CN112041463A - 结肠直肠癌的miRNA标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过分析选择的miRNA种类的量来诊断受试者的结肠直肠癌或评估结肠直肠癌患者的来自疾病的死亡率可能性的新方法。还提供了用于这些方法的试剂盒，组合物和装置。

Description

结肠直肠癌的miRNA标志物
相关申请
本申请要求2019年3月11日提交的美国临时专利申请号62/816,724的优先权，将其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
发明背景
结肠直肠癌是世界范围内第三个最常见的癌症，占每年诊断的所有癌症病例的约10％。它是一种严重影响人类健康的致命疾病。在2012年期间，例如，全球诊断出140万新的结肠直肠癌病例，并且记录到该疾病导致的接近700,000例死亡。在发达国家，结肠直肠癌的发病率显著更高，其中发现超过65％的病例。男性比女性更可能患有这种疾病。
结肠直肠癌的诊断可能具有挑战性。尽管家族史可以为诊断提供有用的启示，但是在具有很少或没有遗传风险的人中发生了绝大多数的疾病(大于75-95％)。结肠直肠癌的症状也可根据结肠中癌症的位置以及其是否在体内扩散到其它地方而显著变化。根据结肠直肠癌的诊断有多早，其预后可以从非常好变化到非常糟糕：当癌症块限制在结肠壁内时，其是利用手术高度可治愈的；另一方面，一旦结肠直肠癌已经扩散，其通常是不可治愈的，其中医学干预集中于改善生活质量和减轻症状。平均而言，美国的5年生存率在65％左右。
由于结肠直肠癌的高患病率和早期诊断对患者的预期寿命至关重要，迫切需要新的和更有效的结肠直肠癌的早期诊断方法，特别是以非侵入性的方式。本发明满足了这种和其它相关的需要。
发明内容
本发明人已经发现，使用多种miRNA标志物的组，可以改进的特异性和灵敏性进行结肠直肠癌的诊断和预后。更具体地，使用患者粪便或结肠癌组织样品中的三种，四种或五种miRNA标志物miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a，允许可靠地确定由于疾病引起的疾病风险或死亡率。
因此，在第一方面，本发明提供了用于评估受试者中结肠癌的风险的方法。所述方法包括以下步骤：(a)定量测定取自受试者的粪便样品中miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a的表达谱；(b)基于miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；以及(c)确定受试者是否具有增加的结肠癌风险。在一些实施方案中，所述方法还包括使用受试者的粪便样品进行粪便免疫化学试验(FIT)的步骤。阳性FIT测试结果进一步表明结肠癌的风险增加。在一些情况下，对至少两个受试者进行所述方法，其中具有来自步骤(b)的较高综合评分的第一受试者被认为具有比具有较低综合评分的第二受试者更高的结肠癌风险。在一些实施方案中，为测试受试者生成综合评分，然后与预定的截止值进行比较以评估受试者患结肠癌的风险：例如，当综合评分高于截止值时，认为受试者患结肠癌的风险增加，这可能意味着受试者患有未检测到的结肠癌或将有可能在将来发展该疾病。在一些情况下，当认为受试者具有增加的结肠癌风险时，他进一步接受结肠镜检查，例如，以确认他是否患有结肠癌、腺瘤或两者都不是。在一些情况下，该方法的步骤(a)包括多核苷酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，优选逆转录PCR(RT-PCR)，尤其是定量RT-PCR。
在第二方面，本发明提供了用于评估结肠癌患者的来自结肠癌的死亡率可能性的方法。所述方法包括这些步骤：(a)定量测定取自患者结肠癌组织样品中miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a的表达谱；(b)基于miR-92a、miR-21、miR-145和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；以及(c)确定所述患者是否具有增加的来自结肠癌的死亡率风险。在一些实施方案中，已经测试了两个或更多个患者，并且具有较高综合评分的第一患者被认为具有比具有较低综合评分的第二患者更高的结肠癌死亡率风险。在一些实施方案中，为被测试的患者生成综合评分，然后与预定的截止值进行比较以评估患者在一段时间(例如，接下来的5年)内由于结肠癌引起的死亡率可能性：例如，当综合评分小于截止值时，认为患者在接下来的5年或更长时间内具有至少约85％的存活机会；否则，患者在接下来的5年中仅有约55％的存活机会。在一些实施方案中，在测试时，患者已经接受了结肠癌的诊断，例如在I,II或III期。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)包括多核苷酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，优选逆转录PCR(RT-PCR)，尤其是定量RT-PCR。
在第三方面，本发明提供了一种用于评估结肠癌患者的来自结肠癌的死亡率可能性的方法。所述方法包括这些步骤：(a)定量测定取自患者的粪便样品中miR-92a,miR-21和miR-133a的表达谱；(b)基于miR-92a、miR-21和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；以及(c)确定所述患者是否具有增加的来自结肠癌的死亡率风险。在一些实施方案中，已经测试了两个或更多个患者，并且具有较高综合评分的第一患者被认为具有比具有较低综合评分的第二患者更高的结肠癌死亡率风险。在一些实施方案中，为被测试的患者生成综合评分，然后与预定的截止值进行比较，以评估患者在一段时间(例如，接下来的5年)内由于结肠癌引起的死亡率可能性：例如，当综合评分小于截止值时，认为患者在接下来的5年或更长时间内具有至少约85％的存活机会；否则，患者在接下来的5年中有约65％的存活机会。在一些实施方案中，在测试时，患者已经接受了结肠癌的诊断，例如在I,II或III期。在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)包括多核苷酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)，优选逆转录PCR(RT-PCR)，尤其是定量RT-PCR。
在第四方面，本发明提供了用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒，其包含特异性和定量检测miR-92a,miR-21和miR-133a中的每一种的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含特异性和定量检测miR-92a、miR-21、miR-145和miR-133a中的每一种的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含特异性和定量检测miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a中的每一种的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于逆转录至少一种，可能多种，至多全部五种miRNA的引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含两种寡核苷酸引物的组，用于在扩增反应中从所述miRNA的任一种特异性扩增逆转录DNA的至少一个片段或全长。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA的任一种的一组寡核苷酸引物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA中的每一种的一组寡核苷酸引物。在一些实施方案中，寡核苷酸引物组选自表1。在一些实施方案中，所述试剂是特异性结合miRNA或来自miRNA的逆转录DNA的多核苷酸探针。在一些实施方案中，试剂包含可检测部分。任选地，该试剂盒包含用户使用该试剂盒用于其预期诊断或预后目的的说明书手册。
