CN115820855B

CN115820855B - Hdc、smpdl3a、irf4和aqp3在制备诊断cml的试剂及试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115820855B
Application number: CN202211245379.3A
Authority: CN
Inventors: 钟芳敏; 羊玉林; 程瑛; 姚芳苡; 黄波; 王小中
Original assignee: Second Affiliated Hospital to Nanchang University
Current assignee: Second Affiliated Hospital to Nanchang University
Priority date: 2022-10-12
Filing date: 2022-10-12
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-10-12
Also published as: CN115820855A

Abstract

本发明公开了一种基于四个基因HDC、SMPDL3A、IRF4、AQP3构建的风险评分模型在制备用于CML诊断的试剂或试剂盒中的应用。本发明基于多组测序数据，通过多种机器学习方法发现相较于正常人，患有慢性髓细胞白血病的患者外周血中HDC的表达显著上调，SMPDL3A、IRF4、AQP3的表达显著下调，ROC曲线分析证实具有较高的诊断价值；本发明联合检测四个基因的表达来进行CML诊断，通过LASSO回归分析构建了四个基因的风险评分模型，风险评分的诊断效能比单个基因的诊断效能更高。本发明具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确地对CML患者进行诊断，以便及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

Description

HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3在制备诊断CML的试剂及试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及四个基因(HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3)构建的风险评分模型作为标志物在CML诊断中的应用，以及制备相应的检测试剂和试剂盒中的应用。

背景技术

慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种造血干细胞恶性增殖的血液肿瘤。t(9；22)易位形成的费城染色体与疾病密切相关，重组的BCR-ABL1融合基因编码一种具有强酪氨酸激酶活性的癌蛋白，是导致CML发病的关键因素。随着疾病的进展，CML分为慢性期、加速期和急变期。CML的主要治疗药物是酪氨酸激酶抑制剂，具有良好的治疗效果。然而，部分患者可以达到完全缓解，但依然存在未及时合理治疗、药物反应不佳和复发等情况，导致疾病进展，经短暂加速期后进入急变期，而一旦急变，预后极差。因此，深入探索CML的发病机制并确定新的诊断生物标志物或治疗靶点具有重要意义。

随着下一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术的发展，基于基因表达和调控水平的研究揭示了许多疾病的发病机制和恶性表型。将NGS纳入CML患者的诊断、风险分层和治疗评估非常重要。通过系统分析CML样本和正常样本之间基因表达谱的差异，可以确定其他新的生物标志物。然而，目前大多数与CML相关的研究仅限于单一分子或信号通路，缺乏大样本和多维探索，并且，对如何找到一组用于CML诊断的基因组合，以及优化的数学模型用于诊断的研究极少。因此，选用合理的方式筛选出相关基因分子标志物，并建立准确且稳定的数学模型，能够为早期精确诊断CML提供方向。

发明内容

本发明基于多个CML转录组测序队列，通过支持向量机递归特征消除、最小绝对收缩选择算子和随机森林算法三种机器学习方法，确定了4个CML诊断基因(HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3)，这些基因构建的风险评分模型诊断效能进一步提高。本发明进一步验证了基于4个基因构建的风险评分模型在临床CML样本中具有高诊断价值。基于HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3构建的风险评分模型可以作为新的生物标志物用于CML患者的诊断。

本发明使用多种机器学习方法鉴别CML诊断基因并构建风险评分模型的具体方法，包括以下步骤：

步骤一：从GEO数据库获取CML患者和正常人血液样本的转录组测序数据，并计算出CML患者和正常人血液样本中差异表达的基因；

步骤二：基于差异表达的基因使用支持向量机递归特征消除、最小绝对收缩选择算子和随机森林三种机器学习算法，获得CML的诊断基因，对三个机器学习算法识别出的诊断基因进行取交集。

