CN102864236B - 一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，第1506位存在一个单核苷酸多态性：T>C。一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列。一种体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：（1）用特异性引物扩增样品的GADD45A基因，得到扩增产物；（2）对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：1506T>C。本发明的方法检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

Description

一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记

技术领域

本发明涉及一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其检测方法，具体地涉及GADD45A基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及其与卵巢癌的相关性，及检测这些SNP的方法和试剂盒，属于分子生物学和医学领域。

背景技术

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤，2008年全球新发病例225500人，死亡140200人。由于起病隐匿，症状不明显，多数患者发现时已届晚期，晚期卵巢癌患者5年生存率仅为30～45％左右，预后差，而早期卵巢癌患者5年生存率高达90％，这提示我们提高卵巢癌患者预后和生存的关键是早诊、早治，因此探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，寻找鉴定卵巢癌易感人群的分子标记，卵巢癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

现有技术中，虽然已经有超过200个候选基因和20个遗传区域的1100个遗传变异与卵巢癌易感性相关，但是与卵巢癌相关性很强的遗传变异却很少。并且没有GADD45A基因与卵巢癌相关性的报道，更没有GADD45A基因SNP与卵巢癌相关性的报道。因此，本领域急需进一步寻找卵巢癌易感基因，开发检测卵巢癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

针对上述现有技术，本申请的发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析，首次发现GADD45A和卵巢癌易感性密切相关，可作为卵巢癌易感性检测或者早期诊断的分子标记，因此，本发明提供了一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于检测卵巢癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的GADD45A基因相比，区别在于：第1506位存在一个单核苷酸多态性：T>C，即第1506位的碱基包括碱基T和碱基C两种情形，当为碱基T时，为正常的GADD45A基因，当为碱基C时，为突变的GADD45A基因：

一种用于检测卵巢癌易感性的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列，能够特异性的扩增GADD45A基因的引物，能特异性地扩增出长度200～2700bp。

进一步地，试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg²⁺、Taq酶和Buffer组成。PCR反应液中各组分的用量关系为常规的，对所属领域技术人员而言是公知常识。

一种体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：

（1）用GADD45A基因特异性引物扩增样品的GADD45A基因，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列；

（2）对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：1506T>C；1506T>C突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

一种对个体的卵巢癌易感性或患病风险进行检测或诊断的方法，步骤如下：

检测该个体的GADD45A基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GADD45A基因、转录本和/或蛋白进行比较，存在差异就表明该个体患卵巢癌的可能性高于正常人群。所述差异是指是否存在单核苷酸多态性：1506T>C；1506T>C突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

本发明的用于检测卵巢癌易感性的分子标记、试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在GADD45A基因的单核苷酸多态性的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1GADD45A基因突变的检测及与卵巢癌的关联分析

1.1研究对象

选取卵巢癌患者139例，2008年9月～2011年4月于山东大学齐鲁医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄匹配的对照病人189例，为齐鲁医院健康体检中心健康查体妇女。大部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃冷藏保存。所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。

1.2DNA提取

用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：

（1）取400ul血加于1.5ml离心管中。

（2）加入800ul PBS,混匀，3500g，15min，弃上清；重复一遍。

（3）加入400ul裂解液，37℃，1h。

（4）加入蛋白酶K4ul，浓度200ug/ml。

（5）55℃水浴消化过夜（4-12h）。

（6）加入400ul的Tris饱和酚，混合摇动10min。

（7）5000g，15min，取水相。

（8）加入100ul NaAc，800ul无水乙醇，-20℃，20min。

（9）12000g，5min，弃上清。

（10）600ul70%冰乙醇，12000g，5min，弃上清，重复一次。

（11）12000rpm离心，10分钟。弃上清，晾干。溶于100μl TE。

（12）测定浓度和纯度，分装，冻存于-80℃。

1.3引物、PCR扩增和测序

从GenBank下载GADD45A基因组序列（GenBank序列；AY135686.1；GI:22122007），用primer premier5.0设计引物。具体引物详细信息见表1。

表1引物序列表

引物名称	序列	SEQ ID NO：
			上游引物	5'AGTTTGCACAGGGCAACTCC3'	2
下游引物	5'CCTGCTAAAGGAATTAGTCACG3'	3

PCR扩增条件：94℃3分钟，（94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒）×35，72℃7分钟，10℃保温。PCR扩增产物为1255bp。

PCR扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序，测序结果应用软件Meglign7.0和Chromas2.33进行检验和分析，本实施采用了反向测序，经分析，发现存在以下SNP：1506T>C。

1.4SNP分型和关联分析

应用卡方（X²）检验对受试人员位点的分布进行统计分析；当一个单元格的期望个数少于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率，当P<0.05时认为有显著统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和卵巢癌患病之间的相关性进行评估，计算其比值比（Odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI），并应用SPSS17.0软件（SPSS Inc.Chicago,Illinois,USA）进行统计分析。

结果发现SEQ ID NO：1中的1506T>C位点与卵巢癌发病显著相关，其中加性遗传模型（T/T vs.T/C vs.C/C）的P值为0.003。显性遗传模型（T/T+T/C vs C/C）的P值为0.002（OR=1.301,95%CI[1.093～1.55）。隐性遗传模型（T/T vs T/C+C/C）的P值为0.014（OR=1.817，95%CI[1.112～2.968]），C等位基因为易感基因（P=0.0004，OR=1.762，95%CI[1.285～2.418]）。详细结果见表2。

表21506T>C位点基因型及等位基因在卵巢癌组和健康对照组中的分布

实施例2卵巢癌易感性检测试剂盒

由于SEQ ID NO：1中1506T>C的突变与卵巢癌发表高度相关，因此可基于这个突变设计GADD45A基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。

制备一试剂盒（100人次），它含有如表3所示的物质：

表3

抽取受试者外周血2ml，常规方法提取DNA。利用卵巢癌易感性检测试剂盒进行PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign7.0和Chromas2.33软件进行检验和分析。检测结果含有1506T>C的受试者卵巢癌易感性高于正常人群。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改或改动，但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。

Claims (2)

1.特异性引物在制备用于检测卵巢癌易感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述特异性引物为一对，其序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中除特异性引物外，还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg²⁺、Taq酶和Buffer组成。