在第五方面，本发明提供了特异性和定量检测miR-92a,miR-21和miR-133a中的每一种的试剂在制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒中的用途。在一些实施方案中，所述试剂包括特异性和定量检测miR-92a、miR-21、miR-145和miR-133a中的每一种的试剂，其用于制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂包括特异性和定量检测miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a中的每一种的试剂，其用于制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒。在一些实施方案中，使用五种试剂，其各自特异性和定量地检测miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a中的一种。在一些实施方案中，所述试剂包括用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA中的每一种，例如表1中的那些的一组寡核苷酸引物。
附图的简要说明
图1:(A)通过分析来自三项研究的miRNA表达谱数据来鉴定CRC相关的miRNA。(B)选择用于进一步靶向定量的miRNA。T，肿瘤；N，正常；AA，晚期腺瘤。
图2:(A)在来自60个CRC患者和60个对照受试者的粪便样品的测试群组中，五种miRNA的粪便水平，以及它们通过逻辑回归模型的组合评分(C指数)。(B)在CRC中上调的三种单独的miRNA的诊断性能与组合C指数的ROC曲线比较。(C)在实验过程中，对单独的miRNA的定量评估受模板输入累积的误差影响，而组合的C指数可耐受高达±30％的模板误差。
图3:(A)在CRC组织中上调的三种miRNA(miR-92a,miR-21和miR-135b)的粪便水平和在验证组中的C指数。(B)ROC曲线比较显示C指数在诊断CRC方面明显优于miR-92a、miR-21和miR-135b。(C)C指数与CRC患者的年龄、性别、病变位置和TNM分期的相关性。
图4:(A)在具有FIT结果的样品群组中的C指数的粪便水平，以及FIT,C指数及其组合在诊断CRC和晚期腺瘤(AA)中的比较。(B)FIT、C指数及其组合在根据TNM分期子集诊断CRC中的比较。
图5：(A)miR-21，miR-92a或miR-133a的粪便水平与患者存活不显著相关，(B)由粪便miR-21，miR-92a和miR-133a产生的Ps指数与患者存活显著相关。PS指数与CRC患者的年龄，性别或病变位置无关，但随着癌症进展而增加。(C)多变量分析表明，Ps指数是TNM I-III CRC患者不良存活的独立风险因素。
图6:(A)由原发性CRC中miR-21,miR-92a,miR-145和miR-133a的水平产生的Pm指数与患者存活显著相关。(B)远端癌中的Pm指数显著高于近端癌中的Pm指数，并且随着癌症进展显著增加。(C)多变量分析显示Pm指数是TNM I-III CRC患者不良存活的独立风险因素。
图7：在单靶RT-qPCR和多重RT-qPCR中测试的miRNA的Cp值的相关性。
定义
在本公开中，术语“结肠直肠癌(CRC)”和“结肠癌”具有相同的含义，并且是指大肠(结肠)，即人类消化系统的下部的癌症，尽管直肠癌经常更具体地是指结肠的最后几英寸，即直肠的癌症。“结肠直肠癌细胞”是具有结肠癌特征的结肠上皮细胞，并且包括癌前细胞，其处于转化成癌细胞的早期阶段或其易于转化成癌细胞。这种细胞可表现出癌细胞的一种或多种表型特征。
在本公开中，术语“或”通常以其包括"和/或"的意义使用，除非内容另外清楚地规定。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参比核酸相似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因，cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段；它包括在基因产物的转录/翻译和转录/翻译的调节中涉及的编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)，以及在各个编码区(外显子)之间的插入序列(内含子)。
如本文所用，术语“基因表达”用于指DNA转录以形成编码特定蛋白质的RNA分子或由多核苷酸序列编码的蛋白质的翻译。换句话说，本公开中的术语“基因表达水平”包括由感兴趣的基因编码的mRNA水平和蛋白质水平。
在本申请中，术语“多肽”,“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。为了本申请的目的，氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团连接的碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。为了本申请的目的，氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
氨基酸可包括具有非天然存在的D-手性的氨基酸，如WO01/12654中所公开，其可改善包含一个或多个此类D-氨基酸的多肽的稳定性(例如半衰期)，生物利用度和其它特征。在一些情况下，治疗性多肽的一个或多个，以及可能所有的氨基酸均具有D-手性。
氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来表示。
如本申请中所用的，“增加”或“减少”是指与比较对照，例如建立的标准对照(例如在作为对照建立的样品中发现的相关DNA或RNA或蛋白质的平均水平)相比，在量上可检测的正或负变化。增加是正变化，其通常为对照值的至少10％，或至少20％，或50％，或100％，并且可以高达对照值的至少2倍，或至少5倍，或甚至10倍。类似地，降低是负变化，其通常为对照值的至少10％，或至少20％，30％或50％，或甚至高达对照值的至少80％或90％。在本申请中以与上述相同的方式使用表示与比较基础的定量变化或差异的其它术语，诸如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示与标准对照值相比在量上变化很小或没有变化，通常在标准对照的±10％内，或在标准对照的±5％，2％内，或甚至更少的变化。
本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶生物过程，例如RNA转录、蛋白表达、细胞增殖、细胞信号转导、细胞增殖、致瘤性、转移潜能和疾病/病症的复发的任何可检测的负面影响。通常，与未施用抑制剂的对照相比，在施用抑制剂时，抑制反映为靶过程(例如，相关DNA、RNA或蛋白质的水平)中至少10％、20％、30％、40％或50％的降低。
本文所用的“多核苷酸杂交方法”是指基于其在适当杂交条件下与已知序列的多核苷酸探针形成Watson-Crick碱基配对的能力来检测预定多核苷酸序列的存在和/或数量的方法。这种杂交方法的实例包括Southern印迹，Northern印迹和原位杂交。