步骤三：基于四个诊断基因的表达通过最小绝对收缩选择算子算法进行风险评分模型构建，并得到风险评分的计算公式；

步骤五：临床实际样本验证四个基因及风险评分模型的诊断价值。

进一步的，所述步骤一中包含两个CML样本和正常样本的转录组测序数据集，其中GSE13159包含76个CML样本和74个正常样本，GSE144119包含16个CML样本和6个正常样本；差异表达分析共鉴定出210个差异基因。

进一步的，所述步骤二中三种机器学习算法共识别出四个诊断基因(HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3)；

进一步的，所述步骤三中风险评分的计算公式：HDC表达×1.96931556223423+SMPDL3A表达×(-0.881524751781288)+IRF4表达×(-2.18413966166841)+AQP3表达×(-1.44980797069836)；

本发明第一方面提供一种用于慢性髓细胞白血病诊断的相关生物标志物组合，所述相关生物标志物组合为：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3。

本发明第二方面提供了检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3相关生物标志物组合表达量在制备用于慢性髓细胞白血病诊断的试剂或试剂盒中的应用。

作为本发明优选的实施方案，所述诊断试剂包含检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3或其部分片段表达水平的物质的试剂。

作为本发明优选的实施方案，所述诊断试剂盒包含检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3或其部分片段表达水平的物质的试剂。

作为本发明优选的实施方案，所述检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3或其部分片段表达水平的物质的试剂包括检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的核酸扩增引物对。

作为本发明优选的实施方案，HDC所述引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，其引物上游5'-3'：ATGCTGATGAGTCCTGCCTAAAT，下游5'-3'：TGTCATCCACAGGCAGAAATTTC；SMPDL3A所述引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，其引物上游5'-3'：CACCTCATGTTCCTGTACCTGAA，下游5'-3'：ACCTGTGGCCAATAGTCATGATT；IRF4所述引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，其引物上游5'-3'：CAGATCGACAGCGGCAAGTA，下游5'-3'：TGTCGATGCCTTCTCGGAAC；AQP3所述引物对的序列如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示，其引物上游5'-3'：CCTTCTTGGGTGCTGGAATAGTT，下游5'-3'：GGCCAGCACACACACGATAAG。

本发明第三方面还提供了一种用于慢性髓细胞白血病诊断的HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3荧光定量检测试剂盒，所述诊断试剂盒包括HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的核酸扩增引物对和/或检测内参基因GAPDH的核酸扩增引物对。

作为本发明优选的实施方案，所述检测HDC的核酸扩增引物对，其引物上游5'-3'：ATGCTGATGAGTCCTGCCTAAAT，下游5'-3'：TGTCATCCACAGGCAGAAATTTC；所述检测SMPDL3的核酸扩增引物对，其引物上游5'-3'：CACCTCATGTTCCTGTACCTGAA，下游5'-3'：ACCTGTGGCCAATAGTCATGATT；所述检测IRF4的核酸扩增引物对，其引物上游5'-3'：CAGATCGACAGCGGCAAGTA，下游5'-3'：TGTCGATGCCTTCTCGGAAC；所述检测AQP3的核酸扩增引物对，其引物上游5'-3'：CCTTCTTGGGTGCTGGAATAGTT，下游5'-3'：GGCCAGCACACACACGATAAG；所述检测内参基因GAPDH的核酸扩增引物对，如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，其引物上游5'-3'：GACAGTCAGCCGCATCTTCT，下游5'-3'：GCGCCCAATACGACCAAATC。

作为本发明优选的实施方案，所述试剂盒还包括逆转录试剂、SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、DEPC水。

本发明第四方面还提供了一种用于慢性髓细胞白血病诊断的风险评分模型，所述风险评分模型中涉及到的生物标志物组合为：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3；所述风险评分模型采用如下回归方程计算风险评分：风险评分＝HDC表达×1.96931556223423+SMPDL3A表达×(-0.881524751781288)+IRF4表达×(-2.18413966166841)+AQP3表达×(-1.44980797069836)。

