BR122015004941B1 - Método para detectar adenomas colorretais avançados em um sujeito humano - Google Patents

Abstract

métodos para diagnosticar ou detectar adenomas colorretais avançados e neoplasia colorretal em um sujeito humano, biomarcadores ou bioassinaturas para adenomas colorretais avançados e neoplasia colorretal, kits para diagnóstico de adenomas colorretais avançados e para uso em diagnóstico de risco de adenomas colorretais avançados e/ou neoplasia colorretal e uso do kit. a presente invenção se refere em geral ao campo da detecção de câncer colorretal, e mais particularmente, a microrna plasmáticos para a detecção de câncer colorretal precoce. especificamente, a presente invenção inclui métodos, kits e biomarcadores para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal em um sujeito humano que compreende as etapas de: um método para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal em um sujeito humano que compreende as etapas de: obter uma ou mais amostras biológicas do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal; medir um nível ou padrão de expressão global de um ou mais microrna obtidos da uma ou mais amostras biológicas do sujeito; e comparar o padrão de expressão global do um ou mais microrna da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal com o padrão de expressão global do um ou mais microrna de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal, em que a sobre-expressão de uma combinação de mir19a e mir19b, ou mir19a e mir19b e mir15b é indicativa de câncer colorretal.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisional norte-americano n.° de série 61/550.148, depositado em 21 de outubro de 2011, os conteúdos completos dos quais são incorporados no presente documento como referência.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere em geral ao campo da detecção de câncer colorretal, e mais particularmente, a microRNA plasmáticos para a detecção de câncer colorretal precoce.

DECLARAÇÃO DE PESQUISA FINANCIADA PELO GOVERNO FEDERAL

[003] Nenhuma.

INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA DE MATERIAIS DEPOSITADOS EM DISCOS COMPACTOS

[004] Nenhuma.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[005] Sem limitar o escopo da invenção, seu antecedente é descrito em relação com cânceres colorretais.

[006] O pedido de patente norte-americana n.° 20100317533 (Lou et al. 2010) proporciona um painel de biomarcadores de metástase tumoral que compreende qualquer um dos dois de anidrase carbônica-9 (CAIX), fator de crescimento endotelial vascular C (VEGF-C), efrina A5 (EFNA5), receptor de eph B2 (EPHB2), fator de crescimento transformante beta 3 (TGF-β3), piruvato desidrogenase quinase, isoenzima-3 (PDK3), anidrase carbônica-12 (CAXII), queratina 14 (KRT14), subunidade alfa do fator induzível por hipoxia 1 (HIF-Iα) ou tenascina C (TNC). CAIX, VEGF-C, EFNA5, EPHB2, TGF-β3 ou PDK3 podem ser indicadores de potencial metastático moderado, enquanto que CAXII, KRT14, HIF-1α, ou TNC podem ser indicadores de potencial metastático alto. Também se proporciona um método de determinação de risco de metástase tumoral usando os biomarcadores mencionados anteriormente. Os biomarcadores podem ser usados em diagnóstico, prognóstico, seleção de tratamento ou para testar terapêuticos putativos. Os biomarcadores podem ser usados para avaliar malignidades ou cânceres que têm regiões hipóxicas, tais como câncer de mama.

[007] O pedido de patente norte-americana n.° 20100120898 (Croce et al. 2010) revela métodos e composições para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de carcinoma hepatocelular (HCC). Também se proporcionam métodos de identificação de agentes anti-HCC. O pedido de Croce proporciona um método que diagnostica se um sujeito tem, ou corre risco de desenvolver, carcinoma hepatocelular (HCC), que compreende medir o nível de pelo menos um produto gênico de miR em uma amostra de teste do sujeito, em que uma alteração no nível do produto gênico de miR na amostra de teste, em relacão com o nível de um correspondente produto gênico de miR em uma amostra de controle, é indicativa do sujeito ou ter, ou estar correndo risco de desenvolver, HCC.

[008] A patente norte-americana n.° 7.939.255, concedida a Chung se refere a métodos de diagnóstico para câncer colorretal. Em resumo, a patente revela um método de diagnóstico e um kit para a avaliação de prognóstico de câncer colorretal (CRC) com um gene supressor de tumor a ser usado para o diagnóstico de câncer colorretal (CRC), em que o método compreende: identificar regiões recorrentemente alteradas (RAR) em um cromossomo; e detectar alterações genômicas nas RAR. Diz-se que a invenção torna possível realizar o diagnóstico precoce assim como a avaliação do prognóstico para diversos cânceres e tumores incluindo câncer colorretal (CRC).

[009] A publicação n.° WO2011076147, titulada, Plasma-Based Micro-RNA Biomarkers And Methods For Early Detection of Colorectal, depositada por Li, revela um kit de diagnóstico de marcadores moleculares em sangue para diagnosticar câncer colorretal e/ou monitorar o efeito terapêutico para tratar câncer colorretal. Diz-se que o kit compreende uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico, e cada molécula de ácido nucleico codifica para um biomarcador de microRNA, em que uma ou mais da pluralidade de moléculas de ácido nucleico são expressas diferencialmente em plasma de paciente e controle saudável, e a uma ou mais moléculas de ácido nucleico expressas diferencialmente juntas representam um biomarcador de expressão de ácido nucleico que é indicativo da presença de câncer colorretal. Diz-se que a invenção proporciona ainda correspondentes métodos que usam tais biomarcadores de expressão de ácido nucleico para identificar câncer colorretal assim como para prevenir ou tratar um estado desse tipo. Finalmente, a invenção proporciona uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou o tratamento de câncer colorretal.

[010] A publicação n.° WO2011076142, titulada, Compositions And Methods For MicroRNA Expression Profiling in Plasma of Colorectal, também depositada por Li, diz-se que ensina composições e métodos para a obtenção do perfil de expressão de microRNA (miRNA) em plasma de câncer colorretal. Em particular, diz-se que a invenção se refere a um kit de diagnóstico de marcadores moleculares em sangue para diagnosticar câncer colorretal, monitorar a terapia do câncer e/ou tratar câncer colorretal que inclui uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico, codificando cada molécula de ácido nucleico para uma sequência de microRNA, em que uma ou mais da pluralidade de moléculas de ácido nucleico são expressas diferencialmente em plasma de câncer colorretal e plasma de controle saudável, e em que a uma ou mais moléculas de ácido nucleico expressas diferencialmente juntas representam uma assinatura de expressão de ácido nucleico que é indicativa da presença de câncer colorretal. Diz-se que a invenção se refere ainda a correspondentes métodos de uso de tais assinaturas de expressão de ácido nucleico para identificar câncer colorretal assim como para prevenir ou tratar um estado desse tipo. Finalmente, a invenção se refere a uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou o tratamento de câncer colorretal.

[011] A publicação n.° WO2011088226, titulada, Detection Of Gastrointestinal Disorders, depositada por Christine, diz-se que ensina métodos e sistemas para caracterizar um fenótipo detectando microRNA, vesículas ou biomarcadores que são indicativos de doença ou progresso da doença. A doença pode ser um transtorno gastrointestinal, tal como câncer colorretal. Os microRNA, vesículas ou biomarcadores podem ser detectados em um fluido corporal.

[012] A publicação n.° WO2010004562, titulada, Methods And Compositions For Detecting Colorectal Cancer, depositada por Baruch, diz-se que ensina um método para realizar a detecção precoce minimamente invasiva de câncer colorretal e/ou de células precursoras de câncer colorretal, usando moléculas de microRNA associadas com câncer colorretal, assim como diversas moléculas de ácido nucleico relacionadas ao mesmo ou derivadas do mesmo.

[013] Finalmente, a publicação n.° WO2011012136, titulada, A Method For Classifying A Human Cell Sample As Cancerous, depositada por Fog, et al, diz-se que ensina um método para discriminar entre amostras de câncer e não câncer. Diz-se que o método compreende detectar o nível de pelo menos um microRNA (miR) selecionado do grupo I de Mir que consiste em: miR- 21, miR-34a e miR-141, e detectar o nível de pelo menos um miR selecionado do grupo II de Mir que consiste em: miR-126, miR-143 e miR- 145 em uma amostra de célula de teste e, comparar o nível de expressão de ditos miR selecionados na amostra de célula de teste com o nível de expressão dos mesmos miR selecionados em um conjunto de testes registrado anteriormente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] Em uma modalidade a presente invenção inclui um método para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal em um sujeito humano que compreende as etapas de: obter uma ou mais amostras biológicas do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal; medir um nível ou padrão de expressão global de um ou mais microRNA obtidos de uma ou mais amostras biológicas do sujeito; e comparar o padrão de expressão global do um ou mais microRNA da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal com o padrão de expressão global do um ou mais microRNA de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal, em que a superexpressão de uma combinação de miR19a e miR19b, ou miR19a e miR19b e miR15b é indicativa de câncer colorretal. Em um aspecto, o método compreende ainda a análise de pelo menos um de miR18a, miR29a ou miR335 em comparação com a expressão do sujeito normal é indicativa de neoplasia colorretal. Em outro aspecto, o método compreende ainda a análise de pelo menos um de miR29a, miR92a ou miR141. Em outro aspecto, a uma ou mais amostras biológicas são selecionadas do grupo que consiste em um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de tecido ou uma amostra fecal. Em outro aspecto, o método pode detectar CRC precoce (I-II) de maneira tão precisa como CRC avançado (fase II-III), tumores do lado direito e lesões do lado esquerdo. Em outro aspecto, o método compreende um intervalo de confiança que é 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% ou superior. Em outro aspecto, o método compreende ainda determinar o nível de expressão de microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[015] Em outro aspecto, o método compreende ainda determinar o nível de expressão de microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[016] Em outro aspecto, o nível de expressão do um ou mais microRNA é medido mediante obtenção do perfil de expressão de micro alinhamentos, PCR, PCR de transcriptase reversa, PCR em tempo real de transcriptase reversa, PCR em tempo real quantitativa, PCR de ponto final, PCR de ponto final multiplex, PCR fria, PCR gelada, espectrometria de massas, hibridação in situ (ISH), hibridação in situ multiplex ou sequenciamento de ácido nucleico. Em outro aspecto, o método é usado para tratar um paciente que corre risco ou sofre de neoplasia colorretal, selecionar uma terapia com agente antineoplásico para um paciente que corre risco ou sofre de neoplasia colorretal, estratificar um paciente em um subgrupo de neoplasia colorretal ou para um ensaio clínico de terapia de neoplasia colorretal, determinar a resistência ou receptividade a um regime terapêutico de neoplasia colorretal, desenvolver um kit para o diagnóstico de neoplasia colorretal ou qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto, o nível ou padrão de expressão global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 microRNA selecionados das tabelas 2, 3, 4 e 5, em que os microRNA aumentam a especificidade da determinação, diagnóstico ou detecção de neoplasia colorretal. Em outro aspecto, o método compreende ainda a etapa de usar o nível ou padrão de expressão global de microRNA para prognóstico, guia de tratamento ou resposta de monitoramento ao tratamento da neoplasia colorretal.

