MX2014004810A - Microarn plasmaticos para la deteccion de cancer colorrectal temprano. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en general al campo de la detección de cáncer colorrectal, y más particularmente, a microARN plasmáticos para la detección del cáncer colorrectal temprano. Específicamente, la presente invención incluye métodos, kits y biomarcadores para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: Un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende etapas de: obtener una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal; medir un nivel o patrón de expresión global de uno o más microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de cáncer colorrectal.

Description

MICROARN PLASMÁTICOS PARA LA DETECCIÓN DE CÁNCER COLORRECTAL TEMPRANO Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama prioridad para la Solicitud Provisional Estadounidense con No. de serie 61/550,148, presentada el 21 de octubre de 2011, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general al campo de la detección de cáncer colorrectal, y más particularmente, a microARN plasmáticos para la detección de cáncer colorrectal temprano.

Declaración de Investigación Financiados por el Gobierno Federal Ninguna.

Incorporación Mediante Referencia de Materiales Presentados en Disco Compacto Ninguna.

Antecedentes de la Invención Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen en relación con cánceres colorrectales.

La Solicitud de Patente Estadounidense No. 20100317533 (Lou et al. 2010) proporciona un panel de biomarcadores de metástasis tumoral que comprenden cualquiera de los dos de anhidrasa carbónica-9 (CAIX por sus siglas en inglés), factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C por sus siglas en inglés), efrina A5 (EFNA5 por sus siglas en inglés), receptor de eph B2 (EPHB2 por sus siglas en inglés), factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF- 3 por sus siglas en inglés), piruvato deshidrogenasa cinasa, isoenzima-3 (PDK3 por sus siglas en inglés), anhidrasa carbónica-12 (CAXII por sus siglas en inglés), queratina 14 (KRT14 por sus siglas en inglés), subunidad alfa de factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1a por sus siglas en inglés) o tenascina C (TNC por sus siglas en inglés). CAIX, VEGF-C, EFNA5, EPHB2, TGF-p3 o PDK3 pueden ser indicadores de potencial metastásico moderado, mientras que CAXII, KRT14, HIF-1a o TNC pueden ser indicadores de potencial metastásico alto. Se proporciona también un método de determinación del riesgo de metástasis tumoral usando los biomarcadores mencionados anteriormente. Los biomarcadores pueden usarse en diagnóstico, pronóstico, selección del tratamiento o para someter a prueba supuestos productos terapéuticos. Los biomarcadores pueden usarse para evaluar tumores malignos o cánceres que tienen regiones hipóxicas, como cáncer de mama.

La Solicitud de Patente Estadounidense No. 20100120898 (Croce et al. 2010) da a conocer métodos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (CHC por sus siglas en inglés). También se proporcionan métodos de identificación de agentes anti-CHC. La solicitud de Croce proporciona un método de diagnóstico de sí un sujeto tiene, o corre el riesgo de desarrollar, carcinoma hepatocelular (CHC), que comprende medir el nivel de al menos un producto génico de miR en una muestra de prueba del sujeto, en donde una alteración en el nivel del producto génico de miR en la muestra de prueba, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra control, es indicativa de que el sujeto o bien tiene, o bien corre el riesgo de desarrollar CHC.

La Patente Estadounidense No. 7,939.255, concedida a Chung se refiere a métodos de diagnóstico para cáncer colorrectal. En resumen, la patente describe un método de diagnóstico y un kit para la evaluación del pronóstico de cáncer colorrectal (CCR) con un gen supresor de tumores que va a usarse para el diagnóstico de cáncer colorrectal (CCR), en donde el método comprende: identificar regiones alteradas de manera recurrente (RAR por sus siglas en inglés) en un cromosoma; y detectar alteraciones genómicas en las RAR. Se dice que la invención hace posible realizar el diagnóstico temprano así como la evaluación del pronóstico para diversos cánceres y tumores incluyendo cáncer colorrectal (CCR).

La Publicación No. WO2011076147, titulada Biomarcadores de Micro-RNA Basado en Plasma y Métodos para la Detección Temprana de Colorrectal, presentada por Li, da a conocer un kit de diagnóstico de marcadores moleculares en sangre para diagnosticar cáncer colorrectal y/o monitorizar el efecto terapéutico para tratar cáncer colorrectal. Se dice que el kit comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, y cada molécula de ácido nucleico codifica para un biomarcador de microRNA, en donde una o más de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se expresan de manera diferencial en plasma de paciente y control sano, y la una o más moléculas de ácido nucleico expresadas de manera diferencial representan juntas un biomarcador de la expresión de ácido nucleico que es indicativo de la presencia de cáncer colorrectal. Se dice que la invención proporciona además métodos correspondientes que usan tales biomarcadores de la expresión de ácido nucleico para identificar cáncer colorrectal así como para prevenir o tratar un estado de este tipo. Finalmente, la invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de cáncer colorrectal.

La Publicación No. WO2011076142, titulada Composiciones y Métodos para la Expresión de microARN de Perfiles en Plasma de Colorrectal, también presentada por Li, se dice que enseña composiciones y métodos para la obtención del perfil de expresión de microARN (miARN) en plasma de cáncer colorrectal. En particular, se dice que la invención se refiere a un kit de diagnóstico de marcadores moleculares en sangre para diagnosticar cáncer colorrectal, monitorizar la terapia contra el cáncer y/o tratar cáncer colorrectal que incluye una pluralidad de moléculas de ácido nucleico, codificando cada molécula de ácido nucleico para una secuencia de microARN, en donde una o más de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico se expresan de manera diferencial en plasma de cáncer colorrectal y plasma control sano, y en donde una o más moléculas de ácido nucleico expresadas de manera diferencial representan juntas un patrón de expresión de ácido nucleico que es indicativa de la presencia de cáncer colorrectal. Se dice que la invención se refiere además a métodos correspondientes de uso de tales patrones de expresión de ácido nucleico para identificar cáncer colorrectal así como para prevenir o tratar un estado de este tipo. Finalmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de cáncer colorrectal.

La Publicación No. WO2011088226, titulada Detección de Trastornos Gastrointestinales, presentada por Christine, se dice que enseña métodos y sistemas para caracterizar un fenotipo detectando microARN, vesículas o biomarcadores que son indicativos de enfermedad o progreso de la enfermedad. La enfermedad puede ser un trastorno gastrointestinal, como cáncer colorrectal. Los microARN, las vesículas o los biomarcadores pueden detectarse en un líquido corporal.

La Publicación No. WO2010004562, titulada Métodos y Composiciones para Detectar el Cáncer Colorrectal, presentada por Baruch, se dice que enseña un método para realizar una detección temprana mínimamente invasiva de cáncer colorrectal y/o de células precursoras de cáncer colorrectal, usando moléculas de microARN asociadas con cáncer colorrectal, así como diversas moléculas de ácido nucleico relacionadas con el mismo o derivadas del mismo.

Finalmente, la Publicación No. WO2011012136, titulada Un Método para Clasificar una Muestra de Células Humana como Canceroso, presentada por Fog, et al, se dice que enseña un método para discriminar entre muestras cancerosas y no cancerosas. Se dice que el método comprende detectar el nivel de al menos un microARN (miR) seleccionado del grupo I de Mir que consiste de: miR-21, miR-34a y miR-141, y detectar el nivel de al menos un miR seleccionado del grupo II de Mir que consiste de: miR-126, miR-143 y miR-145 en una muestra de células de prueba y comparar el nivel de expresión de dichos miR seleccionados en la muestra de células de prueba con el nivel de expresión de los mismos miR seleccionados en un conjunto de prueba registrado previamente.

Breve Descripción de la Invención En una modalidad la presente invención incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: obtener una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal; medir un nivel o patrón de expresión global de uno o más microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de cáncer colorrectal. En un aspecto, el método comprende además el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a o miR335 en comparación con la expresión a partir del sujeto normal es indicativa de neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el método comprende además el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141. En otro aspecto, una o más muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el método puede detectar CCR temprano (l-ll) de manera tan precisa como CCR avanzado (estadio ll-lll), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo. En otro aspecto, el método comprende un intervalo de confianza que es del 90, 91, 92, 93, 94 o 95% o mayor. En otro aspecto, el método comprende además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el método comprende además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el nivel de expresión de uno o más microARN se mide mediante obtención del perfil de expresión de micro matrices, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real cuantitativa, PCR de punto final, PCR de punto final múltiplex, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación in situ múltiplex o secuenciación de ácido nucleico. En otro aspecto, el método se usa para tratar a un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia con agente antineoplásico para un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, el nivel o patrón de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN seleccionados de las tablas 2, 3, 4 y 5, en donde los microARN aumentan la especificidad de la determinación, el diagnóstico o la detección de neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el método comprende además la etapa de usar el nivel o patrón de expresión global de microARN para el pronóstico, gula de tratamiento o monitorización de la respuesta al tratamiento de la neoplasia colorrectal.