本文所用的“引物”是指可用于扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)中，以基于对应于目的基因的多核苷酸序列(例如相关细菌种类的DNA或RNA序列)扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的至少一种PCR引物对该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度，引物的来源和使用的方法。例如，对于诊断和预后应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10个，或15个，或20个，或25个或更多个核苷酸，尽管它可以含有更少的核苷酸或更多个核苷酸。确定引物的适当长度所涉及的因素是本领域技术人员容易知道的。在特定实施方案中使用的引物显示在本公开的表1中，其中指出了它们的特定应用。在本公开中，术语“引物对”是指与靶DNA分子的相对链或与靶DNA的侧翼待扩增的核苷酸序列的区域杂交的一对引物。在本公开中，术语“引物位点”是指与引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
“标记物”、“可检测标记物”或“可检测部分”是通过光谱、光化学、生化、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA中)、生物素、洋地黄毒苷、或半抗原，以及可通过例如将放射性组分掺入肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体而被制成可检测的蛋白质。通常可检测标记物附着于具有确定的结合特性的探针或分子(例如，具有已知的结合特异性的多肽或多核苷酸)，以便允许探针(以及因此其结合靶标)的存在易于检测。
术语“截止值”，如在评估正在测试的患者是否具有增加的结肠直肠癌风险或结肠直肠癌患者在将来的时间段内是否具有增加的来自该疾病的死亡率可能性的上下文中所使用的，是指在通过使用预定配方的特定方法(例如定量RT-PCR)处理的特定样品类型(例如粪便样品或结肠直肠癌组织样品)中，从相关miRNA种类(诸如miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-133a和miR-145b)的量计算的“综合评分”中的预定值。
本申请中使用的术语“量”是指样品中存在的感兴趣的多核苷酸或感兴趣的多肽(例如，一种或多种miRNA，如miR-21、miR-92a、miR-135、miR-133a和miR-145b)的量。这样的量可以用绝对术语表示，即样品中多核苷酸或多肽的总量，或者用相对术语表示，即样品中多核苷酸或多肽的浓度。
本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”描述了导致相关病症的任何症状的消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病症包括对该病症的治疗和预防性干预。
本文所用的术语“受试者”或“需要治疗的受试者”包括由于结肠癌的风险或实际罹患结肠癌而寻求医学关注的个体。受试者还包括当前正在进行治疗或即将开始治疗的个体，其寻求可用于进行治疗方案的选择或操作的信息。需要治疗的受试者或个体包括显示结肠癌症状或处于罹患结肠癌或其症状的风险中的受试者或个体。例如，需要治疗的受试者包括具有结肠癌的遗传倾向或家族史的个体，过去已经经历相关症状的个体，已经暴露于触发物质或事件的个体，以及罹患慢性或急性病症症状的个体。“需要治疗的受试者”可以是任何性别和处于任何年龄。在一些情况下，受试者可以是已经被诊断患有晚期结肠直肠癌(至少II期、III期、IV期或甚至更晚期，例如，具有确定的远处转移)的患者。
如本文所用，术语“约”表示数值范围，包括预定值的+/-10％。例如，“约10”意指9至11。
发明的详细描述
I.引言
所公开的主题一般涉及用于结肠直肠癌诊断和预后的方法和用于这些目的的标志物。本发明公开了一组miRNA预测和预后生物标志物，包括miRNA种类miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-133a和miR-145b中的3、4或5种，以及随后可用于评估受试者发展成结肠直肠癌的风险和评估结肠直肠癌患者由该疾病存活的可能性的方法。本发明还提供了一种通过实时聚合酶链式反应(PCR)实验的检测miRNA表达的方法，包括以下步骤：总RNA提取，设计miRNA特异性引物；miRNA逆转录；miRNA实时PCR定量。本发明使用5种特异性miRNA,即miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-133a,miR-145b作为粪便样品中的一组生物标志物用于结肠直肠癌诊断；使用4种特异性miRNA,即miR-92a,miR-21,miR-133a和miR-145b作为癌症组织样品中的一组生物标志物用于预期结肠直肠癌死亡率；以及使用3种特异性miRNA,即miR-92a,miR-21和miR-133a作为粪便样品中的一组生物标志物用于预期结肠直肠癌死亡率。
II.一般方法
实施本发明利用分子生物学领域中的常规技术。公开在本发明中使用的一般方法的基础教科书包括Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人出版，1994)).
对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些估计来自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳，测序的核酸，或公开的DNA序列。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。蛋白质大小由凝胶电泳，测序的蛋白质，衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估计。
寡核苷酸可以化学合成，例如，根据Beaucage和Caruthers,TetrahedronLett.22:1859-1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用如Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中的所描述的自动合成仪。寡核苷酸的纯化使用任何本领域已知的策略进行，例如如Pearson和Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中所描述的天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换高效液相色谱(HPLC)。
本发明中使用的感兴趣的序列，例如微小RNA的多核苷酸序列，和合成的寡核苷酸(例如引物)可以使用例如Wallace等人，Gene 16:21-26(1981)的双链模板的链终止方法来验证。
III.样品的采集和miRNA的分析
本发明涉及测量取自被测试患者的样品(例如粪便样品或结肠直肠粘膜样品(特别是癌组织样品))中发现的特定miRNA的水平或量，作为在患者中已经进行结肠直肠癌的诊断之后确定患者中结肠直肠癌的风险或来自结肠癌的死亡率可能性(或存活前景)的手段。因此，实施本发明的第一步是从测试对象获得样品，如粪便样品或结肠组织样品(如结肠癌组织样品)，并从样品中提取RNA。
A.样品的采集和制备
粪便样品或结肠直肠组织样品获自待测试疾病风险或疾病的治疗存活可能性的人。粪便样品的收集可以在诊所或患者家中进行，而结肠直肠组织样品的收集通常通过手术切除或活组织检查(例如通过结肠镜检查)进行。在获得样品后，可以在进一步制备之前根据标准程序储存样品。根据本发明，在患者粪便或结肠直肠样品(其可以取自癌组织或正常非癌组织，尤其是上皮组织如结肠粘膜)中发现的miRNA的分析可以使用已建立的技术进行。制备用于核酸提取的组织样品的方法在本领域技术人员中是熟知的，并且在本文中描述。
B.RNA的提取和定量