本发明进一步提供了所述相关生物标志物组合以及风险评分模型在诊断CML上的应用方法，该方法包括至少三个步骤：

(a)测定怀疑处于CML的受试者外周血PBMCs标本中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达量；和

(b)根据HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达量，计算风险评分，评估该受试者是否患有CML。

作为本发明优选的实施方案，所述评估包括：将根据所测定的HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达量，计算风险评分，评估该受试者是否患有CML；风险评分与预确定的阈值进行比较，风险评分高于阈值，指示该受试者患有CML。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次通过多种机器学习方法在公共数据库中发现HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3在CML和正常对照之间具有显著的表达差异和优异的诊断价值，并在临床样本种验证了它们的表达特征，进一步构建的风险评分模型能进一步提高CML的诊断准确性，表明HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3构建的风险评分模型可用作为CML诊断的标志物，可以更简单、准确地进行诊断，从而及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

附图说明

图1为GSE13159和GSE144119数据集的基因差异表达图，其中图1A为GSE13159差异表达火山图，图1B为GSE144119差异表达火山图，图1C为合并GSE13159和GSE144119共有的差异表达基因的热图。

图2为机器学习方法鉴别CML的诊断基因图，其中，图2A和图2B为最小绝对收缩选择算子鉴别CML的诊断基因图，图2C和图2D为随机森林算法鉴别CML的诊断基因图，图2E为支持向量机递归特征消除鉴别CML的诊断基因图，图2F为三种机器学习算法鉴别的四个共有诊断基因韦恩图，图2G为GSE13159中四个诊断基因的表达水平箱线图，图2H为GSE144119中四个诊断基因的表达水平箱线图，图2I为风险评分模型中四个诊断基因的系数分布图，图2J为GSE13159中风险评分分布水平箱线图，图2K为GSE144119中风险评分分布水平箱线图。

图3为HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在CML中的诊断价值分析图，其中，图3A为GSE13159中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图，图3B为GSE144119中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图。

图4为HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在临床样本中的诊断价值验证图，图4A为临床样本测序数据中四个诊断基因的表达水平箱线图，图4B为临床样本测序数据中风险评分分布水平箱线图，图4C为临床样本测序数据中风险评分的ROC曲线分析图，图4D为临床样本RT-qPCR数据中四个诊断基因的表达水平箱线图，图4E为临床样本RT-qPCR数据中风险评分的ROC曲线分析图，图4F为临床样本RT-qPCR数据中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。

实施例1：CML的转录组数据差异表达分析。

1.分析方法

打开GEO数据库网址，网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，下载GSE13159和GSE144119两个CML数据集的测序数据。使用R语言中“limma”软件包进行差异分析，基于P<0.05，|logFC|>1鉴别出差异表达基因。

2.分析结果

结果见图1A-1C，在两个数据集中，共获得了210个与正常对照样本相比，CML样品中具有显著表达差异的基因。其中图1A为GSE13159差异表达火山图，图1B为GSE144119差异表达火山图，图1C为合并GSE13159和GSE144119共有的210个差异表达基因的热图。

实施例2：机器学习方法鉴别CML的诊断基因。

1.分析方法

基于差异表达的基因使用支持向量机递归特征消除、最小绝对收缩选择算子和随机森林三种机器学习算法，获得CML的诊断基因，对三个机器学习算法识别出的诊断基因进行取交集。基于诊断基因的表达通过最小绝对收缩选择算子算法进行风险评分模型构建，并得到风险评分的计算公式。

