75 95
miR.664 0,8175 0,6715 0,9635 0,5403 80 80
miR.30e* 0,8775 0,7709 0,9841 0,5039 85 80
miR.185 0,8275 0,6976 0,9574 0,6138 65 85
miR.19b 0,8087 0,6746 0,9429 0,4663 80 70
miR.1274b 0,8400 0,7189 0,9611 0,5231 70 75
miR.23a 0,8400 0,7195 0,9605 0,4723 85 70
miR.324.3p 0,8275 0,6976 0,9574 0,5407 80 70
let.7d 0,8025 0,6645 0,9405 0,5203 75 70
miR.581 0,8525 0,7340 0,9710 0,6819 70 90
miR.450b.3p 0,7550 0,6059 0,9041 0,5207 65 70
前50个miRNA AUC CI低 CI高 切点 S Sp
miR.187* 0,9075 0,8125 1,0025 0,5139 85 85
miR.576.3p 0,9575 0,8941 1,0209 0,4191 90 90
miR.1290 0,8750 0,7669 0,9831 0,4742 85 80
miR.380* 0,8475 0,7156 0,9794 0,5532 75 90
miR.369.3p 0,7925 0,6533 0,9317 0,5663 65 80
miR.876.3p 0,8325 0,7090 0,9560 0,6131 70 80
miR.671.3p 0,8550 0,7393 0,9707 0,5179 65 85
miR.936 0,9225 0,8427 1,0023 0,5084 85 85
miR.218 0,8000 0,6591 0,9409 0,4740 75 70
miR.379 0,9325 0,8519 1,0131 0,5830 85 95
miR.630 0,8375 0,7132 0,9618 0,4579 75 70
通过实时qRT-PCR验证血浆miRNA表达。基于微阵列的血浆miRNA表达结果在技术上是可以重复的。首先，进行实时qRT-PCR，以确认从第1组中随机选择的28个样本(19位结直肠肿瘤患者和9位健康对照者)中的微阵列结果。为这些研究，选择总共14个候选miRNA。十二个候选miRNA(miR17-5p、miR92a、miR19b、miR18a、miR29a、miR302a、miR23a、miR27a、miR24、miR335、miR424和miR15b)被选定，因为它们存在于CRC和/或AA中的前50个失调miRNA中，并且log base 2微阵列强度>8。尽管另外两个候选miRNA(miR19a和miR20a)不满足之前的标准，但也被选定，因为它们是miR17-92簇的一部分，而miR17-92簇是被表征最好的原癌(oncogenic)miRNA簇之一。总体而言，除miR424外，qRT-PCR和微阵列结果是相关的(数据未显示)，miR424没有显示出qRT-PCR的任何扩增，因此在随后的分析中被排除。
确认六个血浆微小RNA在来自独立群的CRC患者中过度表达。第二，在42位CRC患者和53位健康对照者的独立组的血浆中，对在上一阶段显示出足够扩增的13个候选miRNA进行分析((miR92a、miR17-5p、miR18a、miR19a、miR19b、miR20a、miR15b、miR29a、miR302a、miR23a、miR27a、miR24和miR335)，以便通过实时qRT-PCR验证我们的结果。
有趣的是，miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335被确认在CRC患者中显著上调(图3)。此外，miR-24在该组患者中也过度表达，但没有达到统计显著性(p＝0.08)。值得注意的是，在第二组中经验证的miRNA还表现出在将CRC患者与健康对照者区分开方面的很高精度，其ROC曲线下面积(AUC)在0.8(95％CI:0.71-0.89)到0.7(95％CI:0.59-0.80)范围内。接下来，我们尝试看看这些miRNA的任何组合是否可以提高它们各自单独检测CRC的区分精度。在这些组合中，表现出最佳区分能力的是miR19a+miR19b和miR19a+miR19b+miR15b的签名(表6；图4)。最后，我们探讨了这些签名在早期(TNM I-II)和晚期(TNMIII-IV)CRC患者中的预测能力。如表2中所示，这两个签名(signatures)在早期和晚期病例中显示出高区分精度。类似地，我们检查了这些签名是否还能如检测左侧肿瘤般一样精确地检测右侧肿瘤，对二者而言正是如此(表2)。
表6.来自第2组的CRC患者中最佳血浆miRNA签名的可预测性。
针对所有CRC病例以及为不同的肿瘤阶段(I/II和III/IV)及位置(右侧和左侧，相对于脾曲(splenic flexure)而言)显示ROC曲线参数(曲线下面积(AUC))和95％置信区间。
