CN102899422B - 一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法。本发明提供的引物组合物，包括序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA，还可包括序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA。本发明提供的引物组合物可以用于丙型肝炎患者筛查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法，特别涉及可用于丙型肝炎筛查和丙型肝炎病毒分型的引物组合物。
背景技术
丙型肝炎(hepatitis C；HC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus；HCV)感染而导致的一种复杂的病理过程。HC呈世界分布，目前全世界有近2亿人感染HCV，占世界人口的3％-5％。2003至2008年我国丙肝新报告的病例数以及与丙肝相关的肝癌发病率逐年增加，在法定报告的27种传染病中，其发病率由2004年的第十位上升至2008年第七位，目前我国约有丙肝患者4000万。
HCV基因组长度约9.6kb，仅含有单个开放阅读框架(ORF)，编码一条长约3100个氨基酸残基的多聚蛋白前体。在宿主细胞和病毒蛋白酶的作用下，多蛋白被加工成至少10个成熟的HCV蛋白质：C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。HCV核心蛋白由191个氨基酸残基组成，与HCV RNA结合后形成病毒核心。
目前，第四代抗-HCV检测试剂主要有C、NS3、NS4、NS5抗原片段。由于HCV极易变异，相应其所表达的蛋白也发生变化，在实际检测中会产生弱阳性和假阴性现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种HCV Core protein基因RT-PCR分型及检测方法。
本发明提供的第一种引物组合物，可用于丙型肝炎患者辅助筛查，包括序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA。
本发明提供的第二种引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b)：(a)丙型肝炎患者辅助筛查；(b)丙型肝炎病毒辅助分型。
本发明提供的第三种引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下(a)或(b)：(a)丙型肝炎患者辅助筛查；(b)丙型肝炎病毒辅助分型。
所述第一种引物组合物、所述第二种引物组合物或所述第三种引物组合物可用于制备丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒。
所述第二种引物组合物或所述第三组引物组合物可用于制备丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒。
本发明还保护一种丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒，包括所述第一种引物组合物、所述第二种引物组合物或所述第三种引物组合物。
本发明还保护一种丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒，包括所述第二种引物组合物或所述第三种引物组合物。
本发明还保护一种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤：
(1)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对；
(2)以步骤(1)的扩增产物为模板，用引物对乙进行PCR扩增，得到扩增产物；所述引物对乙为序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为引物对丙；所述引物对丙为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。
所述步骤(2)中，所述扩增产物具体可为450bp。
本发明还保护另一种丙型肝炎病毒辅助分型的方法，包括如下步骤：
(1)以待测丙型肝炎病毒的总RNA为模板，用所述引物对甲进行RT-PCR扩增，得到扩增产物；
(2)以步骤(1)的扩增产物为模板，用所述引物对丙进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行测序，根据测序结果进行分型；所述测序所用的引物为所述引物对丙。
所述丙型肝炎病毒具体可为1b型、1a型、6a型、3a型或2a型。
HCV的早期诊断与基因分型是传染病防控与临床工作的难点。本研究选择巢式PCR对HCV核心蛋白的编码基因进行扩增和测序，从而对HCV进行基因水平的分型。巢式PCR是为扩增一个低拷贝片段而进行两次聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段是扩增包括目的片段在内的比目的片段还长的片段。第二对引物(称为巢式引物)能够与第一次PCR产物内部结合，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于能够扩增出比普通PCR更难扩增的片段，而且如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
第三代第四代HCV ELISA试剂盒中关键成份之一就是对HCV核心蛋白的检测。本发明对使用HCV ELISA试剂盒检测为抗-HCV阴性但ALT大于100U/L的血清检测发现有一例核心蛋白基因扩增阳性，说明本方法可以作为可疑HCV感染人群的辅助筛查。本发明的引物设计涉及1063条HCV Core Protein基因序列，包括6个基因型83个亚型，理论上能全部对已经发现基因型的检测和分型确认。
综上所述，本发明提供的引物组合物可以用于丙型肝炎筛查和丙型肝炎病毒分型，具有重大潜在应用价值。
附图说明
图1为第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；1为DL2000 DNA分子质量标准；2-5均为待测血清，其中2至4显示阳性结果，5显示阴性结果。
图2为1例1b型的部分测序谱图。
图3为1例1b型的国际HCV数据库检索结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、引物组合物的设计
从国际HCV数据库(http://hcv.lanl.gov/components/sequence/HCV/search/searchi.html)查找到1063条HCV Core Protein基因序列，包括6个基因型83个亚型，利用DNAStar-Megalign分析比对找出其保守序列，并用PRIMER5设计引物，然后在NCBI数据库检测其特异性。
共设计并筛选得到6种引物(C1、C2、C3、C4、C5和C6)，序列见表1。
表1 6条引物(简并引物)的核苷酸序列
| 核苷酸序列(5’→3’) | |
| C1(序列表的序列1) | GCACRAATCCTAAACCTCAAA |
| C2(序列表的序列2) | GGAAGATAGARAAAGAGCAACC |