[017] Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um biomarcador para progressão de doença de neoplasia colorretal, metástase ou ambas em que o biomarcador compreende um ou mais microRNA e uma mudança na expressão global do um ou mais microRNA em células de neoplasia colorretal obtidas de um paciente é indicativa de progressão de doença de neoplasia colorretal quando se compara com a expressão global do um ou mais microRNA em células de neoplasia colorretal normais ou células de neoplasia colorretal obtidas em um ponto de tempo precoce do mesmo paciente, em que a superexpressão da combinação de miR19a e miR19b, ou miR19a e miR19b e miR15b, é indicativa de câncer colorretal. Em um aspecto, o método compreende ainda a análise de um ou mais dos seguintes microRNA miR29a, miR92a, miR141, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a ou miR335. Em outro aspecto, o biomarcador compreende ainda microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e selecionados de:

[018] Em outro aspecto, o biomarcador compreende ainda microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e selecionados de:

[019] Em outro aspecto, o biomarcador compreende ainda microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[020] Em outro aspecto, o biomarcador compreende ainda microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[021] O técnico reconhecerá que na maioria das vezes uma bioassinatura (ensaio) incluirá a combinação de microRNA tanto super como sob-expressos. Como tal, a presente invenção também inclui em um aspecto a combinação de microRNA tanto super como sob-expressos de respectivos microRNA. Em outro aspecto, as amostras biológicas são selecionadas do grupo que consiste em um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de tecido ou uma amostra fecal. Em outro aspecto, o método pode detectar CRC precoce (I-II) de maneira tão precisa como CRC avançado (fase II-III), tumores do lado direito e lesões do lado esquerdo. Em outro aspecto, o nível ou padrão de expressão global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 microRNA selecionados das tabelas 2, 3, 4 e 5, em que os microRNA aumentam a especificidade da determinação, diagnóstico ou detecção de neoplasia colorretal.

[022] Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um kit para um diagnóstico de neoplasia colorretal que compreende: reagentes detectores de biomarcador para determinar um nível de expressão diferencial de microRNA miR19a e miR19b, ou miR19a e miR19b e miR15b, em que a superexpressão de uma combinação de miR19a e miR19b, ou miR19a e miR19b e miR15b é indicativa de neoplasia colorretal, em que um intervalo de confiança para câncer colorretal é 90% ou superior. Em um aspecto, o kit compreende ainda reagentes para a detecção e análise de pelo menos um de miR18a, miR29a ou miR335. Em um aspecto, o kit compreende ainda reagentes para a detecção e análise de pelo menos um de miR29a, miR92a ou miR141. Em outro aspecto, o kit compreende ainda instruções para seu uso no diagnóstico do risco de neoplasia colorretal, em que a instrução compreende direções passo a passo para comparar o nível de expressão dos microRNA, quando se mede a expressão de uma amostra obtida de um sujeito suspeito de ter neoplasia colorretal com o nível de expressão de uma amostra obtida de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal. Em outro aspecto, o kit compreende ainda instrumentos, recipientes e reagentes necessários para obter amostras de um sujeito selecionado do grupo que consiste em um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de tecido ou uma amostra fecal. Em outro aspecto, o kit compreende ainda reagentes para a análise de microRNA que são sob- expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[023] Em outro aspecto, o kit compreende ainda reagentes para a análise de microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[024] Em outro aspecto, o kit compreende ainda reagentes para a detecção e análise do patrão de expressão ou o nível de expressão para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 microRNA é determinado para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal selecionados dos microRNA das tabelas 2, 3, 4 e 5.

[025] Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um método para selecionar uma terapia do câncer para um paciente diagnosticado com neoplasia colorretal, compreendendo o método: obter uma amostra de um sujeito que tem uma neoplasia colorretal; e determinar o nível de expressão de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a e miR335 em comparação com o nível de expressão de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal, em que a superexpressão dos microRNA é indicativa de câncer colorretal; e selecionar a terapia do câncer baseando-se na determinação da neoplasia colorretal no paciente.

[026] Outra modalidade da presente invenção inclui um método de realização de um ensaio clínico para avaliar um fármaco candidato que se acredita ser útil no tratamento de um estado patológico, compreendendo o método: (a) medir o nível de microRNA obtidos de um conjunto de pacientes, em que os microRNA são selecionados de um ou mais microRNA selecionados de microRNA miR19a e miR19b, ou miR19a e miR19b e miR15b; (b) administrar um fármaco candidato a um primeiro subconjunto dos pacientes, e um placebo a um segundo subconjunto dos pacientes; um fármaco comparador a um segundo subconjunto dos pacientes; ou uma combinação de fármacos do fármaco candidato e outro agente ativo a um segundo subconjunto de pacientes; (c) repetir a etapa (a) após a administração do fármaco candidato ou o placebo, o fármaco comparador ou a combinação de fármacos; e (d) determinar se o fármaco candidato reduz o número de células neoplásicas colorretais que têm uma mudança na expressão dos microRNA que é estatisticamente significante em comparação com qualquer mudança que ocorre no segundo subconjunto de pacientes, em que uma redução estatisticamente significante indica que o fármaco candidato é útil no tratamento de dito estado patológico.

[027] Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um método para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal em um sujeito humano que compreende as etapas de: identificar o sujeito humano que sofre de ou suspeito de sofrer de neoplasia colorretal; obter uma ou mais amostras biológicas do sujeito, em que as amostras biológicas são selecionadas de um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de tecido ou uma amostra fecal; medir um nível ou padrão de expressão global de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a e miR335; e comparar o padrão de expressão global do um ou mais microRNA da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal com o padrão de expressão global do um ou mais microRNA de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal, em que a superexpressão de microRNA: miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a e miR335, é indicativa de câncer colorretal.

[028] Ainda outra modalidade da presente invenção inclui um método para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal em um sujeito humano que compreende as etapas de: identificar o sujeito humano que sofre de ou suspeito de sofrer de neoplasia colorretal; obter uma ou mais amostras biológicas do sujeito, em que as amostras biológicas são selecionadas de um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, uma amostra de sangue, uma amostra de tecido ou uma amostra fecal; medir um nível ou padrão de expressão global de um ou mais microRNA selecionados de: 60 miRNA principais (LIMMA) AUC CI baixo CI alto Ponto de corte S Sp

em que ROC são os parâmetros de área sob a curva (AUC), CI é um intervalo de confiança de 95%, S é a sensibilidade, e Sp é a especificidade; e comparar o padrão de expressão global do um ou mais microRNA obtidos da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de neoplasia colorretal com o padrão de expressão global do um ou mais microRNA de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de neoplasia colorretal, em que uma mudança no padrão de expressão global do um ou mais microRNA na amostra biológica do sujeito é indicativa de neoplasia colorretal. Em um aspecto, os microRNA são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[029] Em outro aspecto, os microRNA são superexpressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[030] Em outro aspecto, o nível de expressão do um ou mais microRNA é medido mediante obtenção do perfil de expressão de micro alinhamentos, PCR, PCR de transcriptase reversa, PCR em tempo real de transcriptase reversa, PCR em tempo real quantitativa, PCR de ponto final, PCR de ponto final multiplex, PCR fria, PCR gelada, espectrometria de massas, hibridação in situ (ISH), hibridação in situ multiplex ou sequenciamento de ácido nucleico. Em outro aspecto, o método é usado para tratar um paciente que corre risco ou sofre de neoplasia colorretal, selecionar uma terapia com agente antineoplásico (por exemplo, agentes de reticulação de ácido nucleico, pequenas moléculas, agentes biológicos tais como anticorpos monoclonais com ou sem cargas úteis de destruição de células, tanto dirigidas como não dirigidas) para um paciente que corre risco ou sofre de neoplasia colorretal, estratificar um paciente em um subgrupo de neoplasia colorretal ou para um ensaio clínico de terapia de neoplasia colorretal, determinar a resistência ou receptividade a um regime terapêutico de neoplasia colorretal, desenvolver um kit para o diagnóstico de neoplasia colorretal ou qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto, o nível ou padrão de expressão global de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 microRNA é determinado para diagnosticar ou detectar neoplasia colorretal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] Para um entendimento mais completo das características e vantagens da presente invenção, se faz referência agora à descrição detalhada da invenção junto com as figuras adjuntas e em que:

[032] As figuras 1A e 1B mostram a expressão de miRNA diferencial mediante micro alinhamentos entre pacientes com CRC e controles do conjunto 1 (figura 1A), e entre pacientes com AA e controles (figura 1B). O mapa de calor mostra os 50 miRNA significativamente desregulados com a FC mais alta. Os pixels vermelhos correspondem a uma abundancia crescente de miRNA na amostra de plasma indicada, enquanto os pixels verdes indicam níveis de miRNA diminuídos.