确认在晚期结直肠腺瘤的患者中有一个血浆微小RNA增加。为了评估任何在两个CRC患者组中均被发现过度表达的血浆miRNA在携带癌前病变的患者中是否也会增加，通过实时qRT-PCR对来自包含40位AA患者和53位健康对照者的独立群的血浆样本进行分析。与对照相比较，miR18a被确认在该第二组AA患者中显著过度表达，与其在第一组中的表现一样(图1B)。然而，尽管该miRNA在第一组AA患者中显示出良好的区分能力(AUC：0.84，95％CI：0.72-0.96，S：80％，Sp：80％)，但在第二组患者中，该参数更低(AUC：0.64，95％CI：0.52-0.75，S：72％，Sp：57％)。
在本研究中，发明人通过微阵列对来自CRC或AA患者和健康个体的血浆样本进行全基因组miRNA谱分析。这些结果表明，血浆miRNA表达可以将结直肠肿瘤患者和对照受试者区别开，表明它在这些病变的非侵入性检测中的潜在价值。据我们所知，这是关于通过高通量技术分析CRC和AA患者中血浆miRNA全基因组表达的首次报道，随后以外部独立群(cohort)验证该结果。基于该高通量分析，我们已经识别出大量推定的血浆miRNA生物标志物，可用于检测患有CRC或AA的患者。而且，在不同的群中使用不同的技术，我们也已确认六个血浆微小RNA将CRC和健康个体区别开的高区分能力。值得一提的是，这些miRNA中的5个(即miR19a、miR19b、miR18a、miR15b和miR335)代表之前没有报道过的新型生物标志物。
在血浆和其他流体中最近发现的稳定的miRNA开启了将这些分子用作疾病生物标志物的可能性，多份研究在不同的环境中对此策略进行了评估。在人类癌症中，该方法确实大有前景，因为肿瘤相关循环miRNA的分析可能能够以非侵入性方式检测出肿瘤。然而，虽然使用组织样本进行了癌症中大多数miRNA表达谱研究，但其中只有数量有限的研究关注循环miRNA在诊断和预后中的潜在价值[21-23]。值得注意的是，将miRNA用作生物标志物似乎是比RNA或蛋白质标志物更好的策略，因为这些分子具有高稳定性，即使在RNAses存在时[23]。
迄今，只有少数研究分析了CRC中一些候选血浆miRNA的表达。起初，Ng等人通过qRT-PCR分析发现与对照受试者相比，两个血浆miRNA(即miR17-3p和miR92a)在CRC患者中显著增加。然而，他们的初步分析局限于10个血浆样本(五位CRC患者和五位健康个体)中的95个miRNA。更重要的是，该研究仅仅评估了血浆miRNA在CRC诊断而不是在前体病变识别中的潜在用途[24]。之后不久，Huang等人报告了2个血浆miRNAs-miR29a和miR92a-在检测CRC和AA患者中的潜在用途。然而，该qRT-PCR分析限于在之前报道基础上选择的12个miRNA。Pu等人通过qRT-PCR分析了CRC患者血浆样本中三个miRNA的表达，报道了miR221的显著过度表达，但AA患者没有包括在该研究[25]中。最后，Cheng等人在分析三个miRNAs的表达后，报道了在转移CRC患者中miR141血浆水平显著上调[26]。
该研究通过在CRC和AA患者中使用高通量技术来进行循环miRNA的完整谱分析(complete profiling)，从而确定那些有作为诊断具有这些病变患者的生物标志物潜在用途的血浆miRNA。在分析的743个miRNA中，我们发现在CRC患者中有95个循环miRNA显著失调，在AA患者中则有125个，其中的一些显示出良好的区分能力。需要提到的是，在微阵列分析中，在那些显著上调的miRNA中，本发明人不仅确认了在之前研究中与CRC相关的那些血浆miRNA，例如miR29a、miR92a和miR141，还报告了在CRC癌变(carcinogenesis)中有潜在应用的新候选miRNA。而且，在这些过度表达的miRNA中，我们发现了miR17-92簇中的所有成员(miR17、miR92a、miR19a、miR19b、miR18a和miR20a)以及miR106b-25簇中的两个成员(miR-25和miR93)，其中miR106b-25簇是哺乳动物中miR17-92簇表征程度更低的旁系同源物(paralog)。这些发现突出了miR17-92簇在结直肠癌变中的核心作用。miR17-92簇(也称为oncomiRl)是表征程度最好(best characterized)的原癌miRNA簇之一[27,28]。在这个意义上，已经提示导致从腺瘤进展到腺癌的染色体不稳定性增加，不仅导致原癌基因(oncogenes)上调，还导致关键miRNA的过度表达，包括miR17-92簇[29]。
本发明人证明，在第一组CRC患者中的一些上调miRNA(即miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335)在独立群中也过度表达。值得注意的是，这些经过验证的miRNA显示出针对CRC的高区分精度，而且这些miRNA的几个组合提高了这些miRNA各自单独的区分能力。而且，它们检测早期CRC(I-II期)的准确性与检测晚期CRC(II-III期)的准确性相同，检测右侧肿瘤的准确性与检测左侧病变的准确性相同。这些结果表明这些血浆miRNA用作新型非侵入性CRC诊断生物标志物的潜在用途。