Aún otra modalidad de la presente invención incluye un biomarcador para la progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal, metástasis o ambas en donde el biomarcador comprende uno o más microARN y un cambio en la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal obtenidas de un paciente es indicativo de progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal en comparación con la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal normales o células de neoplasia colorrectal obtenidas en un punto de tiempo anterior del mismo paciente, en donde la sobreexpresión de la combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b, es indicativa de cáncer colorrectal. En un aspecto, el método comprende además el análisis de uno o más de los siguientes microARN miR29a, miR92a, miR141, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a o miR335. En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal seleccionados de: En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal seleccionados de: En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: El experto en la técnica reconocerá lo más a menudo que una biofirma (ensayo) incluirá la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados con respecto a microARN respectivos. En otro aspecto, las muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el método puede detectar CCR temprano (l-ll) de manera tan precisa como CCR avanzado (estadio ll-lll), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo. En otro aspecto, el nivel o patrón de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN seleccionados de las tablas 2, 3, 4 y 5, en donde los microARN aumentan la especificidad de la determinación, el diagnóstico o la detección de neoplasia colorrectal.

Aún otra modalidad de la presente invención incluye un kit para un diagnóstico de neoplasia colorrectal que comprende: reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y m¡R15b, en donde la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de neoplasia colorrectal, en donde un intervalo de confianza para cáncer colorrectal es del 90% o mayor. En un aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a o miR335. En un aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141. En otro aspecto, el kit comprende además instrucciones para su uso en el diagnóstico del riesgo de neoplasia colorrectal, en donde la instrucción comprende indicaciones etapa a etapa para comparar el nivel de expresión de los microARN, cuando se mide la expresión de una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que tiene neoplasia colorrectal con el nivel de expresión de una muestra obtenida de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal. En otro aspecto, el kit comprende además instrumentos, recipientes y reactivos necesarios para obtener muestras de un sujeto seleccionadas del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal. En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para el análisis de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para el análisis de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el kit comprende además reactivos para la detección y el análisis del patrón de expresión o se determina el nivel de expresión para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal seleccionados de los microARN de las tablas 2, 3, 4 y 5.

Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método para seleccionar una terapia contra el cáncer para un paciente al que se le ha diagnosticado con neoplasia colorrectal, que comprende el método: obtener una muestra de un sujeto que tiene una neoplasia colorrectal; y determinar el nivel de expresión de m¡R18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 en comparación con el nivel de expresión de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de los microARN es indicativa de cáncer colorrectal; y seleccionar la terapia contra el cáncer basándose en la determinación de la neoplasia colorrectal en el paciente.

Otra modalidad de la presente invención incluye un método de modalidad de un ensayo clínico para evaluar un fármaco candidato que se cree que es útil en el tratamiento de un estado patológico, que comprende el método: (a) medir el nivel de microARN obtenidos de un conjunto de pacientes, en donde los microARN se seleccionan de uno o más microARN seleccionados de microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de los pacientes, y un placebo a un segundo subconjunto de los pacientes; un fármaco comparador a un segundo subconjunto de los pacientes; o una combinación de fármacos del fármaco candidato y otro agente activo a un segundo subconjunto de pacientes; (c) repetir la etapa (a) tras la administración del fármaco candidato o el placebo, el fármaco comparador o la combinación de fármacos; y (d) determinar si el fármaco candidato reduce el número de células neoplásicas colorrectales que tienen un cambio en la expresión de los microARN que es estadísticamente significativo en comparación con cualquier cambio que se produce en el segundo subconjunto de pacientes, en donde una reducción estadísticamente significativa indica que el fármaco candidato es útil en el tratamiento de dicho estado patológico.

Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal; obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en donde las muestras biológicas se seleccionan de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal; medir un nivel o patrón de expresión global de miR18a, miR19a, m¡R19b, miR15b, miR29a y miR335; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de microRNAs: miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 es indicativa de cáncer colorrectal.

Aún otra modalidad de la presente invención incluye un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal; obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en donde las muestras biológicas se seleccionan de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal; medir un nivel o patrón de expresión global de uno o más microARN seleccionados de: en donde ROC son los parámetros de área bajo la curva (AUC), IC es un intervalo de confianza del 95%, S es la sensibilidad y Sp es la especificidad; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN obtenidos de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde un cambio en el patrón de expresión global de uno o más microARN en la muestra biológica del sujeto es indicativa de neoplasia colorrectal. En un aspecto, los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: En otro aspecto, el nivel de expresión de uno o más microARN se mide mediante obtención del perfil de expresión de micro matrices, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real cuantitativa, PCR de punto final, PCR de punto final múltiplex, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación in situ múltiplex o secuenciación de ácido nucleico. En otro aspecto, el método se usa para tratar a un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia con agente antineoplásico (por ejemplo, agentes de reticulación de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes biológicos como anticuerpos monoclonales con o sin cargas de destrucción celular, tanto dirigidos como no dirigidos) para un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto, se determina el nivel o patrón de expresión global de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.

Breve Descripción de los Dibujos Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace ahora referencia a la descripción detallada de la invención junto con las Figuras adjuntas y en las que: Figura 1A y Figura 1B muestran la expresión de miARN diferencial mediante micro matrices entre pacientes con CCR y controles del conjunto 1 (Figura 1A) y entre pacientes con AA y controles (Figura 1B). El mapa de calor muestra los 50 miARN significativamente desregulados con el FC más alto. Los píxeles de color rojo corresponden a un aumento de la abundancia de miARN en la muestra de plasma indicada, mientras que los píxeles de color verde indican una disminución de los niveles de miARN.

La Figura 2 es un gráfico del análisis entre grupos (BGA por sus siglas en inglés) que muestra el agrupamiento de las muestras basándose en la obtención del perfil de expresión de miARN. Controles sanos (C por sus siglas en inglés); pacientes con cáncer colorrectal (CCR por sus siglas en inglés); pacientes con adenomas avanzados (AA por sus siglas en inglés).

La Figura 3 muestra gráficos de cajas que muestran la expresión de miARN plasmático en el conjunto 2 de CCR determinada mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión de miARN se normalizan a miR16 y se representan como valores de -dCt. Las líneas dentro de las cajas indican las medianas. Las cajas marcan el intervalo entre los percentiles 25 y 75.

Figura 4A y Figura 4B son análisis de características operativas del receptor (ROC por sus siglas en inglés) para el patrón de dos miARN plasmáticos: miR19a + miR19b (Figura 4A) y el patrón de tres miARN plasmáticos: m¡R19a + miR19b + miR15b (Figura 4B) de acuerdo con los resultados obtenidos a partir de la obtención del perfil de micro matrices en el conjunto 1 de CCR y los datos de qRT-PCR en el conjunto 2 de CCR.

Descripción Detallada de la Invención Aunque la preparación y el uso de diversas modalidades de la presente invención se comentan en detalle a continuación, debe apreciarse que la presente invención proporciona muchos conceptos inventivos aplicables que pueden incluirse en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas comentadas en el presente documento son meramente ilustrativas de modos específicos para realizar y usar la invención y no delimitan el alcance de la invención.

Para facilitar la comprensión de esta invención, se definen varios términos a continuación. Los términos definidos en el presente documento tienen significados que entiende comúnmente un experto habitual en las áreas relevantes para la presente invención. Términos como "un", "una" y "el/la" no pretenden referirse a sólo una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual puede usarse un ejemplo específico para ilustración. La terminología en el presente documento se usa para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto como se explica resumidamente en las reivindicaciones.

Abreviaturas: adenomas avanzados, AA; área bajo la curva de ROC, AUC; análisis entre grupos, BGA; cáncer colorrectal, CCR; cambio en veces, FC; modelos lineales para datos de micro matrices, LIMMA; microARN, miRNA; curva de características operativas del receptor, curva de ROC.

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer colorrectal" y "neoplasia colorrectal" incluyen la definición médica bien aceptada que define el cáncer colorrectal como un estado médico caracterizado por cáncer de células del tracto intestinal por debajo del intestino delgado (es decir, el intestino grueso (colon), incluyendo el ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto) e incluye precáncer (también denominado en el presente documento adenomas avanzados), cáncer en estadio temprano y cáncer en estadio tardío. Adicionalmente, como se usa en el presente documento, el término "cáncer colorrectal" también incluye además estados médicos que se caracterizan por cáncer de células del duodeno e intestino delgado (yeyuno e íleo).

Como se usa en el presente documento, el término "muestra de tejido" (el término "tejido" se usa de manera intercambiable con el término "muestra de tejido") se refiere a e incluye cualquier material compuesto por una o más células, o bien individuales o bien en complejo con cualquier matriz o en asociación con cualquier compuesto químico. La definición incluirá cualquier material biológico u orgánico y cualquier subporciones celular, producto o subproducto del mismo. La definición de "muestra de tejido" debe entenderse que incluye sin limitación esperma, óvulos, embriones y componentes sanguíneos. También se incluyen dentro de la definición de "tejido" para fines de esta invención determinadas estructuras acelulares definidas como capas dérmicas de la piel que tienen un origen celular pero que ya no se caracterizan como celulares. El término "deposición" como se usa en el presente documento es un término clínico que se refiere a heces excretadas por humanos.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere a una unidad que codifica para un péptido, un polipéptido o una proteína funcional. Como entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc o fragmentos o combinaciones de los mismos, así como productos génicos, incluyendo los que se han alterado artificialmente. Se usan proteína, ácidos nucleicos y genes y similares purificados para referirse a estas entidades cuando se identifican y se separan de al menos una proteína o ácido nucleico contaminante con la que están asociados habitualmente. El término "alelo" o "forma alélica" se refiere a una versión alternativa de un gen que codifica para la misma proteína funcional pero que contiene diferencias en la secuencia de nucleótidos en relación con otra versión del mismo gen.