[033] A figura 2 é um gráfico de análise entre grupos (BGA) que mostra a aglomeração de amostras baseada na obtenção do perfil de expressão de miRNA. Controles saudáveis (C); pacientes com câncer colorretal (CRC); pacientes com adenomas avançados (AA).

[034] A figura 3 mostra diagramas de caixa que mostram expressão de miRNA plasmático no conjunto de CRC 2 determinado por qRT- PCR. Os níveis de expressão de miRNA são normalizados a miR16 e representados como valores de -dCt. As linhas dentro das caixas indicam as medianas. As caixas marcam o intervalo entre os 25° e 75° percentis.

[035] As figuras 4A e 4B são análises de características de operação do receptor (ROC) para a assinatura de dois miRNA plasmáticos: miR19a+miR19b (figura 4A) e assinatura de três miRNA plasmáticos: miR19a+miR19b+miR15b (figura 4B) de acordo com os resultados obtidos da obtenção do perfil de micro alinhamentos no conjunto de CRC 1 e dados de qRT- PCR no conjunto de CRC 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[036] Embora a realização e uso de diversas modalidades da presente invenção sejam discutidas em detalhes a seguir, deve ser apreciado que a presente invenção proporciona muitos conceitos inventivos aplicáveis que podem ser incorporados em uma ampla variedade de contextos específicos. As modalidades específicas discutidas no presente documento são meramente ilustrativas de maneiras específicas para realizar e usar a invenção e não delimitar o escopo da invenção.

[037] Para facilitar o entendimento desta invenção, vários termos são definidos a seguir. Os termos definidos no presente documento têm significados como entendido comunmente por um técnico habitual nas áreas relevantes para a presente invenção. Os termos tais como “um”, “uma” e “o/a” não pretendem referir a só uma entidade singular, mas incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia no presente documento é usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas seu uso não delimita a invenção, exceto quando citada nas reivindicações.

[038] Abreviações: adenomas avançados, AA; área sob a curva ROC, AUC; análise entre grupos, BGA; câncer colorretal, CRC; mudança em vezes, FC; modelos lineares para dados de micro alinhamentos, LIMMA; microRNA, miRNA; curva de características de operação do receptor, curva de ROC.

[039] Tal como se usam no presente documento, os termos “câncer colorretal” e “neoplasia colorretal” incluem a definição médica bem aceita que define câncer colorretal como um estado médico caracterizado por câncer de células do tubo digestivo abaixo do intestino delgado (isto é, o intestino grosso (colo), incluindo o ceco, colo ascendente, colo transverso, colo descendente, colo sigmoide e reto) e inclui pré-câncer (também denominado no presente documento como adenomas avançados), câncer de fase precoce e fase tardia. Adicionalmente, tal como se usa no presente documento, o termo “câncer colorretal” também inclui ainda estados médicos que são caracterizados por câncer de células do duodeno e intestino delgado (jejuno e íleo).

[040] Tal como se usa no presente documento, o termo “amostra de tecido” (o termo “tecido” é usado de maneira intercambiável com o termo “amostra de tecido”) se refere a incluir qualquer material composto de uma ou mais células, ou individual ou em complexo com qualquer matriz ou em associação com qualquer produto químico. A definição incluirá qualquer material biológico ou orgânico e qualquer subporção celular, produto ou subproduto do mesmo. A definição de “amostra de tecido” deve ser entendida que inclui sem limitação esperma, óvulos, embriões e componentes do sangue. Também incluído dentro da definição de “tecido” para fins desta invenção estão determinadas estruturas acelulares definidas tais como camadas dérmicas da pele que têm uma origem acelular, mas não são mais caracterizadas como celulares. El termo “fezes” tal como se usa no presente documento é um termo clínico que se refere a fezes excretadas por seres humanos.

[041] Tal como se usa no presente documento, o termo “gene” se refere a uma unidade que codifica para um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína funcional. Tal como se entenderá pelos técnicos no assunto, este termo funcional inclui sequências genômicas, sequências de cDNA, ou fragmentos ou combinações das mesmas, assim como produto gênicos, incluindo aqueles que podem ter sido alterados pela mão do homem. Os genes purificados, ácidos nucleicos, proteína e similares são usados para referir a estas entidades quando identificadas e separadas de pelo menos uma proteína ou ácido nucleico contaminante com o que se associa ordinariamente. O termo “alelo” ou “forma alélica” se refere a uma versão alternativa de um gene que codifica para a mesma proteína funcional, mas que contém diferenças na sequência de nucleótidos relativa à outra versão do mesmo gene.

[042] Tal como se usa no presente documento, o termo “microRNA” (“miRNA” ou “miR”) se refere a um RNA (ou análogo de RNA) que compreende o produto de um gene não codificante, endógeno cujos transcritos de RNA precursor podem formar pequenas estruturas de haste e ansa das quais “miRNA” maduros são clivados por, por exemplo, Dicer. “miRNA” são codificados em genes distintos dos mRNA cuja expressão eles controlam.

[043] Tal como se usa no presente documento, “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” se refere a polinucleótidos, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), oligonucleótidos, fragmentos gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação da endonuclease e ação da exonuclease. Moléculas de ácido nucleico podem ser compostas de monômeros que são nucleótidos que se produzem de maneira natural (tal como DNA e RNA), ou análogos de nucleótidos que se produzem de maneira natural (por exemplo, formas □-enantioméricas de nucleótidos que se produzem de maneira natural), ou uma combinação de ambos. Os nucleótidos modificados podem ter alterações em restos de açúcar e/ou em restos de pirimidina ou base de purina. As modificações em açúcar incluem, por exemplo, substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halógenos, grupos alquilo, aminas, e grupos azido, ou açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, o resto de açúcar inteiro pode ser substituído com estruturas estericamente e eletronicamente similares, tais como aza-açucares e análogos de açúcares carbocíclicos. Os exemplos de modificações em um resto de base incluem pirimidinas e purinas alquiladas, pirimidinas ou purinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Os monômeros de ácido nucleico podem ser unidos por enlaces fosfodiéster ou análogos de tais enlaces. Os análogos de enlaces fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato e similares. O termo “molécula de ácido nucleico” também inclui denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que compreendem bases de ácidos nucleicos modificados ou que se produzem de maneira natural unidas a uma estrutura principal de poliamida. Os ácidos nucleicos podem ser ou monocatenários ou bicatenários.

[044] O termo “biomarcador” tal como se usa no presente documento em diversas modalidades se refere a um bioquímico específico no corpo que tem uma característica molecular particular para torná-lo útil para diagnosticar e medir o progresso da doença ou os efeitos do tratamento. Por exemplo, os biomarcadores ou metabolitos comuns encontrados em uma respiração de uma pessoa, e o estado de diagnóstico respectivo da pessoa que proporciona tal metabolito incluem, mas não se limitam a, acetaldeído (fonte: etanol, X-treonina; diagnóstico: intoxicação), acetona (fonte: acetoacetato; diagnóstico: dieta/diabetes), amoníaco (fonte: desaminação de aminoácidos; diagnóstico: uremia e doença de fígado), CO (monóxido de carbono) (fonte: CH2Cl2, % de COHb elevado; diagnóstico: poluição de ar interior), clorofórmio (fonte: compostos halogenados), diclorobenceno (fonte: compostos halogenados), dietilamina (fonte: colina; diagnóstico: supercrescimento bacteriano intestinal), H (hidrogênio) (fonte: intestinos; diagnóstico: intolerância à lactose), isopreno (fonte: ácido graxo; diagnóstico: estresse metabólico), metanotiol (fonte: metionina; diagnóstico: supercrescimento bacteriano intestinal), metiletilcetona (fonte: ácido graxo; diagnóstico: poluição de ar interior/dieta), O-toluidina (fonte: metabolito do carcinoma; diagnóstico: carcinoma broncogênico), sulfuretos e sulfuretos de pentano (fonte: peroxidação de lipídeos; diagnóstico: infarto do miocárdio), H2S (fonte: metabolismo; diagnóstico: doença periodontal/ovulação), MeS (fonte: metabolismo; diagnóstico: cirrose) e Me2S (fonte: infecção; diagnóstico: gengivite necrosante).

[045] O termo diferenças “estatisticamente significante” entre os grupos estudados se refere ao estado quando se usa a análise estatística apropriada (por exemplo, teste de Chi-quadrado, teste t) a probabilidade dos grupos serem iguais é menos de 5%, por exemplo, p<0,05. Em outras palavras, a probabilidade de obter os mesmos resultados em uma base completamente aleatória é menos de 5 em 100 tentativas.