就结直肠癌前病变而言，我们发现在CRC中过度表达的六个miRNA中仅有一个(miR-18a)被确认在两个独立AA患者群中均显著过度表达。尽管miR-18a在第一组患者中显示出相当好的区分能力，但这种能力在第二组中为中等(moderate)。事实上，在Huang等人分析的AA患者群中，两个血浆miR(miR-29a和miR-92a)在将AA患者与对照者区分开时表现出相当好的精度[16]。这两个血浆miRNA在我们的第一AA患者群中也显著过度表达，但在第二组中却不是。对两组患者之间不一致的可能解释是，在第二患者群中AA的晚期特征(advanced features)更少(表1)。总之，这些结果表明AA患者中血浆微小RNA的有用性评估构成一条有趣的研究线索，值得进一步调查。目前，AA检测仍是非侵入性CRC筛查策略的主要挑战。事实上，值得一提的是，粪便免疫学测试是对平均风险人群(average-risk population)非侵入性CRC筛查的当前接受的策略，我们组的一项研究最近表明，粪便免疫学测试在CRC诊断中表现良好，但会忽略近50％的AA[12]。
有趣的是，在本研究中被验证的所有miRNA之前被报道在CRC患者的组织样本中过度表达[30-34]。因此，可假设CRC构成这些血浆miRNA的来源。因此，我们的研究结果不仅指出miR29a、miR15b、miR19a、miR-19b、miR-18a和miR-335作为CRC诊断的强大生物标志物，还强调它们在结直肠癌变中的影响。而且，考虑到这些miRNA的潜在致癌作用(oncogenic role)，我们的研究结果开启了未来设计重点抑制这些分子的新型靶向治疗的可能性。
除了列出的微小RNA和微小RNA家族之外，还可以加入其他微小RNA，以强化结直肠癌的检测。例如，该方法可以进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA的表达水平：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233
hsa-miR-449b
hsa-miR-1204
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105
hsa-miR-298
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p
该方法可以进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA的表达水平：
另一个生物签名(biosignature)或测定(assay)将包括过度表达和表达不足的微小RNA的组合，例如来自上面列出的或本文披露的微小RNA。因此，本发明一方面还包括各微小RNA的过度表达和表达不足的微小RNA的组合，具有或不具有特定的列出的微小RNA和微小RNA家族(或共表达的)。
总之，与健康个体相比，CRC和AA患者显示出显著不同的血浆miRNA谱。这些与肿瘤有关的循环miRNA构成新型生物标志物，代表非侵入性早期诊断的潜在策略。在本研究中，我们鉴定了用于CRC检测的六个大有前景的候选血浆miRNA。尽管如此，应在更大规模的患者群中进一步验证该方法，从而评估它们在筛查环境中的效力和潜在适用性。
已经考虑到，在本说明书中讨论的任何实施方案可以用本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物进行实施，反之亦然。而且，本发明组合物可用于实现本发明的方法。
可以理解，本文描述的特定实施方案是以解释说明的方式显示的，而不是作为对本发明的限制。本发明的主要特征可以用于不同的实施方案，而不会脱离本发明的范围。使用不超过常规实验的手段，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述具体流程的众多等同物。此类等同物被认为是在本发明的范围内，并由权利要求所覆盖。
说明书中提及的所有出版物和专利申请用于表明本发明所属领域技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个出版物或专利申请均被特定地逐个地指明通入引用并入本文。
词语“a”或“an”在与术语“comprising”(包含、包括)一起在权利要求和/或说明书中使用时，可以表示“一个”，但也与“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。术语“或”在权利要求书中使用时，是指“和/或”，除非明确指出是指择一方式(alternatives only)或者替代物相互排斥，即使披露内容支持择一方式和“和/或”的定义。本申请中，术语“大约”用于表明这样的数值，该数值包括用于确定该数值的设备、方法的内在误差变化(inherent variation of error)，或者在研究对象中存在的变化。
本说明书和权利要求中所用的词语“comprising”(和comprising的任何形式，例如“comprise”和“comprises”)、“having”(和having的任何形式，例如“have”和“has”)、“including”(和including的任何形式，例如“includes”和“include”)或“containing”(和containing的任何形式，例如“contains”和“contain”)都是包括性的(inclusive)或开放式的(open-ended)，不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。本文所用的词组“consisting essentially of”(基本上由……组成)将权利要求的范围限制为所述及的材料或步骤以及那些不会对要求保护的发明的基本的和新的特性构成实质性影响的材料或步骤。本文所用的词组“consisting of”(由……组成)不包括权利要求中未述及的任何要素、步骤或成分，但是例如通常与所述要素或限定词相关联的杂质除外。
