CN113981096A - 一种用于诊断结直肠癌的血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents
一种用于诊断结直肠癌的血浆miRNA标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种定量检测血浆中miRNA表达水平的试剂及其在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，所述miRNA选自miRNA‑20a、miRNA‑29a、miRNA‑29b、miRNA‑92、miRNA‑125b和miRNA‑145中的一种或多种组合。本发明获得了能稳定应用于结直肠癌诊断的血浆miRNAs生物标志物的组合，该组合生物标志物在结直肠癌早期诊断中具有显著医学的价值。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，具体涉及一种用于诊断结直肠癌的血浆miRNA标志物。
背景技术
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，其已成为威胁我国居民健康的重大疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生学问题。结直肠癌的早期发现、早期诊断、早期治疗是降低死亡率和改善预后的关键。早期结直肠癌五年生存率超过70％以上，而晚期则在20％左右。欧美等西方国家近年来结直肠癌发病率和死亡率均呈现出下降趋势，表明结直肠癌筛查是降低结直肠癌发病率和死亡率的有效手段。
但通过国内外现有的筛查经验也发现了一些待完善的方面：(1)FIT是常用的非侵入式的结直肠癌筛查方法，对于结直肠癌的灵敏度和特异度较高，但是检出进展期腺瘤的效果较差，灵敏度仅为23.8％，还容易受到抗血小板药物使用带来的假阳性影响；(2) 目前肠镜检查是发现结直肠癌的金标准，但由于其侵入性较强，给受检者带来较大的生理及心理痛苦，筛查人群中肠镜的顺应性极低。根据国内已开展的结直肠癌筛查项目，初筛阳性的人群自愿接受肠镜检查的比例仅为14％-40％。因此，寻找更加有效、简单易行的结直肠癌及癌前病变早期发现检测手段是目前提高结直肠癌筛查效果的当务之急。
微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一类长度约19-25个核苷酸的非编码RNA，成熟的miRNA与靶基因3’UTR发生配对，可以导致靶基因miRNA的降解或者翻译抑制，在转录后水平发挥重要的表达调控作用，并参与肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程，从而在肿瘤的发生、发展、转移等方面扮演重要角色。miRNAs对许多结直肠癌相关重要信号通路具有调控作用，如miR-21异常表达会引起Wnt/β-catenin通路和RAS-MAPK通路过度激活，会引起TGF-β信号响应缺失，从而在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用。同时也有人群研究发现，血浆miRNA可以较好地区分结直肠癌、进展期腺瘤和健康对照。前期研究显示，单个miRNA标志物对疾病的预测能力仍然较弱，目前对结直肠癌仍缺乏具有较高预测能力的有效诊断方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明包括以下几个方面：
本发明第一方面提供一种定量检测血浆中miRNA表达水平的试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、 miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的一种或多种组合。
优选的，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、 miRNA-125b和miRNA-145中的三种以上的组合。
更优选的，所述miRNA选自(1)miRNA-20a、miRNA-29a和miRNA-29b的组合，或者(2)miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-92的组合，或者(3)miRNA-29b、miRNA-92 和miRNA-125b的组合。
优选的，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、 miRNA-125b和miRNA-145中的四种以上的组合。
更优选的，所述miRNA选自(1)miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145 的组合，或者(2)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-125b和miRNA-145的组合，或者 (3)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-145的组合，或者(4)miRNA-29a、 miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-125b的组合，或者(5)miRNA-20a、miRNA-29a、 miRNA-29b和miRNA-145的组合，或者(6)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b和 miRNA-125b的组合，或者(7)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-92的组合。
优选的，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、 miRNA-125b和miRNA-145中的五种以上的组合。
更优选的，所述miRNA选自(1)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92 和miRNA-125b的组合，或者(2)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-125b 和miRNA-145的组合，或者(3)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b 和miRNA-145的组合。
最优选的，所述miRNA为miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、 miRNA-125b和miRNA-145六种miRNA的组合。
优选的，所述的试剂盒中包含特异性扩增miRNA的引物。
本发明第二方面提供一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有特异性扩增血浆miRNA的引物，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、 miRNA-125b和miRNA-145中的一种或多种组合。
优选的，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的三种以上的组合。
更优选的，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a和miRNA-29b的组合，或者miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-92的组合，或者miRNA-29b、miRNA-92和 miRNA-125b的组合。