[046] O termo “kit” ou “kit de teste” indica combinações de reagentes e adjuvantes requeridos para uma análise. Apesar de um kit de teste consistir em muitos casos de várias unidades, também estão disponíveis elementos de análise de uma peça, que também devem ser considerados como kits de teste.

[047] O termo “reação em cadeia da polimerase” (PCR) tal como se usa no presente documento se refere ao método de K.B. Mullis, patentes norte-americanas n.os 4.683.195, 4.683.202 e 4.965.188, incorporadas pelo presente documento como referência, que descreve um método para aumentar a concentração de um segmento de uma sequência alvo em uma mistura de DNA genômico sem clonagem ou purificação. Este processo para amplificar a sequência alvo consiste em introduzir um grande excesso de dois iniciadores de oligonucleótidos à mistura de DNA que contém a sequência alvo desejada, seguido por uma sequência precisa de ciclagem térmica na presença de uma DNA polimerase. Os dois iniciadores são complementários a suas respectivas cadeias da sequência alvo bicatenária. Para realizar a amplificação, a mistura é desnaturada e os iniciadores então se hibridam em suas sequências complementárias dentro da molécula alvo. Após a hibridação, os iniciadores são estendidos com uma polimerase de modo que forma um novo par de cadeias complementárias. As etapas de desnaturação, hibridação de iniciador e extensão de polimerase podem ser repetidas muitas vezes (isto é, desnaturação, hibridação e extensão constituem um “ciclo”; podem ter numerosos “ciclos”) para obter uma alta concentração de um segmento amplificado da sequência alvo desejada. O comprimento do segmento amplificado da sequência alvo desejada é determinado pelas posições relativas dos iniciadores com respeito entre si, e, portanto, este comprimento é um parâmetro controlável. Em virtude do aspecto de repetição do processo, o método é denominado como a “reação em cadeia da polimerase” (a seguir no presente documento PCR).

[048] Tal como se usa no presente documento, um ou mais microRNA podem ser medidos mediante obtenção do perfil de expressão de micro alinhamentos, PCR, PCR de transcriptase reversa, PCR em tempo real de transcriptase reversa, PCR em tempo real quantitativa, PCR de ponto final, PCR de ponto final multiplex, PCR gelada, espectrometria de massas, hibridação in situ (ISH), hibridação in situ multiplex ou sequenciamento de ácido nucleico. Sem embargo, outras técnicas para determinar a expressão de microRNA podem ser usadas tal como ressonância plasmônica de superfície, efeitos de ressonância por fluorescência (transferência, extinção e variantes dos mesmos), ou a próxima geração de qualquer uma das técnicas listadas anteriormente e combinações das mesmas, todas as quais estão dentro do escopo da presente invenção. O nível de expressão global do um ou mais microRNA pode ser usado para aumentar a sensibilidade e qualidade da determinação da presença da neoplasia colorretal. Por exemplo, é normal que um aumento na sensibilidade venha acompanhado por um aumento no número de microRNA medidos, por exemplo, quantos mais microRNA são medidos (por exemplo, 2 frente a 8 ou 15 frente a 30) há um aumento concomitante na qualidade da determinação tal como é bem conhecido pelos técnicos na área de níveis de expressão. O técnico reconhecerá que na maioria das vezes uma bioassinatura (ensaio) incluirá a combinação de ambos os microRNA super e sob-expressos. Como tal, a presente invenção também inclui em um aspecto a combinação de ambos os microRNA super e sob-expressos de respectivos microRNA.

[049] A presente invenção pode ser usada para o diagnóstico e o tratamento de pacientes, que inclui ou pode ser estendido ao prognóstico, guia de tratamento, resposta de monitoramento ao tratamento, uso em ensaios clínicos, pesquisa e combinações dos mesmos. O técnico reconhecerá que a detecção dos microRNA identificados no presente documento pode ser usada para qualquer um destes usos.

[050] Os microRNA (miRNA) são moléculas de RNA não codificantes pequenas, endógenas, conservadas de maneira evolucionária de 20-22 nucleótidos que funcionam como reguladores da expressão gênica. Provas recentes mostram que miRNA regulam diversos processos celulares cruciais tais como desenvolvimento, diferenciação, proliferação e apoptose. Pensa-se que desempenham um papel importante na iniciação e progressão de câncer humano, atuando como oncogenes ou supressores tumorais [l].

[051] Foram observadas mudanças nos perfis de expressão de miRNA em diversos tecidos em uma variedade de patologias humanas incluindo câncer. Até a data, cada tipo de tumor analisado mediante obtenção do perfil de tecido de miRNA tem mostrado perfis de miRNA significantemente diferentes em comparação com células normais do mesmo tecido [2-4]. Além disso, alguns relatórios recentes tem demonstrado que miRNA estão presentes no soro e plasma de seres humanos e outros animais [5-7]. Os níveis circulantes de miRNA são bastante estáveis, reproduzíveis e consistentes entre indivíduos da mesma espécie [5]. Portanto, a obtenção do perfil de expressão de miRNA circulantes mostra grande promessa como uma estratégia não invasiva nova para o diagnóstico de câncer e outras doenças.

[052] O câncer colorretal (CRC) é o segundo câncer mais comum em países ocidentais, e representa a segunda causa principal de morte relacionada com câncer [8]. Felizmente, há prova que o exame de indivíduos com risco médio pode dar como resultado redução de mortalidade e incidência mediante detecção de câncer precoce e retirada de lesões precursoras de câncer [9]. De fato, o objetivo dos programas de exame é a detecção de CRC de fase precoce e adenomas avançados (AA) que são lesões pré-malignas associadas com um alto risco de progressão a uma lesão invasiva.

[053] Atualmente, não existe uma estratégia ótima e aceita universalmente para o exame de CRC [10, 11] e testes com base fecal são dificultados pela sua sensibilidade limitada, a colonoscopia constitui um enfoque invasivo [12]. Portanto, novos enfoques que podem complementar e melhorar as estratégias atuais são urgentemente necessários. Neste sentido, estudos anteriores encontraram que alguns miRNA são aumentados em plasma de pacientes com CRC, o que sugere um papel potencial como biomarcadores não invasivos (13-16). Sem embargo, todos deles foram limitados à análise de um pequeno número de miRNA. Consequentemente, é obrigatório caracterizar adicionalmente a obtenção do perfil de miRNA plasmáticos mediante técnicas de alto rendimento e avaliar suas características de funcionamento na detecção de indivíduos que abrigam CRC e/ou lesões percussoras de câncer. No presente estudo, realizou-se a obtenção do perfil de miRNAs plasmáticos mediante micro alinhamentos em um conjunto de pacientes com CRC ou AA, e indivíduos saudáveis, identificando um grupo de miRNA que podem detectar pacientes com neoplasia colorretal com alta capacidade discriminativa. A validação em uma coorte independente de indivíduos e o uso de uma tecnologia diferente permite confirmar 6 miRNA plasmáticos como biomarcadores muito promissores para o diagnóstico não invasivo de CRC.

[054] Os miRNA circulantes mostram grande promessa como biomarcadores novos para o diagnóstico de câncer e outras doenças. Novos enfoques não invasivos que podem complementar e melhorar as estratégias atuais para o exame de câncer colorretal (CRC) são urgentemente necessários. A obtenção do perfil de expressão de miRNA plasmáticos de genoma completo foi realizado por micro alinhamentos em um conjunto de indivíduos (n=61) incluindo pacientes com CRC ou com lesões pré-malignas tais como adenomas colorretais avançados (AA), e sujeitos saudáveis. qRT-PCR em tempo real foi usada para validar a expressão de miRNA selecionados em uma coorte independente de pacientes de outro hospital (n=135). Pacientes com CRC ou AA mostraram perfis de expressão de miRNA plasmáticos significantemente diferentes em comparação com os controles. Um grupo de 13 miRNA foi selecionado para ser validado em uma coorte independente de pacientes, e 6 deles foram confirmados que são superexpressos significantemente no grupo CRC, mostrando uma alta precisão discriminativa. Um destes 6 miRNA foi confirmado para ser também superexpresso significantemente em pacientes com AA, com uma moderada capacidade discriminativa.

[055] Um total de 273 sujeitos de dois hospitais (Hospital Clinic de Barcelona, Catalunha, Espanha e Hospital Donostia, Guipúscoa, Espanha) foi incluído prospectivamente neste estudo. Deles, 77 foram excluídos devido a que eles satisfaziam qualquer um dos seguintes critérios: diagnóstico clínico de polipose adenomatosa familiar ou síndrome de Lynch, presença de mais de 10 adenomas colorretais, diagnóstico de câncer em outros lugares no momento da seleção, apresentar doença inflamatória intestinal, experimentar quimioterapia ou terapia por radiação no momento da coleta de sangue, exame no intestino incompleto, preparação do intestino inadequada na colonoscopia de diagnóstico, ou presença de hemólise em amostras de plasma. Finalmente, 196 indivíduos foram incluídos: 123 pacientes recém- diagnosticados com neoplasia colorretal esporádica (63 com CRC e 40 com AA) e 73 indivíduos saudáveis sem história pessoal de nenhum câncer e com uma recente colonoscopia que confirma a carência de lesões neoplásicas colorretais. Pacientes com AA foram aqueles com adenomas que têm um tamanho de pelo menos 10 mm ou que têm histologicamente displasia em alto grau ou >20% de componente viloso. Estes indivíduos foram divididos em dois conjuntos diferentes e não relacionados: conjunto 1, 61 sujeitos do Hospital Clinic de Barcelona, que foram empregados para realizar a obtenção do perfil de expressão de microRNA plasmático de genoma completo; e conjunto 2, 135 sujeitos do Hospital Donostia, que foram recrutados para validar adicionalmente os resultados obtidos no conjunto 1. As características de participantes são mostradas na tabela 1. As amostras de sangue foram recolhidas antes da endoscopia ou cirurgia em todos os indivíduos.