Como se usa en el presente documento, el término "microARN" ("miARN" o "miR") se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende el producto de un gen endógeno, no codificante cuyos transcritos de ARN precursor pueden formar estructuras de tallo-bucle pequeñas de las que se escinden "miARN" maduros mediante, por ejemplo, Dicer. Los "miARN" se codifican en genes distintos de los ARNm cuya expresión controlan.

Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados mediante cualquiera de ligamento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas a-enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, el resto de azúcar completo puede reemplazarse por estructuras esférica y electrónicamente similares, como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Pueden unirse monómeros de ácido nucleico mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, y similares. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácido nucleico modificadas o que se producen de manera natural unidas a una estructura principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien monocatenarios o bien bicatenarios.

El término "biomarcador" como se usa en el presente documento en diversas modalidades se refiere a un compuesto bioquímico específico en el organismo que tiene una característica molecular particular que lo hace útil para diagnosticar y medir el progreso de la enfermedad o los efectos del tratamiento. Por ejemplo, los metabolitos o biomarcadores comunes encontrados en el aliento de una persona, y la condición de diagnóstico respectiva de la persona que proporciona tal metabolito incluyen, pero no se limitan a, acetaldehído (fuente: etanol, X-treonina; diagnóstico: intoxicación), acetona (fuente: acetoacetato; diagnóstico: dieta/diabetes), amoniaco (fuente: desaminación de aminoácidos; diagnóstico: uremia y enfermedad hepática), CO (monóxido de carbono) (fuente: CH2CI2, % de COHb elevada; diagnóstico: contaminación del aire de interiores), cloroformo (fuente: compuestos halogenados), diclorobenceno (fuente: compuestos halogenados), dietilamina (fuente: colina; diagnóstico: sobrecrecimiento de bacterias intestinales), H (hidrógeno) (fuente: intestinos; diagnóstico: intolerancia a la lactosa), isopreno (fuente: ácido graso; diagnóstico: estrés metabólico), metanotiol (fuente: metionina; diagnóstico: sobrecrecimiento de bacterias intestinales), metiletilcetona (fuente: ácido graso; diagnóstico: contaminación del aire de interiores/dieta), O-toluidina (fuente: metabolito de carcinoma; diagnóstico: carcinoma broncogénico), sulfuros y sulfuros de pentano (fuente: peroxidación de lípidos; diagnóstico: infarto de miocardio), H2S (fuente: metabolismo; diagnóstico: enfermedad periodontal/ovulación), eS (fuente: metabolismo; diagnóstico: cirrosis) y Me2S (fuente: infección; diagnóstico: gingivitis necrosante).

El término diferencias "estadísticamente significativas" entre los grupos estudiados se refiere a una condición en la que usando el análisis estadístico apropiado (por ejemplo prueba de Chi-cuadrado, prueba de la t) la probabilidad de que los grupos sean iguales es inferior al 5%, por ejemplo p<0.05. En otras palabras, la probabilidad de obtener los mismos resultados en una base completamente al azar es inferior a 5 de 100 intentos.

El término "kit" o "kit de pruebas" indica combinaciones de reactivos y adyuvantes requeridos para un análisis. Aunque un kit de prueba consiste de la mayoría de los casos en varias unidades, también están disponibles elementos de análisis de una pieza, que deben considerarse asimismo kits de pruebas.

El término "reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) como se usa en el presente documento se refiere al método de K.B. Mullís, Patentes Estadounidenses No.4,683.195, 4,683.202 y 4.965,188, incorporadas por el presente documento como referencia, que describen un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia objetivo consiste de introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia objetivo deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclado término en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia objetivo bicatenaria. Para efectuar la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y entonces se aparean los cebadores con sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Tras el apareamiento, se extienden los cebadores con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, apareamiento de los cebadores y extensión con polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, la desnaturalización, el apareamiento y la extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada se determina por las posiciones relativas de los cebadores uno con respecto al otro, y por tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del procedimiento, el método se denomina "reacción en cadena de la polimerasa" (a continuación en el presente documento PCR).

Como se usa en el presente documento, el uno o más microARN puede medirse mediante obtención del perfil de expresión de micro matrices, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real cuantitativa, PCR de punto final, PCR de punto final múltiplex, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación in situ múltiplex o secuenciación de ácido nucleico. Sin embargo, pueden usarse otras técnicas para determinar la expresión de microARN como resonancia de plasmones superficiales, efectos de resonancia de fluorescencia (transferencia, extinción y variantes de las mismas) o la siguiente generación de cualquiera de las técnicas enumeradas anteriormente y combinaciones de las mismas, todas las cuales están dentro del alcance de la presente invención. El nivel de expresión global de uno o más microARN puede usarse para aumentar la sensibilidad y calidad de la determinación de la presencia de la neoplasia colorrectal. Por ejemplo, es típico que un aumento en la sensibilidad vaya acompañado por un aumento en el número de microARN medidos, por ejemplo, cuantos más microARN se midan (por ejemplo, 2 frente a 8 o 15 frente a 30) hay un aumento concomitante en la calidad de la determinación como conocen bien los expertos en la técnica en el área de niveles de expresión. El experto en la técnica reconocerá que lo más a menudo una biofirma (ensayo) incluirá la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados con respecto a microARN respectivos.

La presente invención puede usarse para el diagnóstico y tratamiento de pacientes, que incluye o puede extenderse al pronóstico, guía de tratamiento, monitorización de la respuesta al tratamiento, su uso en ensayos clínicos, investigación y combinaciones de los mismos. El experto en la técnica reconocerá que la detección de los microARN identificados en el presente documento puede usarse para cualquiera de estos usos.

Los microARN (miARN) son moléculas de ARN no codificante conservadas evolutivamente, endógenas, pequeñas de 20 - 22 nucleótidos que funcionan como reguladores de la expresión génica. Pruebas recientes han mostrado que los miARN regulan diversos procesos celulares cruciales como desarrollo, diferenciación, proliferación y apoptosis. Se cree que desempeñan un papel importante en el inicio y la progresión de cáncer humano, actuando como oncogenes o supresores de tumores [1].

Se han observado cambios en los perfiles de expresión de miARN en diversos tejidos en una variedad de patologías humanas incluyendo cáncer. Hasta la fecha, cada tipo de tumor analizado mediante obtención del perfil tisular de miARN ha mostrado perfiles de miARN significativamente diferentes en comparación con células normales del mismo tejido [2 - 4]. Además, algunos informes recientes han demostrado que están presentes miARN en el suero y el plasma de humanos y otros animales [5 - 7]. Los niveles circulantes de miARN son bastante estables, reproducibles y constantes entre individuos de la misma especie [5]. Por tanto, la obtención del perfil de expresión de miARN circulantes es muy prometedora como estrategia no invasiva novedosa para el diagnóstico de cáncer y otras enfermedades.

El cáncer colorrectal (CCR) es el segundo cáncer más común en los países occidentales, y representa la segunda causa principal de muerte relacionada con cáncer [8]. Afortunadamente, hay pruebas de que el examen de individuos de riesgo promedio puede dar como resultado una reducción de la incidencia y mortalidad mediante la detección temprana del cáncer y la eliminación de las lesiones precursoras del cáncer [9]. De hecho, el objetivo de los programas de examen es la detección de CCR en estadio temprano y adenomas avanzados (AA) que son lesiones premalignas asociadas con un alto riesgo de progresión a una lesión invasiva.

Actualmente, no hay una estrategia óptima y aceptada universalmente para el examen de CCR [10, 11] y las pruebas basadas en heces se ven dificultadas por su limitada sensibilidad, la colonoscopia constituye un enfoque invasivo [12]. Por tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques que puedan complementar y mejorar las estrategias actuales. En este sentido, estudios previos han encontrado que algunos miARN están aumentados en el plasma de pacientes con CCR, lo que sugiere un posible papel como biomarcadores no invasivos (13 - 16). Sin embargo, todos se limitaban al análisis de un pequeño número de miARN. Por consiguiente, es obligatorio caracterizar adicionalmente la obtención del perfil de miARN plasmáticos mediante técnicas de alto rendimiento y evaluar sus características de rendimiento en la detección de individuos que alojan CCR y/o lesiones precursoras de cáncer. En el presente estudio, se realizó la obtención del perfil de miARN plasmáticos mediante micro matrices en un conjunto de pacientes con CCR o AA, e individuos sanos, identificando un grupo de miARN que pueden detectar pacientes con neoplasia colorrectal con alta capacidad de discriminación. La validación en una cohorte independiente de individuos y usando una tecnología diferente permite confirmar 6 miARN plasmáticos como biomarcadores muy prometedores para el diagnóstico no invasivo de CCR. Desafortunadamente, la capacidad de discriminación de estos miARN era limitada en la detección de lesiones precursoras de cáncer.