本文所用的术语“or combinations thereof”(或其组合)是指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果在特定情境中顺序很重要，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续以此为例，明确包括的是包含一个或更多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟练的技术人员将明白，对于任何组合中的项目或术语的数量通常没有限制，除非上下文中明显看出不是这样。
本文所用的近似型词语，例如但不限于“about”(大约)、“substantial”或“substantially”(基本地，实质地)是指这样的情况：在如此修饰时被理解为不一定是绝对的或完美的，但会被本领域技术人员视为足够接近，足以确保可以按照目前的表述来指称这种情况。这种描述可以变化的程度将取决于可以引入多大的改变，并仍然使得本领域技术人员可以认识到被修饰的特征仍然具有未修饰的特征所要求的特性和能力。受限于前面的讨论，一般而言，此处用近似型词语例如“大约”修饰的数值可以在所述数值的至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％范围内变化。
基于本文披露的内容，在无需过度实验的情况下，本文披露和要求保护的所有组合物和/或方法都可以被制造和实施。虽然已经结合优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员将会明显认识到，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，许多变化可以被引入到所述组合物和/或方法中，以及本文所述方法的步骤或步骤顺序中。所有此类对本领域技术人员来说很明显的类似替代和修饰均被视为落在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思的范围内。
本发明提供了以下实施方案：
[实施方案1].诊断或检测人受试者中结直肠肿瘤的方法，包括以下步骤：
从疑似患上结直肠肿瘤的受试者处获取一个或更多个生物样本；
测量从该受试者的所述一个或更多个生物样本中获取的一个或更多个微小RNA的整体表达模式或水平；以及
将来自所述疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本的一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者生物样本的一个或更多个微小RNA的整体表达模式相比较，其中所述正常受试者是指未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠癌。
[实施方案2].实施方案1的方法，进一步包括对miR18a、miR29a或miR335中的至少一个进行分析并与来自所述正常受试者的表达量进行比较，其中miR18a、miR29a或miR335的过度表达提示结直肠肿瘤。
[实施方案3].实施方案1的方法，进一步包括对miR29a、miR92a或miR141中的至少一个进行分析。
[实施方案4].实施方案1的方法，其中所述一个或更多个生物样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。
[实施方案5].实施方案1的方法，其中该方法检测早期CRC(I-II)的准确性与检测晚期CRC(II-III期)、右侧肿瘤和左侧病变的准确性相同。
[实施方案6].实施方案1的方法，其中该方法包括90、91、92、93、94或95％或更大的置信区间。
[实施方案7].实施方案1的方法，其中该方法进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA的表达水平：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
[实施方案8].实施方案1的方法，其中该方法进一步包括测定从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA的表达水平：
[实施方案9].实施方案1的方法，其中通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、定量实时PCR、终点PCR、多重终点PCR、冷PCR、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序来对所述一个或更多个微小RNA的表达水平进行测量。