[056] O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Clinic de Barcelona (data de aprovação: 03/26/2009), e o consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes de acordo com a Declaração de Helsinki.

[057] Extração de RNA de amostras de plasma. Vinte ml de sangue total de cada participante foram coletados em tubos EDTA. Amostras de sangue foram colocadas a 4°C até a separação do plasma, e o plasma foi congelado dentro de 6 horas da coleta de sangue. Em resumo, as amostras foram centrifugadas a 1.600 x g durante 10 min. a 4°C para sedimentar por centrifugação as células sanguíneas, e o plasma foi transferido a novos tubos, seguido por centrifugação adicional a 16.000 x g durante 10 minutos a 4°C para remover completamente componentes celulares. Então o plasma foi divido em alíquotas e armazenado a -80°C até o seu uso. O RNA total que contém RNA pequenos foi isolado de 550 μl de plasma usando reagente Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) e kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações. O reagente Trizol LS foi adicionado às amostras de plasma em uma razão volumétrica 2:1. Após a separação de fases mediante adição de clorofórmio e centrifugação, a fase aquosa foi separada em um novo tubo e um volume de Trizol LS foi adicionado adicionalmente. Após a segunda separação de fases 1,5 volumes de etanol a 100% foram adicionados à fase aquosa e a mistura foi carregada em uma coluna miRNeasy, de acordo com as instruções do fabricante. O tratamento com DNase (Qiagen) foi levado a cabo para remover qualquer DNA contaminante. O volume de eluição final foi de 30 μl. A concentração de RNA foi quantificada usando NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, DE) em todas as amostras e oscilou entre 3 e 35 ng/μl. O processo de extração foi repetido para cada amostra até obter uma quantidade de RNA suficiente para as próximas etapas.

[058] Obtenção do perfil de miRNA plasmáticos de genoma completo mediante micro alinhamento. A obtenção do perfil de expressão de miRNA foi realizada em todas as amostras do conjunto 1 usando o ensaio de obtenção do perfil de expressão de microRNA baseando-se na plataforma SAM- Bead Array (Illumina, Inc. San Diego, CA). Este micro alinhamento contém 1.146 sondas, incluindo 743 miRNA validados, que detectam ao redor de 97% dos miRNA humanos anotados na base de dados miRBase Sanger v.12.0. O ensaio de micro alinhamento de miRNA foi realizado usando 200 ng de RNA total por amostra. Todas as etapas foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante, tal como foi descrito anteriormente [13,14]. Os dados foram extraídos usando o software de análise dados BeadStudio e transformados na escala log base 2. Os dados de micro alinhamento de todas as amostras foram normalizadas por quantiles usando o pacote de biocondutor Lumi [15].

[059] Análise de expressão de miRNA mediante qRT-PCR em tempo real. A expressão de miRNA foi analisada mediante qRT-PCR em tempo real com um processo de pré-amplificação multiplex anterior. Em resumo, 21 ng de RNA plasmático foram retrotranscritos com uma mistura de iniciadores Megaplex RT (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) e pré-amplificados com iniciadores Megaplex PreAmp e mistura mãe TaqMan PreAmp (Applied Biosystems Inc.) durante 14 ciclos. A expressão de cada miRNA foi avaliada mediante qPCR usando ensaios de miRNA TaqMan (Applied Biosystems Inc.) em um sistema de PCR em tempo real Viia7 (Applied Biosystems Inc.). Vários RNA nucleares pequenos de manutenção putativos foram analisados com o fim de determinar o mais adequado nas amostras (RNU6B, miR16, miR423-5p, RNU48, miR544, miR103, miR525, miR451). MiR16 apresentou a abundância e estabilidade mais altas e, portanto, os níveis de expressão de miRNA foram normalizados a miR16 como controle interno de acordo com outras publicações [16, 17]. Os valores de Ct foram calculados a partir de limiar automático. Nenhum controle de modelo mostrou amplificação. Três repetições técnicas foram incluídas para cada ponto de qPCR. Os níveis de expressão relativos de miRNA selecionados foram calculados para cada amostra como valores de ΔCt [ΔCt = Ct de miRNA alvo - Ct de miRNA de controle interno].

[060] Análise estatística. Um modelo linear para dados de micro alinhamento (LIMMA) foi usado para identificar miRNA expressos diferencialmente entre grupos. LIMMA usa modelos lineares e estatística F e estatística t moderada pareada com Bayes empíricos [18]. Os miRNA mais significantes que usam estatística F foram usados para realizar análise de correspondência tal como se implementa na função de análise entre grupos (BGA) incluída no pacote made4 [19]. Este método pode visualizar dados altamente dimensionais (tal como medições de expressão múltiplas) em um gráfico 2D em que as áreas delimitadas pelas elipses representam 95% da distribuição binormal estimada da pontuações da amostra nos eixos primeiro e segundo [20]. Os diagramas de Venn foram feitos considerando como um acerto só miRNA com uma mudança em vezes absoluta superior a 1,5 e um valor de p moderado <0,05 (VennCounts e VennDiagram do pacote LIMMA). As variáveis quantitativas foram analisadas usando o teste t de Student. Um valor de p de dois lados <0,05 foi considerado como significante. A avaliação de previsibilidade de miRNA individuais e combinações de miRNA diferentes, ajustados por idade e gênero, foram calculados usando regressão logística (distribuição binomial GLM). Os gráficos de análise de ROC e pontos de corte derivados, assim como parâmetros de precisão discriminativos globais, foram computados usando o pacote DiagnosisMed R. A sensibilidade e especificidade foram calculadas a partir do ponto de corte ótimo associado com a distância mínima entre a curva de ROC e a esquina esquerda superior.

[061] Obtenção do perfil de miRNA de genoma completo em amostras de plasma de pacientes com câncer colorretal. A expressão de miRNA plasmáticos discrimina pacientes com câncer colorretal de indivíduos saudáveis. Para avaliar a obtenção do perfil de expressão de miRNA circulante diferencial entre pacientes com CRC e indivíduos saudáveis, os experimentos de micro alinhamento de miRNA foram realizados em RNA total obtido de amostras de plasma de 21 pacientes com CRC e 20 controles saudáveis. Para investigar adicionalmente se os patrões de expressão de miRNA alterados foram encontrados em pacientes com lesões percussoras de câncer colorretal, também foram realizados experimentos de micro alinhamento de miRNA em RNA plasmático de 20 pacientes com adenomas colorretais avançados (AA).

[062] Uma análise estatística comparativa inicial que emprega LIMMA produziu um total de 93 miRNA significantemente desregulados (p<0,05) em pacientes com CRC em comparação com indivíduos saudáveis, e 125 miRNA quando pacientes com AA foram comparados com controles saudáveis. Todos os dados de micro alinhamento estão disponíveis em GEO (número de acesso: GSE 25609). As figuras 1A e 1B mostram mapas de calor incluindo os 50 miRNA com a mudança em vezes significante mais alta entre pacientes com CRC e controles (figura 1A), e entre pacientes com AA e controles (figura 1B). As diferenças em mudança em vezes e valores de p, assim como os correspondentes parâmetros de previsibilidade para estes miRNA em CRC ou AA, são mostrados nas tabelas 2-3 e 4-5, respectivamente. Então o gráfico de BGA foi realizado para representar visualmente a proximidade entre pacientes que abrigam CRC ou AA, e controles de acordo com expressão de miRNA plasmáticos. Tal como se representa na figura 2, pacientes com CRC ou AA, e indivíduos saudáveis apareceram como três grupos claramente separados. As especificidades de expressão de miRNA de cada tipo de lesão neoplásica também foram analisadas, isto é, CRC e AA, em comparação com amostras de controle usando análise de Venn (figura 2). Foi encontrado que um subconjunto de 21 e 28 miRNA foram exclusivamente e significantemente regulados por incremento em pacientes com CRC e AA, respectivamente, enquanto que ambos os tipos de pacientes neoplásicos compartiram 24 miRNA significantemente regulados por incremento. Portanto, cada lesão neoplásica colorretal tem um perfil de expressão de miRNA particular, mas ambos deles também compartem um importante número de miRNA desregulados, o que poderia permitir a identificação de ambas as lesões usando um teste simples baseado em uma assinatura de miRNA plasmáticos comum. TABELA 2. PARÂMETROS DE MUDANÇA EM VEZES E VALOR DE P PARA OS 50 MIRNA DESREGULADOS PRINCIPAIS EM CRC QUE MOSTRAM AS MUDANÇAS EM VEZES MAIS ALTAS.