Los miARN circulantes son muy prometedores como biomarcadores novedosos para el diagnóstico de cáncer y otras enfermedades. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques no invasivos que puedan complementar y mejorar las estrategias actuales para el examen de cáncer colorrectal (CCR). Se realizó la obtención del perfil de miARN plasmáticos en todo el genoma mediante micro matrices en un conjunto de individuos (n = 61) incluyendo pacientes con CCR o con lesiones premalignas como adenomas colorrectales avanzados (AA) y sujetos sanos. Se usó qRT-PCR en tiempo real para validar la expresión de miARN seleccionados en una cohorte independiente de pacientes de otro hospital (n = 135). Los pacientes con CCR o AA mostraron perfiles de expresión de miARN plasmáticos significativamente diferentes en comparación con los controles. Se seleccionó un grupo de 13 miARN para validarse en una cohorte independiente de pacientes, y se confirmó que 6 de ellos se sobreexpresaban significativamente en el grupo de CCR, mostrando una alta precisión de discriminación. Se confirmó que uno de estos 6 miARN también se sobreexpresaba significativamente en pacientes con AA, con una capacidad de discriminación moderada.

Se incluyeron de manera prospectiva un total de 273 sujetos de dos hospitales (Hospital Clinic de Barcelona, Cataluña, España y Hospital Donostia, Gipuzkoa, España) en este estudio. De ellos, se excluyeron 77 porque cumplían alguno de los siguientes criterios: diagnóstico clínico de poliposis adenomatosis familiar o síndrome de Lynch, presencia de más de 10 adenomas colorrectales, diagnóstico de cáncer en otros sitios en el momento de la selección, que presentan enfermedad inflamatoria del intestino, que están sometiéndose a quimioterapia o terapia de radiación en el momento de la toma de muestras de sangre, examen incompleto del intestino, preparación inadecuada del intestino en la colonoscopia de diagnóstico o presencia de hemólisis en muestras de plasma. Finalmente, se incluyeron 196 individuos: 123 pacientes con diagnóstico reciente de neoplasia colorrectai esporádica (63 con CCR y 40 con AA) y 73 individuos sanos sin historia personal de ningún cáncer y con una colonoscopia reciente que confirma la falta de lesiones neoplásicas colorrectales. Los pacientes con AA eran aquellos con adenomas que tenían un tamaño de al menos 10 mm o que tenían histológicamente un alto grado de displasia o >20% de componente de vellosidades. Estos individuos se dividieron en dos conjuntos diferentes y no relacionados: conjunto 1, 61 sujetos del Hospital Clinic de Barcelona, que se emplearon para realizar la obtención del perfil de expresión de microARN plasmáticos en todo el genoma; y conjunto 2, 135 sujetos del Hospital Donostia, que se reclutaron para validar adicionalmente los resultados obtenidos en el conjunto 1. Las características de los participantes se muestran en la tabla 1. Se recogieron muestras de sangre antes de la endoscopia o cirugía en todos los individuos.

Tabla 1. Características de los Pacientes.

Se aprobó el estudio por el Comité de Ética Institucional del Hospital Clinic de Barcelona (fecha de aprobación: 03/26/2009), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Extracción de ARN a partir de muestras de plasma. Se recogieron veinte mi de sangre completa de cada participante en tubos de EDTA. Se colocaron las muestras de sangre a 4°C hasta la separación del plasma, y se congeló el plasma en el plazo de 6 horas de la extracción de la sangre. En resumen, se centrifugaron las muestras a 1,600 x g durante 10 minutos a 4°C para sedimentar por centrifugación las células sanguíneas, y se transfirió el plasma a nuevos tubos, seguido por centrifugación adicional a 16,000 x g durante 10 minutos a 4°C para eliminar completamente los componentes celulares. Entonces se alicuotó el plasma y se almacenó a -80°C hasta su uso. Se aisló ARN total que contenía ARN pequeños a partir de 550 µ? de plasma usando reactivo Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones. Se añadió reactivo Trizol LS a muestras de plasma en una razón volumétrica 2:1. Tras la separación de fases mediante adición de cloroformo y centrifugación, se separó la fase acuosa a un nuevo tubo y se añadió adicionalmente un volumen de Trizol LS. Tras la segunda separación de fases, se añadieron 1.5 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa y se cargó la mezcla en una columna miRNeasy, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo tratamiento con ADNasa (Qiagen) para eliminar cualquier ADN contaminante. El volumen de elución final era de 30 µ?. Se cuantificó la concentración de ARN usando NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, DE) en todas las muestras y variaba entre 3 y 35 ng/µ?. Se repitió el procedimiento de extracción para cada muestra hasta obtener una cantidad de ARN suficiente para las siguientes etapas.

Obtención del perfil de miARN plasmáticos en todo el genoma mediante micro matriz. Se realizó la obtención del perfil de expresión de miARN en todas las muestras del conjunto 1 usando el ensayo de obtención del perfil de expresión de microARN basándose en la plataforma SAM-Bead Array (lllumina, Inc. San Diego, CA). Esta micro matriz contiene 1,146 sondas, incluyendo 743 miARN validados, que detectan alrededor del 97% de los miARN humanos anotados en la base de datos miRBase Sanger v.12.0. Se realizó el ensayo de micro matriz de miARN usando 200 ng de ARN total por muestra. Se realizaron todas las etapas de acuerdo con el protocolo del fabricante, como se describió anteriormente [13.14], Se extrajeron los datos usando el software de análisis de datos BeadStudio y se transformaron a la escala logarítmica de base 2. Se normalizaron por cuantiles los datos de micro matriz de todas las muestras usando el paquete bioconductor Lumi [15].

Análisis de la expresión de miARN mediante qRT-PCR en tiempo real. Se analizó la expresión de miARN mediante qRT-PCR en tiempo real con un procedimiento de preamplificación múltiplex previo. En resumen, se transcribieron de manera inversa 21 ng de ARN plasmático con una mezcla de cebadores Megaplex RT (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) y se preamplificaron con cebadores Megaplex PreAmp y TaqMan PreAmp MasterMix (Applied Biosystems Inc.) durante 14 ciclos. Se evaluó la expresión de cada miARN mediante qPCR usando ensayos de miARN TaqMan (Applied Biosystems Inc.) en un sistema de PCR en tiempo real Viia7 (Applied Biosystems Inc.). Se analizaron varios supuestos ARN nucleares pequeños de mantenimiento con el fin de determinar el más adecuado en las muestras (RNU6B, miR16, miR423-5p, RNU48, miR544, miR103, miR525, miR451). MÍR16 presentaba la mayor estabilidad y abundancia y, por tanto, se normalizaron los niveles de expresión de miARN a miR16 como control interno en concordancia con otras publicaciones [16, 17]. Se calcularon los valores de Ct a partir del umbral automático. Ningún control de molde mostró amplificación. Se incluyeron tres réplicas técnicas para cada punto de qPCR. Se calcularon los niveles de expresión relativa de miARN seleccionados para cada muestra como valores de ACt [AC\ = Ct de miARN objetivo - Ct de miARN de control interno].

Análisis estadístico. Se usó un modelo lineal para datos de micro matrices (LIMMA) para identificar miARN expresados de manera diferencial entre grupos. LIMMA usa modelos lineales y estadísticos de F y estadísticos de t moderada apareada de Bayes empírica [18]. Se usaron los miARN más significativos usando estadística de F para realizar el análisis de correspondencia como se implementa en la función de análisis entre grupos (BGA) incluida en el paquete made4 [19]. Este método puede visualizar datos de dimensión alta (como mediciones de expresión múltiples) en un gráfico 2D en donde las áreas delimitadas por las elipses representan el 95% de la distribución binormal estimada de las puntuaciones de muestras en los ejes primero y segundo [20]. Se realizaron diagramas de Venn considerando como acierto sólo miARN con un cambio en veces absoluto mayor de 1.5 y un valor de p moderado <0.05 (VennCounts y VennDiagram del paquete de LIMMA). Se analizaron las variables cuantitativas usando la prueba de Student. Se consideró un valor de p bilateral <0.05 como significativo. Se calculó la evaluación de la capacidad de predicción de miARN individuales y diferentes combinaciones de miARN, ajustadas por edad y género, usando regresión logística (distribución binomial GLM). Se calcularon gráficos de análisis de ROC y puntos de corte derivados, así como parámetros de precisión de discriminación global usando el paquete DiagnosisMed R. Se calcularon la sensibilidad y especificidad a partir del punto de corte óptimo asociado con la distancia mínima entre la curva de ROC y la esquina superior izquierda.

Obtención del perfil de miARN en todo el genoma en muestras de plasma de pacientes con cáncer colorrectal. La expresión de miARN plasmáticos discrimina pacientes con cáncer colorrectal de individuos sanos. Para evaluar la obtención del perfil de expresión de miARN circulantes diferentes entre pacientes con CCR e individuos sanos, se realizaron experimentos de micro matrices de miARN en ARN total obtenido de muestras de plasma de 21 pacientes con CCR y 20 controles sanos. Para investigar además si se encontraban patrones de expresión de miARN alterados en pacientes con lesiones precursoras de cáncer colorrectal, se realizaron también experimentos de micro matrices de miARN en ARN plasmático de 20 pacientes con adenomas colorrectales avanzados (AA).