[实施方案10].实施方案1的方法，其中该方法用于治疗有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者，为有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者选择抗肿瘤剂疗法，将患者分入结直肠肿瘤亚组或用于结直肠肿瘤疗法临床试验，确定对结直肠肿瘤治疗方案的耐药性或应答性，开发用于结直肠肿瘤诊断的试剂盒或其任何组合。
[实施方案11].实施方案1的方法，其中选自表2、3、4和5的4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平被测量，其中所述微小RNA提高所述结直肠肿瘤测定、诊断或检测的特异性。
[实施方案12].实施方案1的方法，进一步包括将所述微小RNA的整体表达模式或水平用于所述结直肠肿瘤的预后、治疗指导或监测治疗应答的步骤。
[实施方案13].针对结直肠肿瘤病情进展、转移或两者的生物标志物，其中该生物标志物包括一个或更多个微小RNA，并且与来自正常结直肠肿瘤细胞或来自同一患者更早时点获得的结直肠肿瘤细胞的所述一个或更多个微小RNA的整体表达相比，从患者处获得的结直肠肿瘤细胞的所述一个或更多个微小RNA的整体表达若发生变化，则提示结直肠肿瘤病情进展，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠癌。
[实施方案14].实施方案13的生物标志物，进一步包括对后述微小RNA：miR29a、miR92a、miR141、miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a或miR335中的一个或更多个进行分析。
[实施方案15].实施方案13的生物标志物，其中该生物标志物进一步包括从下表选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
[实施方案16].实施方案13的生物标志物，其中该生物标志物进一步包括从下表选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA：
[实施方案17].实施方案13的生物标志物，其中所述微小RNA在结直肠肿瘤中表达不足，并且选自：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
[实施方案18].实施方案13的生物标志物，其中所述微小RNA在结直肠肿瘤中过度表达，并且选自：
[实施方案19].实施方案13的生物标志物，其中所述生物样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。
[实施方案20].实施方案13的生物标志物，其中该方法检测早期CRC(I-II)的准确性与检测晚期CRC(II-III期)、右侧肿瘤和左侧病变的准确性相同。
[实施方案21].实施方案13的生物标志物，进一步包括对选自表2、3、4和5的4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的表达模式或表达水平进行检测和分析，以诊断或检测结直肠肿瘤。
[实施方案22].用于结直肠肿瘤诊断的试剂盒，包括：
用于测定微小RNA的不同表达水平的生物标志物检测试剂，其中miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠肿瘤，其中结直肠癌的置信区间为90％或更大。
[实施方案23].实施方案22的试剂盒，进一步包括用于对miR18a、miR29a或miR335中至少一个进行检测和分析的试剂。
[实施方案24].实施方案22的试剂盒，进一步包括用于对miR29a、miR92a或miR141中至少一个进行检测和分析的试剂。
[实施方案25].实施方案22的试剂盒，进一步包括用于诊断患上结直肠肿瘤风险的说明书，其中该说明书包括逐步的指导，用于当测量来自疑似患上结直肠肿瘤的受试者的样本的表达水平以及来自正常受试者的样本的表达水平时，比较所述微小RNA的表达水平，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者。
[实施方案26].实施方案22的试剂盒，进一步包括获取受试者样本所必需的工具、容器和试剂，所述样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。
[实施方案27].实施方案22的试剂盒，进一步包括用于分析从下面选择的在结直肠肿瘤中表达不足的微小RNA的试剂：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
[实施方案28].实施方案22的试剂盒，进一步包括用于分析从下面选择的在结直肠肿瘤中过度表达的微小RNA的试剂：
[实施方案29].实施方案22的试剂盒，其中通过测定3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平，以诊断或检测结直肠肿瘤。
[实施方案30].为诊断患有结直肠肿瘤的患者选择癌症疗法的方法，该方法包括：
获取来自患结直肠肿瘤的受试者的样本；以及