[063] Validação de expressão de miRNA plasmáticos mediante qRT-PCR em tempo real. Os resultados de expressão de miRNA plasmáticos baseados em micro alinhamento são reproduzíveis tecnicamente. Inicialmente, uma qRT-PCR em tempo real foi realizada para confirmar resultados de micro alinhamento em 28 amostras selecionadas de maneira aleatória do conjunto 1 (19 pacientes com neoplasmas colorretais e 9 controles saudáveis). Para estes estudos, um total de 14 miRNA candidatos foram selecionados. Doze miRNA candidatos (miR17-5p, miR92a, miR19b, miR18a, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24, miR335, miR424 e miR15b) foram eleitos para estarem presentes nos 50 miRNA desregulados principais em CRC e/ou AA e para terem uma intensidade de micro alinhamento de log base 2 >8. Dois miRNA adicionais (miR19a e miR20a) também foram selecionados para fazer parte do aglomerado miR17-92, um dos melhores aglomerados de miRNA oncogênicos caracterizados, apesar de não satisfazerem os critérios anteriores. Em geral, os resultados de qRT-PCR e micro alinhamento foram correlacionados (dados não mostrados) exceto para miR424 que não mostrou nenhuma amplificação mediante qRT-PCR e, portanto, foi excluído da análise posterior.

[064] Seis microRNA plasmáticos foram confirmados que são superexpressos em pacientes com CRC de uma coorte independente. Em segundo lugar, os 13 miRNA candidatos que mostraram amplificação adequada na fase anterior foram analisados (miR92a, miR17-5p, miR18a, miR19a, miR19b, miR20a, miR15b, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24 e miR335) em plasma de um conjunto independente de 42 pacientes com CRC e 53 controles saudáveis, para validar os resultados mediante qRT-PCR em tempo real.

[065] De maneira interessante, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a e miR335 foram confirmados que são significantemente regulados por incremento em pacientes com CRC (figura 3). Além disso, miR-24 também foi superexpresso neste grupo de pacientes, mas sem alcançar significância estatística (p=0,08). Notavelmente, os miRNA validados neste segundo conjunto também demonstraram uma alta precisão na discriminação de CRC de controles saudáveis com áreas sob a curva de ROC (AUC) que oscilam entre 0,8 (CI de 95%: 0,71-0,89) e 0,7 (CI de 95%: 0,59-0,80). A seguir, procurou-se observar se qualquer combinação destes miRNA poderia melhorar a precisão discriminativa na detecção de CRC em relação com cada um deles sozinho. Entre as combinações que mostram a melhor capacidade discriminativa destacavam as assinaturas miR19a + miR19b, e miR19a + miR19b + miR15b (tabela 6; figura 4). Finalmente, foi explorada a capacidade preditiva destas assinaturas em pacientes com CRC precoce (TNM I-II) e avançado (TNM III-IV). Tal como se expõem na tabela 2, ambas as assinaturas mostraram uma alta precisão discriminativa em ambos os casos precoce e avançado. De maneira similar, foi examinado se estas assinaturas também puderam detectar tumores do lado direito de maneira tão precisa como os do lado esquerdo, e foi o caso para ambos (tabela 2). TABELA 6. PREVISIBILIDADE DAS MELHORES ASSINATURAS DE MIRNA PLASMÁTICOS EM PACIENTES COM CRC DO CONJUNTO 2.

[066] Os parâmetros da curva de ROC (área sob a curva (AUC) e um intervalo de confiança (CI) de 95% são mostrados para todos os casos de CRC assim como para diferentes fases tumorais (I/II e III/IV) e localizações (direita e esquerda, em relação com a flexura esplênica)).

[067] Um microRNA de plasma foi confirmado que é aumentado em pacientes com adenomas colorretais avançados. Com o fim de avaliar se qualquer um dos miRNA plasmáticos encontrados superexpressos em ambos os conjuntos de pacientes com CRC também foram aumentados em pacientes que abrigam lesões percussoras de câncer, que foram analisadas mediante qRT-PCR em tempo real em amostras de plasma de uma coorte independente de 40 pacientes com AA e 53 controles saudáveis. O miR18a foi confirmado que é superexpresso significantemente em este segundo conjunto de pacientes com AA em comparação com controles, como era no primeiro conjunto (figura 1B). Sem embargo, embora este miRNA mostrasse uma boa capacidade discriminativa no primeiro conjunto de pacientes com AA (AUC: 0,84, CI de 95%: 0,72-0,96, S: 80%, Sp: 80%), este parâmetro foi inferior no segundo conjunto de pacientes (AUC: 0,64, CI de 95%: 0,52-0,75, S: 72%, Sp: 57%).

[068] Neste estudo, os inventores realizaram uma obtenção do perfil de miRNA de genoma completo mediante micro alinhamentos em amostras de plasma de pacientes com CRC ou AA, e indivíduos saudáveis. Estes resultados mostram que a expressão de miRNA plasmáticos pode discriminar entre pacientes com neoplasia colorretal e sujeitos controle, o que sugere seu valor potencial para a detecção não invasiva destas lesões. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que analisa a expressão de genoma completo de miRNA plasmáticos em pacientes com CRC e AA mediante uma tecnologia de alto rendimento e, então, validação dos resultados em uma coorte independente, externa. Baseando-se nesta análise de alto rendimento, foi identificado um grande número de biomarcadores de miRNA plasmáticos putativos úteis para detectar pacientes que abrigam CRC ou AA. Além disso, foi confirmada a alta capacidade de discriminação entre indivíduos com CRC e indivíduos saudáveis de seis microRNA plasmáticos em uma coorte diferente e usando uma tecnologia diferente. Vale a pena mencionar que cinco destes miRNA (isto é miR19a, miR19b, miR18a, miR15b e miR335) representam biomarcadores novos, não informados anteriormente.

[069] A recente descoberta de miRNA estáveis em plasma e outros fluidos abriu a possibilidade de usar estas moléculas como biomarcadores de doença, e vários estudos avaliaram esta estratégia em diferentes configurações. Em câncer humano, este enfoque é realmente promissor devido a que a análise de miRNA circulantes relacionados com tumor poderia provavelmente poder detectar neoplasia de um modo não invasivo. Sem embargo, enquanto a maioria dos estudos de obtenção do perfil de expressão de miRNA em câncer tem sido realizados usando amostras de tecido, só um número limitado deles tem sido focado no valor potencial de miRNA circulantes em diagnóstico e prognóstico [21-23]. Notavelmente, o uso de miRNA como biomarcadores parece ser uma melhor estratégia que marcadores de RNA ou proteína devido à alta estabilidade destas moléculas, inclusive na presença de RNAse [23].

[070] Até agora, só poucos estudos analisaram a expressão de alguns miRNA plasmáticos candidatos em CRC. Inicialmente, Ng et al. encontraram mediante análise de qRT-PCR que dois miRNA plasmáticos (isto é, miR17-3p e miR92a) foram elevados significantemente em pacientes com CRC em comparação com sujeitos controle. Sem embargo, sua análise inicial foi limitada a 95 miRNA em 10 amostras de plasma (cinco pacientes com CRC e cinco indivíduos saudáveis). Mais importante, este estudo só avaliou a utilidade potencial de miRNA plasmáticos no diagnóstico de CRC, mas não na identificação de lesões precursoras [24]. Pouco tempo depois, Huang et al. notificaram a utilidade potencial de 2 miRNA plasmáticos -miR29a e miR92a- para detectar pacientes tanto com CRC como AA. Sem embargo, esta análise por qRT-PCR foi restrita a 12 miRNA selecionados com base nos relatórios anteriores. Pu et al. analisaram mediante qRT-PCR a expressão de três miRNA em amostras de plasma de pacientes com CRC que notificam uma superexpressão significante de miR221, mas pacientes com AA não foram incluídos neste estudo [25]. Finalmente, Cheng et al. notificaram uma regulação por incremento significante de níveis de plasma de miR141 em pacientes com CRC metastático após analisar a expressão de três miRNA [26].

[071] O estudo foi para realizar uma obtenção do perfil completa de miRNA circulantes usando tecnologia de alto rendimento em pacientes com CRC e AA, com o fim de identificar aqueles miRNA plasmáticos com utilidade potencial como biomarcadores para o diagnóstico de pacientes com estas lesões. Entre os 743 miRNA analisados, encontraram 95 miRNA circulantes desregulados significantemente em pacientes com CRC, e 125 em pacientes com AA, alguns deles mostrando uma boa capacidade discriminatória. É importante mencionar que entre aqueles miRNA regulados por incremento significantemente na análise de micro alinhamento os presentes inventores não só confirmaram os miRNA plasmáticos relacionados com CRC em estudos anteriores, tais como miR29a, miR92a e miR141, mas também notificaram novos miRNA candidatos com implicação potencial em carcinogênese de CRC. Além disso, entre estes miRNA superexpressos, foram encontrados todos os membros do aglomerado miR17-92 (miR17, miR92a, miR19a, miR19b, miR18a e miR20a) e dois membros do aglomerado miR106b-25 (miR-25 e miR93), um aglomerado caracterizado de maneira menos extensiva parálogo a miR17-92 em mamíferos. Estes achados destacam o aglomerado miR17-92 como um ator central em carcinogênese colorretal. O aglomerado miR17-92, também designado como oncomiRl, é um dos aglomerados de miRNA oncogênicos melhor caracterizados [27,28]. Neste sentido, tem sido sugerido que o aumento na instabilidade cromossômica, responsável pela progressão desde adenoma até adenocarcinoma, não só conduz a regulação por incremento de oncogenes, mas também causa superexpressão de miRNA críticos, incluindo o aglomerado miR17-92 [29].