从生物样品中提取RNA(含有miRNA)的方法是公知的，并且在分子生物学领域中常规实施(例如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版,2001中所述的)。可遵循RNA制备的一般方法，参见例如Sambrook和Russell，同上；各种市售试剂或试剂盒，例如Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA),TRIzol LS试剂(Thermo FisherScientific,Wilmington,DE),miRNeasy Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany),OligotexDirect mRNA Kits(Qiagen,Valencia,CA),RNeasy Mini Kits(Qiagen，Hilden，Germany)和
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Series 9600TM(Promega，Madison，WI)也可用于从来自测试受试者的生物样品获得mRNA。也可以使用这些方法中的一种以上的组合。从RNA制备物中除去所有污染的DNA是必要的。因此，在扩增和定量步骤中，应仔细处理样品，用DNase彻底处理和适当的阴性对照。
一旦从样品中提取出mRNA，就可以定量任何特定miRNA种类如miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a的量。用于测定miRNA水平的优选方法是基于扩增的方法，例如通过聚合酶链式反应(PCR)，包括用于RNA定量分析的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。
在扩增之前，必须首先逆转录miRNA：必须合成靶RNA的DNA拷贝(cDNA)。这是通过逆转录实现的，其可以作为单独的步骤进行，或者在均相逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行，该反应是对用于扩增RNA的聚合酶链式反应的修改。Romero和Rotbart，DiagnosticMolecular Biology:Principles and Applications pp.401-406；Persing等人,MayoFoundation,Rochester,MN,1993；Egger等人，J.Clin.Microbiol.33:1442-1447,1995；和美国专利号5,075,212中描述了适于核糖核酸的PCR扩增的方法。
PCR的一般方法是本领域熟知的，因此在此不再详细描述。关于PCR方法，方案和设计引物的原理的综述，参见例如Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications,Academic Press,Inc.N.Y.,1990。PCR试剂和方案也可从商业供应商处获得，例如Roche Molecular Systems。
PCR最常作为用热稳定酶的自动化过程进行。在该方法中，反应混合物的温度通过变性区，引物退火区和延伸反应区自动循环。特别适用于该目的的机器是可商购的。
IV.诊断和预后方法
为了实施本发明的方法，首先分析患者粪便或结肠直肠癌组织样品以定量相关的miRNA种类(例如，miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a)。然后将每种miRNA的量输入到预定的公式中以计算每位患者的综合评分。
更具体地，基于在个体的粪便样品中发现的5种miRNA，即miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a的量，计算每个被测试结肠癌的风险的个体的C指数。C指数越高，已经患有或以后发展成结肠直肠癌的风险越高。C指数的截止值＝2.7417通常可用于确定个体是否处于升高的疾病风险中：如果人的C指数大于截止值，则他被认为具有增加的结肠癌风险。任选地，粪便免疫化学试验(FIT)，即用于检测粪便中微量血液作为结肠癌的早期迹象的筛查试验，被同时用于增强检测性能：阳性FIT试验结果指示进一步增加的疾病风险。C指数的计算如下进行：
C指数＝2(0.145*miR145+0.1262*miR133-0.5276*miR92+0.1558*miR21-0.03543*miR135+6.0898)
为了评估已经接受结肠癌诊断的患者，基于在患者的结肠癌组织样品中发现的4种miRNA,即miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a的量，计算每个被测试来自结肠癌的死亡率可能性的患者的Pm指数。Pm指数越高，在一段时间内(例如，接下来的1、2、3、4或5年或更长时间)将越不可能由结肠直肠癌存活。因此，两个个体的Pm指数值之间的比较允许确定哪个个体在下一个预定长度的时间段内更可能由该疾病存活。Pm指数的截止值＝1.92可用于一般地确定个体是否可能死于疾病：如果个体的Pm指数大于截止值，则认为他不太可能在下一个限定的时间段内由结肠癌存活。例如，对于已经接受I-IV期结肠直肠癌诊断的患者，如果他的Pm指数值小于1.92，则他有79％或更大的可能性从诊断点起存活5年或更长时间；否则，他在接下来的5年中存活的可能性仅为约47％。在另一个实例中，具有小于1.92的Pm指数值的I-III期结肠直肠癌患者，其存活5年或更长时间的机会为约85％；否则，他的5年存活机会仅为约56％。通常，对于I-III期患者，低于截止值的Pm指数表示未来5年中至少约85％的存活机会；否则，随后5年的存活机会仅为约55％。Pm指数的计算如下进行：
Pm指数＝0.03603483*miR133-0.07733817*miR92-0.34147392*miR145+0.32122176*miR21+3.9243
类似地，为了评估已经接受结肠癌诊断的患者，基于患者粪便样品中发现的3种miRNA,即miR-92a,miR-21和miR-133a的量，计算每个被测试的患者的来自结肠癌的死亡率可能性的患者的Ps指数。Ps指数越高，在一段时间内(例如，接下来的1、2、3、4或多达5年)将越不太可能从结肠直肠癌存活。因此，两个个体的Ps指数值之间的比较允许确定哪个个体在下一个预定长度的时间段内更可能由该疾病存活。Ps指数的截止值＝1.41通常可用于确定个体是否可能死于疾病：如果个体的Ps指数大于截止值，则认为他不太可能在下一个限定的时间段内由结肠癌存活。例如，对于已经接受I-IV期结肠直肠癌诊断的患者，如果他的Ps指数值小于1.41，则他有约77％的可能性从诊断点起存活5年或更长时间；否则，他在接下来的5年中存活的可能性为约49％。在另一个实例中，具有小于1.41的Ps指数值的I-III期结肠直肠癌患者，其存活5年或更长时间的机会大于约86％；否则，他5年存活的机会仅为约66％。通常，对于I-III期患者，低于截止值的Ps指数表示未来5年的至少约85％的存活机会；否则，随后5年的存活机会少得多，仅为约65％。Ps指数的计算如下进行：
PS指数＝0.2901*miR133-0.1208*miR92-0.2016*miR21+2
以下是本公开中呈现的实验数据的概述，例如，图5和6，其将个体患者中的Ps和Pm值(高于或低于截止值)与它们的5年存活相关联：
Figure BDA0002742361720000141
v.结肠癌的预防性治疗
通过说明粪便或结肠直肠粘膜样品中特定miRNA种类的存在/量与结肠癌的存在或风险的相关性，本发明提供了预防性治疗处于增加的后来发展为结肠癌的风险的患者的预防措施：一旦鉴定了这种风险患者，就可以设计预防性治疗处于增加的后来发展为结肠癌的风险的患者的预防措施。
如本文所用，结肠癌的预防性治疗包括预防或延迟疾病的一种或多种相关症状的发作，包括降低已经接受初始治疗的患者中的死亡率或疾病复发的可能性。