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本发明产生的有益效果：
本发明研究采用社区队列人群作为研究对象，充分保证人群代表性，严格确定候选 miRNA标准，筛选标准为经不同独立研究互相验证且在血浆和肿瘤组织中差异表达方向一致的miRNAs，进一步在HMDD(the Human microRNADisease Database)数据库中核实补充。基于上述方法获得一组能稳定应用于结直肠癌诊断的血浆miRNAs生物标志物，其在结直肠癌早期诊断中具有显著医学的价值。
附图说明
图1示出miRNA-19a对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图2示出miRNA-20a对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图3示出miRNA-21对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图4示出miRNA-24对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图5示出miRNA-29a对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图6示出miRNA-29b对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图7示出miRNA-92对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图8示出miRNA-106a对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图9示出miRNA-125b对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图10示出miRNA-145对结直肠癌预测价值的ROC曲线图；
图11示出本发明基本模型及加入六种miRNA组合(miRNA-20a、miRNA-29a、 miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b、miRNA-145)后对结直肠癌预测价值的ROC曲线图。
具体实施方式
试验例1、血浆miRNAs组合对结直肠癌的预测试验
1、试验对象
本试验基于2007年建立的无锡重大慢性病监测队列开展的巢氏病例对照。病例组为截止至2018年12月31日新发的结直肠癌病例，对照为根据年龄、性别进行匹配的无任何肿瘤的健康对照。最终纳入研究病例为97例，匹配对照为103例。检测的miRNA均为经不同研究报道过跟结直肠癌相关的miRNA。本次检测共10种，分别为miRNA-19a， miRNA-20a，miRNA-21，miRNA-24，miRNA-29a，miRNA-29b，miRNA-92，miRNA-106a， miRNA-125b，miRNA-145。检测所用内参为miRNA-16，每个样本检测三平行，不同样本三平行CT值变异系数从0.0001至0.088，说明检测结果稳定。样本的每种miRNA表达量用2-ΔCT计算。
2、检测方法
miRNA定量检测采用Sybrgreen荧光染料法。设置茎环结构逆转录引物，引物5‘端不成熟体miRNA 3’末端5、6个碱基互补，经逆转后cDNA模板得到增长，然后在上下游引物引发下进行定量PCR检测。
(一)Total RNA提取和质检
采用Trizol法提取total RNA，然后用分光光度计或Qubit等方法定量，用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100等方法检测其完整性。
(二)Total RNA过柱纯化
对total RNA使用mirVanaTM miRNAIsolation Kit(AM1561)进行纯化。纯化后重新定量。
(三)Total RNA逆转录反应采用颈环结构的MegaplexTM RNA逆转录引物混合物进行。
(1)逆转录反应体系的配制见下表：
(2)逆转录反应：在PCR仪上，16℃，10min；37℃，30min；65℃，5min。
(四)定量PCR反应
(1)miRNA RealTime PCR反应体系配制见下表：
(2)进行定量PCR反应，PCR仪器设置程序如下：
(五)Realtime PCR产物1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增特异性。
3、检测结果
(1)病例-对照人口学信息比较
对新发病例以及对照进行基线时情况分析，病例组与对照组在年龄、性别、吸烟、饮酒以及肥胖指标、血脂指标中无显著差异。病例组肥胖指标略高于对照组，未达到统计学意义。
(2)血浆miRNAs在病例组和对照组的比较
由于miRNA在人群分布不是正态分布，选择秩和检验比较病例组和对照组中miRNA的差异。经过秩和检验，有7个miRNA在病例和对照中存在显著差异(见下表1)，分别为miRNA-19a、miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和 miRNA-145。
表1新发结直肠癌病例与健康对照的血浆miRNA秩和检验表
| miRNA | Case(N) | Control(N) | P |
| miRNA-19a | 0.94(0.53-2.12) | 0.61(0.42-1.75) | 0.015 |
| miRNA-20a | 2.08(1.16-8.69) | 1.40(0.72-3.51) | 2.95×10<sup>-4</sup> |
| miRNA-21 | 0.18(0.01-2.30) | 0.19(0.02-1.39) | 0.865 |
| miRNA-24 | 1.36(0.33-6.56) | 0.83(0.27-4.52) | 0.467 |
| miRNA-29a | 5.39(0.84-32.38) | 1.53(0.62-6.36) | 3.66×10<sup>-4</sup> |
| miRNA-29b | 0.56(0.14-2.92) | 0.28(0.11-0.86) | 0.032 |
| miRNA-92 | 44.06(2.59-176.97) | 7.06(1.45-44.41) | 3.30×10<sup>-4</sup> |
| miRNA-106a | 1.52(0.60-4.12) | 0.96(0.48-2.75) | 0.053 |
| miRNA-125b | 0.67(0.15-4.19) | 0.28(0.07-0.72) | 6.40×10<sup>-5</sup> |
| miRNA-145 | 4.98(0.26-22.13) | 0.78(0.13-4.76) | 0.001 |
(3)不同单个miRNA对疾病预测的效应
单个miRNA对结直肠癌的预测价值通过ROC曲线下面积来反映。ROC曲线及相关数值变量由R软件进行计算。从附图1-10可以看出，不同的miRNA对疾病预测的AUC 从0.493至0.665不等，说明单个miRNA对疾病的预测能力仍然较弱。
(4)差异表达miRNA进行多因素调整