Un análisis estadístico comparativo inicial usando LIMMA produjo un total de 93 miARN significativamente desregulados (p<0.05) en pacientes con CCR en comparación con individuos sanos, y 125 miARN cuando se compararon pacientes con AA con controles sanos. Todos los datos de micro matrices están disponibles en GEO (número de registro: GSE 25609). La Figura 1A y Figura 1B muestran mapas térmicos que incluyen los 50 miARN con el cambio en veces significativo más alto entre pacientes con CCR y controles (Figura 1A), y entre pacientes con AA y controles (Figura 1B). Los valores de p y las diferencias de cambio en veces, así como los parámetros de capacidad de predicción correspondientes para estos miARN en CCR o AA se muestran en las tablas 2 - 3 y 4 - 5, respectivamente. Entonces se realizó un gráfico de BGA para representar visualmente la proximidad entre pacientes que alojan CCR o AA, y controles de acuerdo con la expresión de miARN plasmáticos. Como se representa en la Figura 2, los pacientes con CCR o AA y los individuos sanos aparecen como tres grupos claramente separados. También se analizaron las especificidades de expresión de miARN de cada tipo de lesión neoplásica, es decir, CCR y AA, en comparación con muestras control usando análisis de Venn (Figura 2). Se encontró que un subconjunto de 21 y 28 miARN se regulaban por incremento de manera exclusiva y significativa en pacientes con CCR y AA, respectivamente, mientras que ambos tipos de pacientes neoplásicos compartían 24 miARN regulados por incremento de manera significativa. Por lo tanto, cada lesión neoplásica colorrectal tiene un perfil de expresión de miARN particular pero ambas comparten también un número importante de miARN desregulados, lo que podría permitir la identificación de ambas lesiones usando una única prueba basada en un patrón de miARN plasmáticos común.

Tabla 2. Parámetros de cambio en veces v valor de p para los 50 miARN desregulados superiores en CCR que muestran los cambios en veces más altos.

Tabla 3. Capacidad de predicción de cada miARN individual entre los 50 miARN desregulados superiores en CCR. Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área bajo la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95%. v sensibilidad (S) y especificidad (Sp)) correspondientes a un punto de corte óptimo.

Tabla 4. Parámetros de cambio en veces v valor de p para los 50 miARN desregulados superiores en AA que muestran los cambios en veces más altos.

Tabla 5. Capacidad de predicción de cada miARN individual entre los 50 miARN desregulados superiores en AA. Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área baio la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95%. y sensibilidad (S) v especificidad (Sp)) correspondientes a un punto de corte óptimo.

Validación de la expresión de miARN plasmáticos mediante qRT-PCR en tiempo real. Los resultados de la expresión de miARN plasmáticos basados en micro matrices son técnicamente reproducibles. Inicialmente, se realizó una qRT-PCR en tiempo real para confirmar los resultados de micro matrices en 28 muestras seleccionadas aleatoriamente del conjunto 1 (19 pacientes con neoplasmas colorrectales y 9 controles sanos). Para estos estudios, se seleccionaron un total de 14 miARN candidatos. Se seleccionaron doce miARN candidatos (miR17-5p, miR92a, miR19b, miR18a, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24, miR335, miR424 y miR15b) por estar presentes en los 50 miARN desregulados superiores en CCR y/o AA y tener una intensidad de micro matriz de base logarítmica 2 >8. Se seleccionaron también dos miARN adicionales (miR19a y miR20a) por ser parte de la agrupación de miR17-92, una de las agrupaciones de miARN oncogénicos mejor caracterizadas, aunque no satisfacían los criterios anteriores. Globalmente, los resultados de qRT-PCR y micro matrices se correlacionaban (datos no mostrados) excepto por miR424 que no mostraba ninguna amplificación mediante qRT-PCR y, por tanto, se excluyó del análisis posterior.

Se confirmó que seis microARN plasmáticos se sobreexpresaban en pacientes con CCR de una cohorte independiente. En segundo lugar, se analizaron los 13 miARN candidatos que mostraban amplificación adecuada en la fase anterior (miR92a, miR17-5p, miR18a, miR19a, miR19b, miR20a, miR15b, miR29a, miR302a, miR23a, miR27a, miR24 y miR335) en plasma de un conjunto independiente de 42 pacientes con CCR y 53 controles sanos, para validar los resultados mediante qRT-PCR en tiempo real.

De manera interesante, se confirmó que miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 se regulaban por incremento significativamente en pacientes con CCR (Figura 3). Además, miR-24 también se sobreexpresaba en este grupo de pacientes pero sin alcanzar significación estadística (p=0.08). Sorprendentemente, los miARN validados en este segundo conjunto también demostraban una alta precisión en la discriminación de CCR de controles sanos con áreas bajo la curva de ROC (AUC) que oscilaban entre 0.8 (IC del 95%: 0.71 - 0.89) y 0.7 (IC del 95%: 0.59 - 0.80). A continuación, se buscó observar si cualquier combinación de estos miARN podría mejorar la precisión de discriminación en la detección de CCR con respecto a cada uno de ellos solo. Entre las combinaciones que mostraban la mejor capacidad de discriminación destacaban los patrones miR19a + miR19b y miR19a + miR19b + miR15b (tabla 6; Figura 4). Finalmente, se exploró la capacidad de predicción de estos patrones en pacientes con CCR temprano (TNM l-ll) y avanzado (TNM lll-IV). Como se expone en la tabla 2, ambos patrones mostraban una alta precisión de discriminación en casos tanto tempranos como avanzados. De manera similar, se examinó si estos patrones también podían detectar tumores de lado derecho de manera tan precisa como los de lado izquierdo, y éste era el caso para ambos (tabla 2).

Tabla 6. Capacidad de predicción de los mejores patrones de miARN plasmáticos en pacientes con CCR del conjunto 2.

Se muestran los parámetros de la curva de ROC (área bajo la curva (AUC) e intervalo de confianza (IC) del 95% para todos los casos de CCR así como para diferentes estadios tumorales (l/ll y lll/IV) y ubicaciones (derecha e izquierda, con respecto a la flexión esplénica)).

Se confirmó que un microARN plasmático estaba aumentado en pacientes con adenomas colorrectales avanzados. Con el fin de evaluar si cualquiera de los miARN plasmáticos que se encontró que se sobreexpresaban en ambos conjuntos de pacientes con CCR también estaban aumentados en pacientes que alojaban lesiones precursoras de cáncer, que se analizaron mediante qRT-PCR en tiempo real en muestras de plasma de una cohorte independiente de 40 pacientes con AA y 53 controles sanos. Se confirmó que el miR18a se sobreexpresaba significativamente en este segundo conjunto de pacientes con AA en comparación con los controles, ya que estaba en el primer conjunto (Figura 1B). Sin embargo, aunque este miARN mostraba una buena capacidad de discriminación en el primer conjunto de pacientes con AA (AUC: 0.84, IC del 95%: 0.72 - 0.96, S: 80%, Sp: 80%), este parámetro era inferior en el segundo conjunto de pacientes (AUC: 0.64, IC del 95%: 0.52 - 0.75, S: 72%, Sp: 57%).

En este estudio, los inventores realizaron la obtención del perfil de miARN en todo el genoma mediante micro matrices en muestras de plasma de pacientes con CCR o AA, e individuos sanos. Estos resultados muestran que la expresión de miARN plasmáticos puede discriminar entre pacientes con neoplasia colorrectal y sujetos control, lo que sugiere su posible valor para la detección no invasiva de estas lesiones. Hasta lo que conocen los inventores, este es el primer informe que analiza la expresión en todo el genoma de miARN plasmáticos en pacientes con CCR y AA mediante una tecnología de alto rendimiento y, después, validando los resultados en una cohorte externa, independiente. Basándose en este análisis de alto rendimiento, se han identificado un gran número de supuestos biomarcadores de miARN plasmáticos útiles para detectar pacientes que alojan CCR o AA. Además, se ha confirmado la alta capacidad de discriminación entre CCR e individuos sanos de seis microARN plasmáticos en una cohorte diferente y usando una tecnología diferente. Merece la pena mencionar que cinco de estos miARN (es decir, miR19a, miR19b, miR18a, miR15b y miR335) representan biomarcadores novedosos, no notificados anteriormente.

El descubrimiento reciente de miARN estables en plasma y otros fluidos ha abierto la posibilidad de usar estas moléculas como biomarcadores de enfermedad, y varios estudios han evaluado esta estrategia en diferentes entornos. En cáncer humano, este enfoque es francamente prometedor porque el análisis de miARN circulante relacionado con tumores probablemente podría detectar neoplasia de un modo no invasivo. Sin embargo, mientras que la mayor parte de los estudios de obtención del perfil de expresión de miARN en cáncer se han realizado usando muestras de tejidos, sólo un número limitado de ellos se han centrado en el posible valor de miARN circulantes en diagnóstico y pronóstico [21 - 23]. Sorprendentemente, el uso de miARN como biomarcadores parece ser una estrategia mejor que marcadores de ARN o proteína debido a la alta estabilidad de estas moléculas, incluso en presencia de ARNasas [23].