在通过分析取自患者的粪便或结肠粘膜样品中的5种特异性miRNA的表达模式来检测患者中升高的结肠直肠癌风险(由本发明人证实)时，可以使用另外的临床诊断方法来确认或肯定地建立患者中结肠癌的存在。在一些情况下，粪便免疫化学试验(FIT)(粪便中微量血液作为结肠癌早期迹象的筛查试验)同时用于增强检测性能。此外，可以使用更准确和可靠的筛查技术(例如结肠镜检查)来区分患者是否可能患有腺瘤，结肠癌，或者两者都不是。根据需要，外科干预和/或其它非外科治疗包括化疗，放疗和免疫治疗可由主治医师指示。当患者被认为是无癌症的但处于后来发展成结肠直肠癌的风险中时，患者可以经受替代疗法或预防/监测措施，特别是在那些适合某些概况的患者中，例如具有癌症特别是结肠癌的家族史的那些，使得这些病症的症状可以被预防、消除、改善、减轻严重性和/或频率，或延迟其发作。例如，医师可以指示进行药理学和非药理学治疗，例如生活方式改变(例如，体重减少5％或更多，采取更健康的生活方式，包括遵循高纤维/低盐/低脂肪饮食，并维持较高水平的身体活动，例如每周行走至少150分钟，并每5年定期进行筛查/检查，例如结肠镜检查)。在一些情况下，本文所述的方法可在随后的时间(例如，在初始测试后5或10年后)对同一患者实施，以监测患者状态，从而评估结肠直肠癌风险或存在的任何潜在变化。
vi.试剂盒和装置
本发明提供了用于实施本文所述的方法以评估获自受试者的样品(例如粪便样品或结肠粘膜样品)中的多种miRNA种类(例如，miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a)的水平的组合物和试剂盒。例如，测量取自患者的结肠粘膜组织样品中的miRNA水平，使得患者可以相应地被治疗，例如，如果患者被认为在随后的时间处于发展成结肠直肠癌的风险中，则患者将被给予上文和本文所述的适当的预防性治疗。
在一些实施方案中，用于进行测定特定miRNA水平的试验的试剂盒通常包括用于进行定量测定miRNA的RT-PCR的试剂：至少一种用于逆转录的寡核苷酸和至少一组用于PCR以扩增每一种miRNA序列的两种寡核苷酸引物。在一些情况下，一种或多种寡核苷酸可以用可检测的部分标记。在一些情况下，试剂盒中包括水解探针以允许扩增产物的即时定量测量。通常，水解探针具有荧光标记物和猝灭剂。表1提供了这些引物和探针的一些实例。
通常，试剂盒还包括为每个测定方法提供适当的截止值的信息。此外，本发明的试剂盒可以提供指导使用者分析测试样品和评估测试对象中结肠直肠癌的风险或来自结肠直肠癌的死亡率可能性的说明书手册。
在另一个方面，本发明还可以体现在装置或包括一个或多个这样的装置的系统中，所述装置或系统能够实施本文描述的所有或一些方法步骤。例如，在一些情况下，所述装置或系统在接收测试样品后执行以下步骤，评估患者中结肠直肠癌的风险或来自结肠直肠癌的死亡率可能性：(a)测定样品中特定miRNA种类(例如，miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a)中的每一种的量或水平；(b)基于样品中每种miRNA的水平计算每个样品的指数；(c)将所述指数与截止值或与从取自第二患者的第二样品获得的第二指数进行比较；以及(d)提供输出，所述输出指示(1)所述患者可能患有结肠直肠癌或处于随后发展成所述疾病的风险中，且因此应立即给予额外的诊断测试或接受预防性治疗，或(2)已接受结肠直肠癌诊断的患者是否比第二结肠直肠癌患者更可能在将来的时间段(例如，接下来的1、2、3、4或5年，或接下来的10、20、30、40或50个月))由癌症存活。在一些情况下，本发明的装置或系统在执行步骤(a)之后执行步骤(b)至(d)的任务，并且来自(a)的每种miRNA的量或浓度已经被输入到装置中。优选地，装置或系统是部分或完全自动化的。
实施例
以下实施例仅以说明的方式，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各个非关键参数。
实施例1
背景和目的：microRNA在结肠直肠癌(CRC)的发展中起重要作用。多种miRNA已经显示出对CRC具有诊断和/或预后价值，但是由于应用非靶向方法或单靶标检测，它们的临床应用受到限制。在本研究中，本发明人鉴定和评价了新的miRNA组在基于粪便的非侵入性诊断和基于粘膜的CRC预后中的用途。
实验设计：收集来自381名受试者(184名CRC,60名晚期腺瘤和137名对照受试者)的粪便样品和来自123名患者的原发性CRC组织。通过分析CRC中全基因组范围的miRNA表达谱来选择一组miRNA。设计了用于诊断和预后的多重RT-qPCR分析和评分算法。
结果：通过TCGA小RNA测序数据和内部miRNA阵列数据的综合分析，选择出在CRC组织中与正常结肠组织相比差异表达的5种miRNA(miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a)的组。然后，建立基于茎环和探针的多重RT-qPCR分析，以方便地定量五种miRNA。通过对来自60个CRC和60个对照粪便样品的训练群组的qPCR数据进行逻辑回归来训练组合所有5种miRNA用于CRC诊断的的评分算法(C指数)。验证群组的结果显示，在单独的miRNA中，粪便miR-92a在区分CRC患者和对照中表现最好，其中接收机工作特性曲线下面积(AUROC)为0.782(通过Youden指数法，灵敏度为71.7％，特异性为71.5％)。与单独的miRNA相比，C指数显示出显著改善的诊断性能，其中AUROC为0.849(通过ROC的成对比较，P＝0.001vs miR-92a)。特异性为80.3％时，C指数对于CRC诊断的灵敏度为81.0％，经粪便免疫化学试验(FIT)进一步提高到90.2％(P＝0.010)。对于晚期腺瘤的检测(特异性＝80.3％),C指数的灵敏度(33.3％)显著高于FIT(16.7％,P＝0.035)，并且通过与FIT组合提高到43.3％。此外，通过比例风险回归模型，开发了另一种预后评分算法(Pm指数)来组合粘膜miR-21,miR-92a,miR-145和miR-133a。Kaplan-Meier存活分析显示高Pm指数与CRC患者的缩短的存活期显著相关(HR＝3.74(95％CI:1.93至7.24),P＝9.5e-05)。多变量分析显示Pm指数是CRC患者不良存活的独立风险因素(HR＝2.53(95％CI:1.18～5.42),P＝0.017)。
结论：本研究鉴定了5种CRC相关miRNA的组，并开发了一个多重RT-qPCR和评分平台，其可方便地应用于CRC的基于粪便的非侵入性诊断和基于粘膜的预后的临床环境。
引言
结肠直肠癌(CRC)是全世界最常见的癌症之一[1]。在过去的几十年中，在亚洲的大多数发达地区，包括香港，CRC的负担已经大大增加。早期检测CRC和腺瘤已被证明可降低癌症死亡率和发病率。最广泛使用的非侵入性粪便测试是粪便免疫化学试验(FIT)，其对CRC没有显示出令人满意的灵敏度[2]并且对腺瘤不灵敏[3]。在这点上，包括靶向灵敏生物标志物以改善FIT的筛查性能的分子测试是必要的。结肠直肠肿瘤发生涉及宿主结肠直肠上皮细胞中的分子表观遗传和遗传变化。通过功能和机制研究，证实微小RNA(miRNA)在结肠直肠肿瘤发生中起到重要的致癌或抑瘤作用，诸如miR-92a[4]、miR-135b[5]、miR-21[6]、miR-145[7]和miR-133a[8]。随着结肠上皮细胞不断地脱落到腔中，可以在粪便样品中检测到这些细胞中的分子变化。miRNA在作为CRC诊断的基于粪便的生物标志物方面具有优势。已经显示miRNA保持完整和稳定用于粪便中的检测，因为它们被包装在外来体中[9]。先前的研究表明，粪便样品中的miRNA水平在室温下保持稳定72h，使得其相比粪便中的其它标志物(例如mRNA和甲基化DNA)成为更好的标志物类型[10]。粪便miRNA的定量也具有良好的再现性[10]。多种miRNA，如miR-92a,miR-21和miR-135b，已被几个研究小组单独证明可用作CRC的良好粪便诊断标志物[10-13]。值得注意的是，除了用作诊断标志物之外，miRNA也已被证明可用于CRC患者的预后预测[4，5，14-16]。然而，由于对于粪便miRNA[17]不存在合适的内部对照，因此靶向的miRNA的相对定量很大程度上取决于标准曲线方法，这使得实验繁琐。此外，单个靶标检测的应用限制了诊断或预后性能，而通过基于微阵列或测序的方法定量miRNA组显示缺乏劳动效率和成本有效性。在本研究中，对5种miRNA的组进行了鉴定，并为CRC的非侵入性诊断和预后的方便的临床应用设计了多重RT-qPCR和评分算法。