考虑到年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI等变量可能与结直肠癌发生有关，因此在使用logistic回归计算miRNA与结直肠癌发病风险时，将以上变量作为协变量进行调整。调整完年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI等变量之后，有6个miRNA(miRNA-20a、miRNA-29a、 miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b、miRNA-145)与结直肠癌发生显著相关(见表2)。
表2多因素调整后miRNA与结直肠癌发病风险的关联研究
| miRNA | OR | 95％CI | P |
| miRNA-19a | 1.08 | 0.98-1.19 | 0.137 |
| miRNA-20a | 1.03 | 1.00-1.07 | 0.043 |
| miRNA-21 | 1.02 | 1.00-1.05 | 0.067 |
| miRNA-24 | 1.00 | 0.99-1.01 | 0.445 |
| miRNA-29a | 1.06 | 1.02-1.09 | <0.001 |
| miRNA-29b | 1.23 | 1.04-1.46 | 0.014 |
| miRNA-92 | 1.004 | 1.00-1.01 | 0.002 |
| miRNA-106a | 1.03 | 0.97-1.09 | 0.283 |
| miRNA-125b | 1.36 | 1.14-1.62 | <0.001 |
| miRNA-145 | 1.03 | 1.01-1.05 | 0.003 |
(5)确定6种阳性miRNA的截断值
根据ROC曲线，当miRNA计算值所对应的灵敏度与特异度之和最大时，此时miRNA的计算值则为miRNA的截断值，即ROC曲线最左上角的点作为该miRNA的截断值(见表3)。
表3 6种阳性miRNA的截断值
| miRNA | 截断值(Cutoff) |
| miRNA-20a | 0.918 |
| miRNA-29a | 17.860 |
| miRNA-29b | 0.959 |
| miRNA-92 | 51.198 |
| miRNA-125b | 2.523 |
| miRNA-145 | 7.280 |
(6)计算组合评分对结直肠癌的预测价值
根据截断值将每种miRNA分为0和1，当研究对象某个miRNA计算值超过其截断值时，将该研究对象的此miRNA评分赋值为1，反之赋值为0。将6个miRNA全部赋值完成后，将加和计算每个个体的危险miRNA个数作为miRNA组合评分。
以组合评分得分0作为对照组，计算每组评分的OR值。下表4结果提示，随着危险miRNA个数增加，得结直肠癌的风险随之增加。
表4 miRNA组合评分对结直肠癌发病风险的预测价值
(7)组合评分的ROC曲线
如图11所示，基本模型的AUC为0.548，加上组合评分后AUC上升至0.740(P＝3.06×10-5)。其中基本模型是指仅使用结直肠癌相关的宏观信息纳入预测模型，具体模型中纳入的变量包括年龄、性别、吸烟、饮酒、BMI等变量。加上组合评分之后，模型对未来结直肠癌发病风险的预测价值显著升高(AUC由0.548上升至0.740)，显著提高模型对未来结直肠癌发病预测的灵敏度及特异度，提升了该预测模型的使用价值。
(8)不同组合阳性miRNA对结直肠癌的预测价值
针对不同的miRNA组合，依次纳入阳性miRNA，计算不同的组合模式对未来结直肠癌发病风险的预测价值。从下表5的预测价值数据可以看出，使用三种以上miRNA组合模式对结直肠癌的预测价值AUC为0.673-0.698，显著高于上述10种miRNA单独使用的预测价值(0.493-0.665)，其中最优的组合模式为6种miRNA完全纳入，该组合时对结直肠癌的预测价值最高。
表5不同miRNA组合对结直肠癌的预测价值
Claims (10)
1.一种定量检测血浆中miRNA表达水平的试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的三种以上的组合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自(1)miRNA-20a、miRNA-29a和miRNA-29b的组合，或者(2)miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-92的组合，或者(3)miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-125b的组合。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的四种以上的组合。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自(1)miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145的组合，或者(2)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-125b和miRNA-145的组合，或者(3)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-145的组合，或者(4)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-125b的组合，或者(5)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-145的组合，或者(6)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-125b的组合，或者(7)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-92的组合。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的五种以上的组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自(1)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92和miRNA-125b的组合，或者(2)miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-125b和miRNA-145的组合，或者(3)miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145的组合。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA为miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145六种miRNA的组合。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中包含特异性扩增miRNA的引物。
10.一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有特异性扩增血浆miRNA的引物，其特征在于，所述miRNA选自miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-92、miRNA-125b和miRNA-145中的一种或多种组合。
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