Hasta este punto, sólo unos cuantos estudios han analizado la expresión de algunos miARN plasmáticos candidatos en CCR. Inicialmente, Ng et al. encontraron mediante análisis de qRT-PCR que dos miARN plasmáticos (es decir, miR17-3p y miR92a) estaban significativamente elevados en pacientes con CCR en comparación con sujetos control. Sin embargo, su análisis inicial se limitó a 95 miARN en 10 muestras de plasma (cinco pacientes con CCR y cinco individuos sanos). Más importante, este estudio sólo evaluó la posible utilidad de miARN plasmáticos en el diagnóstico de CCR pero no en la identificación de lesiones precursoras [24]. Poco después, Huang ef al. notificaron la posible utilidad de 2 miARN plasmáticos (miR29a y miR92a) para detectar pacientes con tanto CCR como AA. Sin embargo, este análisis de qRT-PCR se restringía a 12 miARN seleccionados basándose en informes previos. Pu et al. analizaron mediante qRT-PCR la expresión de tres miARN en muestras de plasma de pacientes con CCR notificando una sobreexpresión significativa de miR221, pero no se incluyeron en este estudio pacientes con AA [25]. Por último, Cheng et al. notificaron una regulación por incremento significativa de los niveles plasmáticos de miR141 en pacientes con CCR metastásico tras analizar la expresión de tres miARN [26].

El estudio era para realizar una obtención del perfil completo de miARN circulantes usando tecnología de alto rendimiento en pacientes con CCR y AA, con el fin de identificar los miARN plasmáticos con posible utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de pacientes con estas lesiones. Entre los 743 miARN analizados, se encontraron 95 miARN circulantes significativamente desregulados en pacientes con CCR, y 125 en pacientes con AA, mostrando algunos de ellos una buena capacidad de discriminación. Es importante mencionar que entre los miARN regulados por incremento de manera significativa en el análisis de micro matrices los presentes inventores no sólo confirmaron los miARN plasmáticos relacionados con CCR en estudios previos, como miR29a, miR92a y miR141, sino que también notificaron nuevos miARN candidatos con posible implicación en la carcinogénesis de CCR. Además, entre estos miARN sobreexpresados, se encontraron todos los miembros de la agrupación de miR17-92 (miR17, miR92a, miR19a, miR19b, miR18a y miR20a) y dos miembros de la agrupación de miR106b-25 (miR-25 y miR93), una agrupación caracterizada de manera menos extensa paráloga a miR17-92 en mamíferos. Estos hallazgos destacan a la agrupación de miR17-92 como un actor central en la carcinogénesis colorrectal. La agrupación de miR17-92, también denominada oncomiRI, es una de las agrupaciones de miARN oncogénicos mejor caracterizadas [27,28]. En este sentido, se ha sugerido que el aumento en la inestabilidad cromosómica, responsable de la progresión de adenoma a adenocarcinoma, no sólo conduce a regulación por incremento de oncogenes sino que también provoca sobreexpresión de miARN críticos, incluyendo la agrupación de miR17-92 [29].

Los presentes inventores demostraron que algunos de los miARN regulados por incremento en el primer conjunto de pacientes con CCR (es decir, miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335) también se sobreexpresaban en una cohorte independiente. Sorprendentemente, estos miARN validados mostraban una alta precisión de discriminación para CCR y varias combinaciones de estos miARN mejoraban la capacidad de discriminación de cualquiera de estos miARN solos. Además, podían detectar CCR temprano (l-ll) de manera tan precisa como CCR avanzado (estadio ll-lll), así como tumores de lado derecho de manera tan precisa como lesiones de lado izquierdo. Estos resultados apuntan a la posible utilidad de estos miARN plasmáticos como nuevos biomarcadores no invasivos para el diagnóstico de CCR.

Con respecto a lesiones precursoras de cáncer colorrectal, se encontró que sólo uno de los seis miARN sobreexpresados en CCR (miR-18a) se confirmaba que se sobreexpresaba significativamente en las dos cohortes independientes de pacientes con AA. Aunque miR-18a mostraba una capacidad de discriminación bastante buena en el primer conjunto de pacientes, esta capacidad era moderada en la segunda cohorte. Por consiguiente, los resultados obtenidos en pacientes con AA no son concluyentes y serían necesarios estudios adicionales para establecer si hay algún miARN solo o en combinación que pueda detectar estas lesiones premalignas de manera precisa. De hecho, en la cohorte de pacientes con AA analizados por Huang et al., dos miR plasmáticos (miR-29a y miR-92a) mostraron una precisión bastante buena en la discriminación de AA de los controles [16]. Estos dos miARN plasmáticos también se sobreexpresaban significativamente en la primera cohorte de pacientes con AA pero no en el segundo conjunto. Una posible explicación de esta discrepancia entre ambos conjuntos de pacientes podrían ser las características menos avanzadas de AA en las segundas cohortes de pacientes (tabla 1). Conjuntamente, estos resultados indican que la evaluación de la utilidad de microARN plasmáticos en pacientes con AA constituye una línea de investigación interesante y merece investigación adicional. Actualmente, la detección de AA sigue siendo un desafío importante para estrategias de examen de CCR no invasivas. De hecho, merece la pena mencionar que pruebas inmunoquímicas fecales, una estrategia aceptada actualmente para el examen de CCR no invasivo en la población de riesgo promedio, muestra un buen rendimiento para el diagnóstico de CCR pero pasa por alto casi el 50% de AA, como se ha demostrado recientemente en un estudio del presente grupo [12].

De manera interesante, se ha notificado previamente que todos los miARN validados en este estudio se sobreexpresan en muestras de tejidos de pacientes con CCR [30-34]. Por consiguiente, puede plantearse la hipótesis de que CCR constituye la fuente de estos miARN plasmáticos. Por lo tanto, los resultados no sólo apuntan a miR29a, miR15b, miR19a, miR-19b, miR-18a y miR-335 como potentes biomarcadores para el diagnóstico de CCR sino que también destacan su implicación en carcinogénesis colorrectal. Además, considerando el posible papel oncogénico de estos miARN, los resultados abren la posibilidad de un futuro diseño de nuevos tratamientos dirigidos centrados en la inhibición de estas moléculas.

Además de los microARN enumerados y las familias de microARN, pueden añadirse otros microARN para potenciar la detección del cáncer colorrectal. Por ejemplo, el método puede comprender además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: El método puede comprender además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de: Aún otra biofirma o ensayo incluirá la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados, por ejemplo, a partir de los enumerados anteriormente en el presente documento o dados a conocer en el presente documento. Como tal, la presente invención también incluye en un aspecto la combinación de microARN tanto sobre como sobreexpresados a partir de microARN respectivos, con o sin los microARN enumerados específicos y las familias de microARN (o coexpresados).

En resumen, los pacientes con CCR y AA muestran perfiles de miARN plasmáticos significativamente diferentes en comparación con individuos sanos. Estos miARN circulantes relacionados con tumores constituyen biomarcadores novedosos y representan una posible estrategia para lograr un diagnóstico temprano, no invasivo. En este estudio, se identifican seis miARN plasmáticos candidatos prometedores para la detección de CCR. No obstante, este enfoque debe validarse adicionalmente en cohortes más grandes de pacientes, especialmente aquellos con AA, con el fin de evaluar su eficacia y posible aplicabilidad en un entorno de examen.

Se contempla que cualquier modalidad comentada en esta especificación descriptiva pueda implementarse con respecto a cualquier método, kit, reactivo o composición de la invención, y viceversa. Además, pueden usarse composiciones de la invención para lograr métodos de la invención.

Se entenderá que las modalidades particulares descritas en el presente documento se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden usarse en diversas modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando nada más que experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y están cubiertos por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en el presente documento como referencia en el mismo grado que si se indicara que cada Publicación o solicitud de patente individual se incorpora específica e individualmente como referencia.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa conjuntamente con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación descriptiva puede significar "uno", pero también es compatible con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa queriendo decir "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a las alternativas sólo o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción admite una definición que se refiere a sólo las alternativas y "y/o". A lo largo de toda esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, el método que se usa para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Como se usa en esta especificación descriptiva y la(s) reivindicación/reivindicaciones, las expresiones "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, como "contiene" y "contienen") son inclusivas o de extremos abiertos y no excluyen etapas del método o elementos no mencionados, adicionales. Como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente de" limita el alcance de una reivindicación a las etapas o materiales especificados y a los que no afectan materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. Como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste de" excluye cualquier elemento, etapa o componente no especificado en la reivindicación excepto, por ejemplo, impurezas asociadas habitualmente con el elemento o limitación.

El término "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más artículos o términos, como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y etcétera. El experto en la técnica entenderá que normalmente no hay límite en el número de artículos o términos en cualquier combinación, a menos que resulte evidente lo contrario a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, palabras de aproximación como, sin limitación, "aproximadamente", "sustancial" o "sustancialmente" se refieren a una condición que cuando está así modificada se entiende que no es necesariamente absoluta o perfecta sino que se consideraría suficientemente próxima como para que los expertos habituales en la técnica justifiquen que la designación de la condición está presente. El grado en donde la descripción puede variar dependerá del tamaño del cambio que puede instituirse y que todavía un experto habitual en la técnica reconozca que el rasgo modificado tiene todavía las características y capacidades requeridas del rasgo no modificado. En general, pero sujeto a la discusión anterior, un valor numérico en el presente documento que está modificado por una palabra de aproximación como "aproximadamente" puede variar a partir del valor establecido en al menos ± 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 o 15%.