2.分析结果

结果见图2A-2K，三种机器学习共鉴别到4个诊断基因(HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3),并得到了风险评分的计算公式：HDC表达×1.96931556223423+SMPDL3A表达×(-0.881524751781288)+IRF4表达×(-2.18413966166841)+AQP3表达×(-1.44980797069836)；相比于正常对照，HDC的表达在CML中显著增加，SMPDL3A、IRF4和AQP3则显著降低，风险评分也显著增加。其中，图2A和图2B为最小绝对收缩选择算子鉴别CML的诊断基因图，图2C和图2D为随机森林算法鉴别CML的诊断基因图，图2E为支持向量机递归特征消除鉴别CML的诊断基因图，图2F为三种机器学习算法鉴别的四个共有诊断基因韦恩图，图2G为GSE13159中四个诊断基因的表达水平箱线图，图2H为GSE144119中四个诊断基因的表达水平箱线图，图2I为风险评分模型中四个诊断基因的系数分布图，图2J为GSE13159中风险评分分布水平箱线图，图2K为GSE144119中风险评分分布水平箱线图。

实施例3：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在CML中的诊断价值分析。

1.分析方法

利用ROC曲线分析HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在CML中的诊断价值。

2.分析结果

结果见图3A-3B，图3A为GSE13159中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图，在GSE13159中，HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在健康对照组和CML中的综合诊断AUC值分别为：0.969(95％ CI:0.936-0.993)、0.936(95％ CI:0.887-0.973)、0.940(95％ CI:0.899-0.971)、0.935(95％CI:0.891-0.970)、1.000(95％ CI:1.000-1.000)；图3B为GSE144119中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图，在GSE144119中，HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在健康对照组和CML中的综合诊断AUC值分别为：0.987(95％ CI:0.961-1.000)、0.975(95％ CI:0.936-1.000)、0.955(95％ CI:0.901-0.933)、0.961(95％ CI:0.907-1.000)、1.000(95％ CI:1.000-1.000)。表明表明检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达量对于CML患者的诊断具有较高价值，而且基于四个基因的表达计算的风险评分进一步提高了诊断准确性。

实施例4：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在临床样本中的诊断价值验证。

1.分析方法

(1)外周血单个核细胞提取。Ficoll密度梯度离心法：①将2.5ml全血置入15ml离心管中，2.5ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；②取15ml离心管先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液用移液管轻轻加到Ficoll上层(避免两种溶液混合)；③离心2000rpm，20min；④用吸管吸取白色细胞层(即PBMC)放入干净的15ml离心管中；⑤加入PBS至10-15ml，1500rpm，10min离心后去掉上清，加入Trizol混匀。-80℃保存备用。

(2)总RNA提取。TRIzol法：①加入0.5ml TRIzol/5×106个PBMC，放置无核酶EP管中反复吹打后，室温静置5min；②加入0.1ml氯仿/1mlTRIzol，剧烈震荡15s，室温静置2-3min；③4℃，12000rpm，离心15min，最上层的无色水相层(约50％)为RNA层(可见三层，轻拿轻放，避免三层液体混合)；④轻轻吸取上层水相至新的EP管中(避免吸到中间层)，加入0.25ml异丙醇/1mlTRIzol，颠倒混匀，4℃放置20min；⑤4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，胶状沉淀可见于EP管侧壁及管底；⑥RNA沉淀用0.5ml的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无核酶水现配)吹打混匀洗涤，后4℃、8000rpm，离心5min；⑦弃上清后获RNA沉淀于室温干燥5-10min，加入无核酶水(适量)溶解RNA，-80℃保存备用。

(3)RT-qPCR分析。①通过时实荧光定量PCR方法，对各组间HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3表达量进行定量检测。来自各组样本的总RNA用RQ1 DNase酶除去除DNA。总RNA纯度和浓度测定，备用。②模板DNA即cDNA的合成：按Takara逆转录反应试剂盒说明对制备的总RNA进行反转录，配制反应体系如下：

其中，100ng的总RNA，据RNA浓度可换算所需加入的体积。配制体系需在冰上操作完成，精准加样，避免操作误差。配制好的体系需点动混匀并离心，随后置于PCR扩增仪上逆转录，反应条件为37℃15min、85℃5s和4℃30min，逆转录结束后及时取出扩增产物(即为模板cDNA)，-20℃保存备用。③SYBR Green法RT-qPCR检测：①LINC00958引物及内参基因GAPDH引物由华大基因公司合成，分别用无核酶水溶解为20nmol/ml，备用；②按Takara荧光定量试剂盒配制RT-qPCR反应体系如下表：

