CN107083449A - 一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒 - Google Patents
一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，包括第一至第八检测组件，每一检测组件均包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、UNG酶、逆转录酶、TMAC、荧光检测探针、检测引物、内标荧光探针DIP、内标正向引物DIF和内标反向引物DIR，第一至第八检测组件的荧光定量PCR反应程序均一致。本发明的试剂盒采用荧光定量PCR，可鉴定基因型1a、1b、2a/c、2b、3a、3b、4a、5a和6a，具有内标监测体系和防污染系统，检测时间为2h，同时可以进行定量。
Description
技术领域
本发明属于疾病检测试剂盒技术领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒。
背景技术
现有技术中的丙型肝炎病毒检测试剂盒多为Abbott Molecular、上海星耀医学、福州泰普、湖南圣湘和李艳等人的产品，其中，Abbott Molecular的试剂盒采用荧光定量PCR，可以鉴定基因型1～6及亚型1a和1b，具有内标监测体系和防污染系统，检测时间为2h，不能进行定量；上海星耀医学的试剂盒采用荧光定量PCR，只能鉴定基因型1和2，具有内标监测体系和防污染系统，检测时间为2h，可以进行定量；福州泰普的试剂盒采用PCR+杂交，可以鉴定基因型1a、1b、2a、2b、3a、3b和6a，具有内标监测体系，无防污染系统，检测时间为4～5h，不能进行定量，由于PCR后需要开管后取出PCR产物再进行杂交，容易造成PCR污染从而增加了产生假阳性的风险；湖南圣湘的试剂盒采用荧光定量PCR，只能鉴定基因型1、2、3和6，具有内标监测体系，无防污染系统，检测时间为2h，不能进行定量；李艳等人的试剂盒采用测序法，可以鉴定到亚型，但需要测序测序后比对获得具体型别信息，无内标监测体系和防污染系统，检测时间为4～5h，不能进行定量，操作复杂、成本高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，包括第一至第八检测组件，每一检测组件均包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、UNG酶、逆转录酶、TMAC、荧光检测探针、检测引物、内标荧光探针DIP、内标正向引物DIF和内标反向引物DIR，第一至第八检测组件的荧光定量PCR反应程序均一致，dNTPs由等量的dATP、dCTP、dGTP和dUTP组成，内标荧光探针DIP包括如SEQ ID NO 01所示的序列，内标正向引物DIF包括如SEQ ID NO 02所示的序列，内标反向引物DIR包括如SEQ ID NO 03所示的序列；
第一检测组件用以检测基因型1、基因型2和基因型3，其中，荧光检测探针包括P-1、P-2a/c、P-2b和P-3，检测引物包括F-3、R-1和R-3；
第二检测组件用以检测基因型1a，其中，荧光检测探针包括P-1a/g，检测引物包括F-1和R-1a；
第三检测组件用以检测基因型1b，其中，荧光检测探针包括P-1b，检测引物包括F-1b和R-1b；
第四检测组件用以检测基因型2a/c和基因型3a，其中，荧光检测探针包括P-2a/c和P-3a，检测引物包括F-1、F-4、R-3a和R-5；
第五检测组件用以检测基因型4a，其中，荧光检测探针包括P-4，检测引物包括F-4和R-3b/4a；
第六检测组件用以检测基因型5a，其中，荧光检测探针包括P-5，检测引物包括F-5和R-5；
第七检测组件用以检测基因型6a、基因型2b和基因型3b，其中，荧光检测探针包括P-3b、P-6a和P-2b，检测引物包括F-1b、F-3b、R-3b/4a和R-2b/c；
第八检测组件用以HCV阳性，其中，荧光检测探针包括CP3，检测引物包括CF和CR2；
上述荧光检测探针P-1、P-1a/g、P-1b、P-2a/c、P-2b、P-3、P-3a、P-3b、P-4、P-5、P-6a和CP3依次包括如SEQ ID NO 04至15所示的序列；上述检测引物F-1、F-1b、F-3b、F-4、F-5、R-1、R-1a、R-1b、R-2b/c、R-3、R-3a、R-3b/4a、R-5、CF和CR2依次包括如SEQ ID NO 16～30所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述内标荧光探针DIP如SEQ ID NO 01所示，内标正向引物DIF如SEQ ID NO 02所示，内标反向引物DIR如SEQ ID NO 03所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光检测探针P-1、P-1a/g、P-1b、P-2a/c、P-2b、P-3、P-3a、P-3b、P-4、P-5、P-6a和CP3依次如SEQ ID NO 04至15所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述检测引物F-1、F-1b、F-3b、F-4、F-5、R-1、R-1a、R-1b、R-2b/c、R-3、R-3a、R-3b/4a、R-5、CF和CR2依次如SEQ ID NO 16～30所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其荧光定量PCR反应程序如下：95℃，5min；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，15个循环；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，35个循环。