Todas las composiciones y/o métodos dados a conocer y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en cuanto a modalidades preferidas, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones en las composiciones y/o los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Se considera que todos los sustitutos y modificaciones similares de este tipo evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Bibliografía 1. Esquela-Kerscher, A. y Slack, F.J. (2006) Oncomirs -microRNAs with a role in cáncer. Nat Rev Cáncer, 6, 259-69. 2. Calin, G.A. y Croce, CM. (2006) MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cáncer, 6, 857-66. 3. Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, B.L., Mak, R.H., Ferrando, A. A., Downing, J.R., Jacks, T., Horvitz, H.R. y Golub, T.R. (2005) MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature, 435, 834-8. 4. Schetter, A.J., Leung, S.Y., Sohn, J.J., Zanetti, K.A., Bowman, E.D., Yanaihara, N., Yuen, S.T., Chan, T.L., Kwong, D.L., Au, G.K., Liu, C.G., Calin, G.A., Croce, CM. y Harris, C.C (2008) MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA, 299, 425-36. 5. Mitchell, P.S., Parkin, R.K., Kroh, E.M., Fritz, B.R., Wyman, S.K., Pogosova-Agadjanyan , E.L., Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, K.C., Alien, A., Lin, D.W., Urban, N., Drescher, C.W., Knudsen, B.S., Stirewalt, D.L., Gentleman, R. , Vessella, R.L., Nelson, P.S., Martin, D.B. y Tewari, M. (2008) Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cáncer detection. Proc Nati Acad Sci U S A, 105, 10513-8. 6. Gilad, S., Meiri, E., Yogev, Y., Benjamín, S., Lebanony, D., Yerushalmi, N., Benjamín, FL, Kushnir, M., Cholakh, H., Melamed, N., Bentwich, Z., Hod, M., Goren, Y. y Chajut, A. (2008) Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One, 3, e3148. 7. Chim, S.S., Shing, T.K., Hung, E.C., Leung, T.Y., Lau, T.K., Chiu, R.W. y Lo, Y.M. (2008) Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin Chem, 54, 482-90. 8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J. y Thun, M.J. (2009) Cáncer statistics, 2009. CA Cáncer J Clin, 59, 225-49. 9. Gellad, Z.F. y Provenzale, D. Colorectal cáncer: national and international perspective on the burden of disease and public health impact. Gastroenterology , 138, 2177-90. 10. Hoff, G. y Dominitz, J.A. Contrasting US and European approaches to colorectal cáncer screening: which is best? Gut, 59, 407-14. 11. Whitlock, E.P., Lin, J.S., Liles, E., Beil, T.L. y Fu, R. (2008) Screening for colorectal cáncer: a targeted, updated systematic review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann Intern ed, 149, 638-58. 12. Quintero, E., Castells, A., Bujanda, L. , Cubiella, J., Salas, D., Lanas, A., Andreu, M., Carballo, F., Morillas, J.D., Hernández, C, Jover, R. , Montalvo, I., Arenas, J., Laredo, E. , Hernández, V., Iglesias, F., Cid, E., Zubizarreta, R., Sala, T., Ponce, M., Andrés, M., Teruel, G., Peris, A., Roncales, M.P., Polo-Tomas, M., Bessa, X., Ferrer-Armengou, O., Grau, J., Serradesanferm, A., Ono, A., Cruzado, J., Perez-Riquelme, F., Alonso-Abreu, I., de la Vega-Prieto, M., Reyes-Melian, J.M., Cacho, G., Díaz-Tasende, J., Herreros-de-Tejada, A., Poves, C, Santander, C. y González-Navarro, A. Colonoscopy versus fecal immunochemical testing in colorectal-cancer screening. N Engl J Med, 366, 697-706. 13. Cunningham, J.M., Oberg, A.L., Borralho, P.M., Kren, B.T., French, A.J., Wang, L., Bot, B.M., Morían, B.W., Silverstein, K.A., Staggs, R., Zeng, Y., Lamblin, A.F., Hilker, C.A., Fan, J.B., Steer, C.J. y Thibodeau, S.N. (2009) Evaluation of a new high-dimensional miRNA profiling platform. BMC Med Genomics, 2, 57. 14. Chen, J., Lozach, J., García, E.W., Barnes, B., Luo, S., Mikoulitch, I., Zhou, L., Schroth, G. y Fan, J.B. (2008) Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology. Nucleic Acids Res, 36, e87. 15. Du, P., Kibbe, W.A. y Lin, S.M. (2008) lumi: a pipeline for processing lllumina microarray. Bioinformatics, 24, 1547-8. 16. Huang, Z., Huang, D., Ni, S., Peng, Z., Sheng, W. y Du, X. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cáncer. Int J Cáncer, 127, 118-26. 17. Chang, K.H., Mestdagh, P., Vandesompele, J., Kerin, .J. y Miller, N. MicroRNA expression profiling to identify and valídate reference genes for relative quantification in colorectal cáncer. BMC Cáncer, 10, 173. 18. Smyth, G.K. (2004) Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol, 3, artículo 3. 19. Culhane, A.C., Thioulouse, J., Perriere, G. y Higgins, D.G. (2005) MADE4: an R package for multivariate analysis of gene expression data. Bioinformatics, 21, 2789-90. 20. Sabates-Bellver, J., Van der Flier, L.G., de Palo, M., Cattaneo, E., Maake, C, Rehrauer, H., Laczko, E., Kurowski, M.A., Bujnícki, J.M., Menigatti, M., Luz, J., Ranalli, T.V., Gomes, V., Pastorelli, A., Faggiani, R., Anti, M., Jiricny, J., Clevers, H. y Marra, G. (2007) Transcriptome profile of human colorectal adenomas. Mol Cáncer Res, 5, 1263-75. 21. Lawríe, C.H., Gal, S., Dunlop, H.M., Pushkaran, B., Liggíns, A.P., Pulford, K., Banham, A.H., Pezzella, F., Boultwood, J., Wainscoat, J.S., Hatton, C.S. y Harris, A.L. (2008) Detection of elevated levéis of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma. Br J Haematol, 141, 672-5. 22. Wong, T.S., Liu, X.B., Wong, B.Y., Ng, R.W., Yuen, A.P. y Wei, W.I. (2008) Mature miR-184 as Potential Oncogenic microRNA of Squamous Cell Carcinoma of Tongue. Clin Cáncer Res, 14, 2588-92. 23. Chen, X., Ba, Y., Ma, L., Cai, X., Yin, Y., Wang, K., Guo, J., Zhang, Y., Chen, J., Guo, X., Li, Q., Li, X., Wang, W., Wang, J., Jiang, X., Xiang, Y., Xu, C, Zheng, P., Zhang, J., Li, R., Zhang, H., Shang, X., Gong, T., Ning, G., Zen, K. y Zhang, C.Y. (2008) Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cáncer and other diseases. Cell Res, 18, 997-1006. 24. Ng, E.K., Chong, W.W., Jin, H., Lam, E.K., Shin, V.Y., Yu, J., Poon, T.C., Ng, S.S. and Sung, J.J. (2009) Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cáncer: a potential marker for colorectal cáncer screening. Gut, 58, 1375-81. 25. Pu, X.X., Huang, G.L., Guo, H.Q., Guo, C.C, Li, H., Ye, S., Ling, S., Jiang, L., Tian, Y. y Lin, T.Y. Circulating miR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognostic marker of colorectal cáncer and is correlated with p53 expression. J Gastroenterol Hepatol, 25, 1674-80. 26. Cheng, H., Zhang, L., Cogdell, D.E., Zheng, H., Schetter, A.J., Nykter, M., Harris, C.C, Chen, K., Hamilton, S.R. y Zhang, W. Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cáncer and predicts poor prognosis. PLoS One, 6, e17745. 27. endell, J.T. (2008) miRíad roles for the miR-17-92 cluster in development and disease. Cell, 133, 217-22. 28. Olive, V., Jiang, I. y He, L. mir-17-92, a cluster of miRNAs in the midst of the cáncer network. Int J Biochem Cell Biol, 42, 1348-54. 29. Diosdado, B., van de Wiel, M.A., Terhaar Sive Droste, J.S., Mongera, S., Postma, C, Meijerink, W.J., Carvalho, B. y Meijer, G.A. (2009) MiR-17-92 cluster is associated with 13q gain and c-myc expression during colorectal adenoma to adenocarcinoma progression. Br J Cáncer, 101, 707-14. 30. Volinia, S., Calin, G.A., Liu, C.G., Ambs, S., Cimmino, A., Petrocca, F., Visone, R., lorio, M., Roldo, C, Ferracin, M., Prueitt, R.L., Yanaihara, N., Lanza, G., Scarpa, A., Vecchione, A., Negrini, M., Harris, C.C. y Croce, CM. (2006) A microRNA expression signature of human solid tumors defines cáncer gene targets. Proc Nati Acad Sci U S A, 103, 2257-61. 31. Monzo, M., Navarro, A., Bandres, E., Artells, R., Moreno, I., Gel, B., Ibeas, R., Moreno, J., Martínez, F., Díaz, T., Martínez, A., Balague, O. y Garcia-Foncillas, J. (2008) Overlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cáncer. Cell Res, 18, 823-33. 32. Lanza, G., Ferracin, M., Gafa, R., Veronese, A., Spizzo, R. , Pichiorri, F. , Liu, C.G., Calin, G.A., Croce, CM. y Negrini, M. (2007) mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cáncer. Mol Cáncer, 6, 54. 33. Motoyama, K., Inoue, H., Takatsuno, Y., Tanaka, F., Mimori, K., Uetake, H., Sugihara, K. y Mori, M. (2009) Over- and under-expressed microRNAs in human colorectal cáncer. Int J Oncol, 1069-75. 34. Earle, J.S., Luthra, R., Romans, A., Abraham, R., Ensor, J., Yao, H. y Hamilton, S.R. Association of microRNA expression with microsatellite instability status in colorectal adenocarcinoma. J Mol Diagn, 12, 433-40.