[072] Os presentes inventores demonstraram que alguns dos miRNA regulados por incremento no primeiro conjunto de pacientes com CRC (isto é, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a e miR335) também foram superexpressos em uma coorte independente. Notavelmente, estes miRNA validados mostraram uma alta precisão discriminativa para CRC e várias combinações de estes miRNA melhoraram a capacidade discriminativa de qualquer um destes miRNA sozinhos. Além disso, puderam detectar CRC precoce (I-II) de maneira tão precisa como CRC avançado (fase II-III), assim como tumores do lado direito de maneira tão precisa como lesões do lado esquerdo. Estes resultados apontam a utilidade potencial destes miRNA plasmáticos como novos biomarcadores não invasivos para o diagnóstico de CRC.

[073] Quanto a lesões percussoras de câncer colorretal, foi encontrado que só um dos seis miRNA superexpressos em CRC (miR-18a) foi confirmado que é superexpresso significantemente nas duas coortes independentes de pacientes com AA. Embora miR-18a mostrasse uma capacidade discriminativa bastante boa no primeiro conjunto de pacientes, esta capacidade foi moderada na segunda coorte. De fato, na coorte de pacientes com AA analisados por Huang et al. dois miRs plasmáticos (miR-29a e miR-92a) mostraram precisão bastante boa na discriminação de AA de controles [16]. Estes dois miRNA plasmáticos também foram superexpressos de maneira significante na primeira coorte de pacientes com AA, mas não no segundo conjunto. Uma explicação potencial para esta discrepância entre ambos os conjuntos de pacientes poderia ser as características menos avançadas de AA nas segundas coortes de pacientes (tabela 1). Em conjunto, estes resultados indicam que a avaliação da utilidade de microRNA plasmáticos em pacientes com AA constitui uma linha de pesquisa interessante e merece investigação adicional. Atualmente, a detecção de AA permanece um grande desafio para as estratégias de exame de CRC não invasivas. De fato, vale a pena mencionar que o teste imunoquímico fecal, uma estratégia atualmente aceita para o exame de CRC não invasivo na população com risco médio, mostra um bom rendimento para o diagnóstico de CRC, mas ignora quase 50% de AA, como foi demonstrado recentemente em um estudo do presente grupo [12].

[074] De maneira interessante, foi notificado anteriormente que todos os miRNA validados neste estudo são superexpressos em amostras de tecidos de pacientes com CRC [30-34]. Consequentemente, se pode supor que CRC constitui a fonte destes miRNA plasmáticos. Portanto, os resultados não só apontam a miR29a, miR15b, miR19a, miR-19b, miR-18a e miR-335 como biomarcadores poderosos para o diagnóstico de CRC, mas também destacam seu envolvimento em carcinogênese colorretal. Além disso, considerando o papel oncogênico potencial destes miRNA, os resultados abrem a possibilidade de desenho futuro de novos tratamento direcionados enfocados na inibição destas moléculas.

[075] Além dos microRNA listados e famílias de microRNA, outros microRNA podem ser adicionados para potenciar a detecção do câncer colorretal. Por exemplo, o método pode compreender ainda determinar o nível de expressão de microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[076] O método pode compreender ainda determinar o nível de expressão de microRNA que são sob-expressos em neoplasia colorretal e são selecionados de:

[077] Ainda outra bioassinatura ou ensaio incluirá a combinação de microRNA tanto super como sob-expressos, por exemplo, dos listados anteriormente no presente documento ou revelados no presente documento. Como tal, a presente invenção também inclui no aspecto a combinação de microRNA tanto super como sob-expressos dos respectivos microRNA, com ou sem os microRNA listados específicos e famílias de microRNA (ou co- expressos).

[078] Em resumo, pacientes com CRC e AA mostram perfis de miRNA plasmáticos significantemente diferentes em comparação com indivíduos saudáveis. Estes miRNA circulantes relacionados com tumor constituem biomarcadores novos e representam uma estratégia potencial para um diagnóstico precoce, não invasivo. Neste estudo, são identificados seis miRNA plasmáticos candidatos promissores para a detecção de CRC. No entanto, este enfoque deve ser validado adicionalmente em coortes maiores de pacientes, com o fim de avaliar sua eficácia e aplicabilidade potencial em uma configuração de exame.

[079] É contemplado que qualquer modalidade discutida nesta memória descritiva pode ser implementada em relação com qualquer método, kit, reagente ou composição da invenção, e vice-versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para alcançar métodos da invenção.

[080] Será entendido que modalidades particulares descritas no presente documento são mostradas a modo de ilustração e não como limitações da invenção. As características principais desta invenção podem ser empregadas em diversas modalidades sem afastar do escopo da invenção. Os técnicos no assunto reconhecerão, ou poderão determinar usando não mais que a experimentação de rotina, numerosos equivalentes aos procedimentos específicos descritos no presente documento. Tais equivalentes são considerados para estarem dentro do escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações.

[081] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na memória descritiva são indicativos do nível dos técnicos no assunto a que esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes são incorporados no presente documento como referência ao mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado como referência.

[082] O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado em conjunto com o termo “que compreende” nas reivindicações e/ou a especificação pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais de um”. O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que se indique explicitamente para referir a alternativas só ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma definição que se refere a só alternativas e “e/ou”. Ao longo deste pedido, o termo “aproximadamente” é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os objetivos do estudo.

[083] Tal como se usam nesta memória descritiva e reivindicação/reivindicações, as palavras “compreendendo” (e qualquer forma de compreendendo, tal como “compreender” e “compreende”), “tendo” (e qualquer forma de tendo, tal como “ter” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, tal como “incluir” e “inclui”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo, tal como “conter” e “contém”) são inclusivas ou abertas e não excluem elementos ou etapas do método não citados adicionais. Tal como se usa no presente documento, a expressão “que consiste essencialmente em” limita o escopo da reivindicação às etapas ou materiais especificados e os que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Tal como se usa no presente documento, a expressão “que consiste em” exclui qualquer elemento, etapa ou componente não especificado na reivindicação exceto para, por exemplo, impurezas ordinariamente associadas com o elemento ou limitação.

[084] O termo “ou combinações dos mesmos” tal como se usa no presente documento se refere a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, “A, B, C, ou combinações dos mesmos” pretende incluir pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC, e se a ordem é importante em um contexto particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, são incluídas expressamente combinações que contém repetições de um ou mais itens ou termos, tal como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB e etc. O técnico entenderá que normalmente não há limite no número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que se evidencie o contrário do contexto.

[085] Tal como se usam no presente documento, as palavras de aproximação tais como, sem limitação, “aproximadamente”, “substancial” ou “substancialmente” se referem a uma condição que quando assim modificada se entende que não é necessariamente absoluta ou perfeita, mas seria considerada bastante próxima para os técnicos no assunto para justificar a designação da condição que está presente. O grau em que a descrição pode variar depende de quão grande uma mudança pode ser instituída e ainda ter um dos técnicos no assunto que reconheça o rasgo modificado já que ainda tem as capacidades e características requeridas do rasgo não modificado. Em geral, mas sujeito à discussão anterior, um valor numérico no presente documento que é modificado por uma palavra de aproximação tal como “aproximadamente” pode variar a partir do valor indicado por pelo menos ±1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 ou 15%.