材料和方法
受试者和粪便样品收集
招募用于粪便样品收集的受试者包括呈现诸如排便习惯改变、直肠出血、腹痛或贫血等症状的个体，以及如先前的宏基因组学研究中经历筛查结肠镜检查的50岁或以上的无症状个体[18]。在结肠镜检查之前或之后一个月收集样品。排除标准包括：1)在过去3个月内进行任何侵入性医疗干预；2)具有任何癌症或炎性肠病的既往史。要求受试者在家中在标准化容器中收集粪便样品，并立即将样品储存在其家中-20℃的冰箱中。然后将冷冻的样品送到医院的绝缘聚苯乙烯泡沫容器中，并且立即在-80℃下储存直到进一步分析。通过结肠镜检查和对所取的任何活组织检查的组织病理学检查来诊断患者。从所有受试者获得知情同意书。从香港中文大学威尔斯亲王医院于2009-2014年的381名受试者中采集粪便样品，这由184名CRC患者(平均年龄66.9±11.2岁；男性112例，女性72例)；60名晚期腺瘤患者(60.0±5.9岁；男性40例，女性20例)和137名对照受试者(58.5±5.8岁；男性47例，女性90例)。研究在香港中文大学临床研究伦理委员会批准的情况下进行。
粪便RNA提取
将200至300mg(湿重)的粪便样品加入到2mL管(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE)的1mL TRIzol LS试剂中，并通过无RNA酶的研杵机械匀浆以使其完全不成形。向2mL管中加入200μL氯仿并通过摇动剧烈混合2分钟。在室温下孵育2分钟后，将TRIzol-氯仿混合物在4℃下以12,000g离心15分钟。然后将上层水相与1.5体积的100％乙醇混合并用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案纯化，通过使用无RNA酶的Dnase(Qiagen)包括DNase消化步骤。在50μL无核酸酶的水中洗脱总RNA。通过NanoDrop OneMicrovolume UV-Vis分光光度计测量RNA浓度。
组织样品采集和RNA提取
在北京大学肿瘤医院手术切除后立即收集原发性结肠直肠肿瘤组织(n＝123)。将样本在液氮中快速冷冻并在80℃下储存直至使用。所有患者获得知情同意书，并且研究方案由北京大学肿瘤医院临床研究伦理委员会批准。根据制造商的说明书(MolecularResearch Center Inc.,Cincinnati,OH)使用TRI试剂从组织样品中提取总RNA。
逆转录(RT)和qPCR的引物和探针设计
参照茎环法设计RT引物和qPCR的引物-探针组。特异性靶向所选miRNA的引物和探针列于表1中。每种探针携带5’报道染料FAM(6-羧基荧光素),VIC(4,7,2’-三氯-7’-苯基-6-羧基荧光素)，或NED以及3’非荧光猝灭剂-小沟结合剂(NFQ-MGB)。所有引物和探针在Thermo Fisher Scientific合成。
表1.引物和探针的核苷酸序列
Figure BDA0002742361720000201
miRNA的逆转录(RT)
建立了多重cDNA合成试验，使得各个样品中的不同miRNA可一起逆转录以降低实验偏差。通过比较涉及不同浓度的单引物和多引物的RT反应来优化RT引物混合物。TaqManMicroRNA逆转录试剂盒(Life Technology)用于根据制造商的方案进行cDNA合成，不同之处在于将反应体系调节至15μL并涉及靶向所有五种选择的miRNA的RT引物混合物(在最终RT反应中各13.3nM)。在每个RT反应中应用来自每个样品的100ng的总RNA，并且向15-μLcDNA产物中添加35μL无核酸酶的水并且在-20℃下储存直到使用。
通过qPCR多重定量miRNA
使用引物-探针组(0.2μM的每种引物和0.15μM的每种探针)、2μl cDNA和TaqManUniversal Master Mix II(LifeTechnology)的组合进行靶向的miRNA的qPCR反应。ABIQuantStudioTM 7Flex序列检测系统的热循环仪参数为95℃10min和(95℃15s，60℃1min)×45个循环。阳性/参考对照和阴性对照(H2O作为模板)将包括在每个实验中。对每个样品重复进行三次测量。使用序列检测软件(Applied Biosystems)分析qPCR数据，手动阈值设置＝0.04,对于miR-135b基线为2-28个循环，并且对于其它miRNA为2-15个循环。如果获得阴性对照的Cq值<42，则实验将不合格。
诊断和预后评分的计算
应用逻辑回归模型获得与对照相比用于估计CRC发病率的C指数。应用COX比例风险回归模型将多种miRNA拟合成与存活结果相关的得分(Pm指数和Ps指数；风险比的自然对数)。指数计算如下：C指数＝2(I1+β1X1+β2X2+β3X3+β4X4+β5X5)，Ps指数＝I2+βaXa+βbXb+βcXc，并且Pm指数＝I3+βiXi+βiiXii+βiiiXiii+βivXiv，其中，I表示截距，β表示回归系数，X表示相应miRNAs的Cp值。用于计算指数的编译后的MATLAB应用程序可以通过链接(将被提供)被下载。
统计分析
标志物(单独的miRNA和多个miRNA组合的指数)的水平全部表示为中值和四分位数范围[IQR]。通过Wilcoxon符号秩检验或Mann-Whitney U检验确定标志物水平的差异。使用单向ANOVA多重比较与线性趋势检验来评估疾病进展期间(从对照到腺瘤到癌症)的标志物水平的变化。通过计算接收机工作特性曲线下面积(AUROC)来分析标志物的性能，并使用德龙检验进行比较。通过使尤登指数最大化的ROC分析确定最佳的截止值(J＝灵敏度+特异性-1)[19])。使用非参数方法进行每种方法/标志物的AUROC的成对比较[20]。通过T检验比较连续的临床和病理变量，而通过卡方检验比较分类变量。斯皮尔曼相关系数被用于估计标志物和其它感兴趣的因素的关联。使用单变量和多变量逻辑回归估计与CRC诊断独立相关的因素。所有测试由Graphpad Prism 5.0(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA),Medcalc Statistical Software18.5版(Medcalc Software bvba,Ostend,Belgium；http://www.medcalc.org；2018年)或SPSS统计软件包(17.0版；SPSS,Chicago,IL)进行。P<0.05被认为是统计学显著的。
结果
通过综合分析miRNA表达谱数据对5种CRC相关miRNA的鉴定
为了鉴定用于CRC诊断的miRNA候选物，分析来自涉及不同种族的三个研究的miRNA表达图谱数据，包括来自癌症基因组图谱(TCGA)研究的小RNA测序数据集(398个结肠癌以及8个相邻的正常组织，和158个直肠癌以及3个相邻的正常组织)，由Pellatt等人进行的关于结肠癌和直肠癌的miRNA阵列数据(580个结肠癌以及413个相邻的正常组织，和341个直肠癌以及219个相邻的正常组织)[21]，以及由我们先前进行的关于CRC和晚期腺瘤的miRNA阵列数据[11](图1A)。在每个研究中将肿瘤的表达谱与的对照的表达谱进行比较之后，选择在三个研究中通常发现的在CRC中失调的miRNA进行进一步的测试。由于miR-92a和miR-17位于相同的染色体基因座，并且先前的研究已经证明miR-92a可用于CRC诊断[10]，因此选择了miR-92a。最后，选择了5种miRNA用于进一步的靶向定量，包括在CRC中3个上调(miR-92a,miR-21和miR-135b)和2个下调(miR-133a和miR-145b)的(图1B)。
用于定量miRNA组的多重RT-qPCR测定的建立