③反应条件：首先95℃30s，然后按95℃5s、60℃34s的顺序循环40次，最后95℃15s、60℃60s、95℃15s；④为减少试验误差，每例样本进行3次重复试验。⑤分析结果：结合扩增曲线及溶解曲线判断扩增效果，利用2-ΔΔCt法计算目的基因表达量。

(4)分别通过转录组测序分析正常对照组(5例)，CML组(10例)和RT-qPCR检测正常对照组(16例)，CML组(16例)外周血单个核细胞HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3表达水平，分析外周血单个核细胞中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达情况，计算风险评分，并进一步利用ROC曲线分析HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的诊断价值。

2.分析结果

结果见图4A-4F，图4A为临床样本测序数据中四个诊断基因的表达水平箱线图，图4B为临床样本测序数据中风险评分分布水平箱线图，图4C为临床样本测序数据中风险评分的ROC曲线分析图，图4D为临床样本RT-qPCR数据中四个诊断基因的表达水平箱线图，图4E为临床样本RT-qPCR数据中风险评分的ROC曲线分析图，图4F为临床样本RT-qPCR数据中HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分的ROC曲线分析图。在转录组测序数据和RT-qPCR数据中，相比于正常对照，HDC的表达在CML中显著增加，SMPDL3A、IRF4和AQP3则显著降低，风险评分也显著增加；在测序数据中，HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在正常对照组和CML中的综合诊断AUC值分别为：0.680(95％ CI:0.280-1.000)；1.000(95％ CI:1.000-1.000)；1.000(95％ CI:1.000-1.000)；1.000(95％ CI:1.000-1.000)；1.000(95％ CI:1.000-1.000)；在RT-qPCR数据中，HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3及风险评分在健康对照组和CML中的综合诊断AUC值分别为：0.801(95％ CI:0.621-0.949)、0.980(95％ CI:0.930-1.000)、0.895(95％CI:0.758-0.996)、0.965(95％ CI:0.895-1.000)、0.980(95％ CI:0.930-1.000)。通过临床数据验证，证实了检测HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3的表达量对于CML患者的诊断价值，并且风险评分进一步提高了诊断准确性和稳定性。

Claims

1.检测生物标志物组合表达量的试剂在制备用于慢性髓细胞白血病诊断试剂盒中的应用，所述相关生物标志物组合为：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3；

其特征在于，

HDC所述引物对的序列如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示，

其引物上游5'-3'：ATGCTGATGAGTCCTGCCTAAAT，下游5'-3'：TGTCATCCACAGGCAGAAATTTC；

SMPDL3A所述引物对的序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示，其引物上游5'-3'：CACCTCATGTTCCTGTACCTGAA，下游5'-3'：ACCTGTGGCCAATAGTCATGATT；

IRF4所述引物对的序列如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6所示，其引物上游5'-3'：CAGATCGACAGCGGCAAGTA，下游5'-3'：TGTCGATGCCTTCTCGGAAC；

AQP3所述引物对的序列如SEQ ID NO .7和SEQ ID NO .8所示，其引物上游5'-3'：CCTTCTTGGGTGCTGGAATAGTT，下游5'-3'：GGCCAGCACACACACGATAAG；

所述应用使用以下风险评分模型：

所述风险评分模型中使用的生物标志物组合为：HDC、SMPDL3A、IRF4和AQP3；所述风险评分模型采用如下回归方程计算风险评分：

风险评分= HDC表达×1.96931556223423+ SMPDL3A表达×(-0.881524751781288)+IRF4表达×(-2.18413966166841)+ AQP3表达×(-1.44980797069836)。