CN103131777A

CN103131777A - 用于检测e2a-pbx融合基因相对表达量的试剂盒

Info

Publication number: CN103131777A
Application number: CN2013100468214A
Authority: CN
Inventors: 周晓犊; 徐建成; 王淑一; 孙翠莲
Original assignee: NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd
Current assignee: NANJING ADICON CLINICAL LABORATORIES Co Ltd
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明公开了用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、检测目的基因用上下游引物E2A-PBX-F，E2A-PBX-R，探针为E2A-PBX-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe。本发明试剂盒能够对急性淋巴细胞白血病患者体内E2A-PBX融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

Description

用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对急性淋巴细胞白血病患者体内E2A-PBX融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)是由恶性淋巴细胞克隆性增殖、积累、并有组织浸润所致的一类恶性血液病。其中t(1;19)(q23;pl3)易位形成的E2A/PBX1融合基因见于5%左右的儿童，尤其是在B细胞性ALL中占20～25%。t(1;19)使位于19p13的E2A和1q23上的PBX1相融合。完整的E2A作为转录因子包括转录激活结构域和HLH结构域，E2A有促进转录激活的作用。过去认为E2A/PBX1融合基因阳性的ALL患儿在发病时常伴有高白细胞计数，中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia，CNSL)发生率高。过去曾经认为携带有t(1;19)易位的儿童或成人白血病预后不好,但是近年的研究提示对于携带有t(1;19)易位的ALL儿童采用更为强烈的化疗方案,可以改善其预后,5年无病生存率(EFS)已接近80%。

目前已公认,早期治疗反应是重要的预后因素。通常采用MRD水平反映患儿的早期治疗反应情况。对于MRD水平高(即早期治疗反应差)、具有高度复发倾向的患儿采取较强的方案,以减少复发,提高治愈率。而对MRD水平低(即早期治疗反应好)、具有低度复发倾向的患者,则可采用较弱的化疗方案,以减少因化疗引起的毒副作用及经济负担,提高患者的生存质量。已有很多利用定性RT-PCR，扩增e2a-pbx1融合基因,进行白血病微小残留病检测的报道,检测灵敏度达到10^-4-10^-5。但所有这些研究均未能显示出明确的临床意义。目前国际上得到普遍认同,诱导缓解治疗第33天时的MRD水平能够提示ALL患者的远期预后。

在实际应用中，用于检测E2A-PBX融合基因表达水平的方法主要为荧光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时检测,可准确反映患者体内E2A-PBX的表达情况，节约了大量的检测时间,还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于E2A-PBX的基因检测。

发明内容

鉴于现有技术中检测E2A-PBX融合基因的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测E2A-PBX融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒。

用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAce qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：

检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物E2A-PBX-F，E2A-PBX-R，探针为E2A-PBX-Probe，检测内参基因Abl用引物abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，

E2A-PBX-F：GGCAGCCACCCCGAGGACG

E2A-PBX-R：TCTGTGGGTTCCTCCTCCTGG

E2A-PBX-Probe：FAM-CCTCCCCAGCCAGCCAGGCACCCT-TAMRA

abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG

abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC

abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。

进一步地，检测目的基因用上下游引物和探针的比例优选为：E2A-PBX-F、E2A-PBX-R、E2A-PBX-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

参照用上下游引物和探针的比例优选为：abl-F、abl-R、abl-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

所述阳性对照品为含有E2A-PBX基因的溶液；所述阴性对照品为无E2A-PBX基因的溶液。

其中的ReverTraAce qPCR RT Kit为TOYOBO公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。

THUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。

使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对E2A-PBX融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建E2A-PBX和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和E2A-PBX拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的△△CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使扩增效率和速率等实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。

检测受测者体内E2A-PBX的相对于内参基因的表达水平，能够作为急性淋巴细胞白血病（ALL）的早期预防、早期诊断以及预后的辅助性指标，同时还能够对高危人群进行较为准确的筛查。

附图说明

图1：E2A-PBX阳性结果示意图。

图2：E2A-PBX阴性结果示意图。

具体实施方式

实施例1

本发明的用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒，包括：

红细胞裂解液；

TRIzol；

氯仿；

无水乙醇；

检测体系PCR反应液：ReverTraAce qPCR RT Kit（TOYOBO公司）；THNDERBIRD ProbeqPCR Mix（2×）E2A-PBX上、下游引物各0.8uM、E2A-PBX探针0.4uM；abl上、下游引物各0.8uM、abl-probe（探针）0.4uM；

其中：E2A-PBX-F：GGCAGCCACCCCGAGGACG

E2A-PBX-R：TCTGTGGGTTCCTCCTCCTGG

E2A-PBX-Probe：FAM-CCTCCCCAGCCAGCCAGGCACCCT-TAMRA

abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG

abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC

abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。

阳性对照品：含E2A-PBX基因组溶液；阴性对照品：不含E2A-PBX基因组溶液。

实施例2

本发明试剂盒的使用方法：

（1）抽提血液中的组织RNA：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1ml TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75%乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。

（2）参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

（3）试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xul，每人份23ul分装：

X=23ul反应液×（8份内参（标准曲线）+8份目的基因（标准曲线）+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照）；

（4）加样：加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。

（5）检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500（美国AppliedBiosystems公司）等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

（6）结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。

1）内参阳性时，检测结果才认为有效；

2）阳性判断标准：Ct<36，为阳性；35≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

实施例3

采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本

取急性淋巴细胞白血病（ALL）标本60例，按实施例2所述方法提取基因组RNA，配制试剂并检测。

每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。

实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表：

表1为本次实验结果和PCR实验室结果的对比，斜体加粗部分所示为不一致的结果。从上表可以看出，60例样本中有59例与特检的检测结果相符，符合率达到98.3%。说明本发明检测试剂盒与特检利用常规荧光定量方法相比，不但检测结果准确性高，而且缩短了检测时间，提高了检测效率。

实施例4临床样品检测

取待检的临床样品2份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。

每份样品加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。

样品1的检测结果图如图1所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的E2A-PBXCT值<36之前有扩增信号，所以样品1为E2A-PBX阳性。

样品2的检测结果图如图2所示，内参基因abl的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的E2A-PBXCT值>38之后无扩增信号，所以样品2为E2A-PBX阴性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京艾迪康医学检验所有限公司

<120> 用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcagccacc ccgaggacg 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctgtgggtt cctcctcctg g 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctccccagc cagccaggca ccct 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgtgaaga ccttgaagga g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatataga acgggggctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acctggtgca gctccttggg 20

Claims

1.用于检测E2A-PBX融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT Kit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：

E2A-PBX-F：GGCAGCCACCCCGAGGACG

E2A-PBX-R：TCTGTGGGTTCCTCCTCCTGG

E2A-PBX-Probe：FAM-CCTCCCCAGCCAGCCAGGCACCCT-TAMRA

abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG

abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC

abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于E2A-PBX-F、E2A-PBX-R、E2A-PBX-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于abl-F、abl-R、abl-Probe的摩尔比为2︰2︰1。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有E2A-PBX基因的溶液；所述阴性对照品为无E2A-PBX基因的溶液。