为了建立多重RT-qPCR测定，以便方便，高效地定量检测所选择的5种miRNA，采用茎环法[22]进行RT引物和qPCR引物-探针设计。利用优化的RT-qPCR平台，可以进行多重逆转录以合成所有5种cDNA。然后可以进行两次双重qPCR测定(由于缺少用于多重qPCR的市售探针)，通过双重qPCR对靶miRNA的定量与通过单重qPCR的定量具有良好相关性(图7)。然后在60个CRC和60个对照样品上测试测定。如预期的，结果显示，与对照受试者相比，CRC患者的粪便样品中miR-92a、miR-21和miR-135b显著更丰富(均P<0.0005)，而miR-133a和miR-145在癌症患者和对照受试者之间没有显示出显著差异(图2A)。
miRNA的组合显著改善了单种miRNA对CRC的诊断性能
使用逻辑回归模型，产生基于5种miRNA的C指数以将癌症患者与对照受试者区分开(图2A)。在该测试群组中，与单独的miRNA相比，C指数显示最大的AUROC。ROC曲线的成对比较也表明，组合的C指数对于诊断CRC明显优于单独的miRNA(均P<0.05；图2B)。通过改变qPCR过程中cDNA的载量以模拟实验误差(这在单独的miRNA的评价中引起了显著的比例变化)，进一步评价模板输入对C指数的影响。结果显示，在CRC中包含上调和下调的miRNA的情况下，C指数不受±30％偏差的模板输入的显著影响(图2C)。
组合的C指数在非侵入性CRC诊断中的性能
在来自184名CRC患者和137名对照受试者的粪便样品中进一步检查5种miRNA的丰度。结果证实，与对照受试者相比，CRC患者粪便样品中的miR-92a,miR-21和miR-135b显著更丰富(均P<0.0001；图3A)，而miR-133a和miR-145显示CRC患者和对照受试者之间没有差异(未显示)。在单独的miRNA中，粪便miR-92a在将癌症患者与对照受试者区分开中显示出最佳的性能，其中AUROC为0.782。在最佳的截止值时，miR-92a显示出71.7％的灵敏度和71.5％的特异性(图3B)，这类似于先前的发现[10]。基于所有5种miRNA，与单独的miRNA相比，组合的C指数显示出显著改善的CRC诊断性能(AUROC＝0.849)(通过ROC曲线的成对比较，所有P≤0.0012)。在最佳的截止值时，C指数在诊断CRC时显示出81.0％的灵敏度和80.3％的特异性(图3A和B)。相关性分析显示C指数与CRC患者的年龄或性别无关，并且与患有近端癌的患者相比，在患有远端癌的患者中是显著的。C指数显示随着癌症进展而线性增加的趋势(图3C)。这些结果表明，从miRNA组生成的C指数可用作CRC的非侵入性诊断的有用工具。
组合FIT提高C指数对CRC和晚期腺瘤的诊断能力
晚期腺瘤(AA)患者的C指数与对照受试者相比显著增加(P＝0.035；图4A)，证明miRNA组也可用于检测AA。进一步比较miRNA组和FIT的诊断性能。C指数在检测癌症(80.9％vs 70.1％,P＝0.011)和AA(33.3％vs 16.7％,P＝0.035)方面比FIT灵敏。C指数和FIT的组合进一步将针对CRC的灵敏度提高到90.2％,针对AA的灵敏度提高到43.3％(两者均为P≤0.001vs FIT)(图4A)。进一步进行了根据TNM分期子集的比较。C指数对I期癌症显示出比FIT显著更高的灵敏度(71.0％vs 41.9％,P＝0.021)，并且它们的组合显示出80.6％的进一步增加的灵敏度(P＝0.010vs FIT)。还观察到对于其他阶段的癌症，C指数与FIT相比升高的检测率，两者的组合显示出比FIT显著增加的灵敏度(均P<0.05；图4B)。这些结果表明miRNA组可以与FIT一起实施以用于对CRC和AA患者的非侵入性诊断。
用于CRC患者预后预测的粪便miRNA的组合(Ps指数)
由于先前已经报道了所有测试的5种miRNA用于CRC的预后[4,5,15,16]，进一步评价了这些miRNA的粪便丰度是否还显示预后预测价值。结果显示，单独的miRNA对患者存活均没有显示出显著的预测价值(均P>0.05；图5A,miR-135b和miR-145未示出)。然而，通过Cox比例风险回归模型对粪便miR-21,miR-92a和miR-133a的组合产生的Ps指数(P针对预后，s针对粪便)与患者存活显著相关。如Kaplan-Meier分析所示，更高的Ps指数与CRC患者的不良存活显著相关(n＝134；HR＝3.31(2.06-7.86)，经Log-rank检验P<0.0001；图5B)。相关性分析表明，Ps指数与年龄，性别，病变部位无关，但与CRC患者的TNM分期显著相关(P＝0.0004,Spearman秩相关；图5B)。由于具有远处转移的IV期患者显示出比其他阶段的患者短得多的存活，因此分析了与I期至III期患者的存活相关的风险因素。多变量Cox回归分析显示，高Ps指数是TNM I-III期CRC患者不良存活的独立风险因素(HR＝3.02(1.20～7.61),P＝0.019；图5C)。粪便样品中miRNA组的定量对于CRC患者具有预后价值。
用于CRC患者预后预测的粘膜miRNA的组合(Pm指数)
由于检测原发性肿瘤组织中的生物标志物用于预后预测是可行的，因此进一步检测了来自北京的123个原发性CRC组织群组中的5种miRNA。Cox比例风险回归分析表明，miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a的组合产生的Pm指数(m针对粘膜)可作为CRC患者存活的预后预测因子。通过Kaplan-Meier分析，高Pm指数与CRC患者不良存活显著相关(HR＝3.74(1.93～7.24),通过对数秩检验P<0.0001；图6A)。Pm指数与CRC患者的年龄或性别无关，但在远端病变中明显高于近端病变(P＝0.040)。与TNM I和II期相比，TNM III和IV期的Pm指数显著更高(P<0.0001；图6B)。多变量Cox回归分析显示，高Pm指数也是TNM I-III期CRC患者不良存活的独立风险因素(HR＝2.53(1.18～5.42),P＝0.017；图6C)。这些结果表明，miRNA组的基于粘膜的检测可以作为预测CRC患者的新工具。
讨论
在本研究中，通过对不同种族的CRC患者的小RNA测序和miRNA阵列数据的综合分析，鉴定了最有兴趣的一组5种CRC相关的miRNA，已经报道了其中单独的miRNA具有诊断和预后意义。针对所有5种miRNA的多重RT-qPCR定量开发了一个新的定量平台，包括一系列自行设计的引物和探针以及一个优化的方案。然后创建算法以计算用于诊断和预后的评分指数。与特异性和灵敏度<72％的单独的miRNA相比，涉及所有5种miRNA的粪便丰度C指数均能以>80％的特异性和灵敏度从健康受试者中区分出CRC患者。设计Ps指数和Pm指数以组合分别在粪便和组织样品中检测的3种或4种miRNA，用于CRC患者的预测。Ps指数和Pm指数均显示为CRC患者不良存活的独立风险因素。该平台涉及新的miRNA组和新的定量检测和评分方法，是高度灵敏，特异性和易于进行的。该平台被证实对于CRC和晚期腺瘤的非侵入性诊断，以及CRC患者的预后非常有用。本发明可直接用于临床实施。
miRNA的异常表达已被证明在结肠直肠癌变中起重要作用。多种miRNA，包括在本研究中应用的5种miRNA，先前已经显示可用于CRC患者的诊断和预后[4,5,10,11,14-16]。然而，由于没有合适的粪便miRNA的内部对照，因此靶向的miRNA的相对定量很大程度上取决于标准曲线方法，这使得实验繁琐。此外，标准曲线方法的精确性依赖于精确的定量和精确的装载起始材料，由于可变的污染物，这对于粪便RNA实际上是不可能的。对于组织样品中靶向的miRNA的合适的参考基因也缺乏共识。已经进行了工作以鉴定针对miRNA的合适的内源性归一化对照，从而产生了针对不同组织类型的不同对照，例如针对子宫内膜样子宫内膜癌的RNU48、U75和RNU44以及针对子宫颈样本的miR-423[23,24]。多项研究已经尝试鉴定用于CRC中miRNA定量的适当参考基因，但是迄今为止没有关于这一重要但被低估的问题的共识[25-27]。因此，采用参考基因或标准曲线的现有方法并不能令人满意。