本发明的有益效果：
1、本发明采用分子信标作为探针对各HCV RNA基因型及亚型进行荧光定量PCR闭管检测，第一至第七检测组件实现对多达6种基因型(多达10种亚型)的鉴定；第八检测组件表征HCV阳性并通过对照标准曲线可进行定量。
2、本发明的试剂盒均为闭管操作，尽可能地避免了PCR污染。
3、本发明操作简便，只需将提取好的HCV RNA核酸依次加入到第一至第八检测组件中，放入荧光定量PCR中反应并检测即可读取分析结果，判断基因型及亚型。
附图说明
图1为本发明实施例1的第一检测组件的检测结果图。
图2为本发明实施例1的第二检测组件的检测结果图。
图3为本发明实施例1的第三检测组件的检测结果图。
图4为本发明实施例1的第四检测组件的检测结果图。
图5为本发明实施例1的第五检测组件的检测结果图。
图6为本发明实施例1的第六检测组件的检测结果图
图7为本发明实施例1的第七检测组件的检测结果图
图8为本发明实施例1的第八检测组件的检测结果图
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：
一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，包括第一至第八检测组件，每一检测组件均包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、UNG酶、逆转录酶、TMAC、荧光检测探针、检测引物、内标荧光探针DIP、内标正向引物DIF和内标反向引物DIR，第一至第八检测组件的荧光定量PCR反应程序均一致，dNTPs由等量的dATP、dCTP、dGTP和dUTP组成，内标荧光探针DIP如SEQ ID NO 01所示，内标正向引物DIF如SEQ ID NO 02所示，内标反向引物DIR如SEQ IDNO 03所示；
第一检测组件用以检测基因型1、基因型2和基因型3，其中，荧光检测探针包括P-1、P-2a/c、P-2b和P-3，检测引物包括F-3、R-1和R-3；
第二检测组件用以检测基因型1a，其中，荧光检测探针包括P-1a/g，检测引物包括F-1和R-1a；
第三检测组件用以检测基因型1b，其中，荧光检测探针包括P-1b，检测引物包括F-1b和R-1b；
第四检测组件用以检测基因型2a/c和基因型3a，其中，荧光检测探针包括P-2a/c和P-3a，检测引物包括F-1、F-4、R-3a和R-5；
第五检测组件用以检测基因型4a，其中，荧光检测探针包括P-4，检测引物包括F-4和R-3b/4a；
第六检测组件用以检测基因型5a，其中，荧光检测探针包括P-5，检测引物包括F-5和R-5；
第七检测组件用以检测基因型6a、基因型2b和基因型3b，其中，荧光检测探针包括P-3b、P-6a和P-2b，检测引物包括F-1b、F-3b、R-3b/4a和R-2b/c；
第八检测组件用以HCV阳性，其中，荧光检测探针包括CP3，检测引物包括CF和CR2；
上述荧光检测探针P-1、P-1a/g、P-1b、P-2a/c、P-2b、P-3、P-3a、P-3b、P-4、P-5、P-6a和CP3依次如SEQ ID NO 04至15所示；上述检测引物F-1、F-1b、F-3b、F-4、F-5、R-1、R-1a、R-1b、R-2b/c、R-3、R-3a、R-3b/4a、R-5、CF和CR2依次如SEQ ID NO 16～30所示。
具体的探针和引物的序列如下表所示：
将上述第一至第八检测组件分别置于第一直第八管中进行荧光定量PCR检测，具体反应体系如下：
1、第一管
2、第二管
3、第三管
4、第四管
5、第五管
6、第六管
7、第七管
8、第八管
上述第一至第八关的反应程序均如下表所示：
上述第一至第八管的检测的荧光信号如下表所示，结果依次如图1至图8所示：
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
<110> 英科新创（苏州）生物科技有限公司
<120> 一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒
<160> 30
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cggtccttac tgcagaatgt g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaatcgaat cataccgatg aa 22
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggcgcagga cgaccgggtc ctttcttcgc cg 32
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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cggcgaaacc cgctcaatgc ctggagcgcc g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 7
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<212> DNA