[086] Todas das composições e/ou métodos revelados e reivindicados no presente documento podem ser feitos e executados sem experimentação excessiva à luz da presente descrição. Enquanto as composições e métodos desta invenção têm sido descritos em quanto a modalidades preferidas, resultará evidente para os técnicos no assunto que podem ser aplicadas variações às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito no presente documento sem afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos tais substitutos similares e modificações evidentes para os técnicos no assunto são considerados que estão dentro do espírito, escopo e conceito da invenção tal como se define pelas reivindicações adjuntas. REFERÊNCIAS 1. Esquela-Kerscher, A. e Slack, F.J. (2006) Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer, 6, 259-69. 2. Calin, G.A. e Croce, CM. (2006) MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 6, 857-66. 3. Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, B.L., Mak, R.H., Ferrando, A.A., Downing, J.R., Jacks, T., Horvitz, H.R. e Golub, T.R. (2005) MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 435, 834-8. 4. Schetter, A.J., Leung, S.Y., Sohn, J.J., Zanetti, K.A., Bowman, E.D., Yanaihara, N., Yuen, S.T., Chan, T.L., Kwong, D.L., Au, G.K., Liu, C.G., Calin, G.A., Croce, CM. e Harris, C.C (2008) MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA, 299, 425-36. 5. Mitchell, P.S., Parkin, R.K., Kroh, E.M., Fritz, B.R., Wyman, S.K., Pogosova-Agadjanyan, E.L., Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, K.C., Allen, A., Lin, D.W., Urban, N., Drescher, C.W., Knudsen, B.S., Stirewalt, D.L., Gentleman, R., Vessella, R.L., Nelson, P.S., Martin, D.B. e Tewari, M. (2008) Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 10513-8. 6. Gilad, S., Meiri, E., Yogev, Y., Benjamin, S., Lebanony, D., Yerushalmi, N., Benjamin, H., Kushnir, M., Cholakh, H., Melamed, N., Bentwich, Z., Hod, M., Goren, Y. e Chajut, A. (2008) Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One, 3, e3148. 7. Chim, S.S., Shing, T.K., Hung, E.C., Leung, T.Y., Lau, T.K., Chiu, R.W. e Lo, Y.M. (2008) Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin Chem, 54, 482-90. 8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J. e Thun, M.J. (2009) Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin, 59, 225-49. 9. Gellad, Z.F. e Provenzale, D. Colorectal cancer: national and international perspective on the burden of disease and public health impact. Gastroenterology, 138, 2177-90. 10. Hoff, G. e Dominitz, J.A. Contrasting US and European approaches to colorectal cancer screening: which is best? Gut, 59, 407-14. 11. Whitlock, E.P., Lin, J.S., Liles, E., Beil, T.L. e Fu, R. (2008) Screening for colorectal cancer: a targeted, updated systematic review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann Intern Med, 149, 638-58. 12. Quintero, E., Castells, A., Bujanda, L., Cubiella, J., Salas, D., Lanas, A., Andreu, M., Carballo, F., Morillas, J.D., Hernandez, C, Jover, R., Montalvo, I., Arenas, J., Laredo, E., Hernandez, V., Iglesias, F., Cid, E., Zubizarreta, R., Sala, T., Ponce, M., Andres, M., Teruel, G., Peris, A., Roncales, M.P., Polo-Tomas, M., Bessa, X., Ferrer-Armengou, O., Grau, J., Serradesanferm, A., Ono, A., Cruzado, J., Perez-Riquelme, F., Alonso-Abreu, I., de la Vega-Prieto, M., Reyes-Melian, J.M., Cacho, G., Diaz-Tasende, J., Herreros-de-Tejada, A., Poves, C, Santander, C. e Gonzalez-Navarro, A. Colonoscopy versus fecal immunochemical testing in colorectal-cancer screening. N Engl J Med, 366, 697-706. 13. Cunningham, J.M., Oberg, A.L., Borralho, P.M., Kren, B.T., French, A.J., Wang, L., Bot, B.M., Morlan, B.W., Silverstein, K.A., Staggs, R., Zeng, Y., Lamblin, A.F., Hilker, C.A., Fan, J.B., Steer, C.J. e Thibodeau, S.N. (2009) Evaluation of a new high-dimensional miRNA profiling platform. BMC Med Genomics, 2, 57. 14. Chen, J., Lozach, J., Garcia, E.W., Barnes, B., Luo, S., Mikoulitch, I., Zhou, L., Schroth, G. e Fan, J.B. (2008) Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology. Nucleic Acids Res, 36, e87. 15. Du, P., Kibbe, W.A. e Lin, S.M. (2008) lumi: a pipeline for processing Illumina microarray. Bioinformatics, 24, 1547-8. 16. Huang, Z., Huang, D., Ni, S., Peng, Z., Sheng, W. e Du, X. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer, 127, 118-26. 17. Chang, K.H., Mestdagh, P., Vandesompele, J., Kerin, M.J. e Miller, N. MicroRNA expression profiling to identify and validate reference genes for relative quantification in colorectal cancer. BMC Cancer, 10, 173. 18. Smyth, G.K. (2004) Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol, 3, Article3. 19. Culhane, A.C., Thioulouse, J., Perriere, G. e Higgins, D.G. (2005) MADE4: an R package for multivariate analysis of gene expression data. Bioinformatics, 21, 2789-90. 20. Sabates-Bellver, J., Van der Flier, L.G., de Palo, M., Cattaneo, E., Maake, C., Rehrauer, H., Laczko, E., Kurowski, M.A., Bujnicki, J.M., Menigatti, M., Luz, J., Ranalli, T.V., Gomes, V., Pastorelli, A., Faggiani, R., Anti, M., Jiricny, J., Clevers, H. e Marra, G. (2007) Transcriptome profile of human colorectal adenomas. Mol Cancer Res, 5, 1263-75. 21. Lawrie, C.H., Gal, S., Dunlop, H.M., Pushkaran, B., Liggins, A.P., Pulford, K., Banham, A.H., Pezzella, F., Boultwood, J., Wainscoat, J.S., Hatton, C.S. e Harris, A.L. (2008) Detection of elevated levels of tumour- associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol, 141, 672-5. 22. Wong, T.S., Liu, X.B., Wong, B.Y., Ng, R.W., Yuen, A.P. e Wei, W.I. (2008) Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue. Clin Cancer Res, 14, 2588-92. 23. Chen, X., Ba, Y., Ma, L., Cai, X., Yin, Y., Wang, K., Guo, J., Zhang, Y., Chen, J., Guo, X., Li, Q., Li, X., Wang, W., Wang, J., Jiang, X., Xiang, Y., Xu, C, Zheng, P., Zhang, J., Li, R., Zhang, H., Shang, X., Gong, T., Ning, G., Zen, K. e Zhang, C.Y. (2008) Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res, 18, 997-1006. 24. Ng, E.K., Chong, W.W., Jin, H., Lam, E.K., Shin, V.Y., Yu, J., Poon, T.C., Ng, S.S. e Sung, J.J. (2009) Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening. Gut, 58, 1375-81. 25. Pu, X.X., Huang, G.L., Guo, H.Q., Guo, C.C, Li, H., Ye, S., Ling, S., Jiang, L., Tian, Y. e Lin, T.Y. Circulating miR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognostic marker of colorectal cancer and is correlated with p53 expression. J Gastroenterol Hepatol, 25, 1674-80. 26. Cheng, H., Zhang, L., Cogdell, D.E., Zheng, H., Schetter, A.J., Nykter, M., Harris, C.C, Chen, K., Hamilton, S.R. e Zhang, W. Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis. PLoS One, 6, e17745. 27. Mendell, J.T. (2008) miRiad roles for the miR-17-92 cluster in development and disease. Cell, 133, 217-22. 28. Olive, V., Jiang, I. e He, L. mir-17-92, a cluster of miRNAs in the midst of the cancer network. Int J Biochem Cell Biol, 42, 1348-54. 29. Diosdado, B., van de Wiel, M.A., Terhaar Sive Droste, J.S., Mongera, S., Postma, C, Meijerink, W.J., Carvalho, B. e Meijer, G.A. (2009) MiR- 17-92 cluster is associated with 13q gain and c-myc expression during colorectal adenoma to adenocarcinoma progression. Br J Cancer, 101, 707-14. 30. Volinia, S., Calin, G.A., Liu, C.G., Ambs, S., Cimmino, A., Petrocca, F., Visone, R., Iorio, M., Roldo, C, Ferracin, M., Prueitt, R.L., Yanaihara, N., Lanza, G., Scarpa, A., Vecchione, A., Negrini, M., Harris, C.C. e Croce, CM. (2006) A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 2257-61. 31. Monzo, M., Navarro, A., Bandres, E., Artells, R., Moreno, I., Gel, B., Ibeas, R., Moreno, J., Martinez, F., Diaz, T., Martinez, A., Balague, O. e Garcia-Foncillas, J. (2008) Overlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cancer. Cell Res, 18, 823-33. 32. Lanza, G., Ferracin, M., Gafa, R., Veronese, A., Spizzo, R., Pichiorri, F., Liu, C.G., Calin, G.A., Croce, CM. e Negrini, M. (2007) mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cancer. Mol Cancer, 6, 54. 33. Motoyama, K., Inoue, H., Takatsuno, Y., Tanaka, F., Mimori, K., Uetake, H., Sugihara, K. e Mori, M. (2009) Over- and under-expressed microRNAs in human colorectal cancer. Int J Oncol, 34. 1069-75. 34. Earle, J.S., Luthra, R., Romans, A., Abraham, R., Ensor, J., Yao, H. e Hamilton, S.R. Association of microRNA expression with microsatellite instability status in colorectal adenocarcinoma. J Mol Diagn, 12, 433-40.

Claims (5)

1. MÉTODO PARA DETECTAR ADENOMAS COLORRETAIS AVANÇADOS EM UM SUJEITO HUMANO, caracterizado por compreender as etapas de: medir um nível ou padrão de expressão global de um ou mais microRNAs obtidos a partir de uma ou mais amostras biológicas do sujeito, em que pelo menos um daqueles microRNAs é miR18a; e comparar o padrão de expressão global de um ou mais microRNAs da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de adenomas colorretais avançados com o padrão de expressão global do um ou mais microRNAs de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de adenomas colorretais avançados, e em que a superexpressão de miR18a é indicativa de adenomas colorretais avançados.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: medir um nível ou padrão de expressão global de microRNAs obtidos a partir de uma ou mais amostras biológicas do sujeito, em que pelo menos aqueles miRNAs são miR18a e miR19a e miR19b, ou miR18a e miR19a e miR19b e miR15b; e comparar o padrão de expressão global de microRNAs da amostra biológica do sujeito suspeito de sofrer de adenomas colorretais avançados com o padrão de expressão global dos microRNAs de uma amostra biológica de um sujeito normal, em que o sujeito normal é um sujeito saudável que não sofre de adenomas colorretais avançados, em que a superexpressão de miR18a é indicativa de adenomas colorretais avançados.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelas uma ou mais amostras biológicas serem selecionadas a partir do grupo que consiste em um ou mais fluidos biológicos, uma amostra de plasma, uma amostra de soro ou uma amostra de sangue.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela uma ou mais amostras biológicas ser uma amostra de plasma.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo nível de expressão do um ou mais microRNAs ser medido por obtenção de perfil de expressão de micro alinhamentos, PCR, PCR de transcriptase reversa, PCR em tempo real de transcriptase reversa, PCR em tempo real quantitativa, PCR de ponto final, PCR de ponto final multiplex, PCR fria, PCR gelada, espectrometria de massas, hibridização in situ (ISH), hibridização in situ multiplex, ou sequenciamento de ácido nucleico.

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