Claims (37)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar o detectar neopiasia colorrectal en un sujeto humano que comprende las etapas de: obtener una o más muestras biológicas del sujeto que se sospecha que padece neopiasia colorrectal; medir un nivel o patrón de expresión global de uno o más microARN obtenidos de una o más muestras biológicas del sujeto; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neopiasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neopiasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de una combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de cáncer colorrectal.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a o miR335 en comparación con la expresión a partir del sujeto normal, en donde la sobreexpresión de miR18a, m¡R29a o miR335 es indicativa de neopiasia colorrectal.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141.

4. El método de la reivindicación 1, en donde una o más muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el método puede detectar CCR temprano (l-ll) de manera tan precisa como CCR avanzado (estadio ll-lll), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende un intervalo de confianza que es del 90, 91, 92, 93, 94 o 95% o superior.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

8. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además la determinación del nivel de expresión de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

9. El método de la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión de uno o más microARN se mide mediante obtención del perfil de expresión de micro matrices, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real cuantitativa, PCR de punto final, PCR de punto final múltiplex, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación in situ (ISH), hibridación in situ múltiplex o secuenciación de ácido nucleico.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el método se usa para tratar a un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia con agente antineoplásico para un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el nivel o patrón de expresión global de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN seleccionados de las tablas 2, 3, 4 y 5, en donde los microARN aumentan la especificidad de la determinación, el diagnóstico o la detección de neoplasia colorrectal.

12. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de usar el nivel o patrón de expresión global de microARN para el pronóstico, guía del tratamiento o monitorización de la respuesta al tratamiento de la neoplasia colorrectal.

13. Un biomarcador para la progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal, metástasis o ambas, en donde el biomarcador comprende uno o más microARN y un cambio en la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal obtenidas de un paciente es indicativo de progresión de la enfermedad de neoplasia colorrectal en comparación con la expresión global de uno o más microARN en células de neoplasia colorrectal normales o células de neoplasia colorrectal obtenidas en un punto de tiempo anterior del mismo paciente, en donde la sobreexpresión de la combinación de miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b, es indicativa de cáncer colorrectal.

14. El biomarcador de la reivindicación 13, que comprende además el análisis de uno o más de los siguientes microARN miR29a, miR92a, miR141, miR18a, m¡R19a, miR19b, miR15b, miR29a o miR335.

15. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

16. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde el biomarcador comprende además microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal seleccionados de:

17. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

18. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

19. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde las muestras biológicas se seleccionan del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

20. El biomarcador de la reivindicación 13, en donde el método puede detectar CCR temprano (l-ll) de manera tan precisa como CCR avanzado (estadio ll-lll), tumores de lado derecho y lesiones de lado izquierdo.

21. El biomarcador de la reivindicación 13, que comprende además la detección y el análisis del nivel o patrón de expresión para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal seleccionados de los microARN de las tablas 2, 3, 4 y 5.

22. Un kit para un diagnóstico de neoplasia colorrectal que comprende: reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial en donde la sobreexpresión de una combinación de microARN m¡R19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b es indicativa de neoplasia colorrectal, en donde un intervalo de confianza para cáncer colorrectal es del 90% o mayor.

23. El kit de la reivindicación 22, que comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR18a, miR29a o miR335.

24. El kit de la reivindicación 22, que comprende además reactivos para la detección y el análisis de al menos uno de miR29a, miR92a o miR141.

25. El kit de la reivindicación 22, que comprende además instrucciones para su uso en el diagnóstico del riesgo de neoplasia colorrectal, en donde las instrucciones comprenden indicaciones etapa a etapa para comparar el nivel de expresión de los microARN, cuando se mide la expresión de una muestra obtenida de un sujeto que se sospecha que tiene neoplasia colorrectal con el nivel de expresión de una muestra obtenida de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal.

26. El kit de la reivindicación 22, que comprende además instrumentos, recipientes y reactivos necesarios para obtener muestras de un sujeto seleccionadas del grupo que consiste de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal.

27. El kit de la reivindicación 22, que comprende además reactivos para el análisis de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

El kit de la reivindicación 22, que comprende además reactivos para el análisis de microARN que se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

29. El kit de la reivindicación 22, en donde se determina el nivel o patrón de expresión global de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.

30. Un método para seleccionar una terapia contra el cáncer para un paciente al que se le ha diagnosticado neoplasia colorrectal, que comprende el método: obtener una muestra de un sujeto que tiene una neoplasia colorrectal; y determinar el nivel de expresión de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335 en comparación con el nivel de expresión de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de los microARN es indicativa de cáncer colorrectal; y seleccionar la terapia contra el cáncer basándose en la determinación de la neoplasia colorrectal en el paciente.

31. Un método para realizar un ensayo clínico para evaluar un fármaco candidato que se cree que es útil en el tratamiento de un estado patológico, que comprende el método: (a) medir el nivel de microARN obtenidos de un conjunto de pacientes, en donde los microARN se seleccionan de uno o más microARN seleccionados de: microARN miR19a y miR19b, o miR19a y miR19b y miR15b; (b) administrar un fármaco candidato a un primer subconjunto de los pacientes, y un placebo a un segundo subconjunto de los pacientes; un fármaco comparador a un segundo subconjunto de los pacientes; o una combinación de fármacos del fármaco candidato y otro agente activo a un segundo subconjunto de pacientes; (c) repetir la etapa (a) tras la administración del fármaco candidato o el placebo, el fármaco comparador o la combinación de fármacos; y (d) determinar si el fármaco candidato reduce el número de células neoplásicas colorrectales que tienen un cambio en la expresión de los microARN que es estadísticamente significativo en comparación con cualquier cambio que se produce en el segundo subconjunto de pacientes, en donde una reducción estadísticamente significativa indica que el fármaco candidato es útil en el tratamiento de dicho estado patológico.

32. Un método para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal (en un sujeto humano) que comprende las etapas de: identificar el sujeto humano que padece o se sospecha que padece neoplasia colorrectal; obtener una o más muestras biológicas del sujeto, en donde las muestras biológicas se seleccionan de uno o más fluidos biológicos, una muestra de plasma, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de tejido o una muestra fecal; medir un nivel o patrón de expresión global de miR18a, miR19a, miR19b, miR15b, miR29a y miR335; y comparar el patrón de expresión global de uno o más microARN de la muestra biológica del sujeto que se sospecha que padece neoplasia colorrectal con el patrón de expresión global de uno o más microARN de una muestra biológica de un sujeto normal, en donde el sujeto normal es un sujeto sano que no padece neoplasia colorrectal, en donde la sobreexpresión de microARN: m¡R18a, m¡R19a, miR19b, miR15b, m¡R29a y m¡R335, es indicativa de cáncer colorrectal.

33. El método de la reivindicación 32, en donde los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

34. El método de la reivindicación 32, en donde los microARN se sobreexpresan en neoplasia colorrectal y se seleccionan de:

35. El método de la reivindicación 32, en donde el nivel de expresión de uno o más microARN se mide mediante obtención del perfil de expresión de micro matrices, PCR, PCR de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real de transcriptasa inversa, PCR en tiempo real cuantitativa, PCR de punto final, PCR de punto final múltiplex, PCR fría, PCR helada, espectrometría de masas, hibridación ¡n situ (ISH), hibridación ¡n situ múltiplex o secuenciación de ácido nucleico.

36. El método de la reivindicación 32, en donde el método se usa para tratar a un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, seleccionar una terapia con agente antineoplásico para un paciente que corre el riesgo de o que padece neoplasia colorrectal, estratificar un paciente en un subgrupo de neoplasia colorrectal o para un ensayo clínico de terapia de neoplasia colorrectal, determinar la resistencia o receptividad a un régimen terapéutico de neoplasia colorrectal, desarrollar un kit para el diagnóstico de neoplasia colorrectal o cualquier combinación de los mismos.

37. El método de la reivindicación 32, en donde se determina el nivel o patrón de expresión global de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 microARN para diagnosticar o detectar neoplasia colorrectal.