测定miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的表达水平，并与来自正常受试者的生物样本的表达水平相比较，其中所述正常受试者是未患结直肠肿瘤的健康受试者，其中所述微小RNA的过度表达提示结直肠癌；以及
根据该患者体内的结直肠肿瘤的测定结果选择癌症疗法。
[实施方案31].进行临床试验的方法，该临床试验用于评估被认为可用于治疗疾病状态的候选药物，该方法包括：
(a)测量从一组患者中获得的微小RNA水平，其中所述微小RNA是从miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b微小RNA中选择的一个或更多个微小RNA；
(b)给予第一亚组患者候选药物，并且
给予第二亚组患者安慰剂；
给予第二亚组患者对照药物；或者
给予第二亚组患者所述候选药物与另一种活性剂的药物组合；
(c)在给予所述候选药物或安慰剂、对照药物或药物组合后重复步骤(a)；以及
(d)确定所述候选药物是否使具有以下特征的结直肠肿瘤细胞数量减少，与第二亚组患者发生的任何变化相比，这些结直肠肿瘤细胞中所述微小RNA表达量的变化具有统计显著性，其中具有统计显著性的数量减少提示该候选药物可用于治疗所述疾病状态。[实施方案32].诊断或检测人受试者中结直肠肿瘤的方法，包括以下步骤：
识别出患上或疑似患上结直肠肿瘤的人受试者；
获取来自所述受试者的一种或更多种生物样本，其中所述生物样本选自一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本；
测量miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的整体表达模式或水平；以及
将来自所述疑似患上结直肠肿瘤的受试者的生物样本的一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式进行比较，其中所述正常受试者是未患上结直肠肿瘤的健康受试者，其中微小RNA：miR18a、miR19a、miR19b、miR15b、miR29a和miR335的过度表达提示结直肠癌。
[实施方案33].实施方案32的方法，其中所述微小RNA在结直肠肿瘤中表达不足，并且选自：
hsa-miR-636；
hsa-miR-876-3p；
hsa-miR-1537；
hsa-miR-630；
hsa-miR-380*；
hsa-miR-338-5p；
hsa-miR-573；
hsa-miR-182*；
hsa-miR-518c*；
hsa-miR-187*；
hsa-miR-1233；
hsa-miR-449b；
hsa-miR-1204；
hsa-miR-518d-3p；
hsa-miR-1290；
hsa-miR-144:9.1；
hsa-miR-105；
hsa-miR-298；
hsa-miR-491-5p；
hsa-miR-576-3p；
hsa-miR-590-3p；
hsa-miR-1257；
hsa-miR-1225-3p；
hsa-miR-127-3p；
hsa-miR-936；
hsa-miR-379；
hsa-miR-664*；
hsa-miR-548j；
hsa-miR-130b*；和
hsa-miR-515-3p。
[实施方案34].实施方案32的方法，其中所述微小RNA在结直肠肿瘤中过度表达，并且选自：
[实施方案35].实施方案32的方法，其中通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、定量实时PCR、终点PCR、多重终点PCR、冷PCR、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序来对所述一个或更多个微小RNA的表达水平进行测量。
[实施方案36].实施方案32的方法，其中该方法用于治疗有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者，为有风险患上或已经患上结直肠肿瘤的患者选择抗肿瘤剂疗法，将患者分入结直肠肿瘤亚组或用于结直肠肿瘤疗法临床试验，确定对结直肠肿瘤治疗方案的耐药性或应答性，开发用于诊断结直肠肿瘤的试剂盒或其任何组合。
[实施方案37].实施方案32的方法，其中测定2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个微小RNA的整体表达模式或水平，以诊断或检测结直肠肿瘤。
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30.Volinia,S.,Calin,G.A.,Liu,C.G.,Ambs,S.,Cimmino,A.,Petrocca,F.,Visone,R.,Iorio,M.,Roldo,C,Ferracin,M.,Prueitt,R.L.,Yanaihara,N.,Lanza,G.,Scarpa,A.,Vecchione,A.,Negrini,M.,Harris,C.C.and Croce,CM.(2006)A microRNA expressionsignature of human solid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci USA,103,2257-61.