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cgcgggaccg ggtcctttct tggattccgc g 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atgagtgtcg tgcagcctcc agga 24
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atggcgttag tacgagtgtc gtg 23
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ggcgttagta tgagtgttgt a 21
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ggcgttagta tgagtgtcga a 21
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<212> DNA
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ctactcggct agcagtctc 19
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gcacgcccaa atttccgggc 20
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gcgcctagcc atggcgttag ta 22
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<400> 30
ccggtgtact caccggttcc g 21
Claims (5)
1.一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，其特征在于：包括第一至第八检测组件，每一检测组件均包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq酶、UNG酶、逆转录酶、TMAC、荧光检测探针、检测引物、内标荧光探针DIP、内标正向引物DIF和内标反向引物DIR，第一至第八检测组件的荧光定量PCR反应程序均一致，dNTPs由等量的dATP、dCTP、dGTP和dUTP组成，内标荧光探针DIP包括如SEQ ID NO 01所示的序列，内标正向引物DIF包括如SEQ ID NO 02所示的序列，内标反向引物DIR包括如SEQ ID NO 03所示的序列；
第一检测组件用以检测基因型1、基因型2和基因型3，其中，荧光检测探针包括P-1、P-2a/c、P-2b和P-3，检测引物包括F-3、R-1和R-3；
第二检测组件用以检测基因型1a，其中，荧光检测探针包括P-1a/g，检测引物包括F-1和R-1a；
第三检测组件用以检测基因型1b，其中，荧光检测探针包括P-1b，检测引物包括F-1b和R-1b；
第四检测组件用以检测基因型2a/c和基因型3a，其中，荧光检测探针包括P-2a/c和P-3a，检测引物包括F-1、F-4、R-3a和R-5；
第五检测组件用以检测基因型4a，其中，荧光检测探针包括P-4，检测引物包括F-4和R-3b/4a；
第六检测组件用以检测基因型5a，其中，荧光检测探针包括P-5，检测引物包括F-5和R-5；
第七检测组件用以检测基因型6a、基因型2b和基因型3b，其中，荧光检测探针包括P-3b、P-6a和P-2b，检测引物包括F-1b、F-3b、R-3b/4a和R-2b/c；
第八检测组件用以HCV阳性，其中，荧光检测探针包括CP3，检测引物包括CF和CR2；
上述荧光检测探针P-1、P-1a/g、P-1b、P-2a/c、P-2b、P-3、P-3a、P-3b、P-4、P-5、P-6a和CP3依次包括如SEQ ID NO 04至15所示的序列；上述检测引物F-1、F-1b、F-3b、F-4、F-5、R-1、R-1a、R-1b、R-2b/c、R-3、R-3a、R-3b/4a、R-5、CF和CR2依次包括如SEQ ID NO 16～30所示的序列。
2.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，其特征在于：所述内标荧光探针DIP如SEQ ID NO 01所示，内标正向引物DIF如SEQ ID NO 02所示，内标反向引物DIR如SEQ ID NO 03所示。
3.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，其特征在于：所述荧光检测探针P-1、P-1a/g、P-1b、P-2a/c、P-2b、P-3、P-3a、P-3b、P-4、P-5、P-6a和CP3依次如SEQ ID NO 04至15所示。
4.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，其特征在于：所述检测引物F-1、F-1b、F-3b、F-4、F-5、R-1、R-1a、R-1b、R-2b/c、R-3、R-3a、R-3b/4a、R-5、CF和CR2依次如SEQ ID NO 16～30所示。
5.如权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因分型定量检测试剂盒，其特征在于：其荧光定量PCR反应程序如下：95℃，5min；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，15个循环；95℃，5s，60℃，35s，72℃，30s，35个循环。
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