随着健康和患病结肠细胞不断地脱落到腔中，粪便样品中患病结肠细胞中上调的miRNA的检测可能有希望用于CRC的早期诊断，而来自健康结肠细胞的miRNA可用于"标准化"来自患病结肠细胞的miRNA的相对水平。类似地，在同一原发性组织样品中检测到的致癌性miRNA和肿瘤抑制性miRNA之间的差异可以用作标志物。根据这些基本原理设计了新的方法和指数。涉及CRC中上调和下调的miRNA以及相应的评分算法消除了对现有方法中所需的内部对照和/或标准曲线的需求。
来自先前对CRC的miRNA的研究的发现显示了有限的直接临床应用价值，这是由于通过靶向定量或基于在临床环境中没有成本效益的微阵列或测序方法集中于单独的miRNA。常规的靶向定量方法，通常涉及引物特异性RT，随后为PCR扩增单独的miRNA和用于数据分析的标准曲线或参考基因，当考虑多种miRNA时是耗时和耗材的。目前可商购的通用cDNA合成测定，例如TaqManTM高级miRNAcDNA合成试剂盒，有助于单个样品中的不同的miRNA同时逆转录，但其涉及繁琐的实验程序，并且在靶向PCR之前可能需要预扩增。这种多重RT-qPCR方案与市售的用于定量五种靶miRNA的方法相比显著提高了成本效益。
由于基于来自不同种族的数据集选择了miRNA，因此预期这种新的平台可应用于不同的群体。在临床上在不同群体中实施这种新平台之前，需要验证并且可能需要确定不同的截止值。除粪便和新鲜组织样本外，该实验方案适用于来自其它样品类型如福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织块，血清/血浆等的总RNA。该平台还可用于监测治疗效果/疾病复发，并保证对这种应用价值的进一步测试。
总之，本研究建立了一个新的miRNA平台，包括一个新的5种CRC相关miRNA的组以及一个建立良好的多重定量方法和评分算法。该平台可以单独使用或与当前可用的方法(例如FIT)一起使用，用作用于CRC的非侵入性诊断的新的基于粪便的工具。该平台还可以用作新的用于CRC患者预后的基于粪便或基于组织样本的方法。
本申请中引用的所有专利，专利申请和其它出版物，包括GenBank登录号或等同物，通过引用整体并入本文用于所有目的。
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Claims (27)

1.用于评估受试者中结肠癌的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)定量测定取自所述受试者的粪便样品中miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a的表达谱；
(b)基于miR-92a、miR-21、miR-135b、miR-145和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；和
(c)确定受试者是否具有增加的结肠癌风险。
2.如权利要求1的方法，还包括进行粪便免疫化学试验(FIT)的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，当所述受试者被认为具有增加的结肠癌风险时，还包括结肠镜检查的步骤。
4.如权利要求1的方法，其中步骤(a)包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
5.如权利要求4的方法，其中聚合酶链式反应(PCR)是定量PCR。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述PCR是扩增来自miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a的逆转录序列中的每一者的多重PCR。
7.用于评估结肠癌患者的来自结肠癌的死亡率可能性的方法，包括以下步骤：
(a)定量测定取自所述患者的结肠癌组织样品中miR-92a、miR-21、miR-145和miR-133a的表达谱；
(b)基于miR-92a、miR-21、miR-145和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；和
(c)确定所述患者是否具有增加的来自结肠癌的死亡率风险。
8.如权利要求7的方法，其中步骤(a)包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
9.如权利要求8的方法，其中聚合酶链式反应(PCR)是定量PCR。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述PCR是扩增来自miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a的逆转录序列中的每一者的多重PCR。
11.用于评估结肠癌患者的来自结肠癌的死亡率可能性的方法，包括以下步骤：
(a)定量测定取自所述患者的粪便样品中miR-92a、miR-21和miR-133a的表达谱；
(b)基于miR-92a、miR-21和miR-133a中的每一种的量生成综合评分；和
(c)确定所述患者是否具有增加的来自结肠癌的死亡率风险。
12.如权利要求11的方法，其中步骤(a)包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
13.如权利要求12的方法，其中聚合酶链式反应(PCR)是定量PCR。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述PCR是扩增来自miR-92a,miR-21和miR-133a的逆转录序列中的每一者的多重PCR。
15.用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒，其包含特异性和定量检测miR-92a,miR-21和miR-133a中的每一种的试剂。
16.如权利要求15的试剂盒，其包含特异性和定量检测miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a中的每一种的试剂。
17.如权利要求15的试剂盒，其包含特异性和定量检测miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a中的每一种的试剂。
18.如权利要求15-17中任一项的试剂盒，其包含用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA中的任一种的一组寡核苷酸引物。
19.如权利要求15-17中任一项的试剂盒，其包含用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA中的任一种的一组寡核苷酸引物。
20.如权利要求15的试剂盒，其中一组两种寡核苷酸引物选自表1。
21.如权利要求15的试剂盒，其中所述试剂是特异性结合所述miRNA或来自所述miRNA的逆转录DNA的多核苷酸探针。
22.如权利要求15的试剂盒，其中所述试剂包含可检测部分。
23.如权利要求15所述的试剂盒，还包括说明书手册。
24.特异性和定量检测miR-92a,miR-21和miR-133a中的每一种的试剂在制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒中的用途。
25.特异性和定量检测miR-92a,miR-21,miR-145和miR-133a中的每一种的试剂在制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒中的用途。
26.特异性和定量检测miR-92a,miR-21,miR-135b,miR-145和miR-133a中的每一种的试剂在制备用于受试者的结肠癌诊断或预后的试剂盒中的用途。
27.如权利要求24-26中任一项的用途，其中所述试剂包含用于在RT-PCR中特异性扩增所述miRNA中的每一种的一组寡核苷酸引物。
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