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Claims (15)

1.诊断或检测人受试者中高危结直肠腺瘤的方法，包括以下步骤：
测量从该受试者的一个或更多个生物样本中获得的一个或更多个微小RNA的整体表达模式或水平，其中这些微小RNA中的至少一个是miR18a；以及
将来自所述疑似患上高危结直肠腺瘤的受试者的生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者生物样本的所述一个或更多个微小RNA的整体表达模式相比较，其中所述正常受试者是未患上高危结直肠腺瘤的健康受试者，其中miR18a的过度表达提示高危结直肠腺瘤。
2.诊断或检测人受试者中高危结直肠腺瘤和结直肠肿瘤的方法，包括以下步骤：
测量从该受试者的一个或更多个生物样本中获得的微小RNA的整体表达模式或水平，其中这些微小RNA至少是miR18a和miR19a和miR19b、或者miR18a和miR19a和miR19b和miR15b；以及
将来自所述疑似患上高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤的受试者的生物样本的微小RNA的整体表达模式与来自正常受试者生物样本的微小RNA的整体表达模式相比较，其中所述正常受试者是未患上高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤的健康受试者，其中miR18a的过度表达提示高危结直肠腺瘤，miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的过度表达提示结直肠癌。
3.权利要求2的方法，进一步包括对miR29a或miR335中的至少一个进行分析并与来自所述正常受试者的表达量进行比较，其中miR29a或miR335的过度表达进一步提示结直肠肿瘤。
4.前述权利要求之任一项的方法，其中所述一个或更多个生物样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本或血液样本构成的组。
5.前述权利要求之任一项的方法，其中所述一个或更多个生物样本是血浆样本。
6.前述权利要求之任一项的方法，其中通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、定量实时PCR、终点PCR、多重终点PCR、冷PCR、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序来对所述一个或更多个微小RNA的表达水平进行测量。
7.针对高危结直肠腺瘤的生物标志物或生物学签名，其中该生物标志物是miR18a，并且当与从未患上高危结直肠腺瘤的健康受试者获得的正常生物样本中的所述微小RNA的整体表达相比较时，或者当与从同一患者更早时点获得的正常生物样本中的所述微小RNA的整体表达相比较时，从该患者获得的生物样本中的所述微小RNA的整体表达的变化提示高危结直肠腺瘤。
8.针对高危结直肠腺瘤和结直肠肿瘤的生物标志物或生物学签名，其中该生物标志物包括miR18a和miR19a和miR19b、或者miR18a和miR19a和miR19b和miR15b，并且当与从未患上高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤的健康受试者获得的正常生物样本中的所述微小RNA的整体表达相比较时，或者当与从同一患者更早时点获得的正常生物样本中的所述微小RNA的整体表达相比较时，从该患者获得的生物样本中的至少所述微小RNA的整体表达的变化提示高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤。
9.权利要求7或8之任一项的生物标志物，其中所述生物样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本或血液样本构成的组。
10.用于高危结直肠腺瘤诊断的试剂盒，包括用于测定miR18a的不同表达水平的生物标志物检测试剂，其中所述微小RNA的过度表达提示高危结直肠腺瘤。
11.用于诊断患上高危结直肠腺瘤和/或结直肠肿瘤的风险的试剂盒，包括用于测定miR18a和miR19a和miR19b、或者miR18a和miR19a和miR19b和miR15b的不同表达水平的生物标志物检测试剂，其中所述miR18a的过度表达提示高危结直肠腺瘤，miR19a和miR19b、或者miR19a和miR19b和miR15b的组合的过度表达提示结直肠肿瘤，其中结直肠癌的置信区间为90％或更大。
12.权利要求11的试剂盒，进一步包括用于对miR29a或miR335中至少一个进行检测和分析的试剂。
13.权利要求10-12任一项的试剂盒，进一步包括：
a.用于诊断患上高危结直肠腺瘤和/或结直肠肿瘤的风险的说明书，其中该说明书包括逐步的指导，用于当测量从疑似患上高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤的受试者获得的样本的表达水平时，将所述微小RNA的表达水平与从正常受试者获得的样本的表达水平相比较，其中所述正常受试者是未患上高危结直肠腺瘤或结直肠肿瘤的健康受试者；以及任选地
b.从受试者获取样本所必需的工具、容器和试剂，所述样本选自由一种或更多种生物流体、血浆样本、血清样本、血液样本、组织样本或粪便样本构成的组。
14.权利要求10的试剂盒用于体外诊断患上高危结直肠腺瘤风险的用途。
15.权利要求11-13任一项的试剂盒用于体外诊断患上高危结直肠腺瘤和/或结直肠肿瘤的风险的用途。
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