| C3(序列表的序列3) | AACACCAACCGYCGCCCA |
| C4(序列表的序列4) | TTCCCTGTTGCATARTTHAC |
| C5(序列表的序列5) | GCCCACAGGACGTYAAGTTC |
| C6(序列表的序列6) | GACGAGCGGDATGTACCCCA |
R代表A或G，Y代表C或T或U，H代表A或T或C，D代表A或T或G。
实施例2、引物组合物的应用
分别合成实施例1设计的6种引物(C1、C2、C3、C4、C5和C6)，进行110份来自知情同意的志愿者的血清样本的检测。
一、待测样本
分别检测110份血清样本的HCV抗体和丙氨酸氨基转换酶ALT。采用市售的具有药品注册证的丙型肝炎病毒(HCV)抗体诊断试剂盒检测HCV抗体。采用上海申能德赛诊断技术有限公司生产的丙氨酸氨基转换酶检测试剂盒(速率法)检测丙氨酸氨基转换酶ALT。110血清中，60份为HCV抗体检测阳性，另外50份为HCV抗体检测阴性且丙氨酸氨基转换酶ALT大于100(U/L)。
二、待测样本的检测
分别对每个样本进行如下检测：
1、提取RNA
采用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN，货号为52906)提取待测血清的总RNA(按试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：
(1)将560μ1准备好的含有Carrier RNA的AVL缓冲液加入1.5ml离心管；
(2)取待测血清140微升(每批次实验用灭菌水作阴性对照)加入AVL/CarrierRNA缓冲液的离心管，震荡混匀15秒，室温孵育10分钟；
(3)将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；加入560μl 95％乙醇，震荡混匀15秒；震荡混匀后，将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴；
(4)将630μl上一步骤中的溶液小心转入QIAamp RNA提取柱(放置于2ml收集管里)，注意不要碰湿柱子边缘；盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟。
(5)将柱子移入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟；
(6)小心打开柱子的盖子，加入500μl AW1液，盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟。
(7)将柱子放入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，加入500μl AW2液，盖上盖子，全速(20,000g，14,000rpm)离心3分钟；
(8)将柱子放入一新的1.5ml离心管，丢弃剩有滤液的收集管；小心打开柱子的盖子，加入60μl已平衡至室温的AVE缓冲液，盖上盖子，室温孵育1分钟后，6000g(8000rpm)离心1分钟。
(9)收集滤液，即为RNA溶液(4-8℃保存；最好2小时内使用，以免RNA降解)。
2、HCV Core基因扩增
(1)第一轮PCR扩增(RT-PCR)
采用一步法RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司，货号为DRR055A)进行第一轮PCR扩增。
RT-PCR扩增的反应体系(25微升)：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μl、2×1Step Buffer 12.5μl、C1(10μM)1μl、C2(10μM)1μl；步骤1的RNA溶液9.5μl。
RT-PCR扩增的反应条件：50℃30min，94℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，共进行40个循环。
(2)第二轮PCR扩增
采用PCR试剂盒(大连宝生物公司，货号为DRR001)进行第二轮PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(50微升)：Taq 0.25μl、5×1 Step Buffer 5μl、dNTP 4μl、C3(10μM)1μl、C4(10μM)1μl、H2O 38.25μl、第一轮PCR扩增产物0.5微升。(实际应用中也可以将C5和C6代替C3和C4作为第二轮PCR扩增的引物)
PCR扩增的反应条件：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃35sec，共进行35个循环。
(3)电泳
将5微升第二轮PCR扩增产物进行2％琼脂糖电泳和SYBR Green染色，所有样本的第二轮PCR扩增产物显示两种电泳结果：一种显示一条特异性条带(阳性结果)且各个样本显示的条带在凝胶上处于相同的位置；另一种没有条带显示。将所有所有样本的第二轮PCR扩增产物分别进行测序，所有样本显示的特异性条带的大小一致，均为450bp。
60份抗-HCV阳性血清中，42份电泳显示阳性结果，阳性率为70.0％。50份ALT大于100且抗-HCV阴性血清中，仅有1份电泳显示阳性结果，阳性率为2.0％。部分待测血清的电泳图见图1。
3、测序
对于显示阳性结果的待测血清，取第二轮PCR扩增产物用基因分析仪进行测序。测序所用的引物为C5和C6。测序结果在国际HCV数据库中进行BLAST对比(http://hcv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)，确定待测血清中HCV的基因型，测序结果与数据库中的序列同源性相似百分比(Identities)最高者或得分(Score(bits))最高者，即为该待测血清中的HCV基因型。
60份抗-HCV阳性血清中，42份电泳显示阳性结果，测序结果如下：1b型27例(占64.3％)、1a型12例(占28.6％)、6a型1例(占2.4％)、3a型1例(占2.4％)、2a型1例(占2.4％)。1例3a型的测序结果见序列表的序列7，1例2a型的测序结果见序列表的序列8，1例1a型的测序结果见序列表的序列9，1例6a型的测序结果见序列表的序列10，1例1b型的测序结果见序列表的序列11(部分测序结果图谱见图2，NCBI-BLAST检索结果见图3)。
50份ALT大于100且抗-HCV阴性血清中，仅有1份电泳显示阳性结果，测序结果如下：3a型。
Claims (5)
1.引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；所述引物组合物的用途为如下（a）或（b）：
（a）丙型肝炎患者辅助筛查；
（b）丙型肝炎病毒辅助分型。
2.权利要求1所述引物组合物在制备丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述引物组合物在制备丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒中的应用。
4.一种丙型肝炎患者辅助筛查的试剂盒，包括权利要求1所述引物组合物。
5.一种丙型肝炎病毒辅助分型的试剂盒，包括权利要求1所述